Kaltsitriooli vananemisvastase toime uuring inimese looduslikele tapjarakkudele in vitro

ABSTRAKTNE

Laialdaselt arvatakse, et D-vitamiinil on immuunsüsteemi reguleeriv toime. Mõned kliinilised uuringud on näidanud, et nõudlusD-vitamiini sisaldus suureneb koos vanusega. Kaltsitriool on selle bioloogiliselt aktiivne vormD-vitamiini. Selle mõju inimese loomulikele tapjarakkudele (NK) jääb aga ebaselgeks. Seetõttu uurisime selles uuringus kaltsitriooli vananemisvastast ja immunomoduleerivat toimet NK-rakkudele, kasutades mitmeid immunoloogilisi meetodeid, et uurida selle olulist rolli kaasasündinud immuunsuses. Leidsime, et kaltsitriool muutis vananemisega seotud biomarkerite ekspressiooni NK-rakkudes ja pärssis nende laienemist, hoides neid rakke G1-faasis ilma apoptoosi ja kurnatuseta. Kaltsitriool pärssis põletikuga seotud tsütokiinide, nagu interleukiin-5 (IL-5), interleukiin-13 (IL-13), gamma-interferoon (IFN-), vabanemist. ja kasvaja nekroosifaktor-alfa (TNF-). Kaltsitriool vähendas NK-rakkude degranulatsiooni, kui neid rakke kasvatati koos K562 kasvajarakkudega. Samuti leidsime, et kaltsitriool reguleeris üles vananemisega seotud sirtuiini 1- valgu/kinaasi R-sarnase endoplasmaatilise retikulumkinaasi (SIRT1/pERK) rada ja SIRT1-deltaExon8 (SIRT1-∆Exon8) ekspressiooni. aktiveerides D-vitamiini retseptori (VDR). Lisaks võib kaltsitriool olla NK-rakkude potentsiaalne negatiivne regulaatorapoptoosjamitokondriaalne inaktiveeriminemis on põhjustatudoksüdatiivne stress. Seega kaltsitriool eksponeeribvananemisvastane toimeinimese NK-rakkudele in vitro, aktiveerides SIRT1-PERK-telje jaoksüdatiivse vananemise vastu.

Cistanche vananemisvastaste toidulisandite hankimiseks klõpsake siin

1. Sissejuhatus

Paljud uuringud on leidnud, et vananemine avaldab otsest mõju mitmetele haigustele, nagu nakkushaigused, südame-veresoonkonna haigused, neurodegeneratiivsed haigused, autoimmuunhaigused ja vähk. Organismi vananemisega kaasneb immuunsuse vananemine. Vananemise ühised tunnused hõlmavad peamiselt põletikulist vananemist koos kroonilise madala põletikuga [1], genoomi ebastabiilsust, valgu ekspressiooni tasakaalustamatust, mitokondriaalset inaktivatsiooni, rakkude vananemist ja muutusi rakkudevahelises suhtluses [2]. Kaasasündinud immuunsuse põhikomponendina mängivad NK-rakud olulist rolli nii infektsiooni- ja kasvajavastases toimes kui ka immuunsüsteemi reguleerimises [3]. NK-rakud võivad sihtrakud elimineerida otse või antikehast sõltuva rakulise tsütotoksilisuse (ADCC) kaudu, selle asemel, et avaldada antigeeni- või antikehaspetsiifilisi reaktsioone [4]. NK-rakke seostatakse ka ülitundlikkusreaktsioonide ja autoimmuunhaigustega [5]. Immuunsüsteemi vananemisel ilmnevad pinnaaktivatsiooniretseptorid, nagu looduslik tapjarühma 2 liige D (NKG2D) [6], tapja immunoglobuliinitaoline retseptor (KIR), diferentseerumise pinnamarkerite klaster 57 (CD57) [7]. , suurenes diferentseerumise klaster 16 (CD16) [8]. See molekul võib aktiveerida NK-rakkude tapmisfunktsiooni, mis võib eakatel põhjustada rakkude tasakaalustamatust ja põletikku. Samal ajal vähenesid NK-rakkude inhibeerivad molekulid, nagu loodusliku tapja rühma 2 liige A (NKG2A), loodusliku tapja rühma 2 liige C (NKG2C) ja looduslikud tsütotoksilisuse retseptorid (NCR-id) [6]. Teised NK-rakkude vananemisega seotud markerid on T-raku immunoglobuliini ja mutsiini domeeni sisaldav valk 3 (TIM3) ning programmeeritud rakusurma -1 (PD-1) suurenemine. PD-1 ja TIM3 ülesreguleerimine immunosestsentsi ajal võib pärssida NK-rakkude funktsioone ja viia NK-rakkude ammendumiseni [9].

Teine immunosestsentsi põhjustav tegur on immuunpõletik [10]. On teatatud, et NK-rakkude poolt vabastatud põletikuliste tsütokiinide kõrge tase põhjustab DNA kahjustusi, oksüdatiivset stressi ja rakkude vananemist. Lisaks võib NK-rakkude rakuline tasakaalustamatus ja põletikuline seisund põhjustada autoimmuunhaigust [11]. Interleukiini-1 (IL-1), interleukiini-4 (IL-4), interleukiini-6 (IL-6), interleukiini tasemed -10 (IL-10) ja kasvaja nekroosifaktor-alfa (TNF-) on eakatel inimestel suurem [12]. Kuigi immuunrakkude koguarv vananedes vähenes, suurenes NK-rakkude populatsioon märkimisväärselt, mis võib olla põhjustatud põletikuliste rakkude infiltratsioonist [13].

D-vitamiin esineb inimkehas kahes aktiivses vormis: D2-vitamiin (ergokaltsiferool) ja D3-vitamiin (kaltsitriool). D-vitamiini peamine ülesanne on soodustada kaltsiumi ja fosfori imendumist. D-vitamiin reguleerib ka immuunfunktsioone [14]. Kuigi paljud aruanded on keskendunud selle infektsiooni- ja kasvajavastasele funktsioonile [15], on kaltsitrioolil ka põletikuvastane toime [16]. D-vitamiini retseptorit (VDR) ekspresseeritakse erinevatel immuunrakkudel [17]. Põletikuliste tsütokiinide tootmise vähenemine aitab kaasa põletikuliste reaktsioonide vähenemisele. Kaltsitriool pärsib teadaolevalt TNF-i, interleukiini-1 (IL-1), interleukiini-2 (IL-2), gamma-interferooni (IFN-) ja muud põletikulised tsütokiinid B- ja T-rakkudes. Samuti võib see vabastada põletikuvastaseid tsütokiine nagu IL-4 ja IL-10 [18] ning reguleerida autofagiat põletikuliste rakkude infiltratsiooni vastu [19].

Kaltsitriooli antioksüdantsetest omadustest on teatatud depressiooni, rasvmaksa [20], südame-veresoonkonna haiguste ja muude põletikuga seotud haiguste korral. Vananemise käigus kogunevad rakkudesse ja kudedesse ka vabad radikaalid ja reaktiivsed hapniku liigid (ROS). Avaldatud andmed on näidanud, et oksüdatiivne stress mõjutab rakkudes mitmesuguseid signalisatsiooniteid [21], sealhulgas SIRT1, mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaasi (MAPK) ja tuumafaktor-KB (NF-κB) radu. SIRT1 geeni peetakse pikaealisuse geeniks ja selle geeni allasurumine põhjustab valgu ekspressiooni, rakutsükli ja ainevahetusega seotud häireid [22]. SIRT1-ΔExon8 on SIRT1 uudne isovorm, mis eksisteeris imetajatel alternatiivse splaissimise teel. SIRT1-ΔExon8 peeti ka täispika SIRT1 kaasreguleerivaks teguriks [23].

Seni on väga vähesed uuringud keskendunud vananemise ja oksüdatiivse vananemise mõjudele NK-rakkudele. Kaltsitriooli mõjust SIRT{0}}ΔExon8-le ei ole samuti teatatud. Seetõttu oli selle uuringu eesmärk uurida kaltsitriooli mõju NK-rakkude vananemisele ja oksüdatiivsele vananemisele, kuna need rakud on inimese kaasasündinud immuunsüsteemis kesksel kohal.

2. Materjalid ja meetodid

2.1 Rakukultuur ja reaktiivid

Kolm inimese perifeerset vereproovi saadi doonoritelt, kellel ei olnud ühtegi aktiivset autoimmuunhaigust, ägedat või kroonilist põletikulist haigust, vähki ega muid immuunsüsteemiga seotud haigusi. Doonorite vanus jäi vahemikku 48–65 aastat. Perifeerse vere mononukleaarsed rakud (PBMC-d) eraldati Lymphoprep Ficolli abil. NK-rakke laiendati ja hoiti NK rakukultuuri komplekti (MoreCell, Shenzhen, Hiina) abil temperatuuril 37 kraadi / 5 protsenti CO2.

2.2 Voolutsütomeetriline analüüs

Pärast 72-tunnist töötlemist kaltsitriooliga värviti NK-rakud anti-inimese FITC-CD3, PerCp-CD56, APC-CD16, PE-NKG2A, PE-TIM3, PE-PD1 ja PE-KIR-ga (BioLegend, California, USA). Kõik FACS-testid viidi läbi DxFLEX voolutsütomeetriga (Beckman, California, USA).

2.3 Rakkude laienemise mõõtmine, tsütokiinide vabastamise ja rakutsükli analüüs

Rakkude laienemine määrati rakkude loenduskomplekti-8 [24] (CCK8; Beyotime, Shanghai, Hiina) abil. NK-rakke töödeldi kaltsitriooliga 48 tundi ja supernatant koguti tsütokiini vabastamise testi jaoks. Tsütokiinide taset uuriti LEGEND Plex Human Inflammation Panel (BioLegend, California, USA) abil. Esiteks inkubeeriti tsütokiinide püüdmise helmeid koos standardite või proovidega ja seejärel inkubeeriti täiendavalt biotinüülitud tuvastamisantikehadega. Seejärel lisati fluorestsentssignaali saamiseks biotinüülitud detekteerimisantikehi siduv lahus streptavidiin (SA)-PE [25]. Seejärel analüüsiti neid signaale FACS-testi abil.

Rakutsüklit mõõdeti Cell Cycle Detection Kit (Beyotime, Shanghai, Hiina) abil. NK-rakke töödeldi kaltsitriooliga 72 tundi. Need rakud fikseeriti 70-protsendilises jääkülmas etanoolis ja värviti seejärel ribonukleaas A (RNaas A) ja propiidiumjodiidiga (PI) (Beyotime, Shanghai, Hiina) [26].

2.4 NK-rakkude tapmise test

Inimese erütroleukeemilisi rakke, K562 rakke (ATCC, Virginia, USA), inkubeeriti 10 uM 3,3 -dioktadetsüüloksakarbotsüaniiniga (DIOBeyotime, Shanghai, Hiina) 15 minutit ja lisati seejärel kaltsitriooliga töödeldud NK-rakkudele. erinevatel suhetel (E/T'=1:1, 5:1 ja 10:1) vastavalt 4 tunni jooksul (27]).

2.5 Oksüdatiivse vananemise induktsiooni ja X-gal värvimise analüüs

In vitro NK-rakkude vananemise mudel, kasutades vesinikperoksiidi (H2O2). Kaltsitriooli antioksüdatsioonivastase toime määramiseks töödeldi NK-rakke esmalt kaltsitriooliga ja seejärel eksponeeriti 24 tunniks 100 μM H2O2-ga. -galaktosidaasi aktiivsust mõõdeti 5-bromo-4-kloro-3-indolüül- -D-galaktopüranosiidi (X-gal) värvimisega. Töödeldud rakud fikseeriti 4% paraformaldehüüdis ja värviti -galaktosidaasi värvimislahusega (Beyotime, Shanghai, Hiina) üleöö temperatuuril 37 kraadi [28]. Seejärel suspendeeriti värvitud rakud PBS-is ja nende rakkude kujutised saadi Leica fluorestsents-inversioonmikroskoobi süsteemi abil. Iga rühma jaoks koguti erinevatest positsioonidest juhuslikult kolm mikroskoopilist pilti 40-kordse suurendusega. X-gal värvitud rakkude protsent arvutati ja seda kasutati rakkude vananemise hindamiseks, kasutades ImageJ tarkvara V.1.45S.

2.6 Mitokondriaalse membraani potentsiaali värvimine ja analüüs

Mitokondriaalse membraani potentsiaali hindamiseks kasutati klorometüül-X-rosamiini (CMXRos) ja Hoechsti (Beyotime, Shanghai, Hiina). Rakkude tuumad (sinine) määrati Hoechsti värvimisega, samas kui mitokondriaalse membraani potentsiaal määrati mitokondriaalse spetsiifilisuse järgi, mis tähistas fluorestsentsvärvi CMXRos. Hoechst pluss CMXRos-rakud (tähistatud valgete nooltega) näitasid madalat aktiivsust. Suhteline fluorestsentsi tase arvutati, jagades Hoechsti-positiivsete rakkude arvu CMXRos-positiivsete rakkudega [29]. Rakke inkubeeriti 200 nM CMXRos ja Hoechstiga (30 min, 37 kraadi) ja tuvastati Leica pöördmikroskoobiga ergastuslainepikkustel 579 nm ja 350 nm. Hoechst pluss CMXRos pluss rakkude protsent arvutati jaotises 2.5 kirjeldatud viisil.

2.7 Western blot meetod

Rakud lüüsiti radioimmunosadestamise testi (RIPA) lüüsipuhvriga (Beyotime, Shanghai, Hiina) koos fosfataasi inhibiitoriga PhosSTOP (Roche, Basel, Šveits) ja 1 µM fenüülmetüülsulfonüülfluoriidiga (PMSF) (Beyotime, Shanghai, Hiina). Kogu valk kvantifitseeriti, kasutades Bradford Protein Assay Kit (TAKARA, Tokyo, Jaapan). Valguproovid eraldati naatriumdodetsüülsulfaat-polüakrüülamiidi geelelektroforeesiga (SDS-PAGE) ja kanti üle 0,22 μm polüvinülideenfluoriid- (PVDF) membraanidele (Immobilon-P membraan; Millipore, Massachusetts, USA). Pärast blokeerimist testiti membraane primaarsete antikehadega ja inkubeeriti sekundaarsete antikehadega [30]. Membraanid tuvastati Odyssey süsteemi abil (LI-COR, Nebraska, USA).

2.8 Statistiline analüüs

Andmeid analüüsiti ühesuunalise dispersioonanalüüsiga (ANOVA), kasutades GraphPad Prism ja esitati kui keskmine ± standardhälve (SD). 6846 W. LI ET AL.Erinevusi peeti statistiliselt olulisteks, kui P < 0,05. Tulemusi analüüsiti ka GraphPad tarkvara abil.

Küsi lisa:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: pluss 86 15292862950