Kuidas rakumembraani parandavad valgud reguleerivad transkriptsioonifaktori signaaliülekannet, et kontrollida neerufibroosi

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Haichang Li

Neerfibroos on seotud ägeda progresseerumiseganeerudkroonilise neeruhaiguse kahjustus. On näidatud, et MG53, rakumembraani parandav valk, kaitseb neeruepiteelirakkude vigastuste ja ägeda neerukahjustuse eest. Siin hindasime MG53 rolli modulatsioonisneerudfibroos vananevatel hiirtel ja ühepoolse kusejuha obstruktsiooniga (UUO) hiirtel, mis on progresseeruva neerufibroosi teadaolev mudel. MG53 ablatsiooniga hiirtel tekkis vanusega rohkem interstitsiaalset fibroosi kui sama vanusega MG{1}}intaktsetel hiirtel. Samamoodi MG53 puudumiselneerudfibroos oli liialdatud võrreldes hiirtega, kelle MG53 oli ummistunud neerus, võrreldes kontralateraalse ummistuseta neeruga või võltsoperatsiooniga hiirte neerudega. Kusejuha ummistunudneerudMG53 puudulikkusega hiirtel esines samuti oluliselt rohkem põletikku kui MG53 puutumatute hiirte kusejuhade obstruktsiooniga neerudel. In vitro katsed näitasid, et MG53 võib siseneda proksimaalsete tubulaarsete epiteelirakkude tuumadesse ja interakteeruda otseselt transkriptsioonifaktori NF-KB p65 komponendiga, pakkudes võimalikku selgitust suurenenud põletikule MG53 puudumisel. Selle testimiseks anti UUO-le allutatud hiirtele täiustatud MG53 ekspressioon konstrueeritud rakkude või otsese rekombinantse valgu kohaletoimetamise kaudu. See vähendas NF-KB aktivatsiooni ja põletikku ning nõrgendas neerufibroosi. Seega võib MG53-l olla terapeutiline roll kroonilise neerupõletiku ravis ja seeläbi pakkuda kaitset selle eestfibroosmis viib kroonilise neeruhaiguse fenotüübini.

Cistanche tubulosa hoiab ära neeruhaiguse, proovi saamiseks klõpsake siin

Tõlkeavaldus Krooniline põletik põhjustab fibrootilist ümberkujunemist, mis võib samuti olla aluseks üleminekule ägedast neerukahjustusest kroonilisele neeruhaigusele. Valgu-põletikulise transkriptsioonifaktori tuumafaktor-KB (NF-kB) aktiveerimine on seotud neerupõletiku patogeneesiga. Siin pakume tõendeid selle kohta, et MG53, varem tuvastatud rakumembraani parandav valk, interakteerub otseselt NF-KB-ga ja vähendab selle transkriptsioonilist aktiivsust. Samaaegselt võib eksogeenselt manustatud MG53 vähendada põletikulise neeru fibrootilist ümberkujunemist. Need leiud viitavad kaitsvale koosmõjule MG53 ja NF-KB vahel, et nõrgendada põletikust vahendatud neerufibroosi teket. MG53 farmakoloogiline manustamine võib olla paljutõotav lähenemisviis progresseeruva neerufibroosi raviks.

Neerufunktsiooni häired, mida võib klassifitseerida ägedaks neerukahjustuseks (AKI) või krooniliseks neeruhaiguseks (CKD), on kasvanud vanemate populatsioonide epideemiaks. 2017. aastal ulatus kroonilise neeruhaiguse levimus 14,5 protsendini 65-aastastest ja vanematest inimestest, mille tulemuseks on Medicare'i ravikulud üle 84 miljardi dollari.^1,2AKI ja CKD on vanematel inimestel tavalisemad, peamiselt vigastuste suurenenud vastuvõtlikkuse ja vananeva neeru parandamise võime vähenemise tõttu. Kliinilised uuringud on näidanud, et krooniline neeruhaigus on AKI peamine riskitegur ja vastupidi, AKI episoodid võivad kiirendada kroonilise neeruhaiguse progresseerumist lõppstaadiumis neeruhaiguse suunas. Praegu on AKI ravi peamiselt toetav ja väljakujunenud kroonilise neeruhaiguse ravi keskendub progresseerumise aeglustamisele reniin-angiotensiin-aldosterooni süsteemi pärssimise kaudu ja nüüd võib-olla ka naatrium-glükoosi kaastransporteri -2 inhibeerimise kaudu.^3,4

Sõltuvalt vigastuse raskusest võivad proksimaalsed torukujulised rakud, mis on ägeda vigastuse peamine sihtmärk, muutuda rakutsükli progresseerumiseks,5,6 metabolismiks,7 valgupõletiku ja profibrootiliste tsütokiinide sekretsiooniks või osaliseks epiteeli-mesenhümaalseks üleminekuks8. mis määrab, kas ümberkujundamine/parandus on edukas või ebakohane ja põhjustab neerufibroosi, mis on kroonilise neeruhaiguse tunnus.9,10 See ümberkujundamine toimub tavaliselt neerupõletiku taustal,

vähenenud vaskulaarne varustamine ja ekstratsellulaarse maatriksi (ECM) valkude tootmine ning see hõlmab epiteelirakkude kadu ja kollageenide, a-silelihase aktiini ja fibronektiini akumuleerumist; sellel on ka kõrge korrelatsioon neerufunktsiooni halvenemisega.

Krooniline põletik põhjustab fibrootilist ümberkujunemist, mis võib samuti olla aluseks üleminekule AKI-lt kroonilise neeruhaigusele.11–13 Kumulatiivsed uuringud viitavad tuumafaktor-kB (NF-kB) transkriptsioonifaktori osalusele neerupõletiku patogeneesis, mis on põhjustatud infektsioonist, vigastusest, või siirdamine.11,12,14 Kanoonilise NF-kB raja aktiveerimine algab NF-kB (IkB) kinaasi inhibiitori aktiveerimisega, mis viib IkBa fosforüülimiseni ja lagunemiseni ning NF-kB heterodimeeride tuuma translokatsioonini.15 NF-kB signaaliülekande aktiveerimist neeru epiteelirakkudes ja imbunud immuunrakkudes võivad esile kutsuda patofüsioloogilised käivitajad, nagu kokkupuude lipopolüsahhariididega (LPS) või isheemia-reperfusioonikahjustus.16 Molekulaarse profiili koostamise uuringud näitavad, et nfkb1 on peamine neerufibroosi põhjustaja.¹⁷Lisaks neerutorurakkudele soodustavad kaasasündinud immuunrakud, nagu makrofaagid ja dendriitrakud, neerukahjustusi, põletikku ja fibrootilist ümberkujunemist.^13,18–20

cistanche on efektiivne neerufunktsiooni häirete ravis

Kasvavad tõendid viitavad sellele, et lihastest pärinevad sekretoorsed tegurid (st müokiinid) moduleerivad süsteemset füsioloogiat kudede läbirääkimise kaudu, et mõjutada neeruhaiguste progresseerumist.²¹MG53 (nimetatakse ka TRIM72-ks) on lihastega rikastatud kolmepoolse motiivi (TRIM) valk, millel on kriitiline funktsioon rakumembraani parandamisel. 22, 23 TRIM perekonna valkudel on mitmekesised funktsioonid, alates immuunsignaali reguleerimisest kuni kudede parandamiseni.²⁴MG53-vahendatud membraaniparandus on seotud skeletilihaste ägeda vigastuse leevendamisega,²⁵neerud,²⁶süda,²⁷ kopsud, 28 aju,^29,30ja nahk.³¹Meie varasemad uuringud tuvastasid MG53 ekspressiooni madala taseme neerudes, mis on AKI kaitse võtmekomponent, ja hiired, kellel puudus MG53 (mg53 / ), olid stressist põhjustatud AKI suhtes vastuvõtlikumad.²⁶Samuti näitasime hiljuti, et MG53 püsiv tõus vereringes suurendab kudede vigastuste paranemist ja regeneratsiooni.32 ​​Neeruspetsiifilise ja välise tsirkuleeriva MG53 suhteline roll neerufibroosi moduleerimisel progresseeruva kroonilise neeruhaiguse ajal on endiselt teadmata.

Hiljuti on arenenud MG53 esilekerkiv roll kudede kaitse moduleerimisel põletiku pärssimise kaudu, eriti NF-KB signaaliülekande moduleerimise kaudu. Näiteks MG53 nõrgendab LPS-i poolt indutseeritud neurotoksilisust ja närvipõletikku, pärssides TLR4/NF-kB rada,33 ja südame MG53 reguleerib KChIP2 ekspressiooni, et kontrollida elektrofüsioloogilist ümberkujundamist kardiohüpertroofia ajal.34 Lisaks demonstreerisime MG53 kahekordset funktsiooni maladaptiivse hüperpõletikulise reaktsiooni vältimine subletaalse A-gripiviiruse infektsiooni ajal, mida iseloomustab liigne interferoon-b tootmine, pärssides IRF3/NF-kB aktivatsiooni ja pärssides ebanormaalset intratsellulaarset Ca2þ signaaliülekannet makrofaagides.35 Lisaks A-gripi surmava annuse korral viirusnakkuse korral takistas MG53 suremust ja kopsukahjustusi, mitte mõjutades otseselt viiruse tiitreid per se, vaid leevendades tsütokiinide tormi (interferoon-b, interleukiin-6 ja interleukiin-1b) negatiivse regulatsiooni kaudu NLRP3 põletikuvastane toime ja kopsu püroptoosi ennetamine.36 Lisaks oli eksogeense MG53 krooniline ravi suurtes annustes seotud NF-kB pärssimisega. – vahendatud põletik vananenud südames.37 Need uuringud näitavad, et MG53 võib põletiku ajal moduleerida hälbivat NF-kB signaaliülekannet, kuid seda, kas see esineb neerupõletiku kontekstis, pole uuritud.

Me oletasime, et MG53 reguleerib neerupõletikku, moduleerides NF-KB transkriptsioonilist aktiivsust, ja seeläbi nõrgendada kroonilise põletiku tagajärjel tekkivat neerufibroosi. See uuring viidi läbi selle hüpoteesi käsitlemiseks.

cistanche on efektiivne neeruhaiguste ravis

MEETODID

Loomade uuringud

Kõik katsed loomadega järgisid riiklike tervishoiuinstituutide laboriloomade hooldamise ja kasutamise juhendit ning Ohio osariigi ülikooli institutsionaalse loomade hooldamise ja kasutamise komitee poolt heaks kiidetud protokolle. Vanusekohane metsiktüüp (WT) ehk mg53^-/-MG53 rolli kindlakstegemiseks vanusest sõltuva ja ühepoolse kusejuha obstruktsiooni (UUO) põhjustatud neerufibroosi moduleerimisel kasutati 129S1/SvImJ tüve mittepesakonnakaaslasi. C57B6/J hiired (9–10 nädalat) osteti firmast Jackson Labs.

Neerukahjustuse uuringutes allutati hiirtele (9–12 nädalat) neerufibroosi esilekutsumiseks UUO-d. Hiired anesteseeriti isofluraaniga (1,5–2,5 protsenti), et tagada anesteesia sügav tase. UUO protseduur viidi läbi, ligeerides vasak kusejuha kaks korda 5-0 kirurgilise siidiga vastavalt avaldatud protokollidele.38 Hammihiirtel tehti ainult kõhunaha sisselõige. Et hinnata rhMG53 mõju obstruktiivsele neerukahjustusele, sai 1 UUO hiirte rühm sabaveeni süstimise teel rhMG53 (2 mg/kg), alustades vahetult pärast UUO operatsiooni (päev 0) ja seejärel iga päev 7 päeva jooksul, 2 täiendavad annused 9. ja 11. päeval. UUO hiirte kontrollrühm sai soolalahuse süsti vastavalt samale skeemile. Hiired surmati 12. päeval pärast UUO operatsiooni, neerud perfuseeriti in situ fosfaatpuhverdatud soolalahusega ning UUO neerust ja kontralateraalsest neerust koguti koeproovid histoloogia ja Western blot analüüsi jaoks.

Eraldi uuringutes WT ja mg53^-/-hiirtele tehti UUO või võltsoperatsioon ja nad tapeti 7. päeval pärast operatsiooni. MG53 manustati hiirtele, kasutades rakupõhist ravi.39 RAW 264.7 makrofaagid nakatati 24 tunni jooksul doksütsükliinist (DOX) sõltuvate Ad tPA-MG{8}}kirsiviiruse osakestega. Nakatunud rakud (kontsentratsioonis {{10}} /100 ml soolalahust hiire kohta) süstiti hiirtele kohe pärast operatsiooni (0. päeva süstimine) sabaveeni. Hiirtele tehti 4 Ad-tPA-MG53 transdutseeritud RAW rakkude süsti päevadel 0, 1, 3 ja 6. Kohe pärast 0. päeval tehtud rakusüsti randomiseeriti hiired rühma, kes said DOX-i ja rühma, kes ei saanud DOX-i (2 mg/ml 5-protsendilises sahharoosilahuses) oma joogivees 7 päeva ja seejärel surmati. UUO neeru ja kontralateraalse neeru koeproovid koguti histoloogia, RNA ja valgu analüüside jaoks.

Statistilised analüüsid Andmed on väljendatud keskmistena -SD. Rühmasisene võrdlus viidi läbi Studenti t-testi abil, kui võrreldi 2 eksperimentaalset alusuuringut H Li et al.: MG53 moduleerib NF-kB neerufibroosis 2 Kidney International (2021) -, ---rühmad ja 1-rohkem kui kahe rühma dispersioonanalüüs (Graphpad Prism 8.2; GraphPad), millele järgneb kas Bonferroni või Holm-Sidaki mitmekordse võrdlustesti ad hoc. Väärtust P < 0,05="" peeti="" statistiliselt="">

Täiendavad meetodid Täielikud meetodid, sealhulgas histoloogiline hindamine, seerumi kreatiniini mõõtmine, plasmiidide konstruktsioonid, rakukultuur ja primaarne tubulaarsete epiteelirakkude eraldamine, adenoviiruse ettevalmistamine ja rakuinfektsioon, NF kB p65 tuuma translokatsiooni test, immunohistokeemia ja konfokaalsed kujutised, NF-kB lutsiferaasi reporteranalüüs, tsütokiini analüüs, ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs, kudede fraktsioneerimine, immunoblotanalüüs, koimmunosadestamine, kvantitatiivne reaalajas polümeraasi ahelreaktsioon (täiendav tabel S1) ja rhMG53 tootmine on lisameetodites.

cistanche tubulosa ekstrakt: neeruhaiguste ravi

TULEMUSED

MG53 ablatsiooniga hiirtel areneb vanusest sõltuv neerufibroos

Võrdlesime vananemise mõju neerufunktsioonile ja fibroosile mg53-s^-/-ja WT hiired. Kinnitasime oma varasemat tähelepanekut, et kuigi seerumi kreatiniinisisaldus noortel hiirtel (2 kuud) MG53-ga ja ilma selleta ei erinenud oluliselt, olid vanemad (16–20 kuud) mg53-/-hiirtel oli oluliselt kõrgem seerumi kreatiniinisisaldus kui vanusega sobitatud WT kontrollidel (joonis 1a). Trikroomvärvimise põhjal leidsime, et mg53-/-hiirtel oli WT hiirtega võrreldes rohkem neerufibroosi, alustades 5 kuu vanusest ja jätkudes kuni 20 kuu vanuseni (joonis 1b ja c). Immunohistokeemilist värvimist kasutati selleks, et hinnata MG53 ablatsiooni mõju leukotsüütide, monotsüütide ja makrofaagide infiltratsioonile 2-kuuste ja 5-kuuste hiire neerudes (joonis 1d ja e). Noorte WT- ja mg{8}}/- hiirte neerudes oli sarnane intrarenaalsete leukotsüütide tase, kuid 5-kuuste hiirte puhul leiti neerudes mg53 neerudes oluliselt rohkem põletikulisi rakke kui WT-neerudes.

Veelgi enam, silelihaste aktiini ja fibronektiini, 2 rakuvälise maatriksi valgu, mida tavaliselt leidub neerufibroosi piirkondades, immunohistokeemia näitas 3- kuni 8-kordset värvumist neerude glomerulites ja tubulointerstitiumis, mis pärinesid { {4}}kuused mg{6}}/- hiired võrreldes 10-kuuste WT hiirtega (täiendav joonis S1).

UUO indutseerib neerupõletiku ja fibroosi ägenemist mg{0}}/- hiirtel Immunoblotanalüüsiga tuvastatud neerude MG53 tase tõusis oluliselt 7 päeva pärast UUO-d (joonis 2a). Mg53- /- UUO neerudes esines liialdatud fibroos koos 30% täiendava trikroomiga värvitud alaga kui WT UUO neerudel (joonis 2b).

MG53 moduleerib NF-KB aktivatsiooni ja p65 tuuma lokaliseerimist

NF-kB (p65) aktiivsust hinnati UUO mudelis. Kogu p65 (t-p65) arv suurenes oluliselt WT ja mg53/hiirte UUO neerudes, kuid NF-kB aktivatsioon, mida hinnati p65 fosforüülimisena, oli suurem (16- korda) mg53 / UUO korral. neer kui WT UUO neer (2- korda) võrreldes fiktiivselt opereeritud loomadega (joonis 3a). Analüüsisime transformeeriva kasvufaktori b1 (TGF-b1), plasminogeeni aktivaatori inhibiitori-1 (PAI-1) ja kollageeni I tüüpi alfa 1 (Col1a1) suhtelisi RNA tasemeid ummistunud neerus.40 tuvastas võltsloomadel madala geeniekspressiooni taseme ja sarnase induktsiooni (TGF-b1, w10-kordne; PAI-1, w40-kordne; Col1a1, w40-kordne) UUO neerus WT-st ja mg53/-st (joonis 3b). MG53 ruumilise jaotuse uurimiseks neerukoores normaalsetes tingimustes analüüsiti neerukoe fraktsioone. Saime regulaarselt 10-korda rohkem kogu tsütosooli valku kui kogu ekstraheeritud tuumavalk. T-p65 tasemed olid võrreldavad tsütosoolses fraktsioonis WT ja mg53-/- hiirte vahel, kuid olid kõrgemad mg53-/- hiirte tuumafraktsioonis (joonis 3c). MG53 tuvastati tsütosooli fraktsioonis (tsütosooli markerina tubuliin). Ootamatult tuvastati tuumafraktsioonis märkimisväärne kogus MG53 (tuumafraktsiooni markerina histoon H3).

Selle leiu kinnitamiseks uurisime ka MG53 lokaliseerimist skeletilihaste fraktsioonides (täiendav joonis S2). Esitasime oma varasemad uuringud, milles MG53 paiknes tsütosoolis ja sarkolemmaalses membraanis (naatrium-kaalium adenosiintrifosfataas kui membraanifraktsiooni marker) 22, 23, 25, kuid tuvastas ka skeletilihastest rikastatud tuuma MG53.

MG53 interakteerub p65-ga, et kontrollida kasvaja nekroosifaktori a-indutseeritud transkriptsioonilist aktiivsust Koe fraktsioneerimise tulemuste kinnitamiseks viisime läbi järgmised immunohistokeemilised uuringud. Kultiveeritud WT proksimaalsetes tubulaarsetes epiteelirakkudes leiti p65 peamiselt tsütosoolis, kuid MG53 puudumisel paiknes see tuumades (joonis 4a). Kui neid rakke töödeldi LPS-ga (5 mg) 8 tundi, oli põletikueelse tsütokiini sekretsioon mg53 / rakkudes oluliselt suurem kui WT rakkudes (joonis 4b).

Kuna need andmed viitasid sellele, et MG53 võib põletikulise tsütokiini ekspressiooni reguleerimiseks interakteeruda p65-ga, hinnati p65 ja MG53 vahelist otsest interaktsiooni koimmunosadestamise analüüsidega, kasutades Flag-p65 ja HA-MG53-ga kotransfekteeritud HEK293 rakke. Näitasime nõrka interaktsiooni (joonis 4c). GFP-p65 ja RFP-MG53 plasmiidide kotransfektsioon ja konfokaalne analüüs kinnitasid p65 ja MG53 kolokaliseerumist (joonis 4d). Seejärel kvantifitseerisime, kas MG53 mõjutab NF-kB (p65) transkriptsiooni aktiivsust pärast TNF-stimulatsiooni, mõõtes lutsiferaasi aktiivsust stabiilselt NF-kB/293-GFP-Luc transkriptsiooni reporterrakuliinilt, mis oli ajutiselt transfekteeritud kummagi pHM6 vektoriga. või HA-MG53. Reporterrakud sisaldavad transdutseeritud lentiviiruse ekspressiooni tulikärbse lutsiferaasi reporterit, mida juhib minimaalne tsütomegaloviiruse promootor koos NF-kB konsensusliku transkriptsioonivastuse elementide (kB sait) 4 koopiaga ülesvoolu. TNF-a puudumisel tuvastati MG53 valke ekspresseerivates reporterrakkudes väga madal sisemine lutsiferaasi aktiivsus. MG53 pärssis TNF-a poolt esile kutsutud NF-kB (p65) transkriptsiooni aktiivsust umbes 40 protsenti (joonis 4e).

MG53 üleekspressioon takistas NF-kB p65 tuuma translokatsiooni pärast TNF-a ravi. NF-kB p65 translokeerus tuumasse pärast TNF-a ravi neeru proksimaalses tuubuli epiteelis.41 Uurida, kas ravi MG53-ga võib nõrgendada NF-kB p65 tuuma translokatsiooni. TNF-a stimulatsioonil ekspresseerisime üle MG53 HKC-8 rakkudes kas DOX-sõltuva Ad-tPA-MG53 viiruse transduktsiooni või inimese rekombinantse MG53-ga (rhMG53) töötlemise teel. Kasutades MG53-spetsiifilist monoklonaalset antikeha, tuvastati pärast DOX-sõltuvat induktsiooni MG53 immunoblotanalüüsiga. MG53 esines Ad-tPA-MG53 transdutseeritud HKC-8 rakkudes väga kõrgel tasemel,

võrdne 1 ng rhMG53/mg rakulüsaadiga. Seevastu HKC-8 võttis ja ekspresseeris palju väiksema koguse rhMG53 (joonis 5a). FL-fluorestsentsmärgisega rhMG53 omastamist HKC -8 poolt kinnitati konfokaalse mikroskoopia abil (täiendav joonis S3). Pärast TNF-a töötlemist oli p65 aktivatsiooni tippaeg 15 kuni 30 minutit (joonis 5b). Põhitingimustes asus NF-kB p65 peamiselt tsütosoolis ja MG53 üleekspressioon seda ei muutnud (joonis 5c ja d). Kuid pärast TNF-a stimuleerimist siirdus p65 HKC-8 rakkude tuumadesse, mis ei ekspresseerinud MG53 üle. Võrdluseks, p65 tuuma translokatsioon langes MG53 üleekspresseerivates rakkudes 33 protsenti (rakud, kellele anti rhMG53) 50 protsendini (transdutseeritud rakud, kellele manustati DOX-i) (joonis 5c ja d).

Tehtud RAW-rakkude ülekandmine UUOmouse'i mudelisse viidi läbi 1 - 106 rakkudega, mis manustati sabaveeni süstimise teel vahetult pärast UUO operatsiooni. Hiired jagati juhuslikult rühmadesse, kes said tavalist joogivett (-DOX) ja rühma, kes said DOX-i (2 mg/ml) joogivees. UUO hiired said RAWeveryt veel üks päev kokku 4 süstiga. Neerud koguti 7 päeva pärast operatsiooni.

Hiirtel, kellele infundeeriti konstrueeritud RAW-d, millele järgnes DOX-induktsioon, vähenes oluliselt (30% võrra) neerufibroos võrreldes nendega, kes ei saanud rakke või infundeeriti RAW-rakkudega, kuid ilma Doxi induktsioonita (66% fibrootiline piirkond; joonised 6a ja b).

Ainult väike RAW / Ad-tPA-MG53 populatsioon elas katsete lõpuks retikuloendoteliaalse süsteemi jälgimisest üle. Immunohistokeemiline värvimine kinnitas, et DOX-ravi poolt indutseeritud RAW-vahendatud MG53 ekspressioon neerus (joonis 6c). Huvitav on see, et RAW-infundeeritud hiirte ja DOX-indutseeritud MG53 UUO neerude p-65/t-p65 suhe (umbes 40 protsenti) oli madalam kui neil, kes ei saanud RAW-d või kes said RAW-d ilma DOX-ita (joonis). 6d ja e). Vähendatud p-p65 taset kinnitati UUO neerude p-p65 (S536) immunohistokeemilise värvimisega (joonis 6f). Arvame, et Raw/Ad-tPA-MG53/þDOX poolt tarnitav ringlev MG53 ja neerude proksimaalsete tuubulite rakkude omastamine võivad osaleda p-p65 (S536) vähendamises ja UUO neerupõletiku vähendamises. Võrreldes ainult UUO-d sisaldavate neerudega, suurenes TGF-b1, PAI- 1 ja Col1a1 ekspressioon märkimisväärselt hiirte UUO neerudes, kellele manustati RAW-d ilma DOX-ita (MG53 induktsioon puudub). Nende profibrootiliste geenide tõusu võib seostada tugeva allograftireaktsiooni esilekutsumisega infundeeritud rakkudest immunokompetentsetesse hiirtesse. Kuid RAW-ga infundeeritud hiirte UUO neerud, kellele manustati DOX-i (MG53 induktsioon), väljendasid oluliselt madalamat (60–72-protsendilist vähenemist) PAI-1 ja suhteliselt madalamat TGF-b1 ja Col1a1 taset kui DOX-ravita hiirtel (joonis). 6 g).

RhMG53 süsteemne manustamine leevendab NF-KB aktivatsiooni ja fibroosi arengut hiirtel, kes on allutatud UUO-le

Testisime, kas rhMG53 avaldas sarnast antifibrootilist toimet kui varem kirjeldatud RAW rakuteraapia. Meie varasemad farmakokineetilised andmed näitasid rhMG53.42 lühikest poolväärtusaega (närilistel umbes 90 minutit) Hiired talusid kroonilist manustamist annuses 2 kuni 6 mg/kg

rhMG5326,37 süvend, seega kasutati joonisel 7a näidatud manustamisstrateegiat. UUO hiirtele manustati juhuslikult kas vehiiklit (soolalahust) või rhMG53 (2 mg/kg) iga päev esimese 7 päeva jooksul pärast operatsiooni ja seejärel ülepäeviti, kuni nad 12. päeval surmati. Näidis- ja kontralateraalsetel neerudel oli ligikaudu samaväärne t-p65 ja fibronektiini ekspressioonitasemed, kusjuures p-p65 tase on veidi suurenenud kontralateraalsetes neerudes, võrreldes valeneerudega. Pärast UUO-d suurenes neeru t-p65. Võrreldes soolalahusega töödeldud loomadega vähenes p-65/t-p65 suhe UUO neerudes rhMG53--ravi saanud loomadel umbes 37 protsenti, samas kui IkBa suurenes umbes 27 protsenti (joonis 7b ja c). Lisaks vähenes fibronektiin umbes 33 protsenti (joonis 7b ja c). Immunohistokeemia kinnitas, et rhMG53 esines UUO neerudes pärast ravi (joonis 7d). Kogu fibroos vähenes rhMG{26}}ravitud UUO neerudes (joonis 7e). Kuid TGF-b1, PAI-1 ja Col1a1 RNA ekspressioon oli sarnane hiirtel, keda raviti kas soolalahuse või rhMG53-ga (joonis 7f).

cistanche on efektiivne neerufunktsiooni häirete ravis

ARUTELU

MG53 on lihastega rikastatud TRIM-valk, mida algselt identifitseeriti plasmamembraani parandamise masinate silmapaistva komponendina.22,26,42,43 Kuid MG53 toime ei piirdu ainult skeletilihastega ja MG53 võib vereringesse vabaneda müokiin.32 Oleme varem näidanud, et MG53 suudab kontrollida põletikku koekahjustuse korral kaugemates elundites.27,29,33,35–37 Käesolev uurimine laiendab MG53-vahendatud elundikaitse ulatust neerudele. Me järeldame, et MG53 võib nõrgendada intrarenaalset põletikku ja neerufibroosi, blokeerides põletikueelse ja profibrootilise transkriptsioonifaktori NF-KB tsütokiinide poolt indutseeritud aktivatsiooni. See järeldus põhineb järgmistel tähelepanekutel: (i) MG53 geneetiline deletsioon normaalsetel hiirtel.

põhjustas hiirte vananedes neerufunktsiooni languse, millega kaasnes neerufibroosi suurenemine ning leukotsüütide ja makrofaagide infiltratsioon neerudesse; (ii) hiire UUO neerukahjustuse mudelis ilmnes MG{0}}puudulike hiirte ummistunud neerudes rohkem fibroosi ja põletikku kui MG53-täielike hiirte puhul; (iii) LPS-ga töödeldud proksimaalsete tubulaarsete epiteelirakkude TNF-a ja interleukiini{3}produktsioon nõrgenes MG53 juuresolekul; (iv) MG53 töötlemine või üleekspressioon proksimaalses tubulaarses epiteeli rakuliinis vähendas TNFa-indutseeritud NF-kB aktivatsiooni, blokeerides kB p65 komponendi tuuma translokatsiooni (MG53 seostub otseselt p65-ga, kuigi nõrgalt); ja (v) p65 fosforüülimine, mis on NF-kB aktiveerimise vajalik etapp, vähenes UUO hiirte ummistunud neerudes, mida raviti rekombinantse MG53-ga, mis indutseeriti MG53 üleekspresseerimiseks makrofaagides. Lisaks suurenes rekombinantse MG53 süstitud UUO hiirte ummistunud neerudes NF-kB aktiveerimise inhibiitor IkBa.

MG53 geneetiline deletsioon normaalsetel hiirtel oli lubatav vananemise kahjulike mõjude suhtes neerudele. See viitab sellele, et endogeense MG53 olemasolu tagab vananemise ajal kaitse algtaseme. Samamoodi muutis endogeense MG53 kadu obstruktsiooni tõttu AKI halvemaks. UUO neer kogus MG53, mis võib peegeldada skeletilihaste müokiinide kaugemat aktiivsust. Jääb ebaselgeks, kuidas lihaste MG53 võib vigastuse ajal neerudesse värvata; kahjustatud neer tekitab aga sageli hüpoksiat ja läbib oksüdatiivset stressi,^44,45signaalid, mis võiksid aidata MG53 värbamiseks. Kui jah, võib seda "lihas-neer-immuunraku" telge kasutada neerukahjustuste leevendamiseks.46 Alternatiivina ekspresseerivad neerurakud algtasemel madalat MG53 taset,²⁶ja ägeda või kroonilise vigastuse korral võib MG53 tootmist ülesreguleerida.

NF-KB on neerukahjustuse ja vananemise korral põletiku ja fibroosi silmapaistev transkriptsiooniline põhjustaja.^14,17,47,48Meil paluti uurida, kas MG53 mõju saab vahendada NF-KB kaudu, kuna MG53 olemasolu neeruhomogenaatide tuumakambris viitas võimalikule transkriptsioonilisele häirele. MG53 tuuma lokaliseerimine pole pretsedenditu. Müokardi MG53 üleekspresseerivas transgeenses mudelis reguleeris tuuma MG53 peroksisoomi proliferaatoriga aktiveeritud retseptori alfa ekspressiooni transkriptsiooni tasemel ja mõjutas südame lipiidide metabolismi.49 Lisaks näitasime hiljuti, et rhMG53 pärssis NF-kB aktivatsiooni, et leevendada vanusega seotud südamepuudulikkust. põletikueelsete tsütokiinide, apoptoosi ja oksüdatiivse stressi vähendamise kaudu vananenud kardiomüotsüütides.³⁷

Molekulaarne mehhanism, kuidas MG53 moduleerib p65 tuuma / tsütoplasmaatilist mobilisatsiooni, jääb ebaselgeks. MG53 ei sisalda tuuma lokaliseerimise signaali, kuid sisaldab 3 oletatavat N-terminaalset leutsiinirikast tuumaekspordi signaali, mille motiivi tunneb ära tuumaekspordivalgu eksportiin.⁵⁰Otsene interaktsioon MG53 ja p65 vahel oli MG53 ainsa või peamise häiriva mõjuna NF-KB aktivatsioonile üsna nõrk. Kuigi näib, et MG53 mõjutab NF-KB kriitiliste komponentide dünaamilist nukleotsütoplasmaatilist liikumist, tuleb täpsed mehhanismid veel kindlaks määrata.

MG{0}}vahendatud renoprotektsiooni kriitiline tulemus näib olevat fibrootilise remodelleerumise vähendamine NF-kB-vahendatud põletiku nõrgenemise kaudu. Neerufibroos on keeruline protsess, mis hõlmab erinevate ECM-valkude patoloogilist ladestumist.51 MG53-l näis olevat selge mõju ECM-valgu fibronektiinile. Fibronektiin suurenes MG53 puudulikkusega UUO neerudes ja vähenes MG53-ga ravitud UUO hiirtel. Teiste ECM-valkude ekspressiooni MG53 juuresolekul ja puudumisel on raskem mõista. Varem näitasime in vitro uuringus, et rhMG53 reguleerib negatiivselt TGF-b1/Smad signaaliülekannet ja pärsib ECM-valkude sünteesi.31 In vivo, TGF b1, PAI-1 ja Col1a1 transkriptid ei suurenenud UUO neerudes mg53 / puudulikud loomad. Need transkriptid vähenesid UUO loomadel, kes olid indutseeritud MG53 üleekspresseerima viiruslikult indutseeritud hiire manustamise kaudu

makrofaagid, kuid rekombinantse MG53 manustamisel ei täheldatud mingit toimet. See võib olla lihtsalt piisava annustamise juhtum, sest saavutatud intrarenaalsed MG53 tasemed olid makrofaagivektorit saanud loomadel palju kõrgemad kui rekombinantse MG53. Lisaks ei mõõdetud valgu taset ja transkriptsioonijärgsed sündmused võivad UUO ECM-i muuta. MG53 esilekerkiva rolli selgitamiseks spetsiifiliste ECM-valkude moduleerimisel on vaja täiendavaid uuringuid. Kokkuvõtteks võib öelda, et see uuring on näidanud, et müokiin võib aidata reguleerida algtaseme põletikku kauges elundis nagu neer ja neerukahjustuse korral võib see aidata leevendada ja kontrollida põletikku. Joonisel 8 on esitatud töömudel MG53 rollist renoprotektsioonis. Kahjustusega seotud molekulaarsete mustrite (DAMP, nt TNF-a) ja patogeeniga seotud molekulaarsete mustrite (PAMP, nt LPS) stimuleerimise ja isheemilise stressi ajal aktiveeritakse neerus NF-kB signaalisoom. MG53 kaitseb neere, inhibeerides NF-kB signaalide fosforüülimist ja aktiveerimist, stabiliseerides IkBa ja vähendades p65 tuuma mobilisatsiooni, blokeerides põletikueelsete programmide aktiveerimise. Kuigi endogeenne MG53 võib neid toimeid vahendada, soovitame MG53 terapeutilisel kasutamisel pakkuda tugevamat kaitset, mis on teostatav, tuginedes eksogeense MG53 võimele vähendada UUO vigastusi. Täiendav uurimine on õigustatud, et mõista, kuidas seda müokiini saab kliiniliselt ära kasutada.

cistanche eelised: kaitsevad maksa ja antifibroosi

AVALIKUSTAMINE

JM-il on osalus ettevõttes TRIM-edicine, Inc., mis arendab rhMG53 inimeste haiguste raviks. Patendid MG53 kasutamise kohta kuuluvad Rutgersi ülikoolile ja Ohio osariigi ülikoolile. Kõik teised autorid ei deklareerinud konkureerivaid huve.

TUNNUSTUS

Seda tööd toetasid riiklikud terviseinstituudid (NIH) R01-DK106394 (JM, BHR ja P-HL) ja NIH R01-AG062896 (P-HL ja BHR). Seda projekti toetas osaliselt ka Ohio osariigi ülikooli (P-HL) intramuralLockwoodi fond ja riikliku tõlketeaduste arendamise keskuse (NCATS; P-HL, auhinna number UL1TR002733) auhind. Sisu eest vastutavad ainult autorid ja see ei pruugi esindada NCATSi või NIH ametlikke seisukohti.

AUTORI KAASAINESHL,

PD, P-HL, JM ja BHR kavandasid ja/või kavandasid uuringud; HL, PD, P-HL, ZL ja XZ viisid läbi katsed, kogusid andmeid ja viisid läbi andmete analüüsi; PD, P-HL ja BHR tõlgendasid tulemusi; ning P-HL ja BHR koostasid, muutsid ja kinnitasid käsikirja. Kõik autorid lugesid lõppversiooni läbi ja kiitsid selle heaks.

LISAMATERJAL

Täiendava faili (PDF) täiendavad meetodid.

Tabel S1.Praimeri järjestused. Joonis S1. mg{1}}/- hiirtel on suurenenud ECM-valgu sadestumine. Vanusekohased (10 kuu vanused) metsiktüüpi (WT) ja mg53- /- neerukuded värviti 40 6-diamidino-2-fenüülindooliga (DAPI; sinine, vasakpoolsed paneelid), a- silelihaste aktiin (SMA; roheline, teine ​​paneel), fibronektiin (punane, kolmas paneel) ja ühendatud (parempoolsed paneelid). Varras ¼ 25 mm. Neerufibroosi pindala kvantifitseerimine (n ¼ 3 rühma kohta). Andmed on esitatud keskmisena -SD. Üliõpilase t-test. ***P <>

Joonis S2.Skeletilihaste MG53 jaotus tuuma ja tsütoplasma vahel. Metsiktüüpi (WT) ormg{3}}/- hiirtelt saadud skeletilihased fraktsioneeriti ja immunoblotiti spetsiaalselt valmistatud MG53-vastase antikehaga (3 mg lüsaate) ja rakuosa markeritega (20 mg lüsaate). Naatrium-kaalium adenosiintrifosfataase kasutatakse rakumembraani markerina, histooni H3 tuumamarkerina ja tubuliini tsütosooli markerina.

Joonis S3.HKC-8 neeru proksimaalsed tuubulite rakud seovad spetsiifiliselt AlexaFluor 647-ga märgistatud rhMG53. rhMG53 (Trimedicine) ja veise seerumi albumiin (BSA; ThermoFisher Scientific) märgistati Alexa Fluor (AF) antikehade märgistamise komplektidega (Life Technologies) vastavalt tootja protokollile. HKC-8 rakke kultiveeriti Delta TPG klaaspõhjaga tassil (Bioptechs Inc.) Dulbecco modifitseeritud Eagle'i söötmes (DMEM), mis sisaldas 10 protsenti veiseloote seerumit (FBS) märgistatud valkude BSA-AF647 (vasakul) juuresolekul. ) ja rhMG53-AF647 (paremal) 24 tunni jooksul. Z-stack kujutised tehti LSM780 konfokaalsest mikroskoobist (Zeiss). Piltidel on roogade põhjas olevad rakud. Varras ¼ 25 mm.

Joonis S4.RAW-rakkude konstrueerimine indutseeritava MG53 sekretsiooni vahendamiseks. (A) RAW rakke nakatati Ad-tPA-MG53-ga 24 tundi ja neid töödeldi ilma (doksütsükliini [Dox]) või Doxiga (þDox, 1 mg/ml) veel 24 tundi, et indutseerida tPA-MG53 ekspressiooni. Konfokaalsed kujutised näitasid MG53 ekspressiooni (eritellimusel valmistatud anti-MG53 antikeha, punased, alumised paneelid) indutseerimist makrofaagitaolistest RAW-rakkudest (F4/80 värvimine, roheline, ülemised paneelid). Vardad ¼ 25 mm. (B, C) Rakulüsaatide (kogustes 0,6, 3 ja 6 mg) Western blot analüüs tPA-MG53 ja MG53 indutseeritud ekspressiooniks nakatunud RAW rakkudest (B) ja vastavast kultuurist söötmekontsentraadid (mahus 2, 5 ja 10ml) (C). Standardina laaditi erinevad kogused rhMG53 (koguses 0,2, 1, 0,05 ja 0,025 ng). Mw, molekulmassi markerid.