Tetrandriin leevendab podotsüütide vigastusi kaltsiumist sõltuva kalpaiini-1 signaaliblokaadi kaudu

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Yin Ding, Xuanli Tang, Yuhui Wang, Dongrong Yu, Caifeng Zhu ja Jin Yu*

Abstraktne

Taust:Podotsüüdid on muutunud proteinuuriasse sekkumise oluliseks sihtmärgiksneerudhaigused. Paljud uuringud on teatanud, et ajutise retseptori potentsiaalse katioonkanali valgu 6 (TRPC6) üleekspressioon podotsüütide vigastuse korral reguleerib rakusisest Ca2 pluss sissevoolu ja stimuleerib Ca2 pluss-sõltuvat proteaasi kalpaiini{5}} signaaliülekannet. Traditsioonilist Hiina ravimit tetrandriini, mitteselektiivne Ca2 pluss kanali blokaator, on pikka aega kasutatud krooniliste haiguste raviks.neerudhaigus. Selle uuringu eesmärk oli uurida võimalikke mehhanisme, mis on aluseks tetrandriini proteiinivastastele omadustele.

Meetodid:Uurisime tetrandriini osalust Ca2 pluss sõltuva kalpaiini-1 signaaliülekandes hiire podotsüütides ja adriamütsiini poolt indutseeritud nefropaatiaga rottidel. Positiivse kontrollina kasutati tsüklosporiin A (CsA) ja U73122. Uuriti rakkude elujõulisust, tsütotoksilisust, Ca2 pluss kontsentratsiooni, kalpaiini aktiivsust ning kalpaiini-1 signaaliradade mRNA ja valgu ekspressioonitasemeid. Mõõdeti kliinilisi ja patoloogilisi muutusi.

Tulemused:Tetrandriin vähendas rakusisest Ca2 pluss sissevoolu kultiveeritud TRPC{1}}üleekspresseerivates podotsüütides. Nii in vitro kui ka in vivo uuringutes vähendas tetrandriini manustamine kalpaiini aktiivsust ja kalpaiini-1 ekspressiooni ning taastas allavoolu Taliini-1 ja nefriini ekspressiooni. Võrreldes CsA-ga avaldas tetrandriinravi kalpaiini aktiivsust ja kalpaiini -1 ekspressiooni paremini inhibeerivat toimet.

Järeldused:Tetrandriinil on terapeutiline potentsiaal podotsüütide kahjustuste korral, blokeerides Ca2 pluss-sõltuva kalpaiini-1 signaaliraja aktivatsiooni. Tetrandriin vähendas proteinuuriat, parandas neerufunktsiooni ja leevendas neerude patoloogilisi kahjustusi.

Märksõnad:Tetrandriin, podotsüütide kahjustus, mööduva retseptori potentsiaalse katioonikanali valk 6, kalpaiin-1

Cistanche tubulosa hoiab ära neeruhaiguse, proovi saamiseks klõpsake siin

Taust

Podotsüüdid on glomerulaarfiltratsiooni barjääri selektiivse läbilaskvuse ja glomerulaarstruktuuri terviklikkuse säilitamise eeltingimus. Podotsüüdi kahjustus on tavaliselt seotud proteinuuriliste neeruhaigustega, sealhulgas fokaalne segmentaalne glomeruloskleroos (FSGS), membraanne nefropaatia, minimaalse muutusega haigus ja diabeet.neerudhaigus [1–4]. Podotsüütide kaitsmine ja taastamine kahjustavate tegurite eest on neeruhaiguse edukas ravis suur väljakutse.

Podotsüüdid on kõrgelt spetsialiseerunud, lõplikult diferentseerunud rakud, mis asuvad väljaspool glomerulaarset alusmembraani ja mida iseloomustavad jalaprotsessid. Kaltsiumi signaalide regulatsiooni düsfunktsioon podotsüütides põhjustab podotsüütide aktiini tsütoskeleti desorganiseerumist, jalaprotsesside lagunemist, pilu diafragma häireid ja proteinuuriat. Mööduva retseptori potentsiaalse katioonikanali valk 6 (TRPC6), uudne piludiafragmaga seotud valk podotsüütides, on tuvastatud mittespetsiifilise Ca2 pluss-juhtiva ioonikanalina [5–8]. Glomerulaarne TRPC6 ekspressioon suureneb paljude pärilike ja omandatud proteinuursete haiguste korral. Varasemad uuringud on teatanud, et TRPC6 üleekspressioon podotsüütides põhjustab intratsellulaarse Ca2 ja sissevoolu parema suurenemise, mis arvatakse olevat vastutav podotsüütide rakkude vigastuste eest. Suurenenud kaltsiumisisaldus podotsüütides aktiveerib allavoolu signaaliülekandeteid, sealhulgas kalpaiini-1, taliini-1, nefriini ja kaltsineuriini, et moduleerida sihtgeenide aktiivsust või ekspressiooni [9–12]. Fangji Huangqi Tang on klassikaline traditsiooniline hiina meditsiin (TCM) nefrootilise sündroomi raviks [13]. See koosneb kuuest ürdist: Radix Stephania Tetrandra (Stephania tetrandra juured), Radix Astragali (Astragalus membranaceus'e juured), Rhizoma Atractylodis Macrocephalae (Atractylodes macrocephaly juured), Radix Glycyrrhizae (Rhiiszlyencyrrhiisingi juured), (Zingiber Officinale juured) ja Fructus Ziziphi Jujubae (Fructus of Ziziphus jujuba) [1]. Tetrandriini, mitteselektiivse Ca2 pluss kanali blokaatori Radix Stephania Tetrandra üks peamisi aktiivseid komponente, on kliinilistes uuringutes testitud ja see on näidustatud proteinuuria leevendamiseks ja neerufunktsiooni parandamiseks [14, 15]. Eelmine uuring näitas tetrandriini blokeerivat toimet Ca2 pluss-sõltuvale RhoA signaaliülekandele podotsüütides [16], kuid selle aluseks olevaid mehhanisme ei selgitatud. Siin töötati välja TRPC{22}}üleekspresseerivad mudelid in vitro ja in vivo. Pärast tetrandriini manustamist hinnati muutusi TRPC6-sõltuvas Ca2 pluss signaaliülekandes, sealhulgas allavoolu sihtmärke, kalpaiini-1, taliini-1, nefriini ja kaltsineuriini. Positiivse kontrollina kasutati tsüklosporiin A (CsA), kaltsineuriini inhibiitorit, mida kasutatakse laialdaselt proteinuuriahaiguste ravis) [17] ja U73122, TRPC6 kanali avanemise inhibiitorit [18].

meetodid

Rakukultuur ja plasmiidi konstrueerimine

Professor Peter Mundelilt (Mount Sinai School of Medicine, USA) saadud tinglikult immortaliseeritud hiire podotsüütide rakuliini (MPC5) rakke hoiti proliferatsiooniks 33 kraadi juures ja seejärel nihutati diferentseerumiseks 37 kraadini. TRPC6 ekspressiooniplasmiid konstrueeriti TRPC6 geeni kodeeriva DNA järjestuse täispikkuses kloonimisega pCDH-GFP-PURO vektori EcoRI/BamHI saitidesse ja pakiti lentiviirusesse. Pärast diferentseerumist ja ligikaudu 80-protsendilise liitumiseni kasvatamist külvati podotsüüdid rakutihedusega 4 × 104 cm2 kohta ja inkubeeriti koos TRPC{11}}üleekspresseeriva lentiviirusega. Edasistes katsetes kasutati TRPC6 stabiilset rakuliini, mida kontrolliti TRPC6 valgu ja mRNA ekspressiooni abil. Tus, MPC5 podotsüüdid jagati kolme rühma: normaalne kontrollrühm (NC), tühi lentiviiruse (Lv-NC) rühm ja TRPC{16}}üleekspresseeriv (OverTRP) rühm.

In vitro rakuravi ja tsütotoksilisuse test

Rakkude elujõulisuse määramiseks kasutati rakkude loenduskomplekti{{0}} (CCK-8) testi vastavalt tootja juhistele. Kokku kasvatati 96-süvendiplaatidel kolmes eksemplaris 5000 MPC5 podotsüüti süvendi kohta. Rakke töödeldi CsA (0–2 μmol/L; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ja tetrandriiniga (0–40 μmol/L; Sigma Aldrich) 37 kraadi juures 48 tundi. Seejärel lisati plaatidele CCK-8 (10 μL süvendi kohta), mida seejärel inkubeeriti pimedas 2 tundi. Neeldumist 450 nm juures mõõdeti mikroplaadilugejaga (BioTek Instruments, USA). Tsütotoksilisust analüüsiti laktaatdehüdrogenaasi (LDH) vabanemise kvantifitseerimisega, kasutades tsütotoksilisuse LDH analüüsikomplekti-WST (Dojindo Laboratories, Jaapan). Positiivse kontrollina töödeldi rakke 10 μmol/LU73122-ga (Cal biochem, USA) 37 kraadi juures 10 minutit.

RNA ekstraheerimine ja kvantitatiivne pöördtranskriptaasi-polümeraasi ahelreaktsioon (qRT-PCR)

Kultiveeritud rakkudest valmistati kogu RNA janeerudkudesid kasutades RNAiso Plus reaktiivi (Takara, Jaapan) ja pöördtranskribeerituna cDNA PrimeScript™ RT Master Mix komplekti (Takara) vastavalt tootja protokollile. qRT-PCR viidi läbi, kasutades Power SYBR Green PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Saksamaa). Siht- ja võrdlusgeenide praimerijärjestused on loetletud täiendavas tabelis S1. Andmed koguti ABI Prism 7900HT FAST Real-Time PCR süsteemi abil. Sihtgeeni ekspressiooni suhteline kvantifitseerimine normaliseeriti, kasutades võrdlevat 2-ΔΔCt meetodit. Sisekontrollina kasutati glütseraldehüüdi 3-fosfaatdehüdrogenaasi (GAPDH).

Western blotting

koguvalgu proovid ekstraheeriti kultiveeritud rakkudest janeerudkoed. Valgu kontsentratsioonid määrati BCA valguanalüüsi komplekti (Thermo Fisher Scientific) abil. Proovid eraldati 10% naatriumdodetsüülsulfaat-polüakrüülamiidgeelil ja kanti polüvinülideendifluoriidmembraanile. Seejärel blokeeriti membraan üleöö 4 kraadi juures primaarsete antikehadega, nimelt anti-TRPC6 (Santa Cruz, USA), anti-cal valu-1 (Abcam, UK), anti-Talin-1 (Abcam) , anti-nefriini (Santa Cruz) ja anti-kaltsineuriini (Abcam). Pärast pesemist inkubeeriti membraani kitse küülikuvastase IgG-ga (H pluss L; Jackson ImmunoResearch Laboratories, USA). Membraani töödeldi ka GAPDH (Abcam) tuvastamiseks võrdse koormuse jaoks. Primaarse antikeha poolt äratuntavad ribad visualiseeriti ja valguribade optilisi tihedusi analüüsiti tarkvara TanonImage (Tanon, Hiina) abil.

Tsütosoolse Ca2 pluss määramine kultiveeritud podotsüütides MPC5 podotsüüdid külvati ja töödeldi tetrandriini, CsA ja U73122-ga vastavalt 48 tundi, 48 tundi ja 10 minutit. Seejärel inkubeeriti podotsüüte 30 minutit pimedas RPMI-1640-ga, millele oli lisatud 10 μM Fluo-3AM (Dojindo Laboratories). Seejärel pesti neid kohe fosfaatpuhverdatud soolalahusega, milles neid hoiti ja ergutati 488 nm juures. Tsütosoolse Ca2 pluss iooni suhtelist kontsentratsiooni hinnati fluorestsentsi intensiivsuse mõõtmisega, kasutades Zeissi laserkonfokaalset kujutise süsteemi (Zeiss, USA).

Kalpaiini aktiivsuse mõõtmine

Kalpaiini aktiivsus määrati ettevõtte Abcam Inc. Calpain Activity Assay Kit abil vastavalt tootja protokollile. Supernatant (150 uL) podotsüütidest võineerudkuded võeti sobivas puhverlahuses (145 mmol/l Nacl, 100 mmol/l Tris-HCL, pH 7,3) ja 0,15 ml-suktsinüül-leu-tyr-AMC (500 umol/l). Pärast 1-tunnist inkubeerimist 37 kraadi juures pimedas loeti proove fluoromeetriga, mis oli varustatud 360 nm ergastusfiltriga ja 440 nm emissioonifiltriga.

Adriamütsiini poolt indutseeritud nefropaatia (ADRN) roti mudel Tuginedes meie esialgsetes katsetes proovi suuruse Fermi lähendamisele [19] ja proteinuuria erinevusele kontroll- ja mudelrühmade vahel, määrati meie uuringus vajalik rottide koguarv. Kokku 56 tervet isast Sprague-Dawley rotti, kes kaalusid umbes 200 g ja olid umbes 8 nädala vanused (Zhejiang Institute of TCM), jagati juhuslikult seitsmesse rühma (n =8 rotti rühmas), nimelt ADR rühm, ADR pluss. tetrandriini väikese annuse rühm (4 mg/kg/päevas), ADR pluss tetrandriini keskmise annusega rühm (8 mg/kg/päevas), ADR pluss tetrandriini suure annusega rühm (16 mg/kg/päevas), ADR pluss CsA-ga ravitud rühm (30 mg /kg/d), ADR pluss keskmine tetrandriini annus (8mg/kg/d) kombinatsioonis CsA (30mg/kg/d) rühmaga ja NC rühmaga. Mudelrühma ja ravimiravirühmade rotid anesteseeriti ketamiinvesinikkloriidi (50 mg/kg) intraperitoneaalse süstiga ja FSGS-i rotimudeli väljatöötamiseks süstiti sabaveeni kaks annust ADR-i (4mg/kg). 12 nädala pärast koguti rottide uriiniproove 24 tunni jooksul metaboolsete puuride abil, millele järgnes vere kogumine ja rottide kogumine.neerud. Täheldati kliinilist efektiivsust ja muutusi 24-h uriini valgu, plasma albumiini, seerumi kreatiniini (Scr) ja vere uriini lämmastiku (BUN) tasemetes mõõdeti müügilolevate diagnostikakomplektide abil koos automatiseeritud keemianalüsaatoriga (HITACHI 7180). ).

Kõik katseprotseduurid, mis hõlmasid loomade kasutamist, kiideti heaks TCM Zhejiangi Instituudi loomkatsete eetikakomitees (Tianmushan Road No. 132) ja need viidi läbi rangelt vastavalt NIH laboriloomade hooldamise ja kasutamise juhendis kirjeldatud põhimõtetele. .

Histoloogiline värvimine, elektronmikroskoopia ja analüüs

Rottneerudfikseeriti paraformaldehüüdis, dehüdreeriti astmelise etanooli seeriaga ja sisestati parafiini. Lõigud (paksused 5-μm) värviti hematoksüliini ja eosiiniga (H&E) ning Massoni trikroomiga ning uuriti optilise mikroskoobi all. Neerud perfuseeriti ja fikseeriti glutaaraldehüüdiga ning seejärel lõigati 1-mm3 koeplokkideks epoksiidi sisestamiseks. Elektronmikroskoopia viidi läbi standardsete protseduuride abil. Igast proovist saadi juhuslikult viis ultramikrograafi. Podotsüüdi jala protsesside ühinemiskiirus (PFR) arvutati järgmise valemi abil: PFR ( protsenti )=∑LFP / ∑LBM × 100 protsenti , kus ∑LFP on sulandunud jala protsessi kogupikkus ja ∑LBM on perifeersete kapillaaride basaalmembraani (BM) kogupikkus.

Statistiline analüüs

Andmed väljendatakse mõõtmise keskmise ± standardveana ja analüüsimisel kasutatakse SPSS 20.0 (IBM Statistics SPSS, USA) ja GraphPad Prism 6 for Windows (GraphPad Software Inc., USA). Normaaljaotust hinnati qq graafikute ja SW testiga. Andmed näitasid normaaljaotust. Kui võrreldi kahte andmerühma, rakendati sõltumatute proovide t-testi. Kolme või enama sõltumatu rühma erinevusi võrreldi ühesuunalise dispersioonanalüüsi abil, millele järgnes Tukey post hoc test. Statistiline olulisus määrati p<>

Tulemused

Tetrandriini, CsA ja U73122 optimaalsete kontsentratsioonide ja tsütotoksilisuse valik

Rakkude elujõulisuse tuvastamiseks kasutati CCK{{0}} testi. Nagu on näidatud joonistel 1a ja b, ei mõjutanud tetrandriini maksimaalne kontsentratsioon 10 μmol/L ja CsA 0,1 μmol/L MPC5 podotsüütide elujõulisust. LDH vabanemise test kinnitas veel, et 10 μmol/L tetrandriin ja 0,1 μmol/L CsA 48 tunni jooksul ei näidanud toksilisust, samas kui 10 μmol/LU73122 10 minuti jooksul näitas eeldatavat toksilisust (joonis 1c). Seetõttu kasutati järgmistes rakukatsetes tetrandriini ja CsA vastavalt 10 μmol / l ja 0, 1 μmol / l.

Tetrandriin vähendas rakusisest Ca2 pluss sissevoolu kultiveeritud MPC5 rakkudes, mis üleekspresseerivad TRPC6

Plasmiidse transfektsiooni abil loodi edukalt TRPC6 üleekspressiooni rakumudel MPC5 podotsüütides. qRT-PCR ja Western blot analüüs näitasid, et TRPC6 ekspressioonitasemed Over-TRP rühmas tõusid oluliselt võrreldes NC ja Lv-NC rühmadega (p<0.05; fig.="" 2a="" and="" b).="" and="" full-length="" gel="" and="" blot="" of="" trpc6="" were="" included="" in="" supplementary="" fig.="">

Fluorestsentskujutis (joonis 2c) ja poolkvantitatiivne analüüs (joonis 2d) näitasid, et TRPC6 üleekspressioon suurendas intratsellulaarset Ca2 pluss sissevoolu, samas kui NC ja Lv-NC rühmade vahel ei olnud ilmseid erinevusi. Seejärel töödeldi eksperimentaalsete ravimitega kümmet OverTRP rühma rakku. Ravimi eeltöötlemisrühmadel (tetrandriin, CsA ja U73122) oli rakusisese Ca2 pluss sissevoolu pärssiv toime (P<0.05), while="" there="" was="" no="" statistically="" significant="" difference="" among="" the="" three="" groups="" of="">

Tetrandriini mõju kalpaiin-1, kaltsineuriini, Talin-1 ja nefriini aktiivsusele ja ekspressioonile MPC5 rakkudes

On näidatud, et intratsellulaarne Ca2 plus aktiveerib kalpaiini, Ca2 plussist sõltuva tsüsteiini proteaasi ja kaltsineuriini, Ca2 pluss/kalmoduliinist sõltuva proteiinfosfataasi. Kooskõlas varasemate tähelepanekutega olid kalpaiini ja kaltsineuriini aktiivsus ja ekspressioonitasemed Over TRP rühmas kõrgemad kui NC ja Lv-NC rühmades (p<0.05; fig.="" 3a-e,="" h="" and="" i).="" drop="" intervention="" in="" cultured="" trpc6-overexpressing="" podocytes="" established="" that="" tetrandrine="" inhibited="" calpain="" activity="" and="" calpain-1="" expression.="" te="" calpain="" activity="" and="" calpain-1="" mrna="" levels="" were="" significantly="" reduced="" in="" the="" tetrandrine-exposed="" group="" than="" in="" the="" csa="" intervention="" group=""><0.05; fig.="" 3a="" and="" d).="" western="" blotting="" results="" demonstrated="" a="" considerable="" decrease="" in="" calpain-1="" protein="" levels="" because="" of="" tetrandrine=""><0.05; fig.="" 3c="" and="" h).="" in="" addition,="" calcineurin="" activity="" was="" significantly="" reduced=""><0.05; fig.="" 3b)="" after="" tetrandrine="" exposure,="" but="" the="" mrna="" and="" protein="" expression="" levels="" of="" calcineurin="" remain="" unchanged="" (fig.="" 3e="" and="" i).="" treatment="" with="" csa="" did="" not="" block="" calpain="" activation="" (fig.="" 3a),="" and="" the="" effect="" was="" not="" as="" robust="" as="" that="" of="" tetrandrine="" in="" calpain-1="" mrna="" expression=""><0.05; fig.="" 3d).="" in="" addition,="" the="" inhibiting="" effect="" on="" the="" activity="" and="" expression="" of="" calcineurin="" was="" more="" obvious="" in="" the="" csa-treated="" group="" than="" in="" the="" tetrandrine-treated="" group=""><0.05; fig.="" 3b,="" e="" and="">

The podocyte cytoskeleton-associated anchoring protein Talin-1 and the slit diaphragm protein nephrin are two specific targets of calpain-1. When treated with tetrandrine, there was an increasing trend in mRNA and protein expression of Talin-1 (p >0.05) ja nefriin (lk<0.05), compared="" with="" that="" in="" the="" overtrp="" group,="" but="" this="" finding="" was="" not="" statistically="" significant="" among="" the="" three="" treatment="" groups="" (p="">0.05; 3f, g, j ja k).

Täispikad geelid ja blotid lisati täiendavale joonisele S1.

In vivo katsed, kasutades ADRN roti mudelit Et iseloomustada reaktsiooni tetrandriini poolt vahendatud TRPC6/calpain-1 signaaliülekande in vivo inhibeerimisele, töötati rottidel välja ADRN mudel. TRPC6 mRNA ja valgu ekspressiooniprofiilid suurenesid märkimisväärselt ADRN rühmas võrreldes normaalse toiduga toidetud rottide omadega (NC rühm; p<0.05; fig.="" 4a="" and="" b).="" consistent="" with="" the="" above="" studies="" in="" cell-based="" models,="" the="" activity="" and="" expression="" levels="" of="" calpain="" and="" calcineurin="" increased="" remarkably="" in="" the="" adrn="" group=""><0.05; fig.="" 4c-g,="" j,="" and="" k)="" than="" in="" the="" nc="">

Ravi CsA-ga ei blokeerinud TRPC6 üleekspressioonist indutseeritud kalpaiini aktivatsiooni (joonis 4c) ja see ei olnud nii tugev kui tetrandriini oma valgu ekspressioonile (p<0.05; fig.="" 4j).="" in="" addition,="" the="" inhibiting="" effect="" on="" the="" activity="" and="" expression="" of="" calcineurin="" was="" more="" obvious="" in="" the="" csa-treated="" group="" than="" in="" the="" tetrandrine-treated="" group=""><0.05; fig.="" 4d,="" g,="" and="" k).="" the="" tetrandrine="" group="" was="" down="" compared="" to="" the="" adr="" group="" (fig.="">

Ravi CsA-ga ei blokeerinud TRPC6 üleekspressioonist põhjustatud kalpaiini aktivatsiooni (joonis 4c) ja mõju kalpaiini -1 valgu ekspressioonile ei olnud nii tugev kui tetrandriinil (p<0.05; fig.="" 4j).="" in="" addition,="" the="" inhibiting="" effect="" on="" the="" activity="" and="" expression="" of="" calcineurin="" was="" more="" obvious="" in="" the="" csa-treated="" group="" than="" in="" the="" tetrandrine-treated="" group=""><0.05; fig.="" 4d,="" g,="" and="">

Lisaks hinnati Talin-1 ja nefriini ekspressiooni (joonis 4h, i, l ja m). Nii Talin-1 kui ka nefriini tase vähenes ADRN rottidel võrreldes NC rühmaga (p<0.05). upon="" treatment="" with="" tetrandrine,="" the="" mrna="" levels="" and="" protein="" expression="" of="" talin-1="" and="" nephrin="" were="" visibly="" increased.="" the="" high-dose="" group="" of="" tetrandrine="" recovered="" the="" expression="" of="" the="" two="" structural="" components,="" similar="" to="" the="" adr+csa="" group="" (p="">0.05).

Täispikad geelid ja blotid lisati täiendavale joonisele S2.

Tetrandriin pärssis ADRN progresseerumist ja päästis histopatoloogia Tetrandriini mõjuneerudSeejärel hinnati funktsiooni ADRN-ga ravitud Sprague-Dawley rottidel (joonised 5a-d). Algselt olulisi erinevusi 24-h proteinuuria, Scr ja BUN tasemetes rühmade vahel ei olnud. Kaksteist nädalat hiljem suurenesid 24-tunnise proteinuuria, Scr ja BUN tasemed ADRN rühmas statistiliselt, samas kui plasma albumiini tase vähenes märkimisväärselt, võrreldes NC rühmaga (P<0.05). after="" treatment="" with="" tetrandrine,="" the="" levels="" of="" proteinuria,="" scr,="" and="" bun="" were="" markedly="" decreased,="" whereas="" the="" level="" of="" albumin="" was="" significantly="" improved="" compared="" to="" those="" in="" the="" adr="" group=""><0.05). among="" the="" three="" dose-response="" subgroups="" of="" tetrandrine,="" a="" significant="" difference="" was="" observed:="" the="" middle="" dose="" demonstrated="" considerably="" better="" efficacy="" than="" the="" other="" two="" doses=""><0.05). there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" the="" levels="" of="" serum="" alanine="" aminotransferase,="" before="" and="" after="" treatment="" among="" groups="" (p="">0.05; andmeid ei kuvata).

Muutused histomorfoloogias on näidatud joonisel 6. ADRN rottidel näitas H&E ja Massoni värvimine FSGS-i, tubulointerstitsiaalset fibroosi ja neerude interstitsiaalset põletikurakkude infiltratsiooni. Lisaks näitas glomerulite elektronmikroskoopia pildistamisel tugevalt tuhmunud, nuumatud ja sulandunud podotsüütide jalaprotsesse 80–100-protsendilise podotsüütide PFR-iga. Tetrandriini alarühmade (keskmise ja suure annuse rühmad) rottidel esines vähem kahjustusi kui erineva ulatusega ADR rühmas ning paranemine suure annuse rühmas ületas keskmise annuse rühma oma. Madala, keskmise ja suure annusega tetrandriiniga töödeldud rühmades olid podotsüütide PFR-id vastavalt 70–80 protsenti, 50–60 protsenti ja 30–40 protsenti. Need andmed viitavad sellele, et tetrandriin kaitses kõrvaltoimete manustamisest põhjustatud neeruglomerulite struktuursete kahjustuste eest. Valgusmikroskoobis patoloogilistes muutustes rühmade vahel olulisi erinevusi (suure annusega tetrandriin, CsA ja tetrandriin kombinatsioonis CsA-ga) ei täheldatud. Lisaks oli podotsüütide PFR CsA-ga töödeldud ADRN-rühmas sama, mis tetrandriiniga töödeldud rühmade suures annuses.

Arutelu

Podotsüüdid on muutunud üha olulisemaks FSGS-i ja sellega seotud nefrootiliste haiguste sekkumise sihtmärgina [20, 21]. Siin, in vitro ja in vivo andmete põhjal, oli see nii

näitas, et tetrandriini, mitteselektiivse Ca2 pluss kanali blokaatori, podotsüütide kaitse ja antiproteinuriline toime on vahendatud rakusisese Ca2 pluss sissevoolu ja Ca2 pluss-sõltuva kalpaiini-1 signaaliülekande kaskaadi, sealhulgas Talin-1 inhibeerimise kaudu. , nefriin ja kaltsineuriin. Tetrandriin oli tõhusam kui kalpaiini{7}} inhibeerimise pärssimine.

Varasemate leidude kohaselt on podotsüütide TRPC6 kanal, mis aitab peamiselt kaasa Ca2 pluss sissevoolu muutustele normaalsetes ja patoloogilistes tingimustes [7, 22]. On laialt teada, et kalpaiini aktiivsus sõltub kaltsiumi tasemest ja on seotudneerudvigastused, eriti neerude antiglomerulaarne BM kahjustus [10, 23]. 15 tuvastatud kalpaiini isovormi hulgas on hiljuti näidatud, et kalpaiin -1 seob TRPC6 aktiivsuse podotsüütide kahjustusega [24]. On teatatud, et kalpaiin -1 lõhustab podotsüütide tsütoskeletiga seotud ankurdusvalku Talin-1 ja piludiafragma valku nefriini, mis häirib podotsüütide terviklikkust ja kutsub esile raske proteinuuria [8–12, 16]. Kaltsineuriin on Ca2 pluss-sõltuv fosfataas, millel on varem näidatud oma rolli podotsüütides janeerudfunktsiooni. Koguvad tõendid näitavad üha enam, et kalpaiin võib kaltsineuriini proteolüütiliselt lõhustada ja aktiveerida [25, 26]. Selles uuringus loodi TRPC6 üleekspressiooni mudelid viirusinfektsiooniga kultiveeritud podotsüütides ja adriamütsiini süstimisega SD-rottidele. Vastavalt näitasime, et TRPC6-vahendatud Ca2 pluss sissevool aktiveeris kalpaiini aktiivsuse ja kalpaiini perekonnaliikme calpain-1 ekspressiooni. Suurenenud kalpaiin-1 lõikas seejärel allavoolu Talini-1 ja nefriini.

Tetrandriin on alkaloid, mis on ekstraheeritud traditsioonilisest Hiina ravimtaimest ja on mitteselektiivne Ca2 pluss kanalite blokaator. Siin kinnitati veel kord, et tetrandriin inhibeeris TRPC6 üleekspressiooni ja vähendas Ca2 plussi sissevoolu nii rakkudes kui ka TRPC6 üleekspresseerivates rottides, nagu eelnevalt dokumenteeritud [16]. Veelgi olulisem on see, et see uuring keskendub tetrandriini sekkuvale toimele kaltsiumist sõltuvale allavoolu signaalirajale. Täheldati, et erinevalt CsA-st vähendas tetrandriin kaltsiumi poolt aktiveeritud neutraalse proteaasi (kalpaiini) aktiivsust. Lisaks vähendas tetrandriin kaltsiumiga aktiveeritud proteaaside perekonna kalpaiini -1 ekspressiooni ning taastas taliini-1 ja nefriini alareguleeritud ekspressiooni. Võrreldes CsA-ga avaldas tetrandriini manustamine paremat mõju kalpaiini inaktiveerimisele ja kalpaiini ekspressiooni alareguleerimisele-1. Need tulemused näitasid, et tetrandriinil on terapeutiline potentsiaal podotsüütide kahjustuste korral, kuna see blokeerib kalpaiini-1 signaaliraja TRPC6-sõltuva aktiveerimise.

Fosfolipaas C (PLC) on tuvastatud TRPC{0}}sidumise partnerina [27]. U73122 inhibeerib PLC-d, nii et tekib vähem diatsüülglütserooli ja väheneb TRPC6 kanali avanemine [18, 24]. Seega kasutati U73122 paralleelselt positiivse kontrollina ja see näitas märgatavat toimet rakusisese Ca2 pluss sissevoolu vähendamisel, kalpaiini aktiivsuse pärssimisel ja kalpaiini -1 ekspressioonil TRPC6 üleekspresseerivates podotsüütides. Kuid in vitro tsütotoksilisuse testid näitasid ilmset podotsüütide toksilisust.

Selles uuringus ilmnes pärast 12-nädalast ADR-i süstimist ADR-ravi saanud rottidel tõsine proteinuuria, hüpoalbumineemia ning BUN-i ja Scr-i taseme tõus. Valgusmikroskoopia näitas ADRN rottidel FSGS-i, tubulointerstitsiaalset fibroosi ja neerude interstitsiaalset põletikuliste rakkude infiltratsiooni. Elektronmikroskoopia näitas jalaprotsesside laialdast kadumist. In vivo andmed näitasid lisaks, et tetrandriinravi võib vähendada proteinuuriat, parandada neerufunktsiooni ja nõrgendada glomeruloskleroosi progresseerumist. Pärast tetrandriinravi paranesid patoloogilised muutused valgusmikroskoobi ja elektronmikroskoobi all, 24-h proteinuuria, plasma albumiin, Scr ja BUN ADRN rottidel võrreldes NC rühmaga.

Kaltsineuriini inhibiitorit CsA on proteinuuria raviks pikka aega kasutatudneerudhaigused [28]. Kaltsineuriin on immunosupressiivse ravimi CsA otsese sihtmärgina kliiniliselt oluline [17, 29]. CSA vähendab kaltsineuriini ekspressiooni ja vähendab aktiveeritud T-rakkude kaltsineuriini vahendatud tuumafaktorit [30–32]. Hiljutised tõendid toetavad CsA stabiliseerivat toimet podotsüütide aktiini tsütoskeletile, näiteks sünaptopodiinile, blokeerides sünaptopodiini kaltsineuriini poolt vahendatud defosforüülimise [17]. Samuti on näidatud, et kalpaiin võib kaltsineuriini proteolüütiliselt lõhustada ja aktiveerida [25, 26]. Selle uuringu andmed kinnitasid veel kord, et CsA inhibeeris kaltsineuriini aktiivsust ja ekspressiooni tugevamalt kui tetrandriin. Nagu varem teatatud, ei näi CsA otseselt kalpaiini aktiivsust mõjutavat.

Uuringu peamiseks piiranguks oli suutmatus demonstreerida annusest sõltuvat toimet tetrandriini alarühmades (madala annuse, keskmise annuse ja suure annuse rühmad). Üks võimalik seletus võib olla see, et meie kasutatud annuste vahemik oli rottide jaoks liiga kõrge. Lisaks võivad individuaalsed erinevused loomkatses olla tunduvalt suuremad kui annuste erinevused. Suhteliselt väike valimi suurus võib statistilist võimsust vähendada. Seetõttu on vaja täiendavaid uuringuid, mis hõlmavad oluliselt väiksemaid annuseid ja sobivat proovi suurust, et teha kindlaks tetrandriini täpne annusevahemik ja toime ARDN-rottidel.

Kokkuvõtteks võib öelda, et kaltsiumi signaaliradade reguleerimisel avaldas tetrandriin kalpaiini -1 ilmset inhibeerivat toimet, samas kui CsA mõjutas otseselt kaltsineuriini inhibeerimist. Need leiud viitavad sellele, et kombineeritud tetrandriin- ja CsA-ravi võib kliiniliste tulemuste parandamiseks mõjutada kaltsiumi signaaliülekandevõrgu mitut sihtmärki. Nende tähelepanekute kinnitamiseks ja sünergistlike mõjude mehhanismide selgitamiseks on vaja kinnitavaid uuringuid.

Lühendid

FSGS: fokaalne segmentaalne glomerulaarskleroos; MCD: minimaalse muutuse haigus; MN: membraanne nefropaatia; DKD: Diabeetneerudhaigus; TRPC6: mööduva retseptori potentsiaali katioonikanali valk 6; Ca2 pluss: kaltsium; TCM: klassikaline traditsiooniline hiina meditsiin; Tet: tetrandriin; CsA: tsüklosporiin A; Scr: seerumi kreatiniin; BUN: vere uriini lämmastik; PFR: töötleb fusioonikiirust; BM: alusmembraan; ADRN: adriamütsiinist põhjustatud nefropaatia; PLC: fosfolipaas C.

Viidatances

1. Garg P. Ülevaade podotsüütide bioloogiast. Olen J Nephrol. 2018;47 (lisa 1):3–13.

2. Khalilpourfarshbaf M, Hajiaghaalipour F, Selvarajan KK jt. Mesenhümaalsete tüvirakkudel põhinevad ravimeetodid podotsüütide kahjustuste vastu diabeetilise nefropaatia korral. Tissue Eng Regen Med. 2017;14:201–10.

3. Nagata M. Podotsüüdi vigastus ja selle tagajärjed. Kidney Int. 2016;89:1221–30.

4. Pavenstädt H, Kriz W, Kretzler M. Glomerulaarse podotsüütide rakubioloogia. Physiol Rev. 2003;83:253–307.

5. Riehle M, Büscher AK, Gohlke BO jt. TRPC6 G757D funktsiooni kadumise mutatsioon seostub FSGS-iga. J Am Soc Nephrol. 2016;27:2771–83.

6. Ilatovskaja DV, Blass G, Palygin O jt. NOX4 / TRPC6 rada podotsüütide kaltsiumi regulatsioonis ja neerukahjustuses diabeetilise neeruhaiguse korral. J Am Soc Nephrol. 2018;29:1917–27.

7. Reiser J, Polu KR, Möller CC jt. TRPC6 on glomerulaarse pilu diafragmaga seotud kanal, mis on vajalik normaalseks neerufunktsiooniks. Nat Genet. 2005;37:739–44.

8. Huang H, You Y, Lin X jt. TRPC6 signaaliraja pärssimine leevendab TGF- 1 poolt indutseeritud podotsüütide kahjustusi. Cell Physiol Biochem. 2017;41:163–72.

9. Verheijden KAT, Sonneveld R, Bakker-van Bebber M jt. Kaltsiumist sõltuv proteaas Calpain-1 seob TRPC6 aktiivsuse podotsüütide kahjustusega. J Am Soc Nephrol. 2018;29:2099–109.

10. Peltier J, Bellocq A., Perez J jt. Kalpaiini aktiveerimine ja sekretsioon soodustavad glomerulaarset vigastust eksperimentaalse glomerulonefriidi korral: tõendid kalpastatiini transgeensetelt hiirtelt. J Am Soc Nephrol. 2006;17:3415–23.

11. Tian X, Kim JJ, Monkley SM jt. Podotsüüdiga seotud taliin1 on glomerulaarfiltratsiooni barjääri säilitamiseks kriitiline. J Clin uurimine. 2014;124:1098–113.

12. Jiang L, Ding J, Tsai H jt. Mööduva retseptori potentsiaali katioonikanali 6 üleekspresseerimine podotsüütides kutsub esile tsütoskeleti ümberkorraldamise rakusisese Ca2 pluss ja RhoA aktivatsiooni suurenemise kaudu. Exp Biol Med (Maywood). 2011; 236:184–93.

13. Liu X, Zhou QG, Zhu XC jt. Fangji Huangqi tangi potentsiaalsete aktiivsete komponentide sõelumine nefrootilise sündroomi ravis, kasutades integreeritud metaboloomikat, mis põhineb "keemiliste ja metaboolsete profiilide vahel". Front Pharmacol. 2019; 10:1261.

14. Liu KC, Lin YJ, Hsiao YT jt. Tetrandriin kutsub esile apoptoosi inimese nina-neelu kartsinoomi NPC-TW 039 rakkudes endoplasmaatilise retikulumi stressi ja Ca2 pluss / Calpain radade kaudu. Anticancer Res. 2017;37:6107–18.

15. Wang YJ, He LQ, Sun W jt. Traditsioonilise hiina meditsiini optimeeritud projekt kroonilise neeruhaiguse ravis 3. etapis: mitmekeskuseline topeltpime randomiseeritud kontrollitud uuring. J Etnopharmacol. 2012;139:757–64.

16. Yu J, Zhu C, Yin J et al. Tetrandriin pärsib mööduvat retseptori potentsiaali katioonikanali valgu 6 üleekspressioonist põhjustatud podotsüütide kahjustust RhoA / ROCK1 signaaliülekande blokeerimise kaudu. Drug Des Devel Ther. 2020;14:361–70.