(pluss)-katehhiin-laktaasi dimeersete reaktsioonisaaduste kui viinamarjade ja veini oksüdatsiooni võimalike markerite ühemõtteline NMR-i struktuurne määramine
Mar 12, 2022
Lisateabe saamiseks võtke ühendust:tina.xiang@wecistanche.com
Abstraktne:( pluss )-Katehhiin—lakasoksüdatsioondimeersed standardid poolsünteesiti, kasutades lakaasi firmast Trametes Versicolor on vee-etanooli lahus pH väärtusel 3,6. Tuvastati kaheksa fraktsiooni, mis vastasid kaheksale potentsiaalsele oksüdatsiooni dimeersele produktile. Fraktsioonide profiile võrreldi kahe teise oksidoreduktaasiga saadud profiilidega:polüfenooloksüdaasekstraheeritud viinamarjadest ja Botrytis cinerea lakkaasist. Profiilid olid väga sarnased, kuigi mõned väikesed erinevused viitasid võimalikele erinevustele nende ensüümide reaktsioonivõimes. Seejärel eraldati viis fraktsiooni ja analüüsiti 1D ja 2D NMR spektroskoopia abil. Kaadmiumnitraadi jälgede lisamine atsetoonis lahustatud proovidesse viis fenoolsete prootonite täielikult lahutatud NMR signaalideni, võimaldades üheselt määrata kuue reaktsioonisaaduse struktuuri, millest üks sisaldab kahte enantiomeeri. Neid tooteid saab lisaks kasutada oksüdatsioonimarkeritena, et uurida nende olemasolu ja arengut veinis veini valmistamise ja laagerdamise ajal.
Märksõnad: oksüdatsioonimarker;( pluss )-katehiin; fenoolsed NMR signaalid; lakkaas; kaadmiumnitraat; polüfenooloksüdaas
1. Sissejuhatus
Polüfenoolidon looduses laialdaselt esinevate keemiliste ühendite perekond. Neid leidub märkimisväärses koguses tees [1], kakaos [2,3], mustikas [4], viinamarjades [5 l] ja kääritatud toodetes, nagu vein [6]. Olles esmased oksüdatsioonisihtmärgid J7,8], arenevad polüfenoolide keemilised struktuurid pidevalt. Need muutused mõjutavad mitut tüüpi toiduainete organoleptilisi omadusi; nad vastutavad selliste nähtuste eest nagu toidu pruunistumine [9] ja veini sensoorsete omaduste muutumine [10,11. Enoloogias toimub see oksüdatsiooninähtus viinamarjades või veinides. Mis puutub ensümaatilisesse oksüdatsiooni, siis peamised pruunistumise eest vastutavad ensüümid on oksüdoreduktaasid, täpsemaltpolüfenooloksüdaasleidub viinamarjades ja Botrytis cinerea toodetud lakaasis [12].
Ensümaatilineoksüdatsioonesineb peamiselt viinamarjavirdes, kuid veini edasine pruunistumine võib olla tingitud keemilistest oksüdatsioonireaktsioonidest |7,13]või Botrytis cinerea lakkaasist, mis võib veini laagerdamisel olla väga stabiilne14. Fenoolsubstraatidel võib esineda kaks oksüdatsiooni ensümaatilist aktiivsust: monofenooloksüdaasi aktiivsus, mida iseloomustab olemasoleva hüdroksüülrühma külgneva positsiooni hüdroksüülimine ja difenooloksüdaasi aktiivsus, mis vastab orto-dihüdroksübenseenide oksüdeerumisele orto-bensokinoonideks.
Rahvusvahelise Biokeemia ja Molekulaarbioloogia Liidu (NC-IUBMB) nomenklatuurikomitee andmetel katalüüsivad neid ensümaatilisi aktiivsusi EC1-klassi ensüümid, mis vastavad oksidoreduktaasidele. Nende hulgas on polüfenoolide oksüdatsiooni katalüüsivate oksidoreduktaaside kolm peamist klassi EC1.14.18.1 (monofenoolmonooksügenaas), EC1.11.1 (peroksidaas/POD) ja EC1.10.3 (difenoolidele mõjuvad oksidoreduktaasid).
See viimane klass on jagatud erinevatesse alamklassidesse ja kaks neist tundusid selle uuringu jaoks eriti huvitavad: EC1.10.3.1 (polüfenooloksüdaas / PPO) ja EC1.10.3.2 (laktaas) (vt lisamaterjalide joonist S1).
PPO, lakkaas ja peroksidaas on oksüdoreduktaasid, mis vastutavad peamiselt pruunistumise eest viinamarjade töötlemisel [13]. POD-i põhjustatud pruunistumine on puuviljades tühine, kuid võib PPO-ga kombineerituna suurendada fenoolide lagunemist[15]. PPO esineb viinamarjades looduslikult ja on võimeline katalüüsima monofenoolide oksüdeerumist katehhoolideks ja katehhoolide oksüdeerumist pruunideks pigmentideks [8,13,16]. Botrytisega nakatunud viinamarjades esinevatel lakkaasidel on laiem toimespekter|17|, kuna need võivad katalüüsida paljude erinevate substraatide oksüdatsiooni. Peamised lakkaaside oksüdatsiooni sihtmärgid jäävad 1-2 ja 1-4 dihüdroksübenseeniks.
Veinis võib oksüdatsiooni teel toodetud bensokinoon (PPO või lakkaasid) kergesti läbida täiendavaid reaktsioone, sõltuvalt nende redoks-omadustest ja elektroonilistest afiinsustest [15]. Need võivad toimida elektrofiilidena ja reageerida aminoderivaatidega [18] või toimida oksüdeerijatena ja reageerida muu hulgas fenoolsete substraatidega. Sõltuvalt nende keemilisest konformatsioonist (kinoon või poolkinoon) võib bensokinoon põhjustada erinevaid oksüdatsioonireaktsiooni saadusi. Neutraalse pH juures oksüdeeritakse (pluss)-katehiin kinoniks A-tsükli asendis C5 või C7 ja moodustub kuus võimalikku dimeerset isomeeri, mis viitavad sidemele B-tsükli positsioonide C2', C5' või vahel. Ülemise katehhiini üksuse C6' ja alumise üksuse A-rõnga asend C6 või C8 [19,20]. Dehüdrodikatehhiin on selle sidestuse tuntud toode [21]. Struktuuride märgistuspositsioonid on näidatud joonisel 1. Happelistes tingimustes võivad poolkinoonivormid esineda ka B-tsüklil (positsioon OH3' või OH4') ja viia nelja võimaliku dimeerse isomeerini [20,22]. ülemine katehhiini üksus ja alumise üksuse A-rõngas (asend C6 või C8). Katehhiini ensümaatilist oksüdatsiooni uuriti varasemates uuringutes [22, 23] ja sellega seotud oksüdatsiooniprodukte iseloomustati HPLC-ga [24], kuigi harvemini eraldati ja NMR-ga kunagi täielikult ei iseloomustatud.
Selle töö eesmärk oli esmalt võrrelda UHPLC-MS abil dimeersete (pluss)-katehhiini oksüdatsiooniproduktide profiile kolme oksüdoreduktaasi ekstrakti juuresolekul, st viinamarjadest ekstraheeritud PPO ja Botrytis cinerea seene lakkaas, mis esineb botrütiseeritud magusates veinides. [14] ja lakkaas firmalt Trametes Versicolor.
Teine eesmärk oli poolsünteesida ja iseloomustada mõnede dimeersete oksüdatsiooniproduktide struktuure TMR-spektroskoopia abil, mis saadi Trametes Versicolori lakaasiga.
2. Tulemused ja arutelu
2.1. Kolme erineva oksüdoreduktaasi ja (pluss) katehhiiniga dimeersete reaktsioonitoodete profiilide võrdlus
(pluss)-Katehhiin oksüdeeriti esmakordselt Trametes Versicolori laktaasi juuresolekul pH 3,6 juures veini mudellahuses. Pärast dimeerse fraktsiooni eraldamist jääk(pluss)-katehhiinist ja teistest polümeersetest fraktsioonidest koguti ja analüüsiti UHPLC-UV-MS-ga kaheksa peamist fraktsiooni, mis märgiti N1-st N8-ni kasvavas retentsiooniaja järjekorras (tabel 1). Elektropihustusmassispektrid positiivses režiimis näitasid ioonide piike [M pluss H] pluss m/z 579 juures N1 kuni N6 jaoks, mis hüpoteetiliselt vastas dimeerile, mis moodustub üksiksidemega kahe katehhiini ühiku vahel, ja [M pluss H] pluss m/577 N7 ja N8 puhul, mis viitab hüpoteetiliselt täiendava sideme tekkele.
Need kaheksaoksüdatsioonfraktsioone täheldati potentsiaalselt pärast tanniini fraktsiooni keemilist depolümerisatsiooni varasemates töödes [25, 26] ja need võivad olla samad, mida on juba kirjeldanud Guyot et al. [20], isegi kui katsetingimused olid veidi erinevad. Tõepoolest, selles eelmises uuringus kasutati kaheksa fraktsiooni saamiseks puhastamata PPO ekstrakti pH 3 ja 6 juures. Käesolevas uuringus võrreldi kolme erinevat ensüümi pH 3,6 juures veini mudellahuses. Kolme erineva ensüümiga (Trametes Versicolori lakkaas, Botrytis cinerea lac-case ja viinamarjadest ekstraheeritud polüfenooloksüdaas) saadud peamiste oksüdatsioonifraktsioonide LC-MS võrdlev analüüs on esitatud tabelis 2. Iga kaheksa fraktsiooni kohta retentsiooniajad olid peaaegu identsed erinevate ensüümidega ja sarnased m/z määrati MS analüüsiga. Need tulemused toetavad hüpoteesi, et iga ensüümi jaoks saadi samad fraktsioonid, mis sisaldasid tooteid, mille struktuur sarnaneb Guyoti jt hüpoteesiga. [20]. Lopez-Serrano ja Ros Barcel6 [27] viisid läbi ka (pluss)-katehhiini oksüdatsiooniproduktide võrdleva uuringu kahe erineva ensüümiga: peroksüdaas ja polüfenooloksüdaas, mõlemad ekstraheeriti maasikatest. Nad jõudsid järeldusele, et kahe ensüümiga saadud tooted olid kvalitatiivselt samad. Täiendavat ühendit nimega N4', mille m/z=578 Th ja Rt=15.66 min, täheldati katsetes Botrytis cinerea lakkaasiga ja ekstraheeritud PPO-ga, kuid mitte Trametes Versicolori lakkaasiga, mis viitab võimalikele erinevustele. reaktsioonivõime nende ensüümide suhtes.
2.2. 1H-NMR fenoolsete ja alifaatsete OH signaalide füüsikalis-keemiliste parameetrite uurimine ja optimeerimine
Protsüanidiinide dimeeride struktuurse iseloomustuse saab saada NMR analüüsiga. Täpsemalt saab üksuste vahelise seose täpse asukoha määrata HMBC ja/või ROESY korrelatsioonispektrite [28, 29] abil (joonised S2 ja S3). Eeter-tüüpi (COC) sideme korral on vajalik hüdroksüülsignaali prootonite omistamine. Samuti võib CC-sidemete puhul olla oluline, kui mõned alifaatsed või aromaatsed prootonid kattuvad või kui mõned võtmekorrelatsioonid puuduvad. Kuid isegi aprotoonses lahustis ilmnevad polüfenoolide hüdroksüülprootonid sageli laiade signaalidena, millest pole võimalik saada struktuurset teavet [30]. Seda probleemi lahendati esialgu jälgide lisamisega
Cd(NO3)2 proovilahustes. Tõepoolest, OH-rühmade laiaulatuslikud signaalid on tingitud molekulidevahelisest vahetusest nende OH-prootonite ja teiste lahustis või lahustunud aine prootonite vahel. Molekulidevahelisi sidemeid vähendades võib kaadmiumnitraadi esinemine proovides neid vahetusi vähendada, parandades seega OH prootonisignaalide teravust.
2.2.1.Kaadmiumi lisamise mõju
Pärast külmkuivatamist lahustati viis fraktsiooni N2, N3, N4, N6 ja N8 atsetoonis dg. Seejärel saadi 1D prootoni NMR spektrid 25 kraadi juures enne (joonis 2A) ja pärast väikese koguse kaadmiumi lisamist (joonis 2B). Puhtal atsetoonis ilmnesid kõigi fraktsioonide fenoolsed OH prootonid laiade piikidena. Pärast kaadmiumi lisamist näitasid need prootonid fraktsioonide N6 ja N8 puhul kõrge eraldusvõimega signaale, samas kui fraktsioonide N2, N3 ja N4 puhul olid signaalid vaid veidi teravamad. Samuti tuleks mainida, et Cd sisalduse suurendamine ei mõjutanud OH signaali eraldusvõimet, kuna proovidele järjestikuste väikeste koguste Cd lisamisel ei täheldatud piigi joonelaiuse teravust ega laiust (andmeid pole näidatud).
Toodete N2, N3 ja N4 kõrge eraldusvõimega fenoolsed OH signaalid saavutati tänu täiendavale kuivatamisele ja uuesti lahustamisele (joonis 2C, D).
Käitumise erinevust Cd lisamisel fraktsioonide vahel võib seletada molekulaarsete interaktsioonide tugevusega: N2, N3 ja N4 puhul on see tugevam võrreldes N6 ja N8-ga, nende sidemete katkestamiseks on vajalik täiendav samm.
See lisaetapp võib olla võtmeetapp Cd kasutamisel kõrge lahutusvõimega fenoolsete OH signaalide saamiseks igas olukorras, olenemata proovide päritolust, sünteesireaktsioonist või looduslikest polüfenoolsaadustest.
Eelmine töö, mis käsitles üheselt mõistetavat struktuuri iseloomustamistpolüfenool1996. aastal avaldati tänu kaadmiumnitraadi lisamisele kõrge eraldusvõimega OH fenoolseid NMR signaale kasutavaid dimeerisid[30]. Sellest ajast peale pole meile teadaolevalt ühtegi teist seda metoodikat kasutavat uurimistööd avaldatud. Selle eesmärgi saavutamiseks viidi hiljem läbi muid uuringuid, kas pikriinhappe doseeritud lisanditega [31] või kasutades madalat kogumistemperatuuri [32]. Seda võib seletada edasise sammuga, mis on vajalik OH piigi teravusele otsustava mõju saamiseks Cd lisamisega, nagu ülalpool kirjeldatud. Kaadmium näib siiski olevat väga väärtuslik, kuna erinevalt pikriinhappest või NMR spektri kogumisest madalatel temperatuuridel on võimalik saada kõrge lahutusvõimega signaale ilma, et oleks vaja lisada täpseid koguseid.
2.2.2. Temperatuuri mõju
Temperatuuri langus 25 kraadilt 15 kraadile ei mõjutanud fenoolsete OH või alifaatsete OH signaalide teravust. Sellegipoolest võimaldasid vahetatavate prootonite piikide nihked allapoole eraldada mõned kattuvad fenoolsed ja alifaatsed OH-signaalid, muutes nende tuvastamise ilmsemaks (joonis 3). Temperatuuri alandamisega vähenes prootoni vahetuskurss ja võib oodata teravamaid alifaatseid OH piike [31]. 15 kraadine temperatuur ei ole ilmselgelt piisavalt madal, et saada hästi lahendatud alifaatseid OH-signaale. Kuid see võimaldas meil selgelt tuvastada kahe alifaatse OH prootoni resonantsi proovides N3 ja N6 ning ühe proovis N8. Proovi N2 spekter näitas ka kahte OH alifaatse prootoni signaali, mis olid 25 kraadi juures paremini eristatavad kui 15 kraadi juures (joonis 2E). Proovi N4 puhul olid alifaatse OH-st tulenevad signaalid ainult osaliselt nähtavad. spektrid, kas temperatuur oli püsiva kattumise tõttu seatud 25 kraadini või 15 kraadini C (joonis 2E).
2.3. Dimeersete standardite struktuuriline iseloomustus – NMR spektri analüüs
Fraktsioonide N2, N3, N4, N6 ja N8 NMR spektrid näitasid, et oksüdatsiooniproduktid olid kõrge puhtusastmega, kuna teiste tuvastatud ühendite signaali intensiivsus oli nende saaduste omaga võrreldes alla 10 protsendi.
Kõigis spektrites võib eristada nelja katehhiini ühikutele tüüpilist lH keemilise nihke piirkonda (joonis 2C): püraanitsüklite (C-tsüklite) alifaatsete prootonite signaale leidub piirkonnas 2,3 kuni 5.0 ppm, ja resortsinoolitsüklite (A-tsüklid) ja katehhoolitsüklite (Brings) aromaatsete signaalprootonite omad vastavalt 5,5-6,3 ppm ja 6,3-7,1 ppm. Nii A- kui ka B-tsükli OH-fenoolisignaalid ilmnesid vahemikus 7,1 kuni 10 ppm. Mõlema fraktsiooni NMR spektrid näitasid katehhiini ühikute erinevate signaalikomplektide olemasolu konstantse intensiivsuse suhtega: fraktsioonide N2, N3, N6 ja N8 spektrites täheldati kahte signaalikomplekti vastavalt dimeeride olemasolule ja N4 spektrites on neli komplekti, mis võivad vastata ühele tetrameerile, kahele dimeerile või erinevate oligomeeride segule, st ühele trimeerile pluss ühele monomeerile. Fraktsioonis N4 esinevate saaduste oligomerisatsiooniastme määramiseks viidi läbi 'H DOSY eksperiment, kasutades segu, mis sisaldas mõlema fraktsiooni N4 ja N2 alikvoote. Kõikide signaalide difusioonikoefitsiendid näitasid sarnaseid väärtusi (joonis 4), mis näitab kahe katehhiini dimeeri olemasolu fraktsioonis N4.
Tänu täielikult lahendatud OH-fenooli signaalidele, mis annavad usaldusväärseid kvantitatiivseid tulemusi, saab katehhiini ühikute vahelise seose tüübi otse tuletada piigi pindala integreerimisest. Seega näitas mõlema fraktsiooni, N3 ja N6 puhul ühe OH-fenooli (mis kuulus kas resortsinooli või katehhoolitsüklisse) ja ühe resortsinooli aromaatse prootoni puudumine eetritüüpi interflavaanilist sidet (IFL), mis viitab opositsioonile A-s. või B-rõngas ja C6- või C8-positsioon A-rõngas. Proovi N2 puhul puudus kaks aromaatset prootonit, üks B-tsüklist ja üks A-tsüklist, mis viitab CA-CB IFL-ile. Fraktsiooni N4 1D 'H spekter näitas, et B-tsükli kaks prootonit ja A-tsükli kaks prootonit puudusid. Sidemed fraktsiooni N4 dimeerühikute vahel on seega mõlemad CC tüüpi. Fraktsiooni N8 spektrid olid neljast teisest üsna erinevad. Mõned signaalid olid tüüpilised katehhiini ühikutele, milles puudus kolm OH-fenooli, üks aromaatne A-tsükkel ja üks B-tsükli prootonid, samuti üks alifaatne OH. Teisest küljest on mõned teised NMR-signaalid katehhiiniüksusele ebatüüpilised: metüleen, millel on pimendatud 13C keemilised nihked (~ 40 ppm) ja ketoonirühm (~ 192 ppm).
C-, A- ja B-tsüklite prootoni spin-süsteemid määrati nii 'H 1D kui ka 1H 2D TOCSY spektrite abil (pole näidatud). Fraktsioonide N2, N3, N6 ja N8 spektrites täheldati kahte ABMX C-rõnga pöörlemissüsteemi (tüüpiline katehhiinile) ja nelja fraktsiooni N4 spektris. Fraktsioonide N2, N3, N6 ja N8 spektrites omistati mitteseotud katehhiini üksuse A-tsükli prootonitele vastavalt kaks meta-sidestatud dubletti (J~2Hz) ja üksik aromaatse A tsükli piirkonnas. ja C6-}või C8-seotud katehhiiniüksuse A-tsükli jääkprootonile. N4 spektrites tuvastati kahe dimeeri olemasolu tõttu neli meta-sidestatud dubletti ja kaks singletti ja määrati ülalkirjeldatud viisil. B-ringi prootonite süsteeme oli ka nendest spektritest lihtne määrata ja see võimaldas meil tuvastada kaks ABM prootoni spin-süsteemi fraktsioonide N3 ja N6 dimeeride jaoks, samas kui dimeeri N2 jaoks tuvastati üks ABM ja üks AB prootoni spin-süsteem ning üks ABM ja üks AM prootoni spin süsteemid dimeeri N4 jaoks. Dimeeril N8 oli ainult üks katehhiinmonomeerile tüüpiline ABM B-rõnga pöörlemissüsteem.
2.3.1. Fraktsioonide N2, N3, N4 ja N6 dimeeride IFL-i A-rõnga asukoha määramine
Dimeeride A ringil (st C6A- või C8A-asendis) asuva silla loomine nõuab CA-seotud katehhiiniüksuse HA jääkprootoni omistamist. Tänu kõrge lahutusvõimega fenoolsetele OH-signaalidele oli lihtne lähtepunkt A-tsükliga seotud ühikute, st A-tsükli, kahe OH-fenooli prootoni tuvastamine.
had one isolated lHspin. This may be achieved using lH-13C long-range correlations, as illustrated in Figure5. The OH5A has readily been identified thanks to a correlation with the C4aC. This quaternary carbon is indeed characterized by both its chemical shift at~100 ppm and a long-range correlation observed with the H4Cprotons. OH5A also correlated with two other carbons∶ the most deshielded （δ>145 ppm） was obviously C5A, while the other (6>125 ppm) was C6A, which also showed a correlation with the other OHA phenol proton,i.e., OH7A. This latter correlated with two other carbons: a deshielded quaternary carbon（δ>145ppm） and a more shielded carbon（δ>125 ppm), mis olid kergesti omistatavad vastavalt C7A-le ja C8A-le. Kui C6A ja C8A on määratud, võib HA jääkprootoni omistada otse HSQC spektritele. Seega leiti, et see jääk-HA prooton oli H6A kõigi fraktsioonide N2, N3, N4 ja N6 jaoks. IFL katehhiini ühikute vahel tähendas seega kõigi dimeeride C8A positsiooni.
2.3.2. IFL-i B-rõnga asukoha määramine
Fraktsioonide N2 ja N4 dimeerid. Fraktsiooni N2 spektrid näitasid kahte erinevat tüüpi B-tsükli prootoni spin-süsteemi: üks AMX, mis vastab mitteseotud üksuse B-tsüklile, ja üks AM sidestuskonstandiga umbes 8 Hz, mis on iseloomulik H6'B ja H5'. C2'B-seotud üksuse B. N2 dimeeri ühikute vaheline side on seega C2'B-C8A. Fraktsiooni N4 NMR-spektrid näitasid ka erinevaid B-spin-süsteeme: kaks AMX-i, mis vastavad mitteseotud B-rõngale, ja kaks AX-spin-süsteemi, mis mõlemad kuvasid umbes 2 Hz sidestuskonstandid, mis on iseloomulikud H2'B-le ja H6'-le. C5'B-seotud üksuste B-prootonid. Pikamaa-H/13C korrelatsioonide olemasolu H6'-riba C8A vahel, mida täheldati kahe dimeeri HMBC spektris, on kooskõlas C5/'B-C8A sidemega (joonis 5).
Fraktsioonide N3 ja N6 dimeerid. Fraktsioonide N3 ja N6 spektrid näitasid kahe AMX B-ringi prootonisüsteemi olemasolu ja ühe OH fenooli signaali puudumist. Kuna kõik dimeeriühikute OHA fenoolsed prootonid tuvastati (nagu ülalpool kirjeldatud), võib puuduv OH fenoolne signaal olla kas OH3'B või OH4'B signaal.
OH-positsiooni (3'B või 4'B) saab hõlpsasti määrata ROE korrelatsioonide abil vastavalt H2'Bor H5'B-ga või kasutades pikamaa HMBC korrelatsioone, nagu on näidatud joonisel 5.
B-tsüklite jääk-OH omistamine oli hõlpsasti teostatav, kasutades kas pikamaa HMBC või ROESY korrelatsioone, nagu on näidatud joonisel 5. Dimeeri N3 puhul täheldati ROE korrelatsiooni H5'B ja jääk-OH vahel. Katehhiini üksuse B on ühendatud selle B-tsükli kaudu. See OH identifitseeriti seega kui OH4'B. Fraktsiooni N6 puhul määrati OH'B jääk OH3'B-le, kuna selle OH ja H2'B vahel täheldati ROE korrelatsiooni. Pikamaa HMBC korrelatsioonid on nende omistustega kooskõlas. Seejärel määrati nende kahe dimeeri ühenduspositsioonid järgmiselt: CO3'B-C8A ja CO4'B-C8A N3 ja N6 jaoks. vastavalt.
Fraktsioon N8. Dimeeri N8 spektrianalüüs näitas, et selle dimeeri üks ühik on katehhiin, millel on kaks sidepositsiooni, millest üks on A tsükkel, üks on C8A ja teine C-O7A asendis, kuna prootonid H8A ja OH7A on puudu. Selle dimeeri teisel ühikul olid üksikud spektriomadused, mis näitavad B-tsükli aromaatsuse kadumist ja mitmete sidemete olemasolu nii B- kui ka C-tsüklitel.
B-tsüklist tulenevad 'H NMR signaalid olid kaks dubletti 2,49 ja 2,71 ppm juures, millel oli metüleenrühmale tüüpiline geminaalne sidestus ~15 Hz (12,03 ppm) ja singlett 6,38 ppm juures, mis tuleneb etüleenprootonist. Kuna need metüleen- ja etüleeniprootonid ei olnud seotud, on need tõenäoliselt positsioonides 2'B ja 5'B. HIMBC spekter näitas kõiki korrelatsioone, võimaldades nende B-tsükli süsiniku täpset omistamist, nagu on näidatud joonisel 5. Selle ühiku H2C andis kolm korrelatsiooni B-tsükli süsinikudega: üks on metüleensüsinik ~45 ppm juures, mis seega omistati C2'B ja ülejäänud kaks süsinikuaatomitega, mis resoneerivad ~90 ppm ja ~162 ppm juures, mida saab omistada C1'B-le ja C6'B-le. H5'B andsid ainult tugeva 3J korrelatsiooni selle B-tsükli kahe kvaternaarse süsinikuga. : üks on süsinik, mis oli varem määratud C3'B-le (~ 95 ppm), ja teine, mis resoneeris ~ 90 ppm juures, võib seega olla omistatud C1'B-le. Seejärel järeldati, et süsinik on ~162 ppm juures C6'B.
Alifaatse OH (~ 5, 8 ppm) olemasolu C3'B positsioonis (~ 95 ppm) määrati selle ROE korrelatsiooni kaudu mõlema H2'B prootoniga. Lisaks andis OH3/B HMBC korrelatsiooni kvaternaarse süsinikuga ~192,5 ppm juures, mis on iseloomulik ketoonrühmale C4'B positsioonis.
Selle C1'B varjestus umbes 40 ppm on kooskõlas B-tsükli aromaatsuse kadumisega. Lisaks on OH puudumine teise üksuse C7A positsioonis kooskõlas eetri sidemega C1'BO-C7A.
NMR andmed näitasid, et selle üksuse C-tsüklis ei ole OH3C. C3C-O-C3'B sideme olemasolu on kooskõlas C3C varjestusega umbes 1,5 ppm, samuti C3'B keemilise nihkega, mis on tüüpiline poolketaalsele süsinikule (95 ppm).
Kokkuvõttes võimaldavad NMR spektriandmed järeldada, et see dimeer vastab dehüdrokatehhiin A-le, mida on varem kirjeldanud Winges jt.[33] ja seejärel Guyot jt.[20]
Nende NMR analüüsidega määratud kuue dimeerse ühendi struktuurid on näidatud joonisel fig 6, N2, N3, N6 ja N8 on puhtad produktid ning N4 on kahe isomeeri segu.
3. Materjalid ja meetodid
3.1.Kemikaalid
(pluss)-katehiinhüdraat 98 protsenti või suurem; Laccase firmalt Trametes Versicolor (0.94 U·mg-1); kahealuseline naatriumfosfaatdihüdraat 98% või suurem; sidrunhape (ACS reaktiiv, kaadmiumnitraadi tetrahüdraat 99,997 protsenti; sipelghape ja Amberlite XAD7HP saadi firmast Sigma-Aldrich) (Saint-Louis, MO, USA). Atsetoon-dg osteti ettevõttest Euriso-top (Saarbrüicken, Saksamaa) ja hape (TFA) firmalt Roth Labo (Karlsruhe, Saksamaa). Vesi LC-MS, atsetonitriil LC-MS (ACN) ja metanool LC-MS (MeOH) olid kõik VWR-st (Radnor, PA, USA).
3.2. Mudelveinilahuse valmistamine
Veini mudellahus oli etanooli/vee lahus (12/88;o/o) 0,033 M viinhappega, pH reguleeriti 1 M NaOH-ga 3,6-ni [34].
3.3. Toorviinamarjade PPO ekstraktid
PPO ekstrakt valmistati nii, nagu on eelnevalt kirjeldanud Singleton et al. [35]. Külmutatud viinamarjad segati esmalt atsetaatpuhvris (1,5 M, pH 5; 10 gL-I askorbiinhape). Seejärel segu filtriti ja tsentrifuugiti (3000 g; 10 min). Jääk pesti lõpuks atsetooniga (80%) ja kuivatati õhu käes.
3.4. Lakaas Botrytis Cinereast
Lakaas Botrytis cinerea'st saadi nii, nagu on kirjeldanud Quijada-Morin et al. [36]. Seda toodeti tüvest VA612 (koguti 2005. aastal Hautvillersis, Champagne'is, Prantsusmaal, viinamarjaistanduses Pinot Noir kultivarist). Lühidalt, tahkel linnasepärmi söötmel olevad kultuurid jäeti üheks nädalaks temperatuurile 24 kraadi sinise valguse all. Seejärel kaabiti eosed ja inokuleeriti 500 ml Erlenmeyeri kolbi, mis sisaldas 125 ml söödet (4{{30}} gL-1glükoosi, 7 gL{{10}}glütserool, 0,5 g·L-1L-histidiin, 0,1 g: l-1 CuSO, 1,8 gL-1 NaNO3, 0,5 g: l -1 KCl, 0,5 gL-1 CaCl2·H2O, 0,05 g:L-1 FeSO4,7H2O, 1,0 g L-1KH2PO4 ja 0,7 gL-1 MgSO 4-7H2O).Pärast 3-päevast inkubeerimist ja 2-päevast kasvu samas eelmises söötmes lisati eelkultuuridele gallushapet (2 gL{49}}). 5 päeva pärast vedel keskkond filtriti ja supernatant filtriti tangentsiaalselt Quixstandi filtreerimissüsteemis (GE Healthcare UK, Little Chalfont, Inglismaa), mis oli varustatud 30 kDa molekulmassiga membraanilt. Kontsentraadile viidi lõpuks läbi diafiltratsioon destilleeritud vee vastu ja alles jäeti ainult need fraktsioonid, millel oli oksüdeeriv toime ABTS-i suhtes (-80 kraadi).
3.5.Oksüdatsiooniprotseduur
Eelnevalt valmistati laktaasi lahus (1 gL-1) fosfaat-tsitraatpuhvris ja lisati 6 g.l -1(pluss)-katehhiini lahusele (mudelvein), et saada laktaasi lõppkontsentratsioon { {6}}.3 gL-1. Saadud lahust segati seejärel aeglaselt (180 p/min) toatemperatuuril 2 tundi. Kontsentratsioonid olid eelnevalt optimeeritud ja katse viidi läbi kolmes eksemplaris.
3.6. Reaktsioon peatub vaigul Amberlite XAD7HP
Merevaigust lite kolonni konditsioneeriti etanooliga (absoluutne) ja loputati kahe kolonni mahu milli-0 veega. Eelmine laktaasi/(pluss)-katehhiini reaktsioonikeskkond tilgutati kolonnile ja elueeriti esmalt kahe kolonni mahu milli-Qveega [37]. Seejärel kolonni elueeriti etanooliga, kuni kogutud fraktsioon oli värvitu. Ainult etanoolifraktsioone hoiti alles, aurustati ja lüofiliseeriti. Pulbrit hoiti kuni kasutamiseni temperatuuril -80 kraadi.
3.7. Dimeerse fraktsiooni puhastamise protseduur kiirkromatograafia abil
Lüofiliseeritud pulber puhastati esmalt kiirkromatograafiasüsteemiga puriflash430, mis oli varustatud UV-detektoriga, mis oli seatud 280 nm ja Puriflash diol 50 um f0025 kolonni. Binaarne liikuv faas koosnes atsetonitriilist (lahusti A) ja metanoolist (lahusti B), mõlemad hapestati 0,1% TFA-ga. Süstete seeria viidi läbi konstantse voolukiirusega 20 ml·min-1, kasutades järgmist gradienti: 100 protsenti A 4,4 minutit; 0-10 protsenti B 10 minuti jooksul; 10 protsenti B 5 minuti jooksul; 10-90 protsenti B 5 minuti jooksul; 90 protsenti B 3 minuti jooksul; 90-10 protsenti B 2 minuti jooksul; 10 protsenti B 10 minuti jooksul. Süstimismaht oli 1 ml (300 mg lüofiliseeritud pulbrit lahustatuna 1 ml lahustis A). Iga kord koguti kolm erinevat fraktsiooni. Esimene vastas jääkatehhiinile (pluss) ja kolmas oli suure molekulmassiga polüfenoolide segu. Teine elueeritud fraktsioon, mis sisaldas dimeersete oksüdatsiooniproduktide segu, aurustati ja lüofiliseeriti enne teist puhastamisetappi.
3.8. Dimeersest fraktsioonist pärit oksüdatsiooniproduktide puhastamise protseduur, kasutades poolpreparaati kromatograafilist süsteemi
Dimeerseid oksüdatsiooniprodukte sisaldav fraktsioon puhastati, kasutades poolpreparatiivset Bio-Rad NGC 10 keskmise rõhuga kromatograafiasüsteemi, mis oli varustatud pöördfaasilise Varian Dynamax C18 Microsorb kolonniga (250 × 21,2 mm; 3 um). Binaarne liikuv faas koosnes milli-O veest (lahusti A) ja 80 protsendist atsetonitriilist, 20 protsendist Milli-Q veest (lahusti B), mõlemad hapestati 0,05 protsendi TFA-ga. Lüofiliseeritud pulbri (20 mg lahustatuna 200 uL lahustis A ja 100 uL ACN-s) süstimise seeria (300 µl) viidi läbi järgmistel elueerimistingimustel: 100 protsenti A 4 minutit; 0-35 protsenti B 46 minutiga;35-100 protsenti B 2 minutiga; 100 protsenti B 5 minutiga. Iga kord koguti kaheksa erinevat fraktsiooni, mis vastavad puhastele UPLC signaalidele 280 nm juures. Iga fraktsioon aurustati ja lüofiliseeriti enne TMR analüüsi.
3.9. Proovi ettevalmistamine NMR analüüsi jaoks
Umbes 1 mg igast Eppendorfi tuubides kaalutud lüofiliseeritud pulbrist lahustati 500 µl atsetooni dg-s. Seejärel lisati proovidele ~ 10 uL kaadmiumnitraadi kontsentreeritud lahust atsetoonis-d ja saadud lahused viidi NMR analüüsiks 5 mm NMR katsutitesse. Mõnede proovide jaoks viidi läbi täiendav etapp: pärast lüofiliseeritud pulbrite lahustamist atsetoonis-dg kaadmiumi jälgede juuresolekul aurustati proovid kuivaks ja seejärel lahustati uuesti atsetoonis-d ilma täiendava Cd lisamiseta.
3.10.Instrumendi tehnilised andmed
UPLC-MS analüüs. Reaktsioone jälgiti kahe UPLC-MS süsteemi abil. Esimest kasutati toodete peetumisaegade täpseks tuvastamiseks pika gradiendi meetodil. st Watersi pöördfaasi ülikõrge jõudlusega vedelikkromatograafia, mis on ühendatud massispektromeetriaga (UHPLC-MS). Vedelikkromatograafiasüsteem oli Acquity UPLC (Waters, Milford, MA, USA), mis oli varustatud fotodioodide massiividetektoriga. Kasutasime Acquity UPLC HSS T3 kolonni (1,8 um, 2,1 × 15{13}} mm). Kolonni temperatuur oli 25 kraadi. Binaarne liikuv faas koosnes 0,1 protsendilisest sipelghappest vees (lahusti A) ja atsetonitriilist (lahusti B). Eraldamine viidi läbi konstantse voolukiirusega 0,25 ml·min-1, kasutades järgmist gradienti: 8-11 protsenti B 2 minuti jooksul; 11 protsenti B 8 minuti jooksul; 11-25 protsenti Bin 15 minuti jooksul;25-55 protsenti Bin 5 min;55-99 protsenti Bin 1 min; 99 protsenti B 4 minuti jooksul; 99-8 protsenti Bin1 min; 8 protsenti B 4 minutiks. Süstimismaht oli 5 μL. Massispektromeeter oli Waters Acquity QDa elektropihustusionisatsiooni (ESI) lihtne kvadrupool (Waters, Milford, MA, USA). Kapillaari pingeks määrati 0,8 kV. Massispektrid saadi massivahemikus 200-900 Lahjenda positiivsete ioonide režiim.
Teine UHPLC-MS-süsteem, mida kasutati puhastamisetappide ajal kiireks kontrollimiseks, oli sama, mida eelnevalt kirjeldatud, Acquity UHPLC HSS T3 kolonniga (1,8 μm, 2,1 × 100 mm) kuumutati. 38 kraadi juures. Eraldamine viidi läbi konstantsel voolukiirusel 0,55 ml·min{10}}, kasutades järgmist kiiret gradienti: 0,{12}} protsenti B 5 minuti jooksul; 40-99 protsenti B 2 minutiga; 99 protsenti B 1 minuti jooksul; 99-0,1 protsenti B 1 minutiga. Süstimismaht oli 2 μL. Massispektromeetriks oli Bruker Amazon X elektropihustusionisatsiooni (ESI) ioonilõks (Bruker Daltonics, Bremen, Saksamaa). Kapillaari pingeks määrati -5,5 kV. Massispektrid saadi massivahemikus 50-2000 Lahjenda positiivsete ioonide režiim.
Kõik UPLC-MS analüüsid viidi läbi kolmes korduses.
NMR aparatuur. Kõik NMR-spektrid registreeriti Agilent DD{{0}} MHz spektromeetriga (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), mis töötas prootoni- ja süsiniku{5}} tuumade jaoks sagedustel 500,05 ja 125,74 MHz, kasutades vastavalt 5 mm kaudset tuvastussondi, mis oli varustatud gradientmähisega.1D'H ja 13C,2Dhomonuclear1H TOCSY ja ROESY ning heteronukleaarsed lH/13C HSQC ja HMBC Katsed viidi läbi klassikaliste impulssjärjestuste abil ja analüüsiti nii VNMRJ4.2 kui ka MestReNo2.1 MestReNova. .1 (Mestrelab Research, Hispaania) tarkvara. DOSY mõõtmised saadi ja töödeldi nagu eelnevalt kirjeldatud 38]. DgcsteSL-i impulssjärjestuse saamise parameetrid olid järgmised: difusiooni viivitusaeg ja gradiendi impulsi laius määrati vastavalt 50 ms ja 2 ms, gradiendi tugevust (g) suurendati 16 sammu võrra võrdse g2 vahega 0,3 kuni 0,3 kuni 2 ms. 32G·cm-I. Pärast faasikorrektsiooni koostati VNMRJ4.2 tarkvara abil piigi kõrguse mõõtmisest 2D DOSY spektrid.
Kõik spektrid viidati lahusti atsetoon-dg signaalidele ('H jääksignaal 2,05 ppm ja 13C signaal 29,92 ppm).
4. Järeldused
Uuriti kolme erineva oksüdoreduktaasi (viinamarjadest ekstraheeritud polüfenooloksüdaas, Botrytis cinerea laktaas ja Trametes Versicolori laktaas) (pluss)-katehhiini toimet ning LC-UV-MS tulemuseks saadud profiilid olid väga sarnased, kuigi mõned väikesed erinevused soovitas nende ensüümide reaktsioonivõime võimalikke erinevusi.
Kuue katehhiin-lakaasi oksüdatsiooniprodukti (kasutades Trametes Versicolori laktaasi) struktuurid saadi spetsiifiliste NMR-signatuuride põhjal (neli puhast toodet, st N2, N3, N6 ja N8 ning N4, mis vastavad segule kaks isomeeri). Fenoolsete OH-signaalide täielik omistamine oli võimalik tänu kaadmiumnitraadi lisamisele proovi ettevalmistamise protseduuriga, mis võimaldas mõne huvipakkuva ühendi katehhiini ühikute vahelisi sidemeid ühemõtteliselt omistada. See protseduur lihtsustab oluliselt kas sünteesitud või looduslikest saadustest ekstraheeritud polüfenoolide segude NMR analüüsi.
Selles töös saadud standardeid võib tulevikus kasutada oksüdatsioonimarkeritena, et uurida nende olemasolu ja arengut viinamarjade küpsemise ja veini vananemise ajal. Lisaks katehhiinile võib laktaasi substraatidena kasutada ka teisi polüfenoolühendeid, sealhulgas flavonoide ja mitteflavonoide, et saada uusi uusi standardeid.
Lühendid
NMR: tuumamagnetresonants,
CD: kaadmium,
TOCSY: täielik korrelatsioonispektroskoopia,
ROESY: pöörleva raamiga tuuma Overhauseri efekti spektroskoopia,
HSQC: heterotuuma ühe kvantkorrelatsioonikatse,
HMBC: heteronukleaarne mitmeribaline ühenduvus,
DOSY: difusioonijärjekorras spektroskoopia.
Viited
1. Khan, N.; Mukhtar, H. Teepolüfenoolid tervise edendamiseks. Life Sci. 2007, 81, 519–533. [CrossRef]
2. Fayeulle, N.; Vallverdu-Queralt, A.; Meudec, E.; Hue, C.; Boulanger, R.; Cheynier, V.; Sommerer, N. Kääritatud kakaoubade uute flavan{2}oli derivaatide iseloomustus. Food Chem. 2018, 259, 207–212. [CrossRef] [PubMed]
3. Rimbach, G.; Melchin, M.; Moehring, J.; Wagner, AE polüfenoolid kakaost ja veresoonte tervis – kriitiline ülevaade. Int. J. Mol. Sci. 2009, 10, 4290–4309. [CrossRef]
4. Avram, AM; Morin, P.; Brownmiller, C.; Howard, LR; Sengupta, A.; Wickramasinghe, SR Polüfenoolide kontsentratsioon mustikajääkide ekstraktist nanofiltratsiooni abil. Food Bioprod. Protsess. 2017, 106, 91–101. [CrossRef]
5. Antoniolli, A.; Fontana, AR; Piccoli, P.; Bottini, R. Polüfenoolide iseloomustus ja antioksüdantide võime hindamine viinamarjajääkides Cv. Malbec. Food Chem. 2015, 178, 172–178. [CrossRef]
6. Saucier, C. Kuidas arenevad veini polüfenoolid veini laagerdumisel? Cerevisia 2010, 35, 11–15. [CrossRef]
7. Oliveira, CM; Ferreira, ACS; De Freitas, V.; Silva, AMS Veinides esinevad oksüdatsioonimehhanismid. Food Res. Int. 2011, 44, 1115–1126. [CrossRef]
8. Singleton, VL hapnik fenoolidega ja sellega seotud reaktsioonid virdes, veinides ja mudelisüsteemides: tähelepanekud ja praktilised tagajärjed. Olen. J. Enol. Vitic. 1987, 38, 69–77.
9. Mathew, AG; Parpia, HAB Toidu pruunistamine polüfenoolireaktsioonina. In Advances in Food Research; Chichester, CO, Mrak, EM, Stewart, GF, toim. Academic Press: Cambridge, MA, USA, 1971; 19. köide, lk 75–145. [CrossRef]
10. Gambuti, A.; Rinaldi, A.; Ugliano, M.; Moio, L. Fenoolsete ühendite areng ja kokkutõmbumine punase veini laagerdamisel: hapnikuga kokkupuute mõju enne ja pärast villimist. J. Agric. Food Chem. 2013, 61, 1618–1627. [CrossRef] [PubMed]
