Naringeniini mõju MiRNA-mRNA profiilidele HepaRG rakkudes

Lisateabe saamiseks võtke ühendust:tina.xiang@wecistanche.com

Abstraktne: Naringenin, looduslikflavonoidtsitrusviljades laialdaselt leitud, on teatatud, et sellel on loodusliku toidulisandina antioksüdantsed, põletikuvastased ja hepatoprotektiivsed omadused. Naringeniini regulatiivne mehhanism inimese maksas jääb siiski ebaselgeks. Käesolevas uuringus kasutati kontroll- ja naringeniiniga töödeldud HepaRG-rakkude ekspressioonierinevuste eristamiseks Messenger-RNA sekveneerimist (mRNA-seq), mikroRNA sekveneerimist (miRNA-seq) ja reaalajas qPCR-i. Saime 1037 erinevalt ekspresseeritud mRNA-d ja 234 miRNA-d. Sihtmärgi ennustamise ja integratsiooni analüüsi kohaselt in silico leidsime 20 potentsiaalset miRNA-mRNA paari.maksainevahetus. See uuring on esimene, mis annab ülevaate miRNA-mRNA interaktsioonidest naringeniini reguleerimisel mRNA-seq ja miRNA-seq integreeritud analüüsi kaudu HepaRG rakkudes, mis iseloomustab veelgi naringeniini kui toidu lisaaine toiteväärtust.

Märksõnad: naringeniin; mRNA-seq; miRNA-seq; HepaRG rakud

klõpsake toote kohta lisateabe saamiseks

1. Sissejuhatus

Naringenin, looduslikku flavonoidi, leidub rohkesti tsitrusviljades ja teistes söödavates puuviljades, nagu greip, apelsinid, bergamot, tomatid ja viigimarjad [1]. Pärast suukaudset manustamist on naringeniin laialdaselt jaotunud seedetraktis ja maksas [2, 3] ning sellel on oma molekulaarstruktuuri tõttu otsene antioksüdantne omadus vabade radikaalide eemaldamise aktiivsuse tõttu ning see indutseerib endogeense antioksüdantide süsteemi maksas [4]. Kasvavad tõendid nii in vitro kui ka in vivo uuringute põhjal on tuvastanud naringeniini erinevaid kaitsevõimeid, näitekspõletikuvastane[5], antioksüdant [6], fibroosivastane [Z] ja hepatoprotektiivne 4,8| tegevused. Need võimed viitavad sellele, et dieedi naringeniini saab kasutada metaboolse sündroomi ja pahaloomuliste haiguste, sealhulgas fulminantse hepatiidi, rasvhapete ennetamiseks.maksahaigus, fibroos jne. 19,10]. Siiski on vähe üksikasjalikke uuringuid naringeniini regulatiivse mõju kohta maksa üldistele geenidele [4].

MikroRNA-d (miRNA-d) on mittekodeerivate üheahelaliste RNA molekulide klass, mille pikkus on 18-26 nukleotiidi ja mida kodeerivad endogeensed geenid ja millel on lai valik bioloogilisi reguleerivaid funktsioone fülogeneesis, diferentseerumises, proliferatsioonis ja apoptoosis. [11]. miRNA, mis seob messenger-RNA-sid (mRNA-sid) järjestusspetsiifilise äratundmise teel, reguleerib negatiivselt geeniekspressiooni transkriptsioonijärgsel tasemel sihtmärk-mRNA-de lagunemise kaudu [12]. Eksogeense stimulatsiooni korral muudetakse miRNA ekspressiooni ja seejärel reguleeritakse sihtmärk-mRNA ekspressiooni. Lõpuks muudetakse ulatuslikke füsioloogilisi funktsioone, et tulla toime eksogeense stimulatsiooni põhjustatud väljakutsetega [13]. Usaldusväärsem meetod miRNA-mRNA sihtmärksuhete ennustamiseks on integreerida mRNA-seq analüüs samaaegselt miRNA-seq analüüsiga, kasutades konkreetset töötlemiskonteksti in silico [14].

Seetõttu oli meie eesmärk uurida naringeniini mõju globaalsetele geenidele ja tuua esile miRNA-mRNA paaride võimalik regulatiivne mehhanism maksas. Käesolevas uuringus uuriti mRNA ekspressioonimuutusi ja miRNA ekspressiooniprofiile HepaRGcells, tehes mRNA-seq, miRNA-seq, bioinformaatilisi analüüse ja reaalajas qPCR, et anda tõendeid naringeniini potentsiaali kohta loodusliku toidulisandina.

2. Tulemused

2.1. Naringeniini vastuse transkriptoomide järjestamise analüüs

MRNA ekspressioonimuutuste tuvastamiseksHepaRG rakudvastuseks naringeniinile kaheksa komplementaarset DNA (cDNA) raamatukogu kontrollrühmas (CK-1, CK-2, CK-3 ja CK-4) ja katserühmas (T-1, T-2, T-3 ja T-4) konstrueeriti kogu RNA-ga ja allutati Illumina HiSeq2500 sekveneerimisele (Genedenovo Biotechnology Co., Ltd, Guangzhou , Hiina). Kontrollrühma ja katserühma sekveneerimise ja kokkupaneku tulemuste ülevaated on toodud tabelis 1. Geeniekspressiooni muutusi analüüsiti, võrreldes töödeldud ja kontrollrühmi. Nagu on näidatud joonisel la, ekspresseeris naringeniiniga eksponeeritud rühm kontrollrühmaga võrreldes 1037 erinevalt ekspresseeritud geeni (DEG). 1037 DEG-i soojuskaart näitas kontrollrühma ja naringeniinirühma klastrianalüüsi (joonis 1b; 381 üles- ja 656 allareguleeritud geeni; tabel S1, lisamaterjalid).

Vastavalt Gene Ontology (GO) klassifikatsioonisüsteemile jaotati 1037 DEG-d kolme peamisse funktsionaalsesse kategooriasse (bioloogiline protsess, rakukomponent ja molekulaarne funktsioon) ja 61 alamkategooriasse (joonis 2). Bioloogilistest protsessidest oli kõige sagedamini esindatud rakuline protsess (731), millele järgnesid ühe organismi protsess (672) ja bioloogiline regulatsioon (595). Rakulise komponendi kategoorias määrati märkimisväärne osa klastritest rakule (727), raku osale (721) ja organellile (580). Sidumis- (666) ja katalüütilise aktiivsuse (238) rühmadega seotud geenid olid molekulaarse funktsiooni kategoorias märkimisväärselt esindatud.

Kyoto geenide ja genoomide entsüklopeedia (KEGG) klassifikatsioon leiti 1037 DEG jaoks, mis liigitati täiendavalt kahekümne parimasse biokeemilisse rada vastavalt vähima q-väärtusele ja suurimale geeninumbrile raja annotatsioonis (joonis 3). Viie peamise raja geeniarv ja annoteeritud geenide suhe on süsteemne erütematoosluupus (33,8,4 protsenti), alkoholism (38,9,67 protsenti), transkriptsiooni väärregulatsioon vähkkasvajate korral (22, 5,6 protsenti), PI3K-Akt signaalirada (34, 8,65 protsenti ) ning komplemendi ja koagulatsiooni kaskaadid (12, 3,05 protsenti o). Viie raja hulgas oli rohkem kui 10 rikastatud geeni. Üldiselt mõjutas naringeniinravi märkimisväärselt HepaRG rakkude globaalset geeniekspressiooni profiili. Need tulemused viitasid sellele, et nendes radades osalevad geenid võivad mängida naringeniini regulatsioonis olulist rolli.

2.2. miRNA transkriptsioonitasemete analüüs vastuseks naringeniinile

Selles uuringus püüdsime kindlaks teha, kasnaringeniinkokkupuude muudab miRNA-de ekspressioonitasemeid HepaRG rakkudes. Pärast kokkupuudet kogusime väikesed RNA-d ja mõõtsime nende suhtelist arvukust, kasutades Illumina HiSeq2500 (Genedenovo Biotechnology Co., Ltd, Guangzhou, Hiina). Nagu on näidatud tabelis 2, genereeriti pärast saasteainete lugemite eemaldamist vastavalt kaheksa proovi puhtad näidud. Ülevaade väikeste RNA järjestamise lugemistest algandmetest kõrge kvaliteediga ja kvaliteetse filtreerimisega on esitatud tabelis 2. Väikeste RNA-de pikkusjaotus oli raamatukogude lõikes sarnane, kuna 21-23 nt RNA-d olid kõige rohkem (joonis 4). ).

Kõik väikesed RNA-d joondati GeneBanki andmebaasis (väljalase 209.0) ja Rfami andmebaasis (11.0), et tuvastada ja eemaldada ribosomaalne RNA (rRNA), väike tingimuslik RNA (scRNA), väike nukleolaarne (snoRNA), väike tuuma (snRNA) ja ülekande-RNA (tRNA). Vastavalt võrdlusgenoomile eemaldati ka need eksoniteks, introniteks ja kordusjärjestusteks kaardistatud väikesed RNA-d. Filtreerivaid väikeseid RNA-sid otsiti miRBase andmebaasist (väljaanne 21), et tuvastada miRNA-sid. 3373 miRNA soojuskaart näitab kontrollrühma ja naringeniini rühma klastri analüüsi joonisel 5a. Naringeniini ekspositsioonis ja kontrollproovides analüüsitud 3373 miRNA Illumina HiSeq2500 profileerimine näitas, et HepaRG5b rakkudes (Figure) oli tuvastatav kokku 234 erinevalt ekspresseeritud miRNA-d (DEM, 174 üles ja 60 allareguleeritud; tabel S2, täiendavad materjalid). .

2.3. Naringeniini vastuseks mRNA ja miRNA ekspressiooniprofiilide sihtmärgi ennustamine ja integratsiooni analüüs

Transkriptsioonijärgsel tasemel toimides vaigistavad miRNA-d ja/või reguleerivad raku mRNA geeni ekspressiooni sihtmärk-RNA lõhustamise teel. 234 DEM-i sihtgeenide ennustamiseks teostasime arvutuslikud analüüsid, kasutades RNAhübriidi (v2.1.2) pluss katuseakent (v6). .01), Miranda (v3.3a) ja TargetScan (versioon: 7.0). 234 DEM-i ja 1037-kraadise taseme samaaegne profileerimine silico võib tuvastada miRNA-de eeldatavad sihtmärk-mRNA-d. Valisime DEG-de ja DEM-i sihtgeenide ristumiskoha ning teostasime seejärel nende ristumisgeenide bioinformaatika analüüsi. Naringeniini raviks saadi kokku 5607 negatiivset miRNA-mRNA paari, kaasates 216 DEM-i ja 681 DEG-i (tabel S3, lisamaterjalid). Kooskõlas GO klassifikatsioonisüsteemiga liigitati 681 kraadi 58 alamkategooriasse (joonis 6). Esimesed kolm alamkategooriat ei olnud muutunud kolmes peamises funktsionaalses kategoorias võrreldes transkriptoomilise järjestuse analüüsiga (joonised 2 ja 6).

Raja rikastamise analüüs 681° 5607 negatiivse miRNA-mRNA paari kohta tuvastas kakskümmend parimat rada vastavalt väikseimale q-väärtusele ja suurimale geeninumbrile raja annotatsioonis pärast naringeniiniga kokkupuudet (joonis 7): koos PI3K-Akt signaalirajaga (25,8.96). protsenti), mis on kaheksas rada ja suuruselt teine.

2.4. Naringeniini regulatsiooni reaalajas qPCR valideerimine maksa metabolismis ja võimalikud regulatoorsed miRNA-mRNA paarid

Vastavalt globaalsetele geenifunktsioonide annotatsioonidele, kirjanduse ülevaatele ja nende potentsiaalsele seosele naringeniinile reageerivate miRNA-dega, 19° (ALOX15, CA9, TH, HKDC1, NDUFA4L2, RRM2, ACSL5, PLA2G4C, LIPT2, UGDH, FTCD, ABAT, AZSTIN2, , B4GALT6, GUSB, DCT, ALAS2 ja MAT1A) valiti käsitsi nende potentsiaalse rolli esindajatena maksa metabolismis. Lisaks oli PI3K-Akt signaalirada oluliselt rikastatud (RNA-seq analüüsi KEGG-s neljas, joonis 3; kaheksas miRNA-RNA-seq analüüsi KEGG-s, joonis 7); Seetõttu sõeluti välja PI3K-Akt signaaliraja hulgast 11 DEG-d (PDGFRB. CSF1R. FGFR2, IL2RG, IL7R, ITGB4, GNG4, PCK1, CREB3L3, CREB3L1 ja NFkB1).

Kirjeldasime siin 30-kraadise ja 11 inimese miRNA-de (hsa-miR-1306-5p, hsa-miR-627-3p, hsa-miR-194-3p, hsa-miR{{9) interaktsiooni }}p, hsa-miR-6837-5p, hsa-miR-429, hsa-miR-100-3p, hsa-miR-194-5p, hsa-miR{{19} }a-3p, hsa-miR-7-5p ja hsa-miR-200a-5p, sealhulgas 20 negatiivset miRNA-mRNA interaktsiooni (joonis 9). Nagu on näidatud joonisel 9, saab üks miRNA reguleerida mitut sihtmärk-mRNA-d ja vastupidi (nt ABAT HS6ST3, B4GALT6 ja DCT võib olla samaaegselt reguleeritud hsa-miR-429 abil; HS6ST3 võib samaaegselt reguleerida hsa-miR -429, hsa-miR-100-3p,hsa-miR-519a-3p, hsa-miR-676-3p, hsa-miR-7-5 p ja hsa-miR{50}}p; mõnel DEG-l ei olnud seotud DEM-e). Maksa metabolismiga seotud 19 DEG ekspressiooniprofiilid ja PI3K-Akt signaaliraja 11 DEG ekspressiooniprofiilid valideeriti täiendavalt reaalajas qPCR abil (joonis 9a, b). Inimese 11 miRNA (kaks üles- ja üheksa allareguleeritud) ekspressioonitaset hinnati täiendavalt naringeniini poolt indutseeritud muutuste suhtes reaalajas qPCR abil, mis oli kooskõlas sekveneerimistulemustega (joonis 9c). Kuigi kahe analüütilise platvormi vahel esines mõningaid kvantitatiivseid erinevusi, viitasid RNA-seq andmete ja reaalajas PCR vahelised sarnasused sellele, et RNA-seq andmed olid reprodutseeritavad ja usaldusväärsed.

3. Arutelu ja järeldused

Siin käsitletud leiud näitavad esimest üksikasjalikku teavet paralleelsete mRNA ja miRNA ekspressioonimuutuste kohta HepaRG rakkudes vastusenanaringeniin. Tegime nende andmete integreeriva analüüsi, sealhulgas naringeniini poolt indutseeritud 234 DEM-i ja 1037 DEG-d, mis annavad globaalse ülevaate naringeniini miRNA-mRNA interaktsioonidest regulatiivses mehhanismis. Geenifunktsiooni annotatsioonide ja kirjanduse ülevaate kohaselt sõeluti välja 19 ainevahetusega seotud DEG-d. Eelkõige rikastati PI3K-Akt signaalirada märkimisväärselt nii transkriptoomide järjestamise analüüsis (kõige arvukuse poolest kolmas ja neljandal kohal) kui ka miRNA-mRNA ekspressiooniprofiilide integratsioonianalüüsis (kõige sagedamini teine ​​ja kaheksandal kohal) vastusena naringeniinile. Lisaks valideeriti reaalajas qPCR analüüsi abil täiendavalt 11 DEG-d PI3K-Akt signaaliülekande rajal. Selles töös koostasime miRNA-mRNA reguleeriva võrgu vastavalt DEM-i ja DEG-i andmekogumitele ning miRNA-sihtimise teabele. Mõned uuringud on näidanud, et miRNA-mRNA reguleeriv võrk reageeribmaksakahjustus, sealhulgas hepatotsellulaarne kartsinoom ja oksüdatiivne stress [15]. Kuigi tuvastati mitu miRNA-indutseeritud RNA aktiveerimisnähtust [16], peetakse enamikul juhtudel negatiivset korrelatsiooni miRNA-de ja nende sihtmärk-mRNA-de vahel sageli miRNA sihtimise toetuseks [17]. Lõppkokkuvõttes tuvastati 20 miRNA-mRNA negatiivset korrelatsioonipaari, mis olid seotud maksa metabolismi ja PI3K-Akt signaaliülekande rajaga.

Seoses globaalsete geenidega käsitlesime oma konkreetset uurimisküsimust, kasutades raja analüüsi, et tõsta esile 19 DEG-d, mis on seotud funktsionaalsete klastritega: ainevahetus, sealhulgas lipiidide metabolism (ALOX15, ACSL5, PLA2G4C ja B4GALT6), energia metabolism (CA9 ja NDUFA4L2) , Kofaktorite ja vitamiinide (TH, LIPT2 ja FTCD) metabolism, aminohapete metabolism (RRM2, AZIN2, DCT, ALAS2 ja MAT1A), glükaani biosüntees ja metabolism (HS6ST3 ja GUSB) ning süsivesikute metabolism" (HKDC1, PCK1, UGDH ja ABAT). Need 19 DEG-d, mis on rikastatud ainevahetusega, on peamiselt seotud insuliinitundlikkuse, lipiidide akumulatsiooni, glükogeeni säilitamise ja energiakuluga. Varasemad uuringud teatasid, et ALOX15 alareguleerimine alkoholist põhjustatud hiirte maksakahjustuste korral[18], CA9 BALB/C hiirtel [19], THin mittealkohoolne rasvmaksahaigus (NAFLD)[20], HKDC1[21] ja UGDH [22] ülesreguleerimine võivad märkimisväärselt leevendada oksüdatiivset stressi, lipiidide akumuleerumist ja maksakahjustusi. NDUFA4L2 kukkumine surus alla ROS-i kogunemise hepatotsellulaarse kartsinoomi (HCC) rakkudes [23]. RRM2 vaigistamine pärssis NCI-H929 rakkude proliferatsiooni [24] ja FTCD üleekspressioon pärssis rakkude proliferatsiooni, soodustades DNA kahjustusi ja kutsudes esile raku apoptoosi HCC rakkudes [25]. ACSL5 ablatsioon parandas insuliinitundlikkust, suurendas energiakulu ja aeglustas triglütseriidide imendumist hiirtel [26]. DCT lisamine parandas vanusega seotud maksa steatoosi ja põletikku [27]. Lipiidide tilkade moodustumine rasvhapete ja C-hepatiidi viiruse stimuleerimisel PLA2G4C knockdown-rakkudes oli häiritud [28]. LIPT2 allareguleerimine pärssis rasvhapete sünteesi [29]. ABAT [30], AZIN2 [31], B4GALT6 [32], HS6ST3 [33] ja GUSB [34] ülesreguleerimine võib soodustada rasvhapete ja glükogeeni lagunemist. ALAS2 üleekspressioon võib parandada maksa vereloomevõimet [35 l ja hepatotsüütides ekspresseeritud MAT1A säilitas nende rakkude diferentseeritud oleku [36]. Kooskõlas ülalkirjeldatud leidudega võib nende metaboolsete geenide reguleerimine meie tulemustes olla soodne ainevahetuse parandamiseks vastuseks naringeniinile.

PI3K-Akt signaalirada võib pakkuda vihjeid molekulaarsele mehhanismile, mis on seotud ainevahetuse, põletiku ja oksüdatiivse stressiga [37], mis mängib naringeniinile reageerimisel keskset rolli. PI3K-Akt signaalirajal on mitmesugused allavoolu mõjud rakkude metabolismile kas toitainete transporterite ja metaboolsete ensüümide otsese reguleerimise või metaboolsete radade põhikomponentide ekspressiooni reguleerivate transkriptsioonifaktorite [38, 39], sealhulgas glükoosi metabolismi, biosünteesi kaudu. makromolekulide ja redoks-tasakaalu säilitamine. Teatati, et PDGFRB vaigistamine pärssis maksa tähtrakkude aktivatsiooni ja proliferatsiooni ning leevendas maksafibroosi [40]. Eeldatakse, et CSF1R ja FGFR2 koostoimeline inhibeerimine suurendab kasvajavastast toimet, suunates kasvaja mikrokeskkonnas immuunvastuse ja angiogeneesi [41]. ITGB4 hävitamine pärssis vähiga seotud fibroblastides glükolüüsi [42]. PCK1 geneetiline pärssimine hoidis ära rasvhapete põhjustatud oksüdatiivse voo, oksüdatiivse stressi ja põletiku tõusu [43], mis oli samuti korrelatsioonis insuliini poolt juhitavate signaaliradadega [44]. Näidati, et tuuma CREB3L3 üleekspressioon kutsus esile süsteemse lipolüüsi, maksa ketogeneesi ja insuliinitundlikkuse koos suurenenud energiakuluga [45]. Väidetavalt blokeeris CREB3L1 pärssimine vähi invasiooni ja metastaase [46]. NFkB on immuunsüsteemi arengu, immuunvastuste, põletiku ja vähi peamine regulaator [47]. On hästi tõestatud, et NFkB allasurumine indutseerib põletikuvastaseid signaale ja vähendab põletikku [48]. PI3K-Akt signaaliraja puhul näitasid meie tulemused, et naringeniin vähendas oluliselt PDGFRB, PCK1, CREB3L1 ja NFkB1 mRNA ekspressioone seotud miRNA-dega (has-miR-1306-5p ja hsa-miR{{40}). }p) on oluliselt alla reguleeritud. Seetõttu näitasid meie andmed, et naringeniin võib PI3K-Akt signaaliraja pärssimise kaudu mängida põletikuvastases, antioksüdatiivses stressis ja leevendavas metabolismis tervistavat rolli.

See uuring oli esimene, mis integreeris vastusena naringeniinile mRNA-seq ja miRNA-seq analüüsi maksas ja andis ülevaate metabolismist naringeniini regulatsioonis. Ainevahetuse ja PI3K-Akt signaaliraja osas vajavad 11 DEM-i, 30 DEG-i ja 20 miRNA-mRNA paari naringeniini aktiivsuse jaoks rohkem uurimistööd. Sellel uurimistööl on mõned piirangud; näiteks olid naringeniini annusest ja ajast sõltuvad mõjud miRNA-mRNA interaktsioonides endiselt ebaselged. Kuigi antud in silico analüüsitud miRNA-d soovitasid regulatiivseid võimeid, tuleb nende funktsioone elussüsteemis konkreetses kontekstis täiendavalt sertifitseerida. Kokkuvõttes esitasime esialgsed uuringud, mis analüüsisid mRNA ja miRNA ekspressiooni ning metabolismi profiili. MiRNA-mRNA paaride regulatiivne mehhanism võib olla täiendav võimalik tõend naringeniini toitaineväärtuse märkimiseks.

4. Materjalid ja meetodid

4.1. Kemikaalid ja reaktiivid

HepaRG rakuliin osteti algselt ettevõttelt Biopredic International (Rennes, Prantsusmaa). RPMI{0}} sööde ja penitsilliini-streptomütsiini-glutamiini lahus saadi firmalt Gibco (Gaithersburg, MD, USA). Veise loote seerum (FBS) osteti ettevõttest Corning (Auckland, Uus-Meremaa). Naringeniin ja dimetüülsulfoksiid (DMSO) olid firmalt Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). TRIzolTM reagendi tarnis Thermo Fisher (Carlsbad, CA, USA). Ülipuhast vett puhastati Milli-O akadeemilise veepuhastussüsteemiga (Millipore, Bedford, MA, USA). Kõik muud reaktiivid olid kõrgeima saadaoleva analüütilise kvaliteediga turustatavad tooted.

4.2. HepaRG rakukultuur

HepaRG rakud külvati 5 × 10 * rakku/cm- kuue süvendiga plaatidele ja kasvatati RPMI-1640 söötmes, kultiveeriti 100 uM naringeniiniga või ilma 48 tundi ning lisati 10% FBS-i ja 1% antibiootikume. (100 U/mL penitsilliini ja 100 ug/ml streptomütsiini) 37 kraadi juures niisutatud 5% CO-ga inkubaatoris. CK-1, CK-2, CK-3 ja CK-4 viitavad kontrollrühmale; T-1, T-2, T-3 ja T-4 viitavad 100 μM naringeniiniga ravirühmale. Numbrid 1, 2, 3 ja 4 tähistavad nelja sõltumatu korduva katse proove.

4.3. RNA kogu ekstraheerimine

HepaRG rakke pesti kaks korda jääkülma fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS) ja koguti TRIzolTM reagendiga, nagu tootja soovitas. Iga proovi RNA kvaliteedi ja koguse mõõtmiseks kasutati Thermo Scientific NanoDropTM2000 c spektrofotomeetreid (Wilmington, DE, USA) vastavalt tootja protokollile.

4.4.RNA järjestamine

MRNA rikastati Oligo (dT) helmestega, seejärel rikastatud mRNA fragmenteeriti ja pöördtranskripteeriti cDNA-ks juhuslike praimeritega OiaOuick PCR ekstraheerimiskomplektiga (Qiagen, Venlo, Holland). RNA molekule suurusvahemikus 18-30 nt rikastati polüakrüülamiidgeelelektroforeesiga. Lisati 3' ja 5' adapterid, seejärel pöördtranskripteeriti rikastatud RNA-d QiaQuick PCR ekstraheerimiskomplektiga vastavalt tootja juhistele (Qiagen, Venlo, Holland). Ligeerimisproduktid valiti suuruse järgi agaroosgeelelektroforeesiga. Naringeniini rühmas oli neli proovi ja kontrollrühmas neli proovi. Iga proov genereeris kaks cDNA raamatukogu: üks mRNA-seq ja teine ​​miRNA-seg jaoks. PCR-iga amplifitseeritud saadusi rikastati, et saada vastavalt 16 cDNA raamatukogu, ja sekveneeriti Genedenovo Biotechnology Co. (Guangzhou, Hiina) Ⅲlumina HiSeq2500 abil. RNA ja väikese RNA sekveneerimise andmed talletati NCBI järjestuste lugemise arhiivi (juurdepääsunumbrid alates SRR13675952 kuni SRR13675963).

4.5. Reaalajas qPCR

MRNA transkriptsioon cDNA-ks viidi läbi GoScriptTM pöördtranskriptsioonisüsteemiga (Promega, Madison, WI, USA) 3 ug kogu RNA-st vastavalt tootja juhistele. MiRNA analüüsi jaoks viidi cDNA süntees läbi miRNA esimese ahela cDNA sünteesiga (Tailing Reaction, Sangon Biotech, Shanghai, Hiina) 2 ug kogu RNA-st.

koos GoTaq® qPCR Master Mixiga(Promega, Madison, WI, USA) seadmel LightCycler 480 (Roche, Mannheim, Saksamaa), nagu on soovitanud tootja. Termotsükli protseduur algas esialgse denatureerimisega 95 °C juures 10 minuti jooksul. Sellele järgnes 45 denatureerimistsüklit 10 sekundit 95 kraadi juures, praimeri sidumist 20 sekundit 60 kraadi juures ja pikenemist 20 sat 72 kraadi juures. Protseduur lõppes lõpliku võimendusega 95 kraadi juures 5 s, 65 kraadi C 1 minuti jooksul, dissotsiatsioonikõvera etapi lisamisega ja jahutamisetapiga. Praimerid osteti ettevõttelt Sangon Biotech (Shanghai, Hiina). Signatuuri valideerimiseks kasutatud praimeripaari järjestusi on kirjeldatud tabelites 3 ja 4. Ct-väärtused arvutati -aktiini või U6 põhjal.

4.6.Bioinformaatiline analüüs ja statistika

DEG-d ja DEM-id tuvastati R-põhise tarkvarapaketi abil. DEG-de ja DEM-ide valimise läviväärtus oli q-väärtus (korrigeeritud p-väärtus) Väiksem või võrdne 0.05 ja kordne muutus (FC) Suurem või võrdne 2 või väiksem kui 0,5 või sellega võrdne. DEG-de ja DEM-ide analüüsimiseks kasutati KEGG ja GO klassifikatsiooni, sealhulgas molekulaarseid funktsioone, bioloogilisi protsesse ja rakulisi komponente.

Bioloogilise testi tulemused on esitatud keskmise ± SD kujul, mis põhinevad neljal sõltumatul katsel GraphPad Prism 8-s.

Täiendavad materjalid: järgmised on veebis saadaval aadressil https://www.mdpi.com/1422-0 067/22/5/2292/s1: tabel S1, 1037 erinevalt ekspresseeritud mRNA identifitseerimine vastuseks naringeniinile; Tabel S2, 234 erinevalt ekspresseeritud miRNA identifitseerimine vastuseks naringeniinile; Tabel S3, 5607 negatiivse miRNA-mRNA paari tuvastamine vastuseks naringeniinile, kaasates kokku 216 DEM-i ja 681 DEG-d

Viited

1. Salehi, B.; Fokou, PVT Naringenini terapeutiline potentsiaal: kliiniliste uuringute ülevaade. Pharmaceuticals 2019, 12, 11. [CrossRef] [PubMed]

2. Bai, Y.; Peng, W.; Yang, C.; Zou, W.; Liu, M.; Wu, H.; Fan, L.; Li, P.; Zeng, X.; Su, W. Naringiini ja aktiivse metaboliidi naringeniini farmakokineetika ja metabolism rottidel, koertel, inimestel ja liikide erinevused. Ees. Pharmacol. 2020, 11, 364. [CrossRef]

3. Joshi, R.; Kulkarni, YA; Wairkar, S. Naringenini farmakokineetilised, farmakodünaamilised ja ravimvormide aspektid: värskendus. Life Sci. 2018, 215, 43–56. [CrossRef]

4. Hernández-Aquino, E.; Muriel, P. Naringeniini kasulikud mõjud maksahaiguste korral: molekulaarsed mehhanismid. Maailm J. Gastroenterool. 2018, 24, 1679–1707. [CrossRef]

5. Wang, Q.; Oh, Y.; Hu, G.; Wen, C.; Yue, S.; Chen, C.; Xu, L.; Xie, J.; Dai, H.; Xiao, H.; et al. Naringeniin nõrgendab mittealkohoolset rasvmaksahaigust, reguleerides hiirtel NLRP3 / NF-κB rada. Br. J. Pharmacol. 2020, 177, 1806–1821. [CrossRef]

6. Khan, TH; Ganaie, MA Naringeniin hoiab ära doksorubitsiini poolt põhjustatud toksilisuse neerukudedes, reguleerides Wistari rottide oksüdatiivset ja põletikulist solvamist. Arch. Physiol. Biochem. 2020, 126, 300–307. [CrossRef]

7. Wang, J.; Ding, Y.; Zhou, W. Albumiini isemodifitseeritud liposoomid maksafibroosi raviks SPARC-sõltuvate radade kaudu. Int. J. Pharm. 2020, 574, 118940. [CrossRef]

8. Kometsi, L.; Govender, K.; Mofo Mato, EP; Hurchund, R.; Owira, PMO Oksüdatiivset stressi vähendades leevendab naringeniin hüperglükeemiast põhjustatud maksa tuumafaktori erütroidi 2-seotud faktori 2 valgu ülesreguleerimist. J. Pharm. Pharmacol. 2020, 72, 1394–1404. [CrossRef] [PubMed]

9. Rossino, MG; Casini, G. Toitained diabeetilise retinopaatia raviks. Toitained 2019, 11, 771. [CrossRef] [PubMed]

10. Hernández-Aquino, E.; Quezada-Ramírez, MA; Silva-Olivares, A.; Casas-Grajales, S.; Ramos-Tovar, E.; Flores-Beltrán, RE; Segovia, J.; Shibayama, M.; Muriel, P. Naringenin nõrgendab maksafibroosi progresseerumist maksa tähtrakkude inaktiveerimise ja profifibrogeensete radade kaudu. Eur. J. Pharmacol. 2019, 865, 172730. [CrossRef] [PubMed]