Lentinula Edodes'i ja Pleurotus Ostreatus'e söödavate seente vesiekstraktide proteoomianalüüs ja in vitro viirusevastane, vähivastane ja antioksüdantne toime

Lisateabe saamiseks võtke ühendusttina.xiang@wecistanche.com

Abstraktne: Selles uuringus uurisime söögiseente Pleurotus ostreatus (austraseen) ja Lentinula edodes (shiitake seen) vesiekstrakte. Proteoomianalüüs viidi läbi LC-Triple TOF-MS abil ja see näitas 753 valgu ekspressiooni Pleurotus ostreatus ja 432 valgu ekspressiooni Lentinula edodes. Bioaktiivsed peptiidid: mõlemas seenes tuvastati raba SKP dissotsiatsiooni inhibiitor, superoksiiddismutaas, tioredoksiinreduktaas, seriini proteinaas ja lektiin. Ekstraktid sisaldasid ka paljulubavaid bioaktiivseid ühendeid, sealhulgas fenoole,flavonoidid, vitamiinid ja aminohapped. Väljavõtted osutusid paljulubavaksviirusevastased tegevused, mille selektiivsusindeks (SI) on 4,5 Pleurotus ostreatus'e puhul adenoviiruse (Ad7) suhtes ja Lentinula edodes'i aktiivsus herpes simplex-II (HSV-2) vastu. Ekstraktid ei olnud tsütotoksilised inimese normaalsetele perifeerse vere mononukleaarsetele rakkudele (PBMC). Vastupidi, nad näitasid mõõdukat tsütotoksilisust erinevate vähirakuliinide suhtes. Lisaks hinnati DPPH abil antioksüdantset aktiivsustradikaalne puhastamine, ABTS radikaali katioonide eemaldamine ja ORAC analüüsid. Need kaks väljavõtet näitasid potentsiaaliantioksüdantsed tegevused, mille maksimaalne aktiivsus on täheldatud Pleurotus ostreatuse puhul (IC50 ug/mL) =39,46 ± 1,27 DPPH puhul; 11,22±1,81 ABTS puhul; ja 21,40±2,20 ORAC-testide puhul. See uuring julgustab neid seeni meditsiinis kasutama, pidades silmas nende madalat tsütotoksilisust normaalsetele PBMC-dele, võrreldes nende viirusevastase, kasvajavastase ja antioksüdantse toimega.

Märksõnad: valgemädaniku seen; Pleurotus ostreatus; Lentinula edodes; šiitake; antioksüdant; kasvajavastane; viirusevastane

1. Sissejuhatus

Seenel on suured väljavaated meditsiinis ja toitainete tootmises. Lisaks headele organoleptilistele omadustele ja kõrgele toiteväärtusele on paljudel seentel teadaolevalt lugematu arv farmakoloogilisi toimeid [1-3]. Kõige laialdasemalt kasvatatavatest seentest on Lentinula edodes (shiitake seen) ja Pleurotus ostreatus (austraseen). Shiitake on maailmas enim tarbitava söögiseenena Agaricus bisporuse järel teisel kohal [4]. Sellel seenel on paljulubav antibakteriaalne, seenevastane, viirusevastane, hepatoprotektiivne, antihüperglükeemiline ja immunomoduleeriv toime [5-7]. See on rikas bioaktiivsete molekulide poolest, millest enim uuritud on "lentinaan", polüsahhariid, millel on bakterite, viiruste ja kasvajate vastane toime, lisaks "lentinaanile", mis näitas abi düslipideemia ja hüperglükeemia kontrollimisel [8]. Pleurotus ostreatus, perekonna Pleurotus [9] levinuim liik, tuntud ka kui austrite seen, on puidu lagundaja ja sellel on lai valik bioloogilisi aktiivsusi [10]. Võrreldes teiste raviseentega on austriseened muutumas üha populaarsemaks tervise edendajana [11]. Suure hulga toitvate komponentide, nagu lektiinid, polüsahhariidid, vitamiinid ja mineraalid, olemasolu austrite seentes võimaldab neil omada potentsiaalset vähivastast toimet,antioksüdant, diabeedivastased, antimikroobsed ja antihüperkolesteroleemilised omadused [12,13]. Võrreldes teiste söödavate seentega on austritel ja shiitake seentel lühike kasvuperiood ja neid saab koguda aastaringselt 14. Tänu nende kasvatamise ja katsetamise lihtsusele, kõrgele toiteväärtusele ja paljulubavale ravitoimele on neil seentel tohutu potentsiaal toiduaine- ja farmaatsiatööstuses [4,15]. Tõepoolest, kõrgemad Basidiomycetes võivad olla paljulubavad multifunktsionaalsed toiduallikad.

Nendes kahes seenes leiti palju bioaktiivseid ühendeid, sealhulgas suhkruid, füsioloogiliselt aktiivseid valke, küllastumata rasvhappeid, fenoole (fenoolhappeid ja polüfenoole), flavonoide, terpenoide, glükoproteiine, polüketiide, steroide ja alkaloide [16,17]. Need ühendid toimivad ainult või sünergistlikult, et kutsuda esile nende seente laiaulatuslikud farmakoloogilised toimed. On teatatud, et šiitake- ja austriseentel on antibakteriaalne, viirusevastane, antihüpertensiivne, immunomoduleeriv ja antioksüdantne toime [1,18,19]. Seo jt. [20] võttis kokku seente biomolekulide viirusevastase aktiivsuse mehhanismid, viidates sellele, et viirusnakkuse vähenemine tuleneb peamiselt viiruse peremeesrakkudesse omastamise, selle replikatsiooni ning valkude ja ensüümide sünteesi häirimisest, lisaks viiruse stimuleerimisele. peremeesorganismi immuunvastus [21]. Antioksüdandid on olulised molekulid reaktiivsete hapnikuliikide puhul, mis on paljude terviseprobleemide taga. Kuna sünteetiliste antioksüdantide kasutamise vastu heisati palju punaseid lippe, on looduslike antioksüdantide uurimine muutunud kohustuslikuks [22]. Nende seenetoodete kasvajavastane toime oli seotud biomolekulidega, sealhulgas glükaanidega, ergosterooliga, proteoglükaanidega ja aminohapetega (arginiin ja glutamiin)[23]. Selle toime aluseks olev oletatav mehhanism võib lisaks vähirakkude vastase immuunvastuse vallandamisele hõlmata T-lümfotsüütide stimuleerimist, neovaskularisatsiooni pärssimist ja vähirakkude surma esilekutsumist [24, 25].

Proteoomika on end tõestanud kui üht väärtuslikku vahendit biouuringutes, eriti põllumajandusuuringutes [26]. Lindequist et al. [27] olid esimene rühm, kes valgustas proteoomika kasutamise tähtsust söödavate seente uurimisel. Nad rõhutasid vajadust kasutada "oomikat" seente bioaktiivsete molekulide uurimiseks. Proteoomikat on söödavate seente uurimisel patogeensete seente suhtes vähe kasutatud [28]. Sellest tulenevalt oli selle uuringu eesmärk analüüsida kahe söögiseene, Pleurotus ostreatus ja Lentinula edodes, proteoomi ja uurida nende potentsiaali.viirusevastane, kasvajavastane ja antioksüdantne toime.

2. Tulemused

2.1.Proteom1e analüüs

Proteoomianalüüs viidi läbi, kasutades LC-Triple TOF-MS analüüsi valede avastamise määraga (FDR)<5% and="" a"95%="" confidence="" of="" identification".="" for="" p.ostreatus,="" a="" total="" of="" 753="" proteins="" were="" identified,34="" of="" which="" were="" reversed="" hits.="" a="" total="" of="" 432="" proteins="" were="" detected="" in="" ledodes,="" 48="" of="" which="" were="" reversed="" hits.="" the="" recorded="" accession="" numbers="" of="" the="" proteins="" are="" included="" in="" tables="" s1="" and="" s2="" for="" p.="" ostreatus="" and="" l.edodes,="" respectively.="" in="" tables="" s1="" and="" s2,="" the="" ms-triple="" tof="" data="" were="" analyzed="" by="" proteinpilot="" with="" the="" paragon="" algorithm.="" proteins="" were="" identified="" with="" peptides="" that="" gave="" more="" than="" a="" 95%="" confidence="" of="" identification.="" bioactive="" proteins:="" rab="" gdp="" dissociation="" inhibitor,="" superoxide="" dismutase,="" thioredoxin="" reductase,="" serine="" proteinase,="" and="" lectin,="" were="" expressed="" in="" both="" p.ostreatus="" and="" l.edodes="" extracts="" [29-35].="" p.="" ostreatus="" also="" expressed="" osteolysis="" and="" pleurotolysin,="" whereas="" latch="" pin="" and="" valosin-containing="" protein="" were="" expressed="" by="" l.edodes.="" lc-triple="" tof-ms="" spectra="" of="" the="" mushroom="" extracts="" analyzed="" by="" analyst="" tf1.7.1="" (sciex="" software)="" are="" shown="" in="">

2.2. Bioaktiivsete ühendite üldsisaldus

Üldsisalduse hindamisel hõlmas see süsivesikute, valkude, fenoolide ja flavonoidide üldsisalduse hindamist. P. ostreatus'e ekstrakt sisaldas peaaegu kolm korda rohkem süsivesikuid ja kaks korda rohkem valke, mis esines L. edodes'e ekstraktis; sellegipoolest tuvastati L.edodes ekstraktis rohkem flavonoide kui P. ostreatuse ekstraktis (tabel 1).

2.3. Fenool- ja flavonoidmolekulid

Mõlemad seeneekstraktid sisaldasid katehhiini (tuvastatud retentsiooniajal 26,48 minutit). P.ostreatus sisaldas lisaks kaempferooli ja apigeniini (tuvastatud retentsiooniaegadel vastavalt 59,13 min ja 59,56 min), samas kui L.edodes sisaldas ka kvertsetiini (retentsiooniaeg=56.86 min; tabel 2; joonis). S1).

2.4.Vitamiinid

Nii vees kui ka rasvlahustuvate vitamiinide sisaldus määrati HPLC abil (tabel 3 ja joonised S2 ja S3). Mõlemad seened on rikkad C-vitamiini poolest, tuvastatavad B3-, B6- ja D-vitamiini kogused. Mõlema seente vitamiinide kogustes ei olnud olulist erinevust. Seevastu vitamiine B1, B2, B9, A ja E ei leitud mõlemas seenes.

2.5. Aminohapete analüüs

Aminohapete analüüsiks kasutati Sykam Amino Acid Analyzerit. Aminohapete üldsisaldus oli P.ostreatus'es ja L.edodes'is vastavalt 5,14 ja 4,35, nagu on näidatud tabelis 4, ning need kaks seent on rikkad glutamiinhappe poolest. Kui proliini tuvastati P. ostreatuse ekstraktis märkimisväärses kontsentratsioonis (0,57 g/100 g valku), siis L. edodes'i ekstraktis seda ei tuvastatud. Histidiini ja asparagiinhapet ei tuvastatud kummaski kahes seenes.

2.6. Bioloogiline tegevus

2.6.1. Viirusevastane toime

Viirusevastast toimet hinnati kahe viiruse vastu: adenoviirus ja herpes simplex-II. Nagu on näidatud tabelis 5, näitas P.ostreatus ekstrakt efektiivset viirusevastast toimet adenoviiruse vastu selektiivsuse indeksiga kuni 4,5. Paljutõotav viirusevastane toime registreeriti ka P. ostreatus'e ekstraktil herpes simplex-II vastu ja L. edodes'i ekstraktil mõlema viiruse vastu. Joonised S4 ja S5 kujutavad annuse-vastuse kõveraid.

2.6.2. Tsütotoksiline aktiivsus normaalsete inimese PBMC-de vastu

Normaalsete inimese PBMC-de suhtes registreeriti minimaalne tsütotoksilisus (IC50 ug/ml; 66,41 ± 3,7 ja 82,81 ± 2,72, vastavalt P.ostreatus ja L. edodes).

Vähi rakuliinide vastu

Selles testis kasutati erinevaid vähi rakuliine, sealhulgas eesnäärmevähki (DU-145 ja PC3); hepatotsellulaarne kartsinoom (HepG2); kolorektaalne kartsinoom (Colo-205); pimesoole kartsinoom (LS-513); emakakaelavähk (HeLa); ja rinna adenokartsinoom (MDA-MB-231 ja MCF-7). Doksorubitsiini kasutati positiivse kontrollina (põhjus elujõulisuse vähenemise HepG2 puhul 53 protsendini; MDA-MB-231 puhul 44 protsendini; PC3 puhul 39 protsendini; DU-145 puhul 35 protsendini; MCF puhul 29 protsendini -7:25% LS-513;23% HeLa-s ja 19% Colo-205 rakkudes). Tulemused joonisel 2 näitavad, et Ledodes ja P. ostreatus'e ekstrakt vähendas testitud vähirakuliinide LS-513, HepG2, DU-145 ja PC-3 elujõulisust ligikaudu 20 võrra. protsenti .

Leukeemia ja lümfoomi rakuliinide vastu

P.ostreatus'e ja L.edodes'e seeneekstrakte testiti tsütotoksilisuse suhtes leukeemia (CCR-CEM, NB-4, THP-1) ja lümfoomi (U937) rakkude suhtes. Doksorubitsiin oli positiivne standard, mis põhjustas rakkude elujõulisuse vähenemise 29 protsendini, 25,5 protsendini, 20,3 protsendini ja 19,1 protsendini U937, NB4, CCRF-CEM ja THIP1 rakkudes. L.edodes ekstrakt vähendas THP1 rakkude elujõulisust 66,02 protsendini, samas kui P. ostreatuse ekstrakt vähendas CCRF-CEM rakkude elujõulisust 70,64 protsendini (joonis 3).

2.6.3. Antioksüdantne aktiivsus

Antioksüdantse toime tulemusi uuriti kolme hindamismeetodi, nimelt DPPH abilradikaalne puhastamine, ABTS radikaali katioonide eemaldamise ja ORAC analüüsid, võrreldes antioksüdandi standardiga Trolox, on näidatud tabelis 6 ja joonisel S6a, b. Tulemused näitavad, et P. ostreatuse ekstraktil oli tugevam antioksüdantne võime kui L. edodes'i ekstraktil, nagu näitavad kolm kasutatud antioksüdantanalüüsi. Joonisel 4 on kujutatud ORAC testi ekstraktide poolt indutseeritud fluorestseiini signaali vähenemine.

3. Arutelu

Valgemädaniku seened on äratanud teadusringkondades huvi nende raviomaduste tõttu, mille hulka kuuluvad immuunsüsteemi moduleerimine, hüpoglükeemiline ja tromboosivastane toime ning antihüpertensiivsed, põletikuvastased, antimikroobsed ja kasvajavastased omadused, samuti võime alandada vere kolesteroolitaset. 24, 36-38]. Kaks valgemädaniku seent P. ostreatus ja L.edodes on paljudes riikides kaks kõige enam tarbitavat söögiseeni [39]. Need kaks seent toodavad palju bioaktiivseid valke ja proteoomianalüüs on praegu kõige tõhusam vahend valkude profiilide koostamiseks [40]. Käesolevas uuringus näitas proteoomianalüüs bioaktiivsete valkude, sealhulgas Rab SKP dissotsiatsiooni inhibiitori, tioredoksiini reduktaasi, seriini proteinaasi, superoksiidi dismutaasi ja lektiini ekspressiooni kahes katseseenes. Rab GDP dissotsiatsiooni inhibiitor (Rab GDI) reguleerib Rab GTPaaside funktsiooni, mis mängivad keskset rolli kasvajarakkude membraanikaubanduses. Seetõttu on Rab GDI kasutamine paljutõotav vähivastane strateegia [29].

Seriini proteinaas aitab kaasaviirusevastanesöögiseente aktiivsus [30,31]. Veelgi enam, Yap et al. (2018) teatasid seriinproteinaasi tugevast selektiivsest tsütotoksilisusest inimese rinna adenokartsinoomi rakuliini (MCF7) ees ja väitsid, et see mehhanism hõlmab lisaks kaspaasi stimuleerimisele nii väliste kui ka sisemiste rakusurma mehhanismide koosmõju. 4}} ja -9 ning Bcl-2 pärssimine [41].

Sissevõtmineantioksüdandidon soodne profülaktiline strateegia reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) vahendatud patofüsioloogia vastu [22]. Meie tulemused näitavad antioksüdantide kaitsesüsteemi ensüümide ekspressiooni Pleurotus ostreatus ja Lentinula edodes. Nende ensüümide hulka kuuluvad superoksiiddismutaas, katalaas ja glutatioonperoksüdaas, mis tasakaalustavad ROS-i tootmist [32]. Superoksiidi dismutaas algab superoksiidi muundamisest vesinikperoksiidiks, mille omakorda katalaas ja glutatioonperoksüdaas muudavad veeks [33].

Kahes seenes tuvastati ka lektiini ekspressioon. Paljud teadlased teatasid lektiini märkimisväärselt mitmekesistest bioloogilistest profiilidest, millel on lai valik tegevusi, mis hõlmavad põletikuvastaseid, antidepressante, rasestumisvastaseid ja veresooni laiendavaid aktiivsusi [34, 35, 42]. Lektiinid on süsivesikuid siduvad valgud, millel on mitmesugused rakufunktsioonid, sealhulgas kasvaja kasvu pärssimine in vitro ja in vivo kasvajarakumembraanide või nende retseptoritega selektiivse seondumise kaudu, mille tulemuseks on proteiinkinaaside aktiveerimine või immuunreaktsioonide moduleerimine interleukiini tootmise kaudu. [43]. Lisaks on seente lektiinidel roll ka erinevate rakusurmaradade, sealhulgas apoptoosi, nekroosi ja/või autofagia vallandamisel [42].

Meie andmed näitavad nii osteolüüsi kui ka pleurotolüsiini ekspressiooni Pleurotus ostreatuses. Need on poore moodustavad valgud, millel on väga selektiivne vähivastane toime [44,45]. Ostreolüsiin on 15 kDa tsütolüütiline valk, mis suudab submikromolaarsetes kontsentratsioonides erütrotsüüte ja teisi rakke läbistada. See toimib kolloidse osmootse mehhanismi kaudu ja kutsub esile laiade membraanipooride moodustumise |46,47I. Nimri jt. tootis rekombinantset pleurotolüsiini, millel on tugev kasvajavastane toime inimese ja hiire käärsoole kasvajarakkude vastu [48].

L.edodesis ekspresseeriti valosiini sisaldavat valku ja riivi. Varem teatati, et valosiini sisaldav valk sisaldabantioksüdantomadused, mis võivad aidata neuronaalsete sündroomide, nagu Alzheimeri tõbi, lateraalskleroos ja dementsus [49-51]. Latkripiin on potentsiaalne vähivastane aine [50]. Riaz Ud Din jt (2020) uurisid rinnavähi rakuliinide vastu suunatud riivi vähivastast mehhanismi. Nad teatasid selle võimest indutseerida rakusurma ja autofagiat, lisaks pärssiv toime migratsioonile ja invasioonile [52].

P. ostreatus ja L. edodes ekstraktides määrati hulk bioaktiivseid ühendeid. Käesolevas uuringus tuvastati P.ostreatus'e ja L.edodes'e TPN-d vastavalt 19,37 ± 0,39 ja 24,14 ± 1.{12}}1 mg/g ekstrakti kohta. Need väärtused on kõrgemad kui need, mille registreerisid Rahimah jt, kes kasutasid ammooniumi ja Shinoda teste, et kvantifitseerida P. ostreatus'e flavonoidide kogusisalduseks 6,67 mg/g ekstrakti [53]. Lisaks on meie tulemused kõrgemad kui need, mille leidsid Montibus et al., kes analüüsisid L edodes ekstraktide TPC-d Folin-Ciocalteu meetodil ja leidsid 0.8-1,5 protsenti kuivmassist (DW) korkides ja 0.{16}}.1 protsenti dw stipes [54].

Katehhiin tuvastati nii P. ostreatus'e kui ka L. edodes'e ekstraktides. Katehhiin on taimne sekundaarne fenoolne metaboliit, millel on tugevad vabu radikaale püüdvad omadused [55]. Leiti, et L.edodes ekstrakt sisaldab flavonoidset kvertsetiini. Kvertsetiini antioksüdantset toimet vahendab glutatiooni taseme reguleerimine ja antioksüdantsete ensüümide, sealhulgas glutatioontransferaasi ja Aldo-keto reduktaasi tootmise suurenemine [56]. Lisaks on teatatud, et kvertsetiinil on kasvajavastane toime rakutsükli katkestamise ja apoptoosi soodustamise kaudu [57,58]. Lee et al. teatas, et kvertsetiin põhjustab rakkude seiskumist PC3, Du145 ja U937 vähirakuliinides [59]. Meie tulemused näitavad ka, et kaempferooli ja apigeniini leiti P. ostreatus'es. Kaempferoolil ja apigeniinil on tõestatud antioksüdantne ja proliferatsioonivastane toime [60-62]. Leiti, et glutamiinhape on mõlema seeneekstrakti kõige rikkalikum aminohape. Samal viisil analüüsisid Chirinang jt P. ostreatus'e ja P. major-caju aminohappesisaldust ning leidsid, et glutamiinhappe sisaldus oli kõrgeim, järgnesid asparagiinhape ja seejärel arginiin [63].

P.ostreatus ja L. edodes näitasid paljulubavat viirusevastast toimet adenoviiruse ja herpes simplex viirus-II vastu, kusjuures P. ostreatus'e ekstrakti SI jõudis adenoviiruse vastase ekstrakti puhul 4,5-ni. SI-d kasutati ekstraktide tõhususe ja ohutuse hindamiseks, kuna see hindab tsütotoksilise ja viirusevastase toime vahelist akent. Mida kõrgem SI, seda ohutum ja tõhusam on ühend [64,65]. Seotud andmeid näitasid hiljuti Urbancikova jt, kus pleuraanil (P. ostreatus'est eraldatud lahustumatu -1,3/1,6-D-glükaan) põhinevad toidulisandid lühendasid oluliselt herpes simplex viiruse kestust. -I sümptomid, mille respiratoorsete sümptomite raskusaste on herpes simplex-viiruse I-positiivsetel patsientidel kui platseeborühmas, ilma oluliste kõrvaltoimeteta, soovitades tulevikus kasutada ägeda herpes simplex-viiruse I ravis [66].

Seente viirusevastane toime tuleneb enamasti viiruse omastamise, replikatsiooni, ensüümide aktiivsuse ja funktsioneerivate peptiidide häirimisest ning peremeesorganismi immuunsüsteemi tugevdamisest [67]. Seo ja Choi (2021) tegid ettepaneku, et P.ostreatus'e ja L.edodes'e polüsahhariidifraktsioonis sisalduv -glükaan võib olla vastutav selle antiherpeetilise toime eest ravieelsete ja -järgsete mõjude kaudu [20]. P. ostreatus'e ja L. edodes'e vesiekstraktide HIV-vastane toime võib olla põhjustatud pöördtranskriptaasi ensüümi pärssimisest vastavalt ubikvitiinitaolise valgu ja leptiini poolt [68, 69].

Näidati, et meie seente vesiekstraktid inhibeerivad testitud vähirakuliinide elujõulisust ligikaudu 20 protsenti. Samuti nägime sarnaseid toimeid leukeemia ja lümfoomi rakuliinide vastu, elujõulisuse vähenemine 66 protsendini L.edodes ekstraktiga THP1 leukeemiarakkude vastu ja 70,6 protsendini P.ostreatus ekstraktiga CCRF-CEM leukeemiarakkude vastu. Varem teatati, et L.edodes'i mütseeli ja viljakeha vesilahused avaldavad MCF-7 rinnavähirakkudele antiproliferatiivset ja apoptootilist toimet[70]. Nende toimingute eest vastutasid enamasti L.edodes'e etüülatsetaadi fraktsioon ja -glükaan[71,72]. Samas kontekstis suutis P. ostreatuse ekstrakt näidata proliferatsioonivastast toimet MCF-7 ja MDA-MB-231 rinna adenokartsinoomi rakkude [73] ja 6-seotud glükaanide suhtes. ekstrakt tugevdas looduslikku tapja tsütotoksilisust rinna- ja kopsuvähirakkude vastu [74]. Hiljuti on Jakopovic et al. leidis, et 6 ja 10 seenest koosnevatel meditsiinilistel seenepreparaatidel, sealhulgas L.edodes ja P. ostreatus, on märkimisväärne antiproliferatiivne ja pro-apoptootiline toime kolorektaalsetele (HCT-116, SW620) kasvajarakuliinidele [75]. Vastupidi, autorid märkasid, et toime inimese fibroblasti rakuliinile (WI-38) oli proliferatiivne, mis näitab nende seente preparaatide spetsiifilisust kasvajarakuliinide suhtes. Samamoodi tuvastasime minimaalse tsütotoksilisuse, mille meie seened eritavad inimese normaalsete PBMC-de vastu. See leid viitab ka meie seente ohutule kasutamisele.

Seente tsütotoksilisust on omistatud paljudele molekulidele, sealhulgas x- ja -glükaanidele, valkudele, glükoproteiinidele, rasvhapetele, nukleosiidide antagonistidele, terpenoididele ja fenoolühenditele [76]. Abdalla jt. (2012) tegi ettepaneku, et seeneekstraktid pärsisid rinnavähirakkude proliferatsiooni, pärssides aromataasi aktiivsust [77]. Imam et al. (2021) eraldasid Ledodesest indool-3-piimhappe, mis pärssis kopsu adenokartsinoomirakkude jagunemist [78]. Yukawa et al. (2012) väitsid, et L edodes mütseeli otsene apoptootiline toime HepG2 rakkudele tuleneb kaspaasi-3 ja -8 surmaretseptorite aktiveerimise kaudu [79]. Wu jt (2011) uurisid P. ostreatus'e valguekstrakti tsütotoksilist toimet inimese kolorektaalse adenokartsinoomi (SW480) rakkudele ja inimese monotsüütleukeemiale, THP-1(rakkudele) ning teatasid ROS-i tekkest, kurnatusest glutatiooni, mitokondriaalse membraani potentsiaali muutumine ja oligonukleosomaalse DNA lagunemine, mille tulemuseks on SW480 rakkude apoptoos [80].

Kuna antioksüdandid ei toimi ühe mehhanismi kaudu, hinnatakse antioksüdantide võimet tavaliselt rohkem kui ühe meetodi abil [81]. Selles uuringus kasutati kolme hindamismeetodit, nimelt DPPH, ABTS ja ORAC analüüse. SET (ühe elektroni ülekande) antioksüdandi mehhanismi hinnati DPPH testi kaudu, samas kui ABTS ja ORAC teste kasutati HAT (vesinikuaatomi ülekande) reaktsioonide jaoks [81]. ORAC-test annab täpsemaid ja täpseid hinnanguid, kuna see ühendab inhibeerimisaja ja inhibeerimise astme ühes terminis [82]. Kuigi fosfomolübdaadi testi kasutatakse tavaliselt antioksüdantide koguvõimsuse (TAC) väljendamiseks, kasutatakse kõiki kolme meetodit.

selles käsikirjas on teatatud TACi hindamisest. Munteanu ja Apetrei (2021) kirjeldasid antioksüdantide aktiivsuse määramiseks kasutatud meetodite ülevaates ABTS-i radikaali püüdmise testi kui "lihtsat ja mugavat meetodit, mida kasutatakse antioksüdantide kogumahu (TAC) mõõtmiseks"[83]. Oma võrdlevas uuringus on Csepregi jt. (2016) võrdlesid nelja TACi hindamiseks kasutatud meetodit, milleks olid Troloxi ekvivalentne antioksüdantne võime (TEAC), raud(III) redutseeriv antioksüdantide potentsiaal (FRAP), 2,2-difenüül-1-pikrüülhüdrasüül(DPPH) radikaali püüdmise test ja Folin-Ciocalteu reagendi reaktiivsus (FCR)[84]. 2013. aastal tutvustasid Ou jt ORAC-i TACi hindamise uudse meetodina[85]. Samamoodi Rubio jt (2016) ) klassifitseeris ORAC-testi TAC-i määramise otseste meetodite hulka koos TEAC-ga [86]. ABTS- ja ORAC-testide tulemused näitavad, et P. ostreatus'e ja L.edode'i ekstraktidel on kõrgem antioksüdantne toime kui standardsel antioksüdandil Troloxil.

Kahe seene antioksüdantset toimet võib seostada paljude bioaktiivsete komponentide, sealhulgasflavonoidid, fenoolid, bioaktiivsed peptiidid ja C-vitamiin[87]. Gaber et al. võrdles ABTS, DPPH, raud(III) redutseeriva antioksüdantse võimsuse (FRAP) ja ORAC teste guajaavia ekstraktide antioksüdantse võime hindamiseks ning teatas positiivsest korrelatsioonist nelja meetodi abil määratud antioksüdantsete võimete ning C-vitamiini sisalduse ja TPN vahel. Teisest küljest registreerisid nad negatiivse korrelatsiooni karotenoidisisaldusega [88]. DPPH(1,1-difenüül-2-pikrüülhüdrasüül) on stabiilne vaba radikaal, millel on paaritu valentselektron ühes lämmastiksilla aatomis; seega on DPPH-radikaali eemaldamine populaarse DPPH-antioksüdantide analüüsi aluseks[89]. 2,2'-asino-bis (3-etüülbensotiasoliin-6-sulfonaat) katioon (ABTS) kaotab antioksüdandi toimel redutseerimisel oma sinise värvuse ja värvimuutust saab kvantifitseerida spektrofotomeetriliselt [90]. ORAC-testis mõõdetakse fluorestsentssondi oksüdatiivset lagunemist vabade radikaalide poolt, mille antioksüdantne aine katkestab. Seega, mida tugevam on antioksüdant, seda lühem on fluorestsentsi kustutamiseks vajalik aeg [91]. Lisaks, kuna testitud ekstraktid näitasid ülalnimetatud meetoditega testimisel paljulubavat antioksüdantset toimet, võib järeldada, et need toimivadvabade radikaalide eemaldamine. Kuid testitud seened sisaldasid märkimisväärset kogu flavonoidisisaldust ja kuna flavonoide on seostatud transkriptsioonifaktori Nrf2 aktiveerumisega (2017), võib selle lisada oletatava mehhanismina [92].

4. Materjalid ja meetodid

4.1.Seeneliigi ja subkultuuri ettevalmistamine

Varem identifitseeritud P. ostreatus ja L.edodes seened saadi kudede ja/või viljakehadena Kairos, Egiptuses asuva Agriculture Research Centeri kultuurikogust [93,94]. Viljade aseptiliseks lõikamiseks seente viljakehadest subkultuurimiseks kasutati kirurgilisi lõiketerasid. Sisemine mütseel koguti steriilsete nõeltega ja kultiveeriti steriilsetel kartulidekstroosiagari (PDA) plaatidel (Merck, Darmstadt, Saksamaa)95]. Seenekudede subkultiveerimiseks kasutati steriilsete tangidega seemnete korjamist ja aseptilist ülekandmist steriilsetele PDA plaatidele, mida inkubeeriti seejärel 28 kraadi juures 7 päeva ning iga tüve viljakehad pesti eraldi. Iga isolaat (500 g) jäeti 48 tunniks toatemperatuurile õhu käes kuivama, jahvatati käsitsi köögiveskis ja säilitati tulevaseks kasutamiseks toatemperatuuril hästi õhutatud kohas.

4.2. Pleurotus Ostreatus'e ja Lentinus Edodes'e veepõhine ekstraheerimine

Iga isolaadi kuivatatud puuvilju jahvatati koduse segistiga 500 g pulbriks, seejärel leotati kolm korda 7Lof destilleeritud vees toatemperatuuril kolm päeva, ultraheliga (ultrahelipuhasti, Inglismaa, Ühendkuningriik) ja seejärel filtriti. Leotamise ja filtreerimise protsessi korrati, kuni vedelik oli ammendatud. Saagise säilitamiseks kasutati etanooli. Pärast etanooli aurustamist 45 kraadi juures külmkuivatati kokku 500 ml iga isolaati, et saada ligikaudu 20 g iga ekstrakti kuiva jääki [96].

4.3. Proteoomiline analüüs

Proteoomiline analüüs viidi läbi Egiptuse Laste Vähihaigla 57 357 (CCHE), Kairo, Egiptuse proteoomika ja metaboolika osakonnas. Umbes 600 uL 8 M karbamiidi 500 mM Tris-s (pH 8,5) ja 60 uL täielikes ultraproteaasides (Roche) , Mannheim, Saksamaa) lisati igale proovile, seejärel loksutati proove tugevalt ja tsentrifuugiti kiirusel 10,000 RPM 30 minutit. Supernatandid koguti ja fraktsioonid (1 ug/10 μL) süstiti NanoLC süsteemi abil. Massispektromeetria kolmekordne TOF-süsteem (Sciex TripleTOF 5600 plus, AB SCIEX, Concord) ühendati vedelikkromatograafiaga (LC) (3 um, ChromXP C18 CL, 120 A, 150 × 0,3 mm), mis koosnes Eksigent nanoLC400 automaatsamperist. iga proovi jaoks pump Ekspert nanoLC425, voolukiirusega 10 μL/min 55 minuti jooksul [97]. Andmete analüüsi teostasid ProteinPilot (versioon 5.0.1.0,4895) ja Paragon Algorithm (versioon 5.0.1.0,4874). Valgujärjestused joondati Swiss-Proti ja TrEMBL andmebaasi järjestustega (Pleurotus sp., mis sisaldab 14 792 kirjet P. ostreatuse kohta ja Lentinula sp., mis sisaldab 12603 kirjet L. edodes'e kohta)[98]. Tavaliselt tuvastatud seeneliikide vahelisi valke illustreeriti tarkvara Venny2.1.0.BioinfoGP [99] (Kingston upon Hull, Inglismaa, Ühendkuningriik) abil.

4.4. Bioaktiivsete ühendite iseloomustus

Nagu varem teatatud, määrati lahustuvate süsivesikute kogusisaldus fenoolväävelhappe meetodil [100]. Andmed on esitatud keskmistena ± standardhälbe (SD) ja katsed viidi läbi kolmes korduses.

Fenooli üldsisaldus (TPC) ja flavonoidide kogusisaldus (TFC) määrati vastavalt Ryani jt aruannetele. [101]. Proovid valmistati vees kontsentratsiooniga 20 mg/ml. Gallushape (1 mg/ml põhilahus) valmistati metanoolis. Rutiin (1 mg/ml põhilahus) valmistati metanoolis. Gallushappe standardid ja proovid pipeteeriti plaadi süvenditesse kuues korduses ja mõõdeti lainepikkusel 630 nm. Kõiki 10 rutiini standardit ja proovi kuues korduses mõõdeti 420 nm juures.

Üldfenoolide ja flavonoidide HPLC analüüs viidi läbi Singh et al. meetodil. [102]. Kõik proovid ja 1 0 erinevat standardlahust lahustati metanoolis ja filtreeriti 0,22 um süstalfiltrite abil ning seejärel süstiti 100 µL igast proovist ja 10 µL igast standardist, kasutades HPLC kolonni, Waters 2690 Alliance HPLC. süsteem, mis on varustatud Waters 996 fotodioodide massiividetektoriga. Veerg C18 Inertsil ODS3: 4,6 × 250 mm, 5 um; liikuv faas: puhver (0,1 protsenti fosforhapet vees); metanooli elueerimisviis oli gradient voolukiirusega 1 ml/min lainepikkusel 280 nm.

Vees lahustuvate vitamiinide analüüsiks testitud seeneekstraktid (50 mg/mL), võrdlusstandardid (10 mg 10 ml 0,05 M naatriumhüdroksiidis). seitse veeslahustuvat vitamiini (tiamiin HCl, askorbiinhape, riboflaviin, nikotiinhape, nikotiinamiid, püridoksiin HCl ja foolhape)[103] ning rasvlahustuvad vitamiinid, lahused (50 mg/ml) kolmest seeneekstraktist ja valmistati standardlahus metanoolis kolmest rasvvitamiinist: E, D3 ja A, vastavalt 806,2, 114 ja 400 IU/ml. Seejärel lahjendati lahused kontsentratsioonini 100 ug/ml, filtreeriti 0,22 um süstalfiltriga ja 100 µl süstiti Waters 2690 Alliance HPLC-süsteemi (Milford, CT, USA), mis oli varustatud Waters 996 fotodioodide massiividetektoriga. Kolonn Inertsil ODS 3∶4,6×250 mm,5 μm; liikuv faas: puhver (0,85 g heksaansulfoonhappe naatriumsoola 1000 ml vees ja pH reguleeriti ortofosforhappega väärtuseni 3); metanooli elueerimine oli gradient voolukiirusel 1 ml/min lainepikkusel 210 nm [104].

4.5. Valkude ja aminohapete analüüs

Seeneekstraktide aminohapete koostist hinnati Sykam Amino Acid Analyzer (Sykam GmbH, Saksamaa) abil, mis oli varustatud lahusti kohaletoimetamise süsteemiga S 2100 (kvaternaarne pump vooluvahemikuga {{ 24}}.01 kuni 10.00 ml/min ja maksimaalne rõhk kuni 400 baari), automaatne proovivõttur, S5200, aminohapete reaktsioonimoodul, S4300 (sisseehitatud topeltfiltriga fotomeeter lainepikkusel 570 nm) ja jahutatud reaktiivi organiseerija S4130. Üks gramm igast seeneekstraktist segati 5 ml heksaaniga ja lasti 24 tundi leotada ning seejärel filtriti segu Whatmani nr. 1 filterpaber. Jääk pandi katseklaasi, mis sisaldas 10 ml 6N HCl, ja inkubeeriti ahjus 110 kraadi juures 24 tundi. Pärast inkubeerimist viidi läbi filtrimine, kasutades Whatmani nr. 1 filterpaber, millele järgneb aurustamine pöördaurustis. Jääk lahustati täielikult 2 ml lahjenduspuhvris (tri-naatriumtsitraatdehüdraat 0,06 M, sidrunhape 0,03 M, fenool 0,02 M, tiodiglükool 1,4 protsenti, HCL 32 protsenti), lahjendati 1000- korda samas puhvris. ja seejärel laaditi ammoniaagifiltri kolonni (LCA, K04/Na, 4,6 × 100 mm, Sykam GmbH, Erasing, Saksamaa), mis oli varustatud automaatse aminohapete analüsaatoriga (Sykam) [105].

4.6. Rakukultuurid

Emakakaelavähi (HeLa), ägeda monotsüütleukeemia (Thpl), kolorektaalse kartsinoomi (Colo-205) ja umbsoolekartsinoomi (LS-513) rakke hoiti Roswell Park Memorial Institute (RPMI) söötmes (Lonza, Köln, Saksamaa), millele on lisatud 100 mg/ml streptomütsiini, 100 ühikut/ml penitsilliini ja 10 protsenti kuumusega inaktiveeritud veise loote seerumit. Muud rakuliinid: inimese leukeemia (CCRF-CEM); äge promüelotsüütiline leukeemia (NB-4); inimese lümfoom (U937); eesnäärmevähk (DU-145 ja PC3); hepatotsellulaarne kartsinoom (HepG2); rinna adenokartsinoom (MCF-7 ja MDA-MB-231); Vero; ja Hep-2 rakke subkultuuriti Dulbecco modifitseeritud kotkasöötmel (DMEM; Invitrogen, California, USA) ja inkubeerimine viidi läbi 37 kraadi juures niisutatud atmosfääris 5% CO2-ga. Rakuliinid saadi ettevõttelt Nawah Scientific Inc. (Mokatam, Kairo, Egiptus), samas kui primaarsed perifeerse vere mononukleaarsed rakud (PBMC) ja normaalsed inimese rakud (ATCC PCS{20}}TM) osteti ettevõttest Viscera, Kairo, Egiptus. Selle töö kiitis heaks Ain Shamsi ülikooli farmaatsiateaduskonna eetikauuringute komitee (kinnitus nr 294).

4.7.Iraalne toime

Viirusevastane toimetestiti adenoviiruse tüüp 7 (Ad7) ja herpes simplex viiruse tüüp II (HSV-2) vastu (Nawah Scientific, Mokattam, Egiptus). Viirusevastast toimet hinnati eelnevalt kirjeldatud viisil [106]. Vero ja Hep{5}} rakud külvati 96-süvendiga kultuuriplaadile tihedusega 2 × 10* rakku süvendi kohta üks päev enne nakatamist. Rakukultuuri sööde (jaotis 4.6) eemaldati järgmisel päeval ja rakkude pesemiseks kasutati fosfaatpuhverdatud soolalahust (PBS). Inimese adenoviiruse ja II tüüpi herpes simplex viiruse nakkavus määrati sulforodamiin B(SRB) meetodi abil, mis jälgis tsütopaatilisi toimeid (CPE) ja arvutas rakkude elujõulisuse protsendi [107]. Viirusevastane aktiivsus arvutati seeneekstraktide võime alusel inhibeerida viiruse CPE-sid, kusjuures 50-protsendiline tsütotoksiline kontsentratsioon (CC5o) ja 50-protsendiline inhibeeriv kontsentratsioon (IC50) määrati GraphPad PRISM tarkvara (Graph-Pad Software, San Diego) abil. , CA, USA). Selektiivsuse indeks (SD) arvutati Dogan et al. [108] vastavalt valemile (1) selektiivsuse indeks (SI)=CC50/IC50

4.8. Tsütotoksilisus PBMC-de vastu, kasutades MTT analüüsi

Tsütotoksilisust hinnati MTT testiga【109】. Rakususpensioonide alikvoodid (100 µl) (rakutihedus 1.2-1.8 × 10* rakku süvendi kohta) plaaditi 96-süvendiga plaatidele, lisati täielik sööde ja rakke inkubeeriti 24 tundi. Seejärel töödeldi rakke seeneekstraktide seerialahjendustega 48 tundi. MTT lahus (5 mg/ml) PBS-s lisati süvenditesse ja inkubeeriti 4 tundi ning neeldumine 570 nm juures loeti mikroplaadilugeja abil. Negatiivse kontrollina kasutati töötlemata rakke ja positiivse kontrollina doksorubitsiiniga (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Saksamaa) töödeldud rakke.

4.9. Tsütotoksilise aktiivsuse hindamine, kasutades SRB-d vähirakuliinide vastu

Tsütotoksilisus eesnäärmevähi vastu (DU{{0}} ja PC3); hepatotsellulaarne kartsinoom (HepG2); kolorektaalne kartsinoom (Colo-205); pimesoole kartsinoom (LS-513); emakakaelavähk (HeLa); ja rinna adenokartsinoomi (MDA-MB-231 ja MCF-7) rakuliine hinnati sulforodamiin B (SRB) kolorimeetrilise testiga [110]. Rakususpensioone täissöötmes (4.6) inkubeeriti 96-süvendiga plaatidel 24 tundi. Seejärel lisati erinevates kontsentratsioonides (0 kuni 100 ug/ml täissöötmes) seeneekstrakte ja inkubeeriti 72 tundi. Negatiivse kontrollina kasutati töötlemata rakke ja positiivse kontrollina doksorubitsiiniga töödeldud rakke.

4.10. Leukeemia ja lümfoomi rakuliinide elujõulisus WST-1 analüüsi abil

Inimese leukeemia (CCRF-CEM), ägeda promüelotsüütilise leukeemia (NB4), ägeda monotsüütleukeemia (THP1) ja inimese lümfoomi (U937) vastane tsütotoksilisus määrati vees lahustuva tetrasooliumsoola (WST-1) testiga, kasutades Abcamkiti ( ab155902 WST-1 Cell Proliferation Reagent, Ühendkuningriik). Rakususpensioone inkubeeriti 24 tundi ja seejärel töödeldi erinevate kontsentratsioonidega (0 kuni 100 ug/ml täissöötmes) seeneekstrakte 48 tundi. Seejärel töödeldi rakke 1 tund 10 μL WST-1 reagendiga ja A450 loeti mikroplaadilugeja abil [111]. Töötlemata rakke kasutati negatiivsete kontrollidena ja doksorubitsiini (Sigma-Aldrich, Saksamaa) töödeldud rakke kasutati positiivse kontrollina.

4.11.Antioksüdantne aktiivsus

4.11.1. DPPH radikaali eemaldamise tegevus

DPPH radikaali püüdmise test viidi läbi vastavalt Lu et al. [112]. Saadud DPPH värvi vähenemist mõõdeti 540 nm juures.Antioksüdantne aktiivsusväljendati inhibeerimise protsendina kalibreerimiskõvera (R2=0.9903) alusel. Andmed on esitatud kui keskmised ± SD vastavalt võrrandile (2): (Antioksüdandi aktiivsuse protsent=[(abs-blank-abs-sample)/abs-blank] × 100)

(2) kus abs-pimekatse ja abs-proov viitavad vastavalt pimekatse ja proovi neeldumisele. Hinnati proovi kontsentratsiooni, mis on vajalik poolte vabade radikaalide inhibeerimiseks (IC50).

4.11.2.ABTS (2,2'-asinobis-(3-etüülbenstiasoliin-6-sulfoonhape)) radikaalkatioonide püüdmise aktiivsus

Analüüs viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud 【113】. Seeneekstraktid (10 μL 0 kuni 100 ug/mL lahuseid) segati 190 μL värskelt valmistatud ABTS-iga (Sigma-Aldrich Germany) 96-süvendiga plaatidel ja inkubeeriti pimedas toatemperatuuril. 2 h. Iga proovi testiti neljas korduses ja neeldumist mõõdeti lainepikkusel 734 nm. Antioksüdantne aktiivsus väljendati inhibeerimise protsendina (võrrand (1)) kalibreerimiskõvera (R2=0.9948) alusel.

4.11.3. Hapnikuradikaalide neeldumisvõime (ORAC) test

Analüüs viidi läbi nagu eelnevalt kindlaks määratud [62], väikeste muudatustega. Lühidalt, 12,5 μL seeneekstrakte, kolmes eksemplaris, inkubeeriti 75 μL fluorestseiiniga (10 nm) 30 minutit temperatuuril 37 kraadi. Fluorestsentsi mõõtmine (485 EX, 520 EM, nm) viidi läbi kolme tsükli jooksul (tsükli aeg =90 s). Seejärel 12,5 μL värskelt valmistatud 240 mm 2,2'-asobis 2- lahust. Igasse süvendisse lisati kohe amidinopropaandivesinikkloriid (AAPH) (Ab-cam, Cambridge, UK) ja fluorestsentsi mõõtmist jätkati 2,5 tundi (85 tsüklit, iga 90 s). Analüüs mõõdab fluorestseiini fluorestsentsi kadu aja jooksul. peroksüülradikaalide moodustumine AAPH lagunemisel. Trolox (6-hüdroksü-2,5,7,8-tetrametüülkromaan-2-karboksüülhape), vees lahustuv E-vitamiin analoog, toimis positiivse kontrollina, inhibeerides annusest sõltuval viisil fluorestseiini lagunemist Antioksüdantne aktiivsus väljendati inhibeerimise protsendina (võrrand (1) kalibreerimiskõvera (R2= 0.9957) suhtes.

4.12.Statistiline analüüs

Viidi läbi kolm keemilist analüüsi ja tulemused väljendati keskmiste ± standardhälvetena. Statistilised analüüsid viidi läbi ühesuunalise ANOVA abil.

Keskmiste erinevuste olulisust hinnati Tukey-Krameri mitme võrdluse testiga. Statistiliselt oluliseks peeti p-väärtust Väiksem kui 0,05 või sellega võrdne. Statistiline hinnang määrati GraphPad PRISM tarkvara abil (Graph-Pad Software, San Diego, CA, USA).

5. Kokkuvõtted

Seened P. ostreatus ja L.edodes sisaldavad laias valikus bioaktiivseid ühendeid. Proteoomianalüüs näitas mitmete bioaktiivsete molekulide ekspressiooni, millel on palju bioloogilisi aktiivsusi. Seente vesiekstraktid on paljulubavadviirusevastane7. tüüpi adenoviiruse ja II tüüpi herpes simplex viiruse vastased toimed tuvastati vähirakuliinide suhtes, kuid mitte normaalsete inimese PBMC-de vastu. Käesolev uuring julgustab neid seeni kasutama farmakoloogilistel eesmärkidel, pidades silmas nende madalat tsütotoksilisust normaalsetel PBMC-del, lisaks nende viiruse-, kasvaja- ja antioksüdantsetele võimetele.

Viited

1. Bertéli, MBD; Oliveira Filho, OBQ; Freitas, JDS; Bertolucci, WC; Silva, GR; Gazim, ZC; Lívero, KAUG; Lovato, ECW; Valle, JS; Linde, GA; et al. Lentinus crinitus basidiocarp stipe ja pileus: keemiline koostis, tsütotoksilisus ja antioksüdantne toime. Eur. Food Res. Technol. 2021, 247, 1355–1366. [CrossRef]

2. Ragupathi, V.; Stephen, A.; Arivoli, D.; Kumaresan, S. Indiast Lõuna-Lääne-Ghatist pärit metsaseene Gymnopilus Juniuse metanooliekstrakti antibakteriaalne aktiivsus, in vitro antioksüdantide potentsiaal ja GC-MS iseloomustus. Eur. J. Biomed. 2018, 5, 650–657.

3. Atila, F.; Owaid, MN; Shariati, MA Agaricus bisporuse toitumis- ja meditsiinilised eelised: ülevaade. J. Microbiol. Biotehnoloogia. Food Sci. 2017, 7, 281–286. [CrossRef]

4. Gaitán-Hernández, R.; Cortés, GMN Söögi- ja ravimseene Lentinula edodes saagikuse parandamine nisuõlgedel, kasutades täiendatud kudemist. Braz. J. Microbiol. 2014, 45, 467–474. [CrossRef] [PubMed]

5. Smânia, A.; Delle Monache, F.; Smânia, E.; Gil, M.; Benchetrit, L.; Cruz, F. Seene Pycnoporus sanguineus (Fr.) Murr poolt toodetud aine antibakteriaalne toime. J. Ethnopharmacol. 1995, 45, 177–181. [CrossRef]

6. Ishikawa, NK; Kasuya, MCM; Vanetti, MCD Vedelas söötmes kasvatatud Lentinula edodes'i antibakteriaalne toime. Braz. J. Microbiol. 2001, 32, 206–210. [CrossRef]

7. Hwang, H.-J.; Kim, SW; Lim, J.-M.; Joo, J.-H.; Kim, H.-O.; Kim, H.-M.; Yun, J.-W. Raviseene Phellinus baumii toodetud tooreksopolüsahhariidide hüpoglükeemiline toime streptozototsiini poolt indutseeritud diabeetilistel rottidel. Life Sci. 2005, 76, 3069–3080. [CrossRef] [PubMed]

8. Hearst, R.; Nelson, D.; McCollum, G.; Millar, eKr; Maeda, Y.; Goldsmith, CE; Rooney, PJ; Loughrey, A.; Rao, J.; Moore, JE Shiitake (Lentinula edodes) ja austriseente (Pleurotus ostreatus) koostisosade antibakteriaalsete ja seenevastaste omaduste uurimine. Täiendage. Seal. Clin. Harjuta. 2009, 15, 5–7. [CrossRef]

9. Zervakis, G.; Philippoussis, A.; Ioannidou, S.; Diamantopoulou, P. Mütseeli kasvukineetika ja optimaalsed temperatuuritingimused söödavate seente liikide kasvatamiseks lignotselluloossubstraatidel. Folia Microbiol. 2001, 46, 231–234. [CrossRef]

10. Sánchez, C. Pleurotus ostreatus'e ja teiste söögiseente kasvatamine. Rakendus Microbiol. Biotehnoloogia. 2009, 85, 1321–1337. [CrossRef]