Galektiin{0}} omab nekroptootilist ja apoptootilist toimet tsisplatiinist põhjustatud ägeda tubulaarnekroosi korral

Kontakt: ali.ma@wecistanche.com

Suhail Al-Salama jt

Cistanche tubulosa annus neeruhaiguste korral, proovi saamiseks klõpsake siin

Abstraktne

Taust/eesmärgid:Ägeneerudvigastus (AKI) on rahvatervise koorem, millega kaasneb suurenenud haigestumus, suremus ja tervishoiukulud. Seda seostatakse suurenenud riskiga krooniliste haiguste tekkeksneerudhaigus ja surm. Äge tubulaarnekroos (ATN) on AKI kõige levinum põhjus. Apoptoos ja kudede nekroos mängivad ATN-is olulist rolli. Galektiin 3 (GAL-3), beeta-galaktosiidi siduv lektiin, omab teadaolevalt rolli põletikus, apoptoosis ja oksüdatiivses stressis, kuid selle roll tsisplatiinist põhjustatud ägedas tubulaarses nekroosis ei ole selgelt välja selgitatud.

Meetodid:Isaseid C57B6-J ja C57BL-6 –GAL-3 knock-out hiiri kasutati ATN esilekutsumiseks, kasutades ägeda tubulaarse nekroosi tsisplatiini hiiremudelit. GAL-3 ekspressioon, apoptootilised, nekrootilised ja nekroptootilised valgudneerudmõõdeti standardsete histoloogiliste, immunohistokeemiliste ja ensüümiga seotud immunosorbentanalüüside meetodite abil. Andmed esitati kui keskmine ± SE Statistiliselt olulised erinevused (lk<0.05) were="" calculated="" between="" experimental="" groups="" and="" corresponding="" control="" groups="" by="" one-way="" analysis="" of="">

Tulemused:Aastal GAL{0}} suurenes märkimisväärseltneerudtsisplatiiniga töödeldud GAL-3 metsikute hiirte seas, võrreldes selle kontrollhiirtega. Lisaks oli perioodil oluliselt suurem ATN protsent, kõrgem plasma uurea ja kreatiniini tase ning kõrgem katepsiin B ja katepsiin D tase.neerudtsisplatiiniga töödeldud GAL-3 KO hiirtest kui tsisplatiiniga töödeldud GAL-3 metsikutest hiirtest. Samuti oli nekroptoosivalkude RIPK1, RIPK3 ja MLKL tase oluliselt kõrgem.neerudtsisplatiiniga töödeldud GAL-3 KO hiirtest kui tsisplatiiniga töödeldud GAL-3 metsikutest hiirtest. Lisaks oli nende tase oluliselt kõrgemneerudpro-apoptootilised valgud; lõhustatud kaspaas-3, lõhustatud PARP, TRAIL ja FAS tsisplatiiniga töödeldud GAL-3 KO hiirtel, võrreldes tsisplatiiniga töödeldud GAL-3 metsikute hiirtega.

Järeldus:GAL-3 võib tsisplatiinist põhjustatud ägeda tubulaarse nekroosi ajal mõjutada rakkude ellujäämist ja surma, toimides neerutuubulites nekroptootiliste, apoptootiliste ja ellujäämist soodustavate valkudega.

Võtmesõnad: Neer• Äge tubulaarnekroos • Tsisplatiin • Galektiin-3 • Nekrotoos • Apoptoos

Sissejuhatus

Ägeneerudvigastust (AKI) iseloomustab järsult vähenenudneerudfunktsioon, mis põhineb seerumi kreatiniinitaseme tõusul, uriinierituse vähenemisel, neeruasendusravi vajadusel või nende tegurite kombinatsioonil [1].

TheNeerHaigust parandava globaalse tulemuse (KDIGO) kliinilise praktika juhistes AKI jaoks on AKI defineeritud kui seerumi kreatiniinisisalduse tõus, mis on suurem või võrdne 0,3 mg/dl (suurem või võrdne 26,5 µmol/l) 48 tundi; või seerumi kreatiniinisisalduse tõus 1,5-kordsest algväärtusest või sellega võrdne, mis on teadaolevalt või oletatavalt toimunud viimase 7 päeva jooksul; või uriini maht<0.5 ml/kg/h="" for="" 6="" hours="">

Äge tubulaarnekroos (ATN) on AKI tavaline põhjus [3]. Isheemilised ja nefrotoksilised häired on ATN-i peamised põhjused [3]. Vaatamata ulatuslikele ATN-i uuringutele, mis hõlmavad rakukahjustusi, rakusurma ja regeneratsiooni, ei ole nende aluseks olevad mehhanismid selgelt määratletud.

Apoptoos on kaspaaside poolt vahendatud programmeeritud rakusurma vorm. Olulised aruanded on näidanud, et apoptoos mängib ATN-is olulist rolli [3, 4]. Teisest küljest on nekroos rakusurma vorm, mida iseloomustab varajane plasmamembraani läbilaskvus, organellide turse ja raku sisu lagunemine [5]. Nekroos tekib sageli siis, kui rakud puutuvad kokku liigse välise stressiga. Nekroosi on traditsiooniliselt peetud passiivseks ja programmeerimata; seetõttu on nekroosi mehhanismi uurimiseks tehtud väga vähe jõupingutusi, hoolimata selle levimusest inimeste haigustes [5]. Hästi tunnustatud nekroosi tüüp on nekroptoos [5]. Nekrotoos on programmeeritud mitteapoptootiline rakusurm, mille põhjustavad mitmed rakuvälised stiimulid, näiteks kasvaja nekroosifaktor (TNF) [5]. Algselt määratleti see rakusurmana, mida iseloomustab nekrootiline rakusurma morfoloogia koos retseptoritega interakteeruva seriini/treoniini valgu kinaasi 1 (RIPK1) aktiveerimisega. RIPK1 aktiveerib retseptoritega interakteeruva seriini/treoniini valgu kinaasi 3 (RIPK3), moodustades kompleksi, mida nimetatakse nekrosoomiks [6]. Hiljem omandab aktiveeritud RIPK3 võime fosforüülida ja aktiveerida segaliini kinaasi domeenilaadset (MLKL) [6]. Fosforüülitud MLKL-i molekulid on võimelised moodustama oligomeere, et hõlbustada nende translokatsiooni rakumembraanile, seondudes fosfatidüülinositooli lipiidide ja kardiolipiiniga. Translokeeritud MLKL-i oligomeerid toimivad rakumembraanis kanalitena, et kutsuda esile kas naatriumi sissevoolu ja kaaliumiioonide väljavoolu [7] või alternatiivselt kaltsiumiioonide sissevoolu [8]. Mõlemal juhul põhjustab see nekrootilise rakusurma plasmamembraani läbilaskvuse ja rebenemise kaudu, mis viib rakusisese sisu lekkimiseni elundisse.

Selles projektis oleme kasutanud ägeda tubulaarse nekroosi esilekutsumiseks tsisplatiini (Cis). Cisil on lai valik kasvajavastaseid toimeid ja seda on kasutatud erinevate pahaloomuliste kasvajate raviks [9]. Sellegipoolest on nefrotoksilisus peamine kõrvaltoime ja seda iseloomustavad neerutuubulite rakkude nekroos, koekahjustused, neerufunktsiooni häired ja ägeneerudebaõnnestumine [10]. Vaatamata mitmesugustele meetmetele, mida on võetud neerukahjustuse ületamiseks, mõjutab AKI peaaegu 4–23 protsenti patsientidest [11]. Tsisplatiini poolt indutseeritud neerukahjustuse teadaolevad mehhanismid hõlmavad apoptoosi, oksüdatiivset stressi ja põletikulist reaktsiooni, mis on tingitud neerutorukeste epiteelirakkude ja neeruveresoonte otsesest vigastusest [12].

Galektiin-3 (GAL-3), 35 kDa valk, on ainulaadne kimääritaoline valk, millel on üks C-terminaalne süsivesikute tuvastamise domeen (CRD), mis on ühendatud pika N-terminaalse domeeniga (ND) [13 ].GAL-3 leidub raku pinnal, tsütoplasmas ja raku tuumas, samuti rakuvälises maatriksis [13].

Intratsellulaarne GAL{0}} on osalenud rakkude proliferatsioonis ja apoptootilistes mehhanismides [14, 15]. See mõjutab K-Ras- ja Akt-valke ning reguleerib seega ka diferentseerumise ellujäämist ja surma [14, 15]. Samal ajal kui rakuväline GAL-3 vahendab raku-raku adhesiooni, raku-maatriksi interaktsiooni ja signaaliülekannet, põletikku ja apoptoosi [16].

On näidatud, et GAL-3 liigub pärast apoptootiliste stiimulitega kokkupuudet kas tsütosoolist või tuumast mitokondritesse ja blokeerib muutused mitokondriaalse membraani potentsiaalis, hoides sellega ära apoptoosi [17]. Uuringud on samuti näidanud, et GAL-3 võib AKT aktiveerimise kaudu inhibeerida TNF-indutseeritud apoptoosi [18]. Teised uuringud on näidanud, et GAL{5}} ja Beclin1 osalevad programmeeritud rakusurma, apoptoosi ja autofagia kahes koordineeritud rajas [18]. Selles projektis oletame, et GAL{8}} omab ägeda tubulaarse vigastuse korral neerutorukeste epiteeli kaitsvat rolli. Oleme kasutanud ägeda tubulaarse kahjustuse hiire mudelit, et uurida GAL-3 kaitsvat rolli tsisplatiinist põhjustatud ägedate tubulaarsete vigastuste korral neerufunktsioonide (plasma uurea ja kreatiniini) mõõtmise kaudu.neerudnekroptoosivalgud (RIP-1, RIP-3 ja MLKL), nekroosivalgud (katepsiin D ja katepsiin B), apoptoosivalgud (lõhustatud kaspaas-3, lõhustatud PARP, TRAIL ja FAS) ja rakkude ellujäämise markerid (p-NF-κB, beeta-kateniin ja Wnt), kasutades standardset ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi, biokeemilist analüsaatorit, histoloogilisi ja immunohistokeemilisi protseduure.

Materjalid ja meetodid

Oleme kasutanud hiire eksperimentaalset ägeda mudeli mudelitneerudvigastus, mida on kirjanduses laialdaselt kirjeldatud ja kasutatud ägedate haiguste uurimiseksneerudvigastused laborites kogu maailmas [19].

Ägeda tubulaarse nekroosi hiiremudel

Kasutati 25-30 g kaaluvaid C57BL/6 ja C57BL/6 –GAL-3 knock-out (KO) hiiri. Hiiri peeti standardse dieediga. Enne tsisplatiini manustamist hoiti hiiri viis inimest puuri kohta 12-tunnise valguse ja pimeduse ajakava järgi vähemalt 1 nädal.

Tsisplatiini (EBEWE Pharma GmbH Nfg. KG, Unterach, AUSTRIA) kasutati värskelt manustamispäeval kontsentratsioonis 0,5 mg/ml. Hiirtele manustati intraperitoneaalselt (IP) kas 30 mg/kg kehakaalu kohta tsisplatiini [11] või vehiikulit (tavalist soolalahust), misjärel oli hiirtel taas vaba juurdepääs toidule ja veele. Eutanaasia meetod algas anesteetikumide intraperitoneaalse süstimisega, mis sisaldas ketamiini (100 mg/kg) ja ksülasiini (10 mg/kg) kombinatsiooni, seejärel eemaldati neerud ja 96 tundi pärast tsisplatiini manustamist võeti vereproovid. Veri koguti EDTA vacutainerites.NeerudSeejärel resekteeriti, pesti jääkülmas fosfaatpuhverdatud soolalahuses (PBS), pool igast neerust külmutati kohe vedelas lämmastikus ja säilitati hiljem –80 kraadises sügavkülmikus. Teine pool fikseeriti kohe 24 tunni jooksul 10% puhverdatud formaalses soolalahuses. Kogutud verd tsentrifuugiti kiirusel 3000 p/min 15 minutit. Plasma koguti, jaotati alikvootidega ja säilitati -80 kraadi juures kuni edasise analüüsini.

Proovide töötlemine valgu ekstraheerimiseks

Kogu valk ekstraheeritineerudproove homogeniseerides lüüsipuhvriga ja kogudes supernatanti pärast tsentrifuugimist. Kogu rakulüsaadi jaoks neeruproovid sulatati, kaaluti ja pandi külma lüüsipuhvrisse, mis sisaldas 5{{20}} mM Tris, 300 mM NaCl, 1 mM. MgCl2, 3 mM EDTA, 20 mM -glütserofosfaat, 25 mM NaF, 1% Triton X-100, 10 w/v glütserooli ja proteaasi inhibiitori tablett (Roche Complete proteaasi inhibiitor kokteilitabletid). Neerud homogeniseeriti jääl homogenisaatoriga (IKA T25 Ultra Turrax). Seejärel tsentrifuugiti proove kiirusel 14000 pööret minutis 15 minutit 4 kraadi juures, supernatant koguti, jaotati alikvootideks ja säilitati kuni edasise analüüsini temperatuuril –80. Tuuma- ja tsütoplasmavalgu ekstraheerimine viidi läbi vastavalt mujal kirjeldatud protokollile [19]. Lühidalt öeldes sulatati neeruproovid jääl, kaaluti ja homogeniseeriti jääl puhvriga, mis sisaldas Tris HCl 10 mmol/l, CaCl2 3 mmol/l, MgCl2 2 mmol/l, EDTA 0,1 mmol/l. , fenüülmetaansulfonüülfluoriid (PMSF) 0,5 mmol/l, sahharoos 0,32 mmol/l, ditiotreitool (DTT) 1 mmol/l, Nonidet P-40 (NP-40) 0,5 protsenti ja proteaasi inhibiitori kokteil 1 protsent . Homogenaate tsentrifuugiti kiirusel 800 p/min 10 minutit. Supernatant eemaldati ja hoiti tsütoplasmaatiliste fraktsioonidena. Pelletit pesti kaks korda homogeniseerimispuhvriga ilma NP-40 ja resuspendeeriti madala soolasisaldusega puhvriga, mis sisaldas HEPES 20 mmol/l, MgCl2 1,5 mmol/l, KCl 20 mmol/l, EDTA 0,2 mmol/l. /l. Glütserool 25 protsenti, PMSF 0,5 mmol/l ja DTT 0,5 mmol/l. Pärast 5-minutilist jääl inkubeerimist võrdne maht kõrge soolasisaldusega puhvrit, mis sisaldab HEPES 20 mmol/l, MgCl2 1,5 mmol/l, KCl 800 mmol/l, EDTA 0,2 mmol/l. Lisati 25% glütserool, PMSF 0,5 mmol/l, DTT 0,5 mmol/l, NP-40 1% ja proteaasi inhibiitori kokteil 1%, segu inkubeeriti jääl 30 minutit, tsentrifuugiti kiirusel 14000 RPM 15 minutit. minutit 4 kraadi juures ja supernatandid salvestati tuumafraktsioonina. Valgu üldkontsentratsioon määrati BCA valguanalüüsi meetodil (Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kit).

Proovide töötlemine histoloogia jaoks

Neerud lõigati välja, pesti jääkülma PBS-ga ja kaaluti. Iganeerudjagati kaheks pooleks ja kumbki pool oli kassett ja fikseeriti otse 10% puhverdatud formaliinis. Sektsioonid dehüdreeriti kasvavas kontsentratsioonis etanoolis, puhastati ksüleeniga ja sisestati parafiiniga. Kolme µm lõigud valmistati parafiiniplokkidest ja värviti hematoksüliini ja eosiini ning perioodhappe Schiffi (PAS) peitsidega, kasutades standardseid protseduure [20]. Värvitud sektsioone hindas selles projektis osalenud histopatoloog.

Immunohistokeemia

Viie µm lõigud deparafineeriti ksüleeniga ja rehüdreeriti gradueeritud alkoholiga. Seejärel asetati lõigud kõrge pH-ga (pH 9) Retrieval Solutionisse 20 minutiks veevanni temperatuuril 95 °C. Seejärel pesti sektsioone destilleeritud veega 5 minutit ja seejärel TBST puhvriga 5 minutit. Seejärel töödeldi sektsioone 10 minuti jooksul peroksidaasi blokeerimisega, millele järgnes valgu blokeerimine 10 minutit. Seejärel inkubeeriti sektsioone üks tund toatemperatuuril lõhustatud kaspaasi -3 antikehaga (Rabbit Polyclonal, 1:300, Cell signaling technology, Danvers, MA USA), lõhustatud PARP antikehaga (Rabbit Polyclonal, 1: 100, raku signaalimistehnoloogia, Danvers, MA, USA), beeta-kateniinivastane antikeha (Rabbit Polyclonal, 1:100, Abcam, Cambridge, MA, USA), anti-fosfo-NF-κB antikeha (Rabbit Polyclonal, 1: 100, Abcam, Cambridge, MA, USA), anti-Wnt-3 (Rabbit Polyclonal, 1:100, Abcam, Cambridge, MA, USA), anti-RIPK1 (Rabbit polyclonal, 1:100, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), anti-RIPK3 (Rabbit polyclonal, 1:100, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) ja anti-MLKL 1 (Rabbit monoklonaalne, 1:100, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) . Pärast primaarsete antikehadega konjugeerimist inkubeeriti sektsioone sekundaarse antikehaga (EnVisionTM Detection System, DAKO, Agilent, USA) 20 minutit toatemperatuuril, millele järgnes DAB kromogeeni lisamine (EnVisionTM Detection System, DAKO, Agilent, Santa Clara, CA, USA) ja vastuvärvimine viidi läbi hematoksüliiniga. Kasutati sobivaid positiivseid kontrolle. Negatiivse kontrolli jaoks primaarset antikeha sektsioonidesse ei lisatud. Positiivseid ja negatiivseid kontrolle kasutati igas värvitud slaidide partiis (pole näidatud joonistel).

Immunofluorestsentsmärgistus

Viie μm lõigud deparafineeriti ksüleeniga ja rehüdreeriti sorteeritud alkoholiga. Sektsioonid asetati kõrge pH-ga (pH 9) väljavõtmislahusesse 95-kraadises veevannis 20 minutiks. Seejärel pesti sektsioone destilleeritud veega 5 minutit ja seejärel TBST puhvriga 5 minutit. Seejärel inkubeeriti sektsioone anti-GAL-3 antikehaga (Rabbit Polyclonal, 1:50, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, USA), anti-RIPK1 (Rabbit polyclonal, 1:50, Thermo Scientific, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), anti-RIPK3 1 (Rabbit polüklonaalne, 1:50, Thermo Scientific, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) ja anti-MLKL 1 (Rabbit monoklonaalne, 1:50, Thermo Scientific, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) üleöö toatemperatuuril. Seejärel inkubeeriti sektsioone eesli küülikuvastase Alexa Fluor 488 (Jackson Immune Research Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA, 1:100) antikehaga. Lõpuks paigaldati sektsioonid DAPI-vesilahustuvasse paigalduskandjasse (Abcam, Cambridge, MA, USA) ja vaadati Olympuse fluorestsentsmikroskoobiga. Kasutati sobivaid positiivse kontrolli sektsioone. Negatiivse kontrolli jaoks primaarset antikeha sektsioonidele ei lisatud ja kogu protseduur viidi läbi ülalmainitud viisil. Positiivseid ja negatiivseid kontrolle kasutati igas värvitud slaidide partiis (pole näidatud joonistel).

Morfomeetriline analüüs

Kaks selles uuringus osalenud uurijat tegid ägeda tubulaarse nekroosi morfomeetrilise analüüsi. Lõhustatud kaspaasi-3, lõhustatud PARP, RIPK1, RIPK3, MLKL, fosfo-NFK-B, Wnt-3, beeta-kateniini, ekspressiooni neerutuubulites morfomeetriline analüüs viidi läbi ImageJ tarkvara abil (http: //rsbweb.nih.gov/ij/). Lõhustatud kaspaas-3, lõhustatud PARP, RIPK1, RIPK3, MLKL, fosfo-NFK-B, Wnt-3, beeta-kateniin, märgistus määrati positiivsete rakkude arvu loendamisega juhuslikult valitud suure võimsusega väljad (HPF) neerudes. Positiivsete rakkude keskmine arv teisendatakse HPF-ist mm2-ks (iga mm{16}}HPF). Lõhustatud kaspaas-3, lõhustatud PARP, RIPK1, RIPK3 ja Wnt-3 märgistamisel võeti arvesse rakke

positiivne, kui esines tsütoplasmaatiline värvimismuster. MLKL-i märgistamiseks peeti rakke positiivseks, kui esines membraanne ja tsütoplasmaatiline värvimismuster. Fosfo-NFK-B ja beeta-kateniini märgistamise puhul loeti rakud positiivseks, kui esines tuuma värvumise muster.

Ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs

NeerGAL-3, katepsiin D, katepsiin B, lõhustatud kaspaasi-3, TRAIL-i ja FAS-i kontsentratsioonid määrati DuoSeti ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi (ELISA) arenduskomplekti (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) abil ) sandwich ELISA jaoks, kasutades standardprotseduuri vastavalt tootja juhistele. Neeru lõhustatud PARP kontsentratsioonid määrati Elisa võileiva jaoks mõeldud raku signaalimistehnoloogia Elisa komplekti (Danvers, MA, USA) abil, kasutades standardprotseduuri vastavalt tootja juhistele. Neerude RIPK1, RIPK3 ja MLKL kontsentratsioonid määrati MyBioSource (San Diego, CA, USA) Elisa võileiva Elisa komplektide abil, kasutades standardprotseduuri vastavalt tootja juhistele. Neeldumisnäidud tehti lainepikkusel 450 nm, kasutades 96-süvendplaadi spektrofotomeetrit (BioTek ELx800 mikroplaadi Elisa lugeja, Winooski, VT, USA). GAL-3, katepsiin D, katepsiin B, lõhustatud kaspaas-3, TRAIL, RIPK1, RIPK3, MLKL, lõhustatud PARP ja FAS kontsentratsioonid neeruproovides määrati standardkõveralt interpoleerimise teel. Tase normaliseeriti valgu üldkontsentratsioonile.

Statistiline analüüs

Kõik statistilised analüüsid viidi läbi Graph Pad Prism tarkvara versiooni 5 abil. Mitmekordsed võrdlused erinevate rühmade vahel saavutati ühesuunalise dispersioonanalüüsi (ANOVA) abil, millele järgnesid Newman Keulsi post hoc mitme vahemiku testid. Kahe rühma võrdlus saadi Studenti t-testiga. Andmed on esitatud keskmisena ± standardviga (SE). P väärtused < 0,05="" loetakse="">

Tulemused

Tsisplatiinist põhjustatud äge tubulaarnekroos

Tsisplatiiniga töödeldud GAL-3 metsikrühm näitab ATN-i, mis hõlmab (67,29 protsenti ± 2,392) neeru parenhüümi (joonis 1) koos harjapiiride kadumisega, tubulaarsete rakkude turse, tubulaarsete langevate rakkude, intratuubulaarsete sekretsioonide ja mitoosiga (joonis 1). 2B ja 3B).

Tsisplatiiniga töödeldud GAL-3 KO rühmas on ATN, mis hõlmab (78,54 protsenti ± 0.8120) neeru parenhüümi (joonis 1) koos harjapiiride kadumisega, torukujuliste rakkude turse, tubulaarsete langevate rakkudega, intratuubulaarsed sekretsioonid ja mitoos (joonis 2D ja 3D).

ATN-i protsent on oluliselt suuremneerudtsisplatiiniga ravitud GAL-3 KO hiirtel kui tsisplatiiniga ravitud GAL-3 metsikutel hiirtel (P<0.002) (fig.="">

GAL-3 väljendub ägedas tubulaarses nekroosis

GAL-3 tsütoplasma fraktsiooni kontsentratsioon on oluliselt suurenenudneerudtsisplatiiniga töödeldud GAL-3 metsikrühmas (6084 ± 587,3 pg/mg) võrreldes metsiku GAL-3 kontrollrühmaga (1620 ± 62,3 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 4e).="" there="" is="" a="" significant="" increase="" in="" the="" nuclear="" fraction="" concentration="" of="" gal-3="" in="">neerudtsisplatiiniga töödeldud GAL-3 metsikult

rühmas (841,8 ± 41,11 pg/mg), võrreldes metsiku GAL-3 kontrollrühmaga (429,2 ± 39,56 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 4e).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Esindaja immunofluorestsentsvärvimineneerudlõigud on näidanud GAL-3 oluliselt kõrgemat ekspressiooni ägedast tubulaarsest nekroosist mõjutatud neerutuubulites (joonis 4B-D), võrreldes GAL-3 metsikute kontrollhiirtega (joonis 4A).

GAL-3 on nekroptootiline vahendaja

Retseptoriga interakteeruv seriini/treoniini valgu kinaas 1 (RIPK1). RIPK-1 kontsentratsioon (55,33 ± 3,766 pg/mg) suurenes oluliseltneerudtsisplatiiniga töödeldud metsikutest GAL-3 hiirtest, võrreldes GAL-3 metsikute kontrollhiirtega (14,22 ± 1,687 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 5a).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" ripk-1="" concentration="" (159.7="" ±="" 4.183="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (39.59="" ±="" 1.808="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 5a).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" ripk-1="" (159.7="" ±="" 4.183="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (55.33="" ±="" 3.766="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="">

Mitmekordne võrdlus nelja katserühma vahel, kasutades ühesuunalist ANOVA-d, millele järgnes Newman-Keulsi post hoc test, oli statistiliselt oluline (P<>

RIPK{0}} immunohistokeemiline värvimine näitas oluliselt suuremat RIPK-1-d ekspresseerivate rakkude arvuneerudtsisplatiiniga ravitud GAL-3 KO hiirtest võrreldes tsisplatiiniga ravitud GAL-3 metsikute hiirtega (P<0.001), (fig.="">

Retseptoriga interakteeruv seriini/treoniini valgu kinaas 3 (RIPK3). Tsisplatiiniga ravitud metsikute GAL-3 hiirte neerudes suurenes oluliselt RIPK-3 kontsentratsioon (616,4 ± 27,07 pg/mg) võrreldes GAL-3 metsikute kontrollhiirtega (17,46 ± 27,07 pg/mg). 7,002 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 5b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" ripk-3="" concentration="" (2165="" ±="" 73.29="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (203.1="" ±="" 6.443="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 5b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" ripk-3="" (2165="" ±="" 73.29="" pg/mg)="" in="">neerudtsisplatiiniga töödeldud GAL-3 KO hiirtel kui tsisplatiiniga töödeldud GAL-3 metsikutel hiirtel (616,4 ± 27,07 pg/mg), (P<0.001), (fig.="">

RIPK-3 immunohistokeemiline värvimine näitas tsisplatiiniga töödeldud GAL-3 KO hiirte neerudes oluliselt suuremat RIPK-3-d ekspresseerivate rakkude arvu kui tsisplatiiniga töödeldud GAL-3 metsikute hiirte ( P<0.001), (fig.="" 7).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Mixed lineage kinase domain-like (MLKL). MLKL-i kontsentratsioon suurenes oluliselt (71,46 ± 1,757 pg/mg)neerudtsisplatiiniga töödeldud metsikute GAL-3 hiirte kohta võrreldes GAL-3 metsikute kontrollhiirtega (23,30 ± 0,5897 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 5c).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" mlkl="" concentration="" (160.3="" ±="" 6.648="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (40.30="" ±="" 1.090="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 5c).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" mlkl="" (160.3="" ±="" 6.648="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (71.46="" ±="" 1.757="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 5c).="" immunohistochemical="" staining="" for="" mlkl="" showed="" a="" significantly="" higher="" number="" of="" cells="" expressing="" mlkl="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice=""><0.001), (fig.="" 8).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Katepsiin B. Katepsiin-B kontsentratsioon suurenes oluliselt aastalneerudtsisplatiiniga töödeldud metsikute GAL-3 hiirte (55,79 ± 4,141 pg/mg), võrreldes GAL-3 metsikute kontrollhiirtega (37,99 ± 1,206 pg/mg), (P<0.05), (fig.="" 9a).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cathepsin-b="" concentration="" in="">neerudtsisplatiiniga töödeldud GAL-3 KO hiirtest (85,87 ± 9,220 pg/mg võrreldes GAL-3 metsikute kontrollhiirtega (32,81 ± 1,570 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 9a).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cathepsin-b="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" (85.87="" ±="" 9.220="" pg/mg="" than="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (55.79="" ±="" 4.141="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="">

Mitmekordne võrdlus nelja katserühma vahel, kasutades ühesuunalist ANOVA-d, millele järgnes Newman-Keulsi post hoc test, oli statistiliselt oluline (P<>

Katepsiin-D. aastal suurenes katepsiin-D kontsentratsioon märkimisväärseltneerudtsisplatiiniga töödeldud metsikute GAL-3 hiirte (5145 ± 286,1 pg/mg) võrreldes GAL-3 metsikute kontrollhiirtega (4066 ± 107,7 pg/mg), (P<0.05), (fig.="" 9b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cathepsin-d="" concentration="" in="">neerudtsisplatiiniga töödeldud GAL-3 KO hiirtest (6695 ± 587,7 pg/mg) võrreldes metsikute GAL-3 kontrollhiirtega (3914 ± 87,51 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 9b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cathepsin-d="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" (6695="" ±="" 587.7="" pg/mg)="" than="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (4066="" ±="" 107.7="" pg/mg),=""><0.01), (fig.="">

Mitmekordne võrdlus nelja katserühma vahel, kasutades ühesuunalist ANOVA-d, millele järgnes Newman-Keulsi post hoc test, oli statistiliselt oluline (P<>

GAL-3 on apoptootiline vahendaja

Lõigatud kaspaas-3. Lõhustatud kaspaasi -3 kontsentratsioon (4665 ± 330,9 pg/mg) suurenes oluliseltneerudtsisplatiiniga töödeldud metsikutest GAL-3-hiirtest, võrreldes GAL-3 looduslike kontrollhiirtega (3193 ± 75,30 pg/mg), (P<0.05), (fig.="" 10a).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cleaved="" caspase-3="" concentration="" (6319="" ±="" 686="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (3022="" ±="" 78.57="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10a).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cleaved="" caspase-3="" (6319="" ±="" 686="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (4665="" ±="" 330.9="" pg/mg),=""><0.01), (fig.="" 10a).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Lõhustatud kaspaasi-3 immunohistokeemiline värvimine näitas tsisplatiiniga töödeldud GAL-3 KO hiirte neerudes oluliselt suuremat apoptootiliste rakkude arvu kui tsisplatiiniga töödeldud GAL-3 metsikute hiirte (P<0.001), (fig.="" 11="" a,="" c,="" i).cleaved="">

Lõhustatud PARP. Lõhustatud PARP kontsentratsioon (1446 ± 56,97 pg/mg) suurenes oluliseltneerudtsisplatiiniga töödeldud metsikutest GAL-3 hiirtest, võrreldes GAL-3 metsikute kontrollhiirtega (171,5 ± 3,926 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 10b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cleaved="" parp="" concentration="" (2044="" ±="" 91.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (236.1="" ±="" 11.86="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cleaved="" parp="" (2044="" ±="" 91.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (1446="" ±="" 56.97="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10b).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Lõhustatud PARP-i immunohistokeemiline värvimine näitas tsisplatiiniga töödeldud GAL-3 KO hiirte neerudes märkimisväärselt suuremat positiivsete rakkude arvu kui tsisplatiiniga töödeldud GAL-3 metsikute hiirte (P<0.001), (fig.="" 11="" e,="" g,="">

TNF-iga seotud apoptoosi indutseeriv ligand (TRAIL). TRAIL-i kontsentratsioon (120,9 ± 4,748 pg/mg) suurenes oluliseltneerudtsisplatiiniga töödeldud GAL-3 metsikute hiirte arvu võrreldes GAL-3 metsikute kontrollhiirtega (86,14 ± 2,879 pg/mg), (P<0.05), (fig.="" 10c).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" trail="" concentration="" (184.3="" ±="" 19.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (82.77="" ±="" 3.881="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10c).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" trail="" (184.3="" ±="" 19.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (120.9="" ±="" 4.748="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10c).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Lõhustatud kaspaasi{0}} immunohistokeemiline värvimine näitas oluliselt suuremat apoptootiliste rakkude arvuneerudtsisplatiiniga ravitud GAL-3 KO hiirtest võrreldes tsisplatiiniga ravitud GAL-3 metsikute hiirtega (P<0.001), (fig.="" 11="" a,="" c,="">

Lõhustatud PARP. Tsisplatiiniga töödeldud metsikute GAL-3 metsikute hiirte neerudes suurenes oluliselt lõhustatud PARP kontsentratsioon (1446 ± 56,97 pg/mg) võrreldes GAL-3 metsikute kontrollhiirtega (171,5 ± 3,926 pg/mg). mg), (P<0.001), (fig.="" 10b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cleaved="" parp="" concentration="" (2044="" ±="" 91.47="" pg/mg)="" in="" the="">neerudtsisplatiiniga töödeldud GAL-3 KO hiirtest võrreldes GAL-3 KO kontrollhiirtega (236,1 ± 11.86 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 10b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cleaved="" parp="" (2044="" ±="" 91.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (1446="" ±="" 56.97="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10b).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Lõhustatud PARP-i immunohistokeemiline värvimine näitas oluliselt suuremat positiivsete rakkude arvuneerudtsisplatiiniga ravitud GAL-3 KO hiirtest võrreldes tsisplatiiniga ravitud GAL-3 metsikute hiirtega (P<0.001), (fig.="" 11="" e,="" g,="">

TNF-iga seotud apoptoosi indutseeriv ligand (TRAIL). TRAIL-i kontsentratsioon (120,9 ± 4,748 pg/mg) suurenes oluliselt tsisplatiiniga töödeldud metsikute GAL-3 metsikute hiirte neerudes, võrreldes GAL-3 metsikute kontrollhiirtega (86.14). ± 2,879 pg/mg), (P<0.05), (fig.="" 10c).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" trail="" concentration="" (184.3="" ±="" 19.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (82.77="" ±="" 3.881="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10c).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" trail="" (184.3="" ±="" 19.47="" pg/mg)="" in="" the="">neerudtsisplatiiniga töödeldud GAL-3 KO hiirtel kui tsisplatiiniga ravitud GAL-3 metsikutel hiirtel (120,9 ± 4,748 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 10c).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

FAS-i legend.FAS-i kontsentratsioon suurenes oluliselt (332,5 ± 6,395 pg/mg)neerudtsisplatiiniga töödeldud metsikutest GAL-3 hiirtest, võrreldes GAL-3 metsikute kontrollhiirtega (77,72 ± 2,805 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 10d).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" fas="" concentration="" (387.9="" ±="" 8.520="" pg/mg)="" in="" the="">neerudtsisplatiiniga töödeldud GAL-3 KO hiirtest võrreldes GAL-3 KO kontrollhiirtega (134,1 ± 3,597 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 10d).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" fas="" (387.9="" ±="" 8.520="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (332.5="" ±="" 6.395="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="">

Mitmekordne võrdlus nelja katserühma vahel, kasutades ühesuunalist ANOVA-d, millele järgnes Newman-Keulsi post hoc test, oli statistiliselt oluline (P<>

GAL-3 ja prosurvival signaalid

NF-κB.Fosfor-NF-κB immunohistokeemiline värvimine näitas oluliselt suuremat rakkude arvu, mis olid värvitud fosfor-NF-κB-ganeerudtsisplatiiniga ravitud GAL-3 metsikutest hiirtest võrreldes tsisplatiiniga ravitud GAL-3 KO hiirtega (P<0.001), (fig.="" 12="">

Beeta Catenin.Beeta-kateniini immunohistokeemiline värvimine näitas oluliselt suuremat beeta-kateniiniga värvitud rakkude arvuneerudtsisplatiiniga ravitud GAL-3 metsikutest hiirtest võrreldes tsisplatiiniga ravitud GAL-3 KO hiirtega (P<0.001), (fig.="" 12="">

Wnt{0}}a.Wnt{0}}a immunohistokeemiline värvimine näitas tsisplatiiniga töödeldud GAL-3 metsikute hiirte neerudes oluliselt suuremat Wnt-3a-ga värvitud rakkude arvu kui tsisplatiiniga töödeldud GAL-3 KO hiired (P<0.001), (fig.="" 12="">

Plasma uureaTsisplatiiniga töödeldud metsikutel GAL-3 metsikutel hiirtel suurenes oluliselt uurea kontsentratsioon plasmas (23,88 ± 6,715 mmol/L), võrreldes GAL-3 metsikute kontrollhiirtega (6,688 ± 0). 6066 mmol/L), (P<0.001), (fig.="" 13a).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" plasma="" urea="" concentration="" (36.10="" ±="" 2.878="" mmol/l)="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (8.331="" ±="" 0.5194="" mmol/l),=""><0.001), (fig.="" 13a).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" plasma="" urea="" concentration="" (36.10="" ±="" 2.878="" mmol/l)="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (23.88="" ±="" 6.715mmol/l),=""><0.001), (fig.="">

Mitmekordne võrdlus nelja katserühma vahel, kasutades ühesuunalist ANOVA-d, millele järgnes Newman-Keulsi post hoc test, oli statistiliselt oluline (P<>

Plasma kreatiniin

Plasma kreatiniini kontsentratsioon (48,42 ± 3,992 umol/L) suurenes oluliselt tsisplatiiniga ravitud metsikutel GAL-3 metsikutel hiirtel, võrreldes GAL-3 metsikute kontrollhiirtega (13,27 ± 0). 3106 umol/l), (P<0.001), (fig.="" 13b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" plasma="" creatinine="" concentration="" (62.36="" ±="" 3.605="" umol/l)="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (13.88="" ±="" 0.4183="" umol/l),=""><0.001), (fig.="" 13b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" plasma="" creatinine="" concentration="" (62.36="" ±="" 3.605="" umol/l)="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (48.42="" ±="" 3.992="" umol/l),=""><0.01), (fig.="" 13b).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Arutelu

Ägeneerudvigastused on kogu maailmas levinud terviseprobleem. Igal aastal on umbes 13,3 miljonit ägedat haigusjuhtuneerudvigastus (AKI). Koormus, mis muutub eriti suureks tärkava turumajandusega riikides [21]. Ülemaailmselt põhjustab AKI aastas 1,7 miljonit surmajuhtumit. Sellest umbes 1,4 miljonit esineb madala ja keskmise sissetulekuga riikides [21]. AKI on sageli ennetatav ja ravitav vaid väheste, kui üldse, pikaajaliste tervisemõjudega. AKI arendamisel osalevate peamiste mehhanismide ja osalejate väljaselgitamine kajastub patsientide ravi parandamises ning suremuse ja haigestumuse minimeerimises.

Oleme näidanud GAL{0}} kontsentratsiooni olulist tõusu aastalneerudallutatud AKI-le. Samuti oleme näidanud tsisplatiiniga ravitud metsikutel GAL-3 metsikutel hiirtel ägedast tubulaarsest nekroosist mõjutatud neerutuubulites oluliselt kõrgemat GAL-3 ekspressiooni kui soolalahusega töödeldud kontrollrühma neerutuubulites. Võrreldes soolalahusega töödeldud hiirtega on GAL-3 nii tsütoplasma kui ka tuuma kontsentratsioon pärast ATN-i neerutuubulites oluliselt suurenenud. GAL-3 kõrgem tase vigastatud neerutuubulites viitab sellele, et GAL-3 on ATN-i oluline osaline.

Samuti oleme kasutanud GAL-3 KO hiiri, et uurida GAL-3 mehaanilist rolli ATN-is. See aitab meil lähemalt uurida proapoptootiliste, pronekroptootiliste ja prosurvival valkude modulatsioone GAL-3 juuresolekul ja puudumisel ning määrata, kas GAL-3 mõjutab neid muutusi või mitte. .

Oleme näidanud, et tsisplatiiniga töödeldud GAL-3 KO hiirtel on ATN-st mõjutatud torukeste protsent oluliselt suurem kui tsisplatiiniga töödeldud GAL-3 metsikutel hiirtel. Meie tulemused on näidanud ka katepsiin B ja katepsiin D olulist suurenemist neerudes, mida mõjutab ATN. Lisaks on sees oluliselt kõrgem katepsiin B ja katepsiin D taseneerudtsisplatiiniga töödeldud GAL-3 KO hiirtel kui tsisplatiiniga töödeldud GAL-3 metsikutel hiirtel. Katepsiinid mängivad olulist rolli signaaliradades, mis põhjustavad apoptootilist ja nekrootilist rakusurma, lagundades erinevaid substraate ja/või aidates kaasa mitokondriaalsele destabiliseerumisele [22]. Lüsosomaalsed proteaasid, katepsiin B ja katepsiin D ekspresseeruvad neerudes rohkesti [23].

Katepsiin B, tsüsteiini proteinaas, millel on optimaalne aktiivsus happelises keskkonnas, osaleb paljudes füsioloogilistes ja patoloogilistes protsessides. See seedib rakus struktuurseid valke ja ensüüme, lagundab basaalmembraani põhielemente ning aktiveerib proensüüme, hormoone ja kasvufaktoreid [24]. Inimese proksimaalses tubulaarses epiteeli rakuliinis HK-2, mis läbib apoptoosi, on täheldatud suurenenud ekspressioonitasemeid ja katepsiin B aktivatsiooni [25].

Katepsiin D ekspresseerub märkimisväärselt proksimaalsetes tubulaarsetes rakkudes. Katepsiin D on võtmetähtsusega lüsosomaalne asparagiinhappe proteaas, mis vastutab valkude ja organellide lagunemise eest autofagia-lüsosomaalse toimega, samuti raku nekroosi ja lüsosomaalse membraani rebenemise ajal [26]. Katepsiin D suureneb märkimisväärselt vigastatud tuubulites pärast neeruisheemiat/reperfusioonikahjustust, mis toetab meie järeldust katepsiin D olulise suurenemise kohtaneerudägeda tubulaarse nekroosiga [27].

Katepsiin B ja D kõrgem tase suurema ATN protsendiganeerudtsisplatiiniga töödeldud GAL-3 KO hiirtel kui tsisplatiiniga töödeldud GAL-3 metsikutel hiirtel on GAL-3 antinekrootilise vahendajana.

Samuti oleme näidanud oluliselt kõrgemat nekroptoosivalkude taset; RIPK1, RIPK3 ja MLKL sisseneerudtsisplatiiniga töödeldud hiirtel. Lisaks oleme tuvastanud tsisplatiiniga töödeldud GAL-3 KO hiirte neerudes oluliselt kõrgemad RIPK1, RIPK3 ja MLKL kontsentratsioonid kui tsisplatiiniga töödeldud GAL-3 metsikute hiirte neerudes.

Uuringud on näidanud, et tsisplatiin on seotud suurenenud oksüdatiivse stressiga [28]. Reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) teke, lipiidide peroksüdatsiooniproduktide akumuleerumineneerud, ja allasurutud antioksüdantide süsteemid arvatakse olevat tsisplatiinist põhjustatud AKI peamised mehhanismid [29]. Rakus muundatakse tsisplatiin väga reaktiivseks vormiks, mis reageerib kiiresti tiooli sisaldavate antioksüdantide molekulidega, nagu glutatioon [30]. Tsisplatiin võib kahjustada hingamisahela kaudu põhjustada ka mitokondriaalset düsfunktsiooni ja suurendada ROS-i tootmist [31]. ROS hõlbustab RIPK1 autofosforüülimist ja soodustab RIPK-3 värbamist ja nekrosoomide moodustumist [32]. Lisaks on ROS lüsosomaalse membraani läbilaskvuse (LMP) kriitiline indutseerija [33].

Cai et al. [34] on näidanud, et ROS-vahendatud LMP osaleb nekroptoosi esilekutsumisel küüliku intervertebraalsetes ketaste rakkudes. Samuti järgneb RIPK1-indutseeritud mitokondriaalse-ROS produktsioonile LMP ja mitokondriaalne düsfunktsioon Ca2 plusi ja JNK vahelise positiivse tagasiside ahela tulemusena, mis põhjustab A549 ja H1299 rakkude nekroptoosi [35, 36].

Lisaks on näidatud, et nekroptoosi ülesreguleeritud-RIPK3 kutsub esile endoplasmaatilise retikulumi stressi, mis suurendab raku Ca2 pluss kontsentratsiooni ja ksantiinoksüdaasi ekspressiooni, mis suurendab ROS-i teket [37].

Katepsiinid B ja D on peamised funktsionaalsed ained, mis vabanevad rakusurma käigus suurenenud LMP-ga lüsosoomidest [34]. Katepsiin B ja D aktiveerimine võib suurendada nekroptootilist rada [38]. Seega saab nekroptoosi esile kutsuda retseptorist sõltumatul viisil [39]. Lisaks on aruanded näidanud, et peale ROS-i, katepsiin B ja D on nekroptoosi esilekutsumiseks ka muid stiimuleid, sealhulgas TRAIL-i ja FAS-i legendi valkude ülesreguleerimine [40]. Seega võib tsisplatiini või RIPK1 või RIPK3 indutseerimise tõttu suurenenud ROS põhjustada LMP suurenemist ning katepsiin B ja D vabanemist, mis omakorda suurendab nekroptoosi. Samuti võib suurenenud ROS aktiveerida RIPK1, RIPK3 värbamist, nekrosoomide moodustumise tõhustamist, MLKL-i fosforüülimist, fosforüülitud MLKL-i translokatsiooni rakumembraanile, mis põhjustab nekrootilise rakusurma plasmamembraani läbilaskvuse ja rebenemise kaudu.

Selles uuringus usume, et suurenenud ROS, katepsiin B, katepsiin D, TRAIL ja FAS on seotud ATN-i nekroptoosi esilekutsumisega.

GAL-3 rolli määramiseks nekroptoosis oleme mõõtnud RIPK1, RIPk3 ja MLKL kontsentratsioone GAL-3 juuresolekul ja puudumisel, kasutades GAL-3 wild ja GAL{{5 }} KO hiired.

RIPK1, RIPK3 ja MLKL oluliselt kõrgemad kontsentratsioonid tsisplatiiniga töödeldud GAL-3 KO hiirtel kui tsisplatiiniga ravitud GAL-3 hiirtel näitavad, et GAL-3 väljalöömine on seotud nekroptoosi valkude märkimisväärne suurenemine, mis viitab GAL-i nekroptoosivastasele rollile-3.

Lisaks oleme näidanud pro-apoptootiliste valkude oluliselt kõrgemat taset; lõhustatud kaspaas-3, lõhustatud PARP, TRAIL, FAS ja apoptootilised kehadneerudjälgides ATN-i.

ATN-i ajal võimaldab lüsosomaalse membraani permeabiliseerimine katepsiin D ja katepsiin B translokatsiooni lüsosoomist tsütosooli, kus see võib avaldada oma pro-apoptootilist funktsiooni. Tsütosoolne katepsiin D lõikab Bid-valgu tBidiks, käivitades Baxi valgu sisestamise mitokondriaalsesse membraani. See viib tsütokroom c vabanemiseni mitokondritest tsütosooli ning prokaspaaside 9 ja 3 aktiveerimiseni [41]. Selles uuringus on nii immunofluorestsentsvärvimine kui ka valgu kontsentratsioon näidanud rakusisese GAL-3, nii tsütoplasma kui ka tuumafraktsioonide, oluliselt kõrgemat ekspressiooni ATN-isneerudGAL{0}} metsikute hiirte arvu võrreldes kontrollhiirtega.

Nii et pro-apoptootiliste valkude kõrgem tase; lõhustatud kaspaas-3, TRAIL, FAS ja apoptootilised kehadneerudtsisplatiiniga töödeldud GAL-3 KO hiirtel kui tsisplatiiniga töödeldud GAL-3 metsikutel hiirtel, viitab GAL-3 apoptootilisele rollile. On leitud, et GAL-3 osaleb apoptoosis kriitiliselt, sõltuvalt selle subtsellulaarsest lokaliseerimisest. Uuringud on näidanud, et intratsellulaarne GAL-3 võib pärssida apoptoosi [42-44]. GAL-i apoptootilise rolli toetamiseks{10}} tuvastasime tsisplatiiniga töödeldud GAL-i neerudes oluliselt suurema arvu fosfo-NF-κB, beeta-kateniini ja Wnt-valke ekspresseerivaid rakke.{15} } metsikud hiired kui GAL-3 KO hiired. NF-κB on transkriptsioonifaktor, mis mängib olulist rolli põletiku, rakkude proliferatsiooni ja rakkude ellujäämise reguleerimisel. Fosforüülimine mängib kriitilist rolli NF-κB aktiveerimisel kõigist nendest stiimulitest allavoolu [45]. NF-κB on nüüdseks tunnistatud oluliseks teguriks rakkude ellujäämisel ja apoptoosi eest kaitsmisel [46]. On näidatud, et Wnt-valkudel on vigastatud rakkudele kaitsev toime nende apoptootilise funktsiooni kaudu -kateniini ja c-Myc aktiveerimise kaudu [47].

Wu et al. on näidanud ka p-NF-κB olulist suurenemistneerudATN-iga [48]. Wang et al. on näidanud ka Wnt / -kateniini signaaliraja ülesreguleerimist ägeda neerukahjustuse korral [49]. Uuringud on näidanud, et NF-κB osaleb GAL-3 [50] indutseerimises, samuti GAL-3 osaleb NF-κB [51] aktiveerimises. Huvitaval kombel on leitud, et GAL{10}} on -kateniini uus sidumispartner [52].

Need leiud viitavad sellele, et GAL-3 anti-apoptootilist rolli võib vahendada ka NF-κB ja Wnt/-kateniini radade aktiveerimine. GAL-3 näib ühendavat neid meie uuringus uuritud ellujäämist soodustavaid signaaliülekandeteid. Nende radade vahel on ka ristkõnesid erinevatel tasanditel. Wnt/-kateniini raja mängijad moduleerivad paljusid oma mõjusid interaktsiooni kaudu NF-κB-ga ja vastastikku mõjutab NF-κB ka Wnt/-kateniini signaaliülekande rada [53]. Seetõttu on arusaadav, et GAL-3 mängib keskset osa ellujäämissignaali ülekandeteedel.

Meie uuring näitab, et intratsellulaarse GAL-3 olemasolu või puudumine on seotud oluliste muutustega proapoptootilistes, pronekroptootilistes ja prosurvival valkudes tsisplatiinist indutseeritud ATN-is ning et GAL-3 kõrge tase neerutuubulites on vahendab anti-apoptootilist, antinekroptootilist ja ellujäämiskeskkonda, mis võib kujundada haiguse edasist kulgu. See viitab GAL-3 kaitsvale rollile ägeda tsisplatiiniga indutseeritud ATN-i korral, mida toetab oluliselt madalam uurea ja kreatiniini tase plasmas GAL-3 metsikutel tsisplatiiniga ravitud hiirtel kui GAL-3 KO tsisplatiiniga töödeldud hiired (joonis 13).

Järeldus

GAL-3 võib tsisplatiinist põhjustatud ägeda tubulaarse nekroosi ajal mõjutada rakkude ellujäämist ja surma, toimides neerutuubulites nekroptootiliste, apoptootiliste ja ellujäämist soodustavate valkudega.

Tänuavaldused

Autori kaastööd

Kõik autorid vaatasid esitatud käsikirja versiooni läbi ja kiitsid selle heaks. SA tutvustas kontseptsiooni, kujundas uuringu, analüüsis ja tõlgendas andmeid, kujundas joonised ja kirjutas töö. GJ viis läbi loomkatseid ja ELISA tehnikat, MS viis läbi immunohistokeemilise ja immunofluorestsentsvärvimise ning sellega seotud kudede töötlemise. HT tegi loomkatseid ja ELISA tehnikat. JY tegi neerufunktsiooni biokeemilise analüüsi ja esitas saadud andmed.

Avalikustamisavaldus

Autorid kinnitavad, et neil puuduvad konkureerivad huvid.

Viited

1 Lameire NH, Bagga A, Cruz D, De Maeseneer J, Endre Z, Kellum JA, Liu KD, Mehta RL, Pannu N, Van Biesen W, Vanholder R: Äge neerukahjustus: kasvav globaalne probleem. Lancet 2013;382:170-179.

2 KDIGO: Kliinilise praktika juhised ägeda neerukahjustuse korral. Kidney Int 2012;2:1–138.

3 Schumer M, Colombel MC, Sawczuk IS, Globe G, Connor J, O'Toole KM, Olsson CA, Wise GJ, Buttyan R: Morfoloogilised, biokeemilised ja molekulaarsed tõendid apoptoosi kohta reperfusioonifaasis pärast lühikest neeruisheemiaperioodi Am J Pathol 1992;140:831-838.

4 Schumer AT, Davies DR, McLaren AJ, Cerundolo L, Morris PJ, Fuggle SV: Apoptoos inimese neeru allotransplantaatide isheemia / reperfusioonikahjustuse korral. Transplantation 1998;66:872-876.

5 Degterev A, Huang Z, Boyce M, Li Y, Jagtap P, Mizushima N, Cuny GD, Mitchison TJ, Moskowitz MA, Yuan J: Mitteapoptootilise rakusurma keemiline inhibiitor, millel on terapeutiline potentsiaal isheemilise ajukahjustuse korral. Nat Chem Biol 2005;1:112–119.

6 Vandenabeele P, Galluzzi L, Vanden Berghe T, Kroemer G: Nekroptoosi molekulaarsed mehhanismid: järjestatud rakuplahvatus. Nat Rev Mol Cell Biol 2010;11:700–714.

7 Chen X, Li W, Ren J, Huang D, He WT, Song Y, Yang C, Li W, Zheng X, Chen P, Han J: Segaliini kinaasi domeenitaolise valgu translokatsioon plasmamembraanile viib nekrootilise rakuni surma. Cell Res 2014;24:105–121.

8 Cai Z, Jitkaew S, Zhao J, Chiang HC, Choksi S, Liu J, Ward Y, Wu LG, Liu ZG: TNF-indutseeritud nekroptoosi jaoks on vajalik trimeriseeritud MLKL valgu plasmamembraani translokatsioon. Nat Cell Biol 2014;16:55–65.

9 Wang Y, Liu Y, Liu Y, Zhou W, Wang H, Wan G, Sun D, ​​Zhang N, Wang Y: pullulaanil põhinev tsisplatiini polümeerne eelravim hepatotsellulaarse kartsinoomi sihipäraseks raviks. Int J Pharm 2015;483:89–100.

10 Pablo N, Dong Z: Tsisplatiini nefrotoksilisus: mehhanismid ja renoprotektiivsed strateegiad. Kidney Int 2008;73:994–1007.

11 Mi XJ, Hou JG, Wang Z, Han Y, Ren S, Hu JN, Chen C, Li W: maltooli kaitsev toime tsisplatiini poolt põhjustatud nefrotoksilisusele AMPK-vahendatud PI3K/Akt ja p53 signaaliradade kaudu. Sci Rep 2018;8:15922.

12 Ozkok A, Edelstein CL: tsisplatiinist põhjustatud ägeda neerukahjustuse patofüsioloogia. Biomed Res Int 2014;2014:1–17.

13 Hughes RC: Imetajate süsivesikuid siduvate valkude galektiini perekonna sekretsioon. Biochim Biophys Acta 1999;1473:172-185.

14 Liu FT, Patterson RJ, Wang JL: Galektiinide rakusisesed funktsioonid. Biochim Biophys Acta 2002;1572:263- 273.

15 van den Brûle FA, Waltregny D, Liu FT, Castronovo V: Galektiini-3 tsütoplasmaatilise/tuuma ekspressioonimustri muutumine korreleerub eesnäärme kartsinoomi progresseerumisega. Int J Cancer 2000;89:361-367.

16 Xue J, Gao X, Fu C, Cong Z, Jiang H, Wang W, Chen T, Wei Q, Qin C: Galektiin{1}}indutseeritud Jurkat rakkude apoptoosi reguleerimine nii O-glükaanide kui ka N-glükaanide poolt CD45 peal. FEBS Lett 2013;587:3986-3994.

17 Matarrese P, Fusco O, Tinari N, Natoli C, Liu FT, Semeraro ML, Malorni W, Iacobelli S: Galektiini-3 üleekspressioon kaitseb apoptoosi eest, parandades raku adhesiooniomadusi. Int J Cancer 2000;85:545- 554.

18 Oka N, Nakahara S, Takenaka Y, Fukumori T, Hogan V, Kanayama HO, Yanagawa T, Raz A: Galektiin -3 inhibeerib kasvaja nekroosifaktoriga seotud apoptoosi indutseerivat ligandi poolt indutseeritud apoptoosi, aktiveerides Akt inimese põies kartsinoomirakud. Cancer Res 2005;65:7546-7553.

19 Hashmi S, Al-Salam S: Galektiin-3 ekspresseerub müokardis väga varajases staadiumis pärast müokardiinfarkti. Cardiovasc Pathol 2015;24:213-223.

20 Zhang S, Li R, Dong W, Yang H, Zhang L, Chen Y, Wang W, Li C, Wu Y, Ye Z, Zhao X, Li Z, Zhang M, Liu S, Liang X: RIPK3 vahendab neerutuubulite epiteelirakkude apoptoos endotoksiini poolt indutseeritud ägeda neerukahjustuse korral. Mol Med Rep 2019;20:1613-1620.

21 Liyanage T, Ninomiya T, Jha V, Neal B, Patrice HM, Okpechi I, Zhao MH, Lv J, Garg AX, Knight J, Rodgers A, Gallagher M, Kotwal S, Cass A, Perkovic V: ülemaailmne juurdepääs ravile lõppstaadiumis neeruhaigus: süstemaatiline ülevaade. Lancet 2015;385:1975-1982.

22 Turk B, Stoka V: Proteaasi signaalimine rakusurmas: kaspaasid versus tsüsteiini katepsiinid. FEBS Lett 2007;581:2761–2767.

23 Pavlock GS, Southard JH, Starling JR, Belzer FO: Lüsosomaalse ensüümi vabanemine hüpodermiliselt perfuseeritud koera neerudes. Cryobiology 1984;21:521-528.

24 Werle B, Jülke B, Lah T, Spiess E, Ebert W: Katepsiin B fraktsioon, mis on aktiivne füsioloogilise pH väärtusel 7,5, on inimese kopsu lamerakulise kartsinoomi korral prognostiliselt oluline. Br J Cancer 1997;75:1137–1143.

25 Wang C, Jiang Z, Yao J, Wu X, Sun L, Liu C, Duan W, Yan M, Sun L, Liu J, Zhang L: katepsiin B osalemine emodiini poolt indutseeritud apoptoosis HK-s-2 Rakud. Toxicol Lett 2008;181:196–204.

26 Suzuki C, Tanida I, Ohmuraya M, Oliva Trejo JA, Kakuta S, Sunabori T, Uchiyama Y: Katepsiini D puudumine neerude proksimaalsetes torurakkudes, mille tulemuseks on suurenenud tundlikkus neeruisheemia/reperfusioonikahjustuse vastu. Int J Mol Sci 2019;20:1711.

27 Lameire N, Van Biesen W, Vanholder R. Äge neerupuudulikkus. Lancet 2005;365:417-430.

28 Yu W, Chen Y, Dubrulle J, Stassi F, Putluri V, Sreekumar A, Putluri N, Baluya D, Lai SY, Sandulache VC: Tsisplatiin tekitab oksüdatiivset stressi, millega kaasnevad kiired nihked tsentraalses süsiniku metabolismis. Sci Rep 2018;8:4306.

29 Aydinoz S, Uzun H, Cermiketal G: Hüperbaarse hapniku erinevate annuste mõju tsisplatiini poolt põhjustatud nefrotoksilisusele. Neerupuudulikkus 2007;29:257–263.

30 Siddik ZH: Tsisplatiin: tsütotoksilise toime viis ja resistentsuse molekulaarne alus. Onkogeen 2003;22:7265–7279.