Vananemisvastaste omaduste ja mehhanismi võrdlev uuring: resveratrool ja kalorite piiramine Ⅱ

Resveratrooli ja CR mõju SIRT1, p53 ja Foxo3a mRNA ekspressioonidele vananevate rottide kudedes

Oksüdatiivsed stressitingimusedindutseerivad sageli SIRT1 ekspressiooni ja aktiivsust. SIRT1 moduleerib peamiste ellujäämistegurite, sealhulgas p53 ja Foxo3a funktsioone [9]. Resveratrooli ja CR mõju määramiseks SIRT1, p53 ja Foxo3a mRNA tasemetele D-Gal-indutseeritud vananevatel rottidel viidi läbi kvantitatiivsed RT-PCR testid. Võrreldes vastava negatiivse kontrollrühmaga olid SIRT1 ja Foxo3a mRNA ekspressioonitasemed oluliselt langenud, kuid p53 tase tõusis oluliselt D-Gal rühmas (P < 0.01; joonis 9A ja 9B). Lisaks põhjustas samaaegne ravi resveratrooli või CR-ga D-gal-iga rottidel SIRT1 ja Foxo3a mRNA ekspressioonide taseme tõusu, kuid vähendas p53 taset võrreldes mudelkontrollrühmaga (P < 0,05). Kuid võrreldes CR-raviga suurenes SIRT1 mRNA ekspressiooni tase märkimisväärselt resveratrooli ja D-gal rühma suurte annuste maksades, p53 mRNA ekspressiooni tase vähenes märkimisväärselt maksades ja ajus, kasutades suures annuses resveratrooli pluss D-gal. gal rühm (P < 0,05).

Cistanche vananemisvastaste toidulisandite hankimiseks klõpsake siin

Resveratrooli ja CR mõju peamise SIRT{0}}seotud valgu ekspressioonile vananevate rottide ajukoes

FOXO3a ja p53, mida reguleerib SIRT1, on SIRT1 allavoolu molekulid. Samal ajal reguleerivad SIRT1 aktiivsust selle ülesvoolu molekulid, näiteks DBC1 (tuntud ka kui KIAA1967), AROS (tuntud ka kui RPS19BP1) ja kasvaja supressor HuR (tuntud ka kui ELAVL1) [9, 10] . Resveratrooli ja CR mõju määramiseks p53, FOXO3a, HuR, AROS ja DBC1 valgu tasemele D-Gal-indutseeritud vananevatel rottidel viidi läbi Western blot testid. Võrreldes vastava negatiivse kontrollrühmaga olid FOXO3a, AROS ja HuR valgu ekspressioonide tasemed oluliselt langenud, kuid p53 ja DBC1 tasemed tõusid oluliselt D-gal rühmas (P < 0.01 ; joonis 10). Lisaks põhjustas samaaegne ravi resveratrooli või CR-ga D-gal-iga rottidel FOXO3a, AROS ja HuR valgu ekspressioonide suurenemist, kuid vähendas p53 ja DBC1 taset võrreldes mudelkontrollrühmaga (P <0, 05). Kuid võrreldes CR-raviga suurenes HuR valgu ekspressiooni tase märkimisväärselt, kuid DBC1 tase langes märkimisväärselt resveratrooli ja D-gal rühma suure annuse ajus (P <0, 05). Resveratrooli pluss D-gal rühma ja CR pluss D-gal rühma vahel ei olnud erinevusi p53, FOXO3a ja AROS valgu ekspressiooni tasemetes (P > 0,05).

FOXO3a ja p53 ekspressioonid aju- ja maksakudedes

FOXO3a ja p53 ekspressioonistaatus määrati aju- ja maksakudedes immunohistokeemia abil. FOXO3a ja p53 immunohistokeemiline analüüs näitas, et FOXO3a ekspressioon aju- ja maksakudedes oli oluliselt vähenenud ja p53 ekspressioon D-Gal rühmas oluliselt suurenenud, võrreldes negatiivse kontrollrühmaga (P < 0.{13} }5, joonis 11). Lisaks põhjustas samaaegne ravi resveratrooli või CR-ga D-gal-iga rottidel FOXO3a ekspressiooni suurenemist, kuid vähendas p53 ekspressiooni võrreldes mudelkontrollrühmaga (P < 0,05). Siiski ei olnud p53 ja FOXO3a ekspressioonides erinevusi resveratrooli pluss D-gal rühma ja CR pluss D-gal rühma vahel (P > 0, 05).

ARUTELU

Vananemise aluseks oleva keemilise põhiprotsessi arendas esmakordselt edasivabade radikaalide vananemise teooria[11] jaoksüdatiivne stressArvatakse, et see on normaalse vananemisprotsessi peamine tegur.Vabade radikaalide initsiaator AAPHoli harjunudesile kutsuda oksüdatiivset stressija luua oksüdatiivse mudeli mudelstressist põhjustatud rakkude vananemineinimese IMR-90 rakkudes [12, 13]. Selle meetodi eelised on, et AAPH laguneb termiliselttekitavad radikaaleilma biotransformatsioonide või ensüümideta ning kiirusradikaalne põlvkondsaab kergesti kontrollida initsiaatori kontsentratsiooni reguleerimisega [12]. AAPH leitipärssida inimese vohamistIMR- 90 rakud kontsentratsioonist ja ajast sõltuval viisil. Tulemused näitasid, et 2-päevane inkubeerimine AAPH-ga (1 mM) suurendas märkimisväärselt SA-Gal positiivse suhte protsenti, apoptootiliste rakkude populatsiooni, vähendas SIRT1 mRNA ekspressiooni ja kutsus esile laienenud ja lamestunud morfoloogia. Need näitasid, et AAPH-st põhjustatud oksüdatiivne stress viis IMR-90 rakkude vananemiseni. Selle rakulise vananemismudeli põhjal inhibeeris 10 μM resveratrooli ravi AAPH-indutseeritud vananemist ja apoptoosi tõhusamalt kui CR-ravi.

D-gal loomamudel on rahvusvaheliselt tunnustatud vananeva looma mudel ja seda on laialdaselt kasutatudvananemisvastased ravimid. D-gal on füsioloogiline toitaine, mis metaboliseeritakse loomadel tavaliselt D-galaktokinaasi ja galaktoos-1-fosfaadi poolt. Kuid D-gal-i ülepakkumine, mis ei metaboliseeru ülalnimetatud ensüümide poolt, vaid koguneb rakkudesse, põhjustab oksüdatiivset stressi ja rakukahjustusi [14]. Seega kutsub D-gal pikaajaline manustamine esile muutusi, mis meenutavad loomadel loomulikku vananemist, nagu lühenenud eluiga, kognitiivsed düsfunktsioonid, neurodegeneratsioon, oksüdatiivne stress, immuunvastuste vähenemine ja arenenud glükatsiooni lõppprodukti (AGE) moodustumine [15]. Käesolev uuring näitas mimeetilise vananemismudeli edukat loomist, mida tõendavad märkimisväärsed õppimis- ja mäluhäired, MDA tootmine, lipofustsiini akumulatsioon, T-AOC ja SOD langus ning telomeraasi aktiivsuse vähenemine ajus. Vahepeal kaitsesid resveratrooli või CR-ravi D-gal-indutseeritud rotte oksüdatiivse stressi eest, tõstes antioksüdantsete ensüümide aktiivsust, vähendades lipiidide peroksüdatsiooniproduktide taset ning hoides oksüdatiivsete ja antioksüdatiivsete süsteemide tasakaalu. Käitumis- ja telomeraasi aktiivsuse testides võib resveratrooli või CR-i ravi muuta D-gal-indutseeritud kognitiivse kahjustuse ja telomeraasi aktiivsuse. Lisaks näitasid resveratrooli suurte annustega ravitud vananevad mudelrotid käitumisele suhteliselt olulisemat mõju kui CR-ga ravitud rotid.

Joonis 11: p53 (A, B) ja FOXO3a (C, D) ekspressioonide immunohistokeemiline analüüs vananevate rottide maksas (A, C) ja ajukoes (B, D). Suurendus oli 20×. NG, negatiivne kontrollrühm; MG, mudeli kontrollrühm; RESL, madala annusega resveratrooli rühm; RESH, suur annus resveratrooli rühma; CR, kaloripiirangu rühm

Uuringud on näidanud, et CR ehk toitainerikka dieedi tarbimise vähendamine 10–40 protsenti võibaeglustada vananemist ja pikendada eluiga, seega rakendati käesolevas uuringus CR rühma rottidel üht tavaliselt kasutatavat CR taset (toidu tarbimise vähendamine 40 protsenti). Sellegipoolest näitasid mõned uuringud, et CR-il ei ole looduslikult vananenud primaatide pikaealisusele kasulikku mõju [16]. Sarnaselt, kuigi resveratrooli ravi indutseerib CR-sarnaseid toimeidenergia metabolismja metaboolne profiil rasvunud inimestel [17], ei parandanud see metaboolset funktsiooni normaalse glükoositaluvusega mitterasvunud naistel [18]. Nende uuringute vaheliste erinevuste põhjus ei ole selge, kuid võib olla, et CR ja resveratrool aitavad taastada homöostaasi metaboolselt kahjustatud inimestel ja vähem tervetel inimestel, mis on kooskõlas SIRT1 teadaolevate funktsioonidega loomkatsetes [19]. Seetõttu kasutati resveratrooli või CR vananemisvastase toime võrdlemiseks looduslikult vananenud rottide mudeli asemel D-gal-indutseeritud vananemisrottide mudeleid.

SIRT1, (NAD pluss) sõltuv deatsetülaas, on pälvinud palju tähelepanu, kuna sellel on mitu rolli eluea pikendamisel, stressiresistentsusel ja apoptoosi vähendamisel [20, 21]. Kuhjuvad uuringud on kindlalt viidanud sellele, et SIRT1 oli resveratrooli ja CR peamine sihtmärk [22]. Seal on suur hulk SIRT1 allavoolu molekule, sealhulgas p53, Foxo1, Foxo3, Foxo4 ja E2F1, mida reguleerib SIRT1. Samal ajal reguleerivad SIRT1 aktiivsust selle ülesvoolu molekulid, näiteks p53, HIC1, E2F1, DBC1, HuR ja AROS. Äge toitainete ärajätmine aktiveerib SIRT1 promootoris transkriptsiooniprogrammi, mida juhivad transkriptsioonifaktorid Foxo3a ja p53. Kuna p53 represseerib SIRT1 geeniekspressiooni, aktiveerib selle eemaldamine Foxo3a poolt SIRT1 transkriptsiooni [23]. DBC1 ja AROS kirjeldati hiljuti vastavalt SIRT1 aktiivsuse otseste negatiivsete ja positiivsete regulaatoritena, HuR näitab SIRT1 ekspressioonitaseme vähendamise mõju vananenud vananevates rakkudes [9, 10].

CRaeglustab vananemist ja pikendab keskmist ja maksimaalset eluigamitmesugustel liikidel, sealhulgas rottidel, hiirtel, kaladel, kärbestel, ussidel ja pärmseentel. Sellised ranged toitumisprogrammid vabalt elavatel inimestel on aga tõstatanud eetilisi ja metoodilisi probleeme [24]. Praegu võib tervisliku eluea pikendamine olla olulisem kui lihtsalt eluea pikendamine. Hiljutised uuringud näitavad, et resveratrool on kõigi taimede polüfenoolide hulgas üks tugevamaid SIR2 aktiivsuse esilekutsujaid [25] ja see mõjutab pikaealisust sarnaste mehhanismide kaudu, nagu on näha kaloripiirangus. Need tulemused näitasid, et CR-l ja resveratroolil oli sarnane toime SIRT1 mRNA ekspressioonitaseme taastamisel, FOXO3a, AROS ja HuR valgu ekspressiooni suurendamisel ning p53 ja DBC1 taseme vähendamisel. Samal ajal näitavad mitmed veenvad tõendid resveratrooli kasulikku mõju neuroloogilisele, maksa- ja kardiovaskulaarsüsteemile.

MATERJALID JA MEETODID

Rakukultuur, stress ja ravi

Inimese diploidne fibroblasti tüvi IMR-90 saadi ATCC-st. Rakke kasvatati minimaalses essentsiaalses söötmes (MEM) (Gibco, UK), millele oli lisatud 10 protsenti veiseloote seerumit (FBS) (Gibco) 37 kraadi juures 5 protsendilise CO2 atmosfääris. Pärast liitumise saavutamist külvati rakud 6-süvendiga kultiveerimisplaatidele. Üks päev hiljem töödeldi rakke 48 tundi 1 mM 2,2'-asobis(2-amidinopropaan)divesinikkloriidiga (AAPH) (Sigma, USA), mis oli lahjendatud MEM-is pluss 10 protsenti FBS-is. 48-tunnine inkubeerimine vabade radikaalide initsiaatoriga AAPH loob oksüdatiivse stressi poolt indutseeritud raku vananemise mudeli [12, 13]. Kontrollrakke inkubeeriti ainult söötmes. Pärast AAPH-ga töötlemist pesti IMR-90 külma fosfaatpuhversoolaga (PBS) pH 7,4 ja inkubeeriti värske söötmega või söötmega, mis sisaldas resveratrooli (resveratrooli rühm) või MEM-i, millele oli lisatud 3 protsenti FBS-i (CR rühm). lisaks 48 tundi enne saagikoristust.

SA -gal värvimisaktiivsus

Kontrolliti vananemise biomarkerite ilmumist (proliferatiivse potentsiaali vähenemine ja SA-gal-värvimise suurenemine) [26] alates ravijärgsest päevast. Seejärel värviti rakud, järgides SA-gal värvimiskomplekti (CST, USA) tootja juhiseid. Pärast värvimist uuriti mitmel väljal vähemalt 300 rakku ja loendati SA-gal-positiivsed rakud. Neid katseid korrati kolm korda ja tulemused esitati keskmiste väärtustena standardhälbetega (SD). Võimalikult rakkude konfluentsusest tingitud mittespetsiifilise värvumise vältimiseks viidi läbi SA-gal histokeemiline värvimine subkonfluentsete rakkudega.

Skaneeriv elektronmikroskoopia analüüs

Rakke kasvatati ülalkirjeldatud viisil 6-süvendiga kultiveerimisplaatidel katteklaasidel. Pärast resveratrooli ja CR-i töötlemist eemaldati plaatidelt katteklaasid, seejärel fikseeriti rakud 2,5-protsendilises fosfaatpuhverdatud glutaaraldehüüdis ja fikseeriti 1-protsendilises puhverdatud osmiumtetroksiidis. Fikseeritud proovid sukeldati t-butüülalkoholi pärast dehüdraatimist läbi sorteeritud etanooli seeria. Proovid külmkuivatati t-butüülalkoholist, seejärel kaeti aurustuskihiga kullaga, kasutades automaatset peenkatet (JFC-1600, JEOC, Jaapan) ja uuriti skaneeriva elektronmikroskoobiga (JEOL, JSM{11}). }LV, Jaapan).

Apoptootiline analüüs

Pärast resveratrooli või CR-i inkubeerimist koguti kõik rakud trüpsiiniga ja pesti kaks korda PBS-iga, seejärel resuspendeeriti 400 µl anneksiin V sidumispuhvris. Seejärel värviti rakud, järgides anneksiin V-FITC raku apoptoosi tuvastamise komplekti (BestBio, Hiina) tootja juhiseid. Fluorestsentsi tuvastamiseks kasutati FACSCaliburi voolutsütomeetrit (Becton-Dickinson, San Jose, CA) ja apoptootiliste rakkude protsent arvutati FACSCaliburi sisemise tarkvarasüsteemi abil. Iga jälje jaoks analüüsiti ligikaudu 104 rakku.

Loomade protseduurid

Isased albiino Wistari rotid, kes kaalusid ligikaudu 200 ± 10 g, saadi Huazhongi teadus- ja tehnoloogiaülikooli Tongji meditsiinikolledži katseloomade keskusest (SCXK 2010-0009). Loomi aklimatiseeriti 2 nädalat enne annustamist Hubei Hiina Meditsiiniülikooli katseloomade keskuses, selle aja jooksul oli neil vaba juurdepääs toidule ja veele ad libitum. Pärast aklimatiseerumist valiti välja 50 rotti ja jagati viide kümneliikmelisse rühma. Loomi hoiti vastavalt riiklikele juhistele ja protokollidele, mille on heaks kiitnud institutsionaalne loomade eetikakomitee (IAEC).

I rühma (negatiivne kontrollrühm) rotid said 6 nädala jooksul ainult kandjat (1 ml/kg kehamassi kohta 0,9 protsenti soolalahust). II rühma (mudeli kontrollrühm) rotid said 6 nädala jooksul D-gal (200 mg/kg kehakaalu kohta, Sigma Chemical, St. Louis, MO). III rühma (resveratrooli väike annus) rotid said 6 nädala jooksul D-gal ja resveratrooli (50 mg/kg kehamassi kohta), mis oli lahustatud 5% dimetüülsulfoksiidis (DMSO). IV rühma (suure annusega resveratrooli rühm) rotid said D-gal ja resveratrooli (100 mg/kg kehamassi kohta). V rühma (CR rühm) rotid said 6 nädala jooksul D-gal ja CR (toidetud dieediga, mis oli 40 protsenti madalam kalorsusega kui ad libitum toidetud rotid [27]). D-gal manustati intraperitoneaalselt, samas kui resveratrooli manustati suukaudselt kogu katse kestuse jooksul. Rotid surmati viimasel ravipäeval, seejärel koguti veri, seerumid ja elundid koheselt bioanalüüsiks või säilitati –80 kraadi juures hilisemaks kasutamiseks.

Käitumistestid

Morrise veelabürindi test oli mõeldud selleks, et hinnata rottide ruumilise õppimise ja mälu võimet pärast 6-nädalast vigastust [28]. Morrise veelabürindi test koosnes 4-päevasest õppimisest ja mälutreeningust ning sondikatsest 5. päeval. Loomi treeniti visuaalsete näpunäidetega ringikujulises basseinis (läbimõõt 155 cm). Evakuatsiooniplatvorm (diameetriga 9.0 cm) sukeldus 1.0 cm sügavusele basseini veepinnast, mille temperatuur hoiti 25 ± 2 kraadi. Platvormi asukoht püsis kogu 4-päevase treeningperioodi vältel loodekvadrandi keskel. Igal päeval treeniti rotte üheks hommikuks ja üheks pärastlõunaseks blokiks. Rott ujus vabalt, kuni leidis platvormi 120 sekundi jooksul. Ebaõnnestumise korral asetati see 10 sekundiks platvormile. Registreeriti põgenemise latentsus (vee all oleva evakuatsiooniplatvormi leidmine) ja ujumiskiirus. Sondikatse viidi läbi, eemaldades platvormi ja lastes igal rotil basseinis 120 sekundit vabalt ujuda. Platvormiületuste arv treenitud kvadrandis (kus platvorm eemaldati) registreeriti arvutipõhise videosüsteemiga. Veelabürindi nähtavat platvormi versiooni ei tehtud pärast seda, kui D-gal ja vehiikuliga ravitud rottide ujumiskiiruses täheldati olulist erinevust.

Oksüdatiivse stressiga seotud bioloogiliste näitajate tuvastamine

MDA, SOD ja T-AOC tasemed veres ja kudedes määrati fotomeetriliselt vastavalt tootja protokollile, kasutades kaubanduslikult saadavaid ensümaatilise analüüsi komplekte (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing City, PR Hiina). Kõik selles osas kirjeldatud katsed viidi läbi kolmes eksemplaris, et saada keskmised ja SD.

Lipofustsiini tase määrati Sohali meetodil [29]. Lühidalt, kaalusime 200 mg ajukoore, lisasime 2 ml kloroformi-metanooli (2:1) ekstrakti, homogeniseerisime ja filtreerisime, seejärel pesti jääki ekstraktiga, ühendasime filtraadid, lisasime ekstrakti 5-le. ml ja mõõdeti fluorestsentsi intensiivsust fluorestsentsspektromeetril. Emissiooni lainepikkus oli 435 nm ja ergastuse lainepikkus 365 nm. Spektrofluoromeeter standardiseeriti, et anda kiniini bisulfaadi 1 ug/ml lahusega 0,1 M H2S04-s ülaltoodud lainepikkustel läbipaine 50. Tulemused väljendati suhteliste fluorestsentsühikutena/ml kloroformi/g niiske koe massi kohta.

TE aktiivsuse tuvastamine

Telomeraasi ekstraheerimiseks pesti ligikaudu 30 mg kudet kaks korda jääkülmas PBS-is ja lõpuks homogeniseeriti ligikaudu 150 ml PBS-is. TE aktiivsust mõõdeti TE ELISA komplektide abil vastavalt tootja juhistele (Nanjing Sen Beijia Biological Technology Co., Ltd., Nanjing, Hiina). Analüüside tundlikkuse piirid olid TE puhul 0,8 IU/L.

RT-PCR analüüs

SIRT1, Foxo3 ja p53 mRNA ekspressioonitasemeid maksas ja ajukoes analüüsiti RT PCR analüüsi abil. Kogu RNA ekstraheeriti Trizoliga ning nende kogust ja puhtust hinnati ultra-mikrospektrofotomeetriga (Thermo Fisher Scientific, USA) neeldumise mõõtmise põhjal 260 ja 280 nm juures. Pärast kvantifitseerimist sünteesiti cDNA, kasutades FastQuant RT komplekti (Tiangen Biotech, Peking, Hiina) vastavalt tootja juhistele. SIRT1, Foxo3, p53 mRNA ekspressioonitasemeid mõõdeti RT-PCR abil, kasutades TIANGEN SuperReal PreMix Plus (Tiangen Biotech, Peking, Hiina) spetsiifiliste praimeritega (tabel 2). Kvantitatiivne reaalajas PCR viidi läbi LightCycler 480 kraadi PCR süsteemiga (Roche, Basel, Šveits), kasutades iga reaktsiooni kogumahuna 20 μL. PCR-i amplifikatsioon käivitati 15-minutise denatureerimisega 95 kraadi juures ja seejärel 40 tsüklit 95 kraadi juures 10 sekundit, 59–63 kraadi juures (anniilimistemperatuur) 20 sekundit ja 72 kraadi juures 30 sekundit ning lõpliku inkubeerimisega 72 kraadi juures. kraadi 5 min. Iga geeni saadud tsükli läviarv (Ct väärtus) normaliseeriti suhteliste muutuste kordadeks vastavalt 2-∆∆CT meetodi võrrandile [30].

Tabel 2: Aabitsate loend

Western blot analüüs

P53, FOXO3a, HuR, RPS19BP1 ja DBC1 valgu ekspressioonitasemeid ajukoes analüüsiti Western blot analüüsi abil. Ajukudede koguvalk ekstraheeriti RIPA lüüsipuhvriga (Beyotime, Hiina) vastavalt tootja juhistele. Valgu kontsentratsioonid määrati BCA Protein Assay Kit (Beyotime, Hiina) abil. 5 mg valke eraldati 12% SDS-polüakrüülamiidgeelide abil ja kanti PVDF membraanile (0.45 μm, Millipore, USA). Blotid blokeeriti 5% rasvavaba piimaga TBS-is, seejärel inkubeeriti üleöö 4 kraadi juures primaarsete antikehade sobiva lahjendusega: anti-p53 (SC- 6243, Santa Cruz Biotechnology), anti-FOXO3a (#12829, Cell). Signaalitehnoloogia), anti-HuR (#12582, rakusignaalitehnoloogia), anti-AROS (Ab201091, abcam), anti-DBC1 (#5857, rakusignaalitehnoloogia), anti-- - toime (AC004, ABklonaalne tehnoloogia) . Pärast membraanide pesemist liigsete primaarsete antikehade eemaldamiseks inkubeeriti membraane 1 tund toatemperatuuril koos sobivate sekundaarsete antikehadega lahjenduses 1:2000-1:5000 (AC004 või AS003, ABclonal Technology). Membraanid pesti 3 korda ja seejärel visualiseeriti kasutades Pierce ECL Western Blotting Substrate (Thermo Scientific). -tegevust kasutati sisekontrollina.

Immunohistokeemia

Koeproovid fikseeriti 10-protsendilises neutraalses puhverdatud formaliinis 1 tunni jooksul pärast kirurgilist eemaldamist ja manustati parafiiniga, kasutades standardseid protseduure. Seejärel lõigati fikseeritud parafiiniga manustatud proovid 5- μm paksusteks osadeks, mis deparafineeriti ksüleenis, rehüdreeriti etanoolis ja töödeldi mikrolaineahjus antigeeni leidmiseks. Sobivalt lahjendatud primaarset antikeha anti-p53 (SC-6243, Santa Cruz Biotechnology) ja anti-FOXO3a (#12829, Cell Signaling Technology) inkubeeriti 60 minutit toatemperatuuril niiskuskambris. Seejärel loputati slaidid PBS-is ja inkubeeriti seejärel küülikuvastase antikeha vastase sekundaarse antikehaga ja HRP visualiseerimisega (kontsentratsioon 1:300, #074-1506, KPL). Seejärel slaidid pesti ja lõigud töötati välja ensüüm-substraadi diaminobensidiini (DAB, Sigma) lahuses. Immunohistokeemiliselt värvitud lõikude kujutised jäädvustati Olympuse digitaalmikroskoobiga (IX-73P1F, Olympus, Jaapan).

Statistiline analüüs

Tulemused väljendati keskmistena ± SD vähemalt kolme sõltumatu katse kohta ja neid analüüsiti tarkvara SPSS 18.{1}} abil. Morrise veelabürindi treeningülesande põgenemislatentsi ja ujumiskiiruse erinevusi analüüsiti kahesuunalise dispersioonanalüüsi (ANOVA) abil korduvate mõõtmistega, kusjuures teguriteks olid ravi- ja treeningpäev. Ülejäänud andmeid analüüsiti ühesuunalise ANOVA abil, millele järgnes post-hoc Tukey test. P väärtust alla 0,05 peeti oluliseks.

JÄRELDUSED

Resveratroolil ja CR-l oli sarnane vananemisvastane toime nii in vitro kui ka in vivo, mida tõendab nende võime inhibeerida AAPH-indutseeritud vananemist ja apoptoosi ning taastada D-gal manustamisest põhjustatud vanusega seotud kognitiivsed häired. Nende vananemisvastased mehhanismid hõlmasid TE aktiivsuse ülesreguleerimist, oksüdatiivsete kahjustuste vähendamist ja SIRT1 raja reguleerimist. Üldiselt avaldasid 10 μM resveratrooli in vitro ja suures annuses resveratrooli in vivo suhteliselt tugevamat vananemisvastast ja stimuleerivat SIRT1 taset. Need tulemused viitasid resveratrooli potentsiaalile CR-i mimeetikumina.

Lühendid

AAPH, 2,2'-asobis(2-amidinopropaan)divesinikkloriid; AMPK, adenosiinmonofosfaadiga aktiveeritud proteiinkinaas; ANOVA, dispersioonanalüüs; AROS, SIRT1 aktiivne regulaator; CR, kalorite piirang; DBC1, kustutatud rinnavähi 1 korral; D-gal, D-galaktoos; FBS, veiseloote seerum; Foxo3a, kahvlipea kast 3a; HuR, Hu antigeen R; MEM, minimaalne oluline kandja; PBS, fosfaatpuhvri soolalahus; PGC-1, peroksisoomi proliferaatoriga aktiveeritud retseptori G koaktivaator-1; RES, resveratrool; SA-gal, vananemisega seotud -galaktosidaas; SD, standardhälbed; SIRT1, vaigistamise teabe regulaator; TE, telomeraas.

Autorite kaastööd

Uuringu kontseptsioon ja ülesehitus: Gang Chen; andmete hankimine, analüüs ja tõlgendamine: Juan Li, Xia Chun Zhang, Yi-Mei Liu; rahastamise saamine ja käsikirja kriitiline läbivaatamine intellektuaalse sisu jaoks: Gang Chen, Ke-Li Chen; käsikirja kirjutamine: Juan Li. Kõik autorid on selle käsikirja läbi lugenud ja selle avaldamise heaks kiitnud. TUNNUSTUS JA RAHASTAMINE

Seda tööd rahastas Hiina järeldoktorantuuri teadusfond (2016M601237), loodusteaduste fondi projekt (81373704, 30873292).

HUVIDE KONFLIKTID

Kõigi osalevate autorite huvide konflikti ei esine.

VIITED

1. Ramis MR, Esteban S, Miralles A, Tan DX, Reiter RJ. Kalorisisalduse piiramine, resveratrool ja melatoniin: SIRT1 roll ja mõju vananemisele ja sellega seotud haigustele. Mech Aging Dev. 2015; 146–148:28–41.

2. Colman RJ, Beasley TM, Kemnitz JW, Johnson SC, Weindruch R, Anderson RM. Kalorite piirang vähendab reesusahvide vanusega seotud ja igasuguste põhjuste suremust. Nat Commun. 2014; 5:3557.

3. Sohal RS, Weindruch R. Oksüdatiivne stress, kalorite piiramine ja vananemine. Teadus. 1996; 273:59–63.

4. Testa G, Biasi F, Poli G, Chiarpotto E. Kalorite piiramine ja toitumispiirangu mimeetikumid: tervisliku vananemise ja pikaealisuse parandamise strateegia. Curr Pharm Des. 2014; 20:2950–77.

5. Lane MA, Roth GS, Ingram DK. Kalorite piiramise mimeetikumid: uudne lähenemisviis biogerontoloogiale. Meetodid Mol Biol. 2007; 371:143–9.

6. Baur JA, Pearson KJ, Price NL, Jamieson HA, Lerin C, Kalra A, Prabhu VV, Allard JS, Lopez-Lluch G, Lewis K, Pistell PJ, Poosala S, Becker KG jt. Resveratrool parandab kõrge kalorsusega dieedil olevate hiirte tervist ja ellujäämist. Loodus. 2006; 444:337–42.

7. Lagouge M, Argmann C, Gerhart-Hines Z, Meziane H, Lerin C, Daussin F, Messadeq N, Milne J, Lambert P, Elliott P, Geny B, Laakso M, Puigserver P jt. Resveratrool parandab mitokondriaalset funktsiooni ja kaitseb ainevahetushaiguste eest, aktiveerides SIRT1 ja PGC-1alfa. Kamber. 2006; 127:1109–22.

8. Howitz KT, Bitterman KJ, Cohen HY, Lamming DW, Lavu S, Wood JG, Zipkin RE, Chung P, Kisielewski A, Zhang LL, Scherer B, Sinclair DA. Sirtuiinide väikesemolekulilised aktivaatorid pikendavad Saccharomyces cerevisiae eluiga. Loodus. 2003; 425:191–6.

9. Kwon HS, Ott M. SIRT1 tõusud ja mõõnad. Trends Biochem Sci. 2008; 33:517–25.

10. Brooks CL, Gu W. Kuidas SIRT1 mõjutab ainevahetust, vananemist ja vähki? Nat Rev Vähk. 2009; 9:123–8.

11. Harman D. Vananemise vabade radikaalide teooria. Mutat Re. 1992; 275:257–66.

12. Mayo JC, Tan DX, Sainz RM, Lopez-Burillo S, Reiter RJ. Peroksüülradikaalide poolt indutseeritud katalaasi oksüdatiivne kahjustus: funktsionaalne kaitse melatoniini ja teiste antioksüdantide poolt. Vaba Radic Res. 2003; 37:543–53.

13. Hubackova S, Krejcikova K, Bartek J, Hodny Z. IL1- ja TGF-Nox4 signaalimine, oksüdatiivne stress ja DNA kahjustusreaktsioon on replikatiivse, onkogeenist ja ravimitest põhjustatud parakriinse kõrvalseisja vananemise ühised tunnused '. Vananemine (Albany NY). 2012; 4:932–51. https://doi.org/10.18632/aging.100520.

14. Cui X, Zuo P, Zhang Q, Li X, Hu Y, Long J, Packer L, Liu J. Krooniline süsteemne kokkupuude D-galaktoosiga põhjustab hiirtel mälukaotust, neurodegeneratsiooni ja oksüdatiivseid kahjustusi: R{{ kaitsev toime 2}}lipoehape. J Neurosci Res. 2006; 84:647–54.

Küsi lisa:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: pluss 86 15292862950