Miks võib retinoehappe retseptori reageerija1 soodustada glomerulaarsete haiguste arengut?

Retinoehappe retseptori reageerija1 soodustab glomerulaarsete haiguste arengut tuumafaktor-kB signaaliraja kaudu

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Katja Mo¨ller-Hackbarth1,2 , Dina Dabaghie1,2 , Emmanuelle Charrin1,2 , Sonia Zambrano1,2, Guillem Genove´ 1,3 , Xidan Li1,3 , Annika Wernerson4 , Mark Lal5 ja Jaakko Patrakka1,2

1 KI/AZ Integrated Cardio Metabolic Centre, Karolinska Institutet at Karolinska University Hospital, Huddinge, Stockholm, Sweden; 2 Laboratoorse meditsiini osakond, Karolinska Ülikooli Haigla Karolinska Instituut, Patoloogia osakond, Huddinge, Stockholm, Rootsi; 3 Huddinge meditsiiniosakond, Karolinska ülikooli haigla Karolinska instituut, Huddinge, Stockholm, Rootsi; 4 Kliiniliste teaduste, sekkumise ja tehnoloogia osakond, neerumeditsiini osakond, Karolinska Institutet, Stockholm, Rootsi; ja 5 Bioscience Renal, Research and Early Development Cardiovascular, Renal and Metabolism (CVRM), R&D Biopharmaceuticals, AstraZeneca, Göteborg, Rootsi

Kidney International (2021) 100, 809–823; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2021.05.036

Autoriõigus ª 2021, International Society of Nephrology. Väljaandja Elsevier Inc. See on avatud juurdepääsuga artikkel CC BY litsentsi alusel

Kirjavahetus: Jaakko Patrakka, Laboratoorse meditsiini osakond, Patoloogia osakond, Karolinska Institutet, Blickagången 6, SE{1}} Huddinge, Rootsi. E-post: jaakko.patrakka@ki.se Saabunud 27. juulil 2020; muudetud 11. mail 2021; vastu võetud 20. mail 2021; avaldatud veebis 18. juunil 2021

MÄRKSÕNAD: glomerulaarneendoteelirakk; NF-kB; podotsüütide; Haruldased 1

Enamikul juhtudel on põletikulised teed aktiveeritudglomerulaarsed haigusedkuid molekulaarsed mehhanismid, mis neid neerukoes juhivad, on vähe teada. Tuvastasimeretinoehaperetseptori reageerija 1 (Rarres1) kui tugevalt podotsüütidega rikastatud valk tervetes neerudes. Uuringud podotsüütide-spetsiifiliste knockout loomadega näitasid, et Rarres1 ei olnud vajalik glomerulusfiltratsiooni barjääri normaalseks arenguks ega säilitamiseks ning see ei moduleerinud neeruhaiguse tulemust glomerulonefriidi mudelis. Huvitaval kombel tuvastasime Rarres1 ekspressiooni indutseerimise glomerulaarsetes ja peritubulaarsetes kapillaaride endoteelirakkudes IgA ja diabeetilise neeruhaiguse korral, samuti ANCA-ga seotud vaskuliidi korral. Avalikult kättesaadavate RNA andmekogumite analüüs näitas, et Rarres1 ekspressiooni esilekutsumine oli krooniliste neeruhaiguste korral tavaline molekulaarne mehhanism. Tingimuslik knock-in hiireliin, mis ekspresseeris Rarres1 spetsiifiliselt endoteelirakkudes, ei näidanud ilmset neerufenotüüpi. Kuid üleekspressioon soodustas neerukahjustuse progresseerumist glomerulonefriidi mudelis. Kooskõlas sellega olid tingimuslikult knock-out hiired, kellel puudus endoteelirakkudes Rarres1, haigusmudelis osaliselt kaitstud. Mehaaniliselt soodustas Rarres1 põletikku ja fibroosi transkriptsioonifaktori tuumafaktor-kB signaaliraja kaudu, aktiveerides retseptori türosiinkinaasi Axl. Seega on Rarres1 ekspressiooni esilekutsumine endoteelirakkudes inimese glomerulopaatiate puhul levinud molekulaarne mehhanism ja sellel näib olevat patogeenne roll põletiku ja fibroosi tekitamisel tuumafaktor-KB signaaliraja kaudu.

Tõlkeavaldus

Tuvastasime ülesreguleerimiseretinoehaperetseptorile reageeriv valk 1 (Rarres1) tavaliste inimese glomerulopaatiate endoteelirakkudes (EC). Tundub, et induktsioonil on patogeenne rollglomerulaarhaiguskuna glomerulonefriidi progresseerumine (i) süvenes hiirel, kes ekspresseeris Rarres1 spetsiifiliselt EC-des, ja (ii) paranes EC-spetsiifilises Rarres1 väljalangemises. Rarres1 võib olla biomarker neeruhaiguste mikrovaskulaarsete kahjustuste tuvastamiseks ja potentsiaalselt uus terapeutiline sihtmärk.

Glomerulaarhaigusprotsessid on lõppstaadiumis neeruhaiguse peamine põhjus. Diabeetiline nefropaatia (DN) on maailmas kõige levinum lõppstaadiumis neeruhaiguse põhjus, samas kui IgA nefropaatia (IgAN) on kõige levinum primaarne glomerulonefriit (GN).1,2 Histoloogiliselt avaldub glomerulaarkahjustus nendes levinud häiretes väga sarnaselt. mood. See hõlmab glomerulaarsete endoteelirakkude (GEC) aktiveerimist, ekstratsellulaarse maatriksi laienemist, mesangiaalrakkude proliferatsiooni, podotsüütide kahjustust ja lõpuks podotsüütide kadu.

Inimese neerubiopsiate globaalsed transkriptsiooniprofiilide uuringud on näidanud tugevat põletikulist tunnust glomerulaarsete häirete korral4–7 ja hiireuuringud on näidanud, et tuumafaktor-kB (NF-kB) ja transformeeriv kasvufaktor-b (TGF-b) aktiveerimine. signaaliradadel on oluline roll haiguse progresseerumisel.8,9 Oluline on see, et NF-kB raja farmatseutilisel sihtimisel on loommudelites renoprotektiivne toime, mis näitab, et rada on potentsiaalne ravi sihtmärk.glomerulaarsed haigused.10,11 Hiljuti tuvastasime podotsüütides G-valguga seotud retseptorite klassi C rühma 5 liikme B kui NF-kB-vahendatud põletikulise reaktsiooni modulaatorit.12 Kuid glomerulopaatiate põletikuliste radade aktiveerumist põhjustavad tõenäoliselt mitmed rakutüübid. . Tegelikult tuvastatakse NF-kB signaaliraja aktiveerimine GEC-des paljude inimese neeruhaiguste korral.13,14 NF-kB aktiveerimisega seotud molekulaarsed mehhanismid GEC-des on halvasti mõistetavad.

Retinoehappe retseptori reageerija1 võib soodustada arengutGlomerulaarsed haigused

Selles uuringus analüüsisime inimese molekulaarseid signatuureglomerulaarsed haigusedja tuvastas induktsiooniretinoehaperetseptori reageerija 1 (Rarres1) ekspressioon GEC-des kui tavaline molekulaarne signatuur DN-i, IgAN-i ja neutrofiilide vastase tsütoplasmaatilise autoantikehaga (ANCA) seotud vaskuliidi korral. Uuringud hiireliinidega, milles aktiveeriti/inaktiveeriti Rarres1 ekspressiooni endoteelirakkudes (EC), näitavad, et sellel induktsioonil on GN hiiremudelis patogeenne roll. Mehhaaniliselt aktiveerib Rarres1 retseptori türosiinkinaasi Axl, mis viib NF-KB signaaliraja aktiveerimiseni. Pakume Rarres1 uueks mikrovaskulaarsete kahjustuste biomarkeriks, mis võib olla atraktiivne terapeutiline sihtmärkglomerulaarhaigusprotsesse, moduleerides põletikulisi reaktsioone.

Joonis 1|(Jätkub) (c) BackSPIN analüüs, mis näitab Rarres1 ekspressiooni spetsiifiliselt podotsüütides (PD) hiire neerukoe RNAseq andmetes (andmed saidilt Woroniecka et al.6). ( d ) Rarres1 suhteline mRNA tase inimese proovidest isoleeritud Tub ja Glom. Andmed on väljendatud Rarres1 ekspressiooni kordse muutusena Glomis võrreldes Tubiga. *P < 0.05="" versus="" vann.="" (e)="" tüüpiline="" konfokaalne="" fl="" fluorestseeruv="" mikroskoopiline="" pilt="" rarres1="" ekspressioonist="" (roheline)="" podotsüütide="" poolt="" normaalsete="" subjektide="" inimese="" glomerulites.="" (f)="" tüüpilised="" konfokaalsed="" mikroskoopilised="" kujutised,="" mis="" näitavad="" rarres1="" ekspressiooni="" inimeste="" podotsüütides;="" vimentiini="" kasutati="" peamiste="" protsesside="" markerina="" ja="" nefriini="" podotsüütide="" jalaprotsesside="" markerina.="" cd31="" kasutati="" endoteelirakkude="" markerina="" ja="" ⍺-silelihase="" aktiini="" (⍺sma)="" kasutati="" mesangiaalse="" raku="" markerina.="" vardad="50/10" mm.="" andmed="" on="" väljendatud="" keskmistena="" ±="" sem.="" kahe="" rühma="" võrdlemiseks="" kasutati="" õpilase="" t-testi.="" selle="" pildi="" vaatamise="" optimeerimiseks="" vaadake="" selle="" artikli="" veebiversiooni="" aadressil="">

MEETODID

RNA ekstraheerimine ja reaalajas polümeraasi ahelreaktsioon

Glomeruli isoleeriti, nagu eelnevalt kirjeldatud.15 RNA ekstraheeriti, kasutades TRIzol reagenti (Invitrogen) ja RNeasy komplekti (Qiagen Inc.). cDNA genereerimiseks kasutati iScript cDNA sünteesikomplekti. Kvantitatiivne polümeraasi ahelreaktsioon viidi läbi, kasutades CFX96 Touch Real-Time PCR-tuvastussüsteemi koos SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermixiga (Bio-Rad). Kasutatud praimerid on loetletud täiendavas tabelis S1. Suhtelised ekspressioonitasemed arvutati 2-DDCT meetodi abil.

Rakukultuur

Human podocytes were cultured as described.16 JetPEI transfection reagent (Polyplus-transfection SA) was used for stable transfection of pRP[Exp]-CMV>hRARRES1[ORF011242]:T2A: Bsd – plasmiid (VectorBuilder Inc. Kloonid on laienenud puromütsiini (Merck KGaA) valikul. Lühikese segava RNA (siRNA) transfektsioon Axl/Rarres1 jaoks viidi läbi kasutades siRNA-d Origene'ist. Rakud transfekteeriti MM30-ga. siRNA, millele järgnes kompleksi moodustamine JetPEI transfektsioonireagendiga (Polyplus-transfection SA) koos TGF-b1 stiimulitega või ilma (10 ng/ml söötmes). Axl-inhibiitor R428 (Selleck Chemicals) lisati 1 tund enne töötlemist (3 mmol/). l).

Miks võib retinoehappe retseptori reageerija1 soodustadaGlomerulaarhaigused?

Western blot

Rakud lüüsiti RIPA lüüsipuhvriga, millele oli lisatud proteaasi / fosfataasi inhibeerimiskokteile (Roche). Tuumafraktsioonidest pärit valgud eraldati Nuclear Extract Kit (Active Motif Europe) abil. Lüsaadid eraldati 4-12% Tris-glütsiinnaatriumdodetsüülsulfaat-polüakrüülamiidgeelil (Invitrogen) ja kanti polüvinülideendifluoriidmembraanidele (Bio-Rad). Membraanid blokeeriti 5-protsendilise veise seerumi albumiiniga (Merck). Inkubeerimine primaarsete antikehadega viidi läbi üleöö (antikehad täiendavas tabelis S2). Signaalide tuvastamiseks kasutati mädarõika peroksidaasiga konjugeeritud sekundaarseid antikehi ja Clarity Western ECL substraati (Bio-Rad). Western blot analüüsid viidi läbi vähemalt kaks korda.

RNA in situ hübridisatsioon

RNAskoobi analüüsid viidi läbi parafiiniga manustatud inimese neerudes vastavalt tootja protokollile (ACD). Kasutatud sondid olid NPHS1 - Cat nr 416071-C2, PECAM1 - Cat No. 487381-C3 ja RARRES1 - kohandatud sondi sihtmärgiks olevad nukleotiidid {{8 }}.

Neerukahjustuse hindamine

Uriini albumiini ja kreatiniini suhet hinnati hiire albumiini ELISA komplekti (Allbuwell M; Ethos Biosciences) ja QuantiChrom Creatinine Assay Kit (BioAssay Systems) abil. Neerukuded fikseeriti 10-protsendilises neutraalses puhverdatud formaliini lahuses ja sisestati parafiini, millele järgnes lõikamine ja perioodiline happe-Schiffi värvimine. 2,5-protsendilises glutaaraldehüüdis fikseeritud proovides viidi läbi elektronmikroskoopia.

Immuunvärvid

Parafiiniga manustatud kudesid fikseeriti 24 tundi formaliinis. Viie mikromeetri suurused lõigud deparafineeriti ja neid töödeldi mikrolaineahjus kas Tris-etüleendiamiintetraäädikhappepuhvris (10 mM Tris alus, 1 mM etüleendiamiintetraäädikhappe puhverlahus, 0.05 protsenti Tween 20, pH 9.0) või naatriumtsitraatpuhver (10 mM naatriumtsitraat, 0,05 protsenti Tween 20, pH 6,0), millele järgneb permeabiliseerimine 0,3 protsendi Triton X-ga-100 ja blokeeritud 10% tavalise kitseseerumi, 3% vesinikperoksüdaasi ja Vector Blocking Kitiga (Vector Laboratories). Slaidid töötati välja DAB peroksidaasi (mädarõika peroksidaasi) substraadikomplekti, 3,30 -diaminobensidiini (Vector Laboratories) abil.

Külmutatud lõikude puhul muudeti atsetooniga fikseeritud lõigud läbilaskvaks 0,1 protsendi Tween 20-ga ja blokeeriti 10 protsendi tavalise kitseseerumiga. Kasutatud primaarsed antikehad on loetletud täiendavas tabelis S1. Alexa-Fluor sekundaarsed immunofluorestsentsi antikehad saadi firmast Molecular Probes (Life Technologies). Pildid saadi Leica SP8 konfokaalse mikroskoobi (Leica Microsystems) abil.

Inimese proovid

Neerubiopsiad saadi Karolinska ülikooli haiglast (Stockholm, Rootsi). Kontrollproovid saadi kasvaja nefrektoomia läbinud isikute tervetest neerupoolustest. Kohalik eetikakomitee kiitis uuringu heaks (kinnitus nr 2010/579-31/1, Stockholm, Rootsi).

versus kontroll (Ctrl) või ***P < {{0}}.001="" versus="" si-negatiivne="" kontroll="" (rüselus)="" (rarres1,="" n="6" sirarres1,="" n="4)." (c)="" tüüpilised="" western="" blot="" dokumendid="" ja="" kokkuvõtlikud="" andmed,="" mis="" näitavad="" pp65="" suhtelist="" valgu="" taset="" podotsüütide="" eraldatud="" tuumafraktsioonides,="" mida="" on="" töödeldud="" 10="" ng/ml="" tgf-b1-ga.="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< {{40}}.001="" versus="" kontroll-podotsüüdid="" (ctrl.="" )="" (n="3)." (d)="" tüüpilised="" western="" blot="" dokumendid="" ja="" kokkuvõtlikud="" andmed,="" mis="" näitavad="" pp65="" suhtelist="" valgusisaldust="" podotsüütide="" isoleeritud="" tuumafraktsioonides,="" mida="" on="" töödeldud="" 10="" ng/ml="" tgf-b1="" ±3="" mmol/l="" r428-ga,="" n="2." (e)="" tüüpiline="" western="" blot,="" mis="" näitab,="" et="" rarres1="" üleekspressioon="" aktiveerib="" axli="" konstitutiivselt.="" *p="">< 0,05="" (n="2)." (f)="" emt-ga="" seotud="" geenide="" suhtelised="" mrna="" tasemed="" podotsüütides,="" mis="" üleekspresseerivad="" rarres1="" (rarres1)="" või="" kontroll="" podotsüütides="" (ctrl.),="" mis="" on="" transfekteeritud="" sirna-ga="" axl="" jaoks="" (siaxl),="" si-negatiivne="" kontroll="" (rüselus),="" ##p=""><0,01, ##="" #p="">< 0,001="" versus="" segamine,="" n="3" või="" töödeldud="" 3="" mmol/l="" r428-ga.="" ##p="">< 0,01,="" ###p="">< 0,001="" versus="" ctrl,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001="" versus="" rarres1,="" *p="">< 0,05="" versus="" rarres1,="" n="4." andmed="" on="" väljendatud="" keskmistena="" ±="" sd.="" kahe="" rühma="" võrdlemiseks="" kasutati="" studenti="" t-testi.="" tü,="">

Joonis 3|Podotsüüdispetsiifiliste Rarres1 knockout (CreD / Rarres1flfl / flfl) hiirte loomine. ( a ) Tingimuslike knockout hiirte genereerimine, kus Rarres1 eemaldatakse spetsiaalselt podotsüütides, kasutades Cre-LoxP rekombinatsioonisüsteemi. Ekson 3 kustutatakse NPHS2-Cre-vahendatud rekombinatsioonil. ( b ) Genotüpiseerimist kinnitati saba ettevalmistamise ja polümeraasi ahelreaktsiooniga 4 nädala vanuselt. (jätkub)

Joonis 3|(Jätkub) (c) Tüüpiline Western blot, mis näitab Rarres1 vähenenud ekspressiooni podotsüütide-spetsiifiliste Rarres1 knockout (Creþ/Rarres1flfl/flfl) hiirte isoleeritud glomerulites. (d) Rarres1 podotsüütide-spetsiifiline kadu ei mõjuta albuminuuria taset hiirtel, keda raviti nefrotoksilise seerumiga (NTS), analüüsituna uriini albumiini ja kreatiniini suhte järgi erinevates hiirerühmades (NTS-ctrl., n {{1{{) 15}}}}–7; NTS-Rarres1_cKO, n - 7). (e) Mikrofotod ja kvantifitseerimised, mis näitavad tüüpilisi glomerulaarstruktuuri muutusi erinevates hiirte rühmades. Glomerulaarsed kahjustused tuvastati perioodilise happe-Schiffiga värvitud lõikudes. #P < 0.0001="" versus="" töötlemata="" kontroll="" (ctrl.)="" (ctrl.,="" n="" -="" 6;="" nts-ctrl.,="" n="" -="" 9;="" nts-rarres1_cko,="" n="9)." (f)="" tüüpilised="" mikrofotod="" ja="" glomerulaarse="" alusmembraani="" (gbm)="" keskmise="" paksuse="" ja="" pilude="" arvu="" kohta="" mm="" gbm="" kohta="" erinevates="" hiirte="" rühmades="" transmissioonielektronmikroskoopia="" analüüside="" abil.="" ##p="">< 0,01,="" ###p="">< 0,001,="" ####p="">< 0,0001="" versus="" töötlemata="" kontroll="" (ctrl.,="" n="3;" nts-ctrl.,="" n="4;" nts-rarres{="" {33}}cko,="" n="6)." andmed="" on="" väljendatud="" keskmistena="" ±="" sem.="" kolmest="" või="" enamast="" rühmast="" koosnevate="" rühmade="" puhul="" kasutati="" ühesuunalist="" dispersioonanalüüsi,="" millele="" järgnes="" tukey="" järeltest.="" selle="" pildi="" vaatamise="" optimeerimiseks="" vaadake="" selle="" artikli="" veebiversiooni="" aadressil="">

Hiirejooned

C57Bl/6J taustaga Floxed Rarres1 hiired (Rarres1flfl/flfl; Cyagen) olid podotsiin (B6.Cg-Tg [NPHS2-cre] 295Lbh/J; Jackson Laboratory) ja Tie2 cre hiired (B6.Cg-Tg() Tek-cre)12Flv/J), et genereerida rakuspetsiifilisi knockout-hiiri. GT(ROSA)26Sortm1(CAG-Rarres1-T2A EGFP)/J hiired ristati Tie2-cre liiniga, et aktiveerida Rarres1 ekspressioon spetsiifiliselt EC-des.17 Aretus ja genotüpiseerimine viidi läbi vastavalt standardile. protseduurid. Kõik loomkatsed viidi läbi prekliinilises laboris (Karolinska Institutet) vastavalt asjakohastele juhistele ja eeskirjadele ning need on heaks kiidetud uuritavate loomade hooldamise eetikakomitee (Linköpings djurförsöksestiska nämd; DNR 1336) poolt.

Nefrotoksiline seerum (NTS) indutseeritud nefropaatia hiirtel

Seitsme kuni 9-nädalased hiired said 50 ml täielikku Freundi adjuvanti (Merck) sc, millele järgnes NTS süstimine (iv; 6 ml kehakaalu kg kohta; Probetex Inc.) päeval 4.18. Uriin koguti 3., 7. , 10 ja 14 päeva pärast süstimist ja hiired tapeti 14. päeval.

Statistiline analüüs

Statistiline analüüs viidi läbi tarkvara Prism 9.{1}} abil (GraphPad).

Esmalt uuriti andmeid normaalsuse suhtes (Shapiro-Wilki test). Kui jaotus oli Gaussi, analüüsiti andmeid parameetrilise testi abil (õpilase t-test 2 rühma jaoks ja dispersioonanalüüs Tukey järeltestiga enam kui 2 rühma puhul). Kui jaotus ei olnud Gaussilik, kasutati mitteparameetrilisi teste (Friedmani test Dunni järeltestiga enam kui 2 rühma jaoks ja Mann-Whitney U test 2 rühma jaoks). Erinevusi peeti olulisteks, kui P <>

TULEMUSED

Rarres1 ekspresseeritakse podotsüütide poolt

Esmalt hindasime Rarres1 ekspressioonimustrit hiire ja inimese neerukoes. Polümeraasi ahelreaktsiooni analüüsid näitasid, et Rarres1 ekspresseerub glomerulaardes oluliselt kõrgemal kui hiire neerukoore tubulointerstitsiaalses fraktsioonis (joonis 1a ja b6). Hiire neerukoe üherakuline RNA sekveneerimisanalüüs näitas, et Rarres1 ekspresseerivad eranditult podotsüüdid (joonis 1c). Inimestel oli Rarres1 rikastatud ka glomerulaarkoes (joonis 1d). Inimese normaalse neerukoe immunofluorestsentsi korral näitas Rarres1 glomerulites kõrget signaali (joonis 1e). Topeltvärvimine näitas, et Rarres1 paiknes kapillaarsilmustes "väljaspool" nefriini reaktiivsust, mis viitab podotsüütide ekspressioonile (joonis 1f). Kolokaliseerimine vimentiiniga näitas peamiste protsesside lokaliseerimist. EC-markeri CD31 või mesangiaalse markeri silelihase aktiini puhul ei täheldatud kattuvat reaktsioonivõimet (joonis 1f).

Rarres1 soodustab NF-kB ja TGF-b1 signaaliülekannet retseptori türosiinkinaasi Axl kaudu

Rarres1 rolli selgitamiseks podotsüütides manipuleerisime selle ekspressioonitasemetega inimese immortaliseeritud podotsüütides.16 Rarres1 tasemed olid inimese Rarres1 cDNA-ga stabiilselt transfekteeritud podotsüütides oluliselt ülesreguleeritud ja pärast Rarres{5}}sihitud siRNA-ga transfektsiooni allareguleeritud (joonis). 2a). Rarres1 üleekspressioon reguleeris epiteeli-mesenhümaalse üleminekuga seotud geenide ekspressiooni, samas kui endogeense Rarres1 allareguleerimisel oli vastupidine mõju (joonis 2b). Kuna NF-kB signaaliülekandel on oluline roll epiteeli-mesenhümaalses üleminekus, mis põhjustab fibroosi ja GN-i põletikku, 19 mõõtsime TGF-b1-indutseeritud NF-KB signaali aktiveerimist in vitro. Rarres1 üleekspressioon põhjustas NF-kB raja suurenenud aktivatsiooni algtasemel ja pärast TGF-b1 stimuleerimist (joonis 2c). Kuna on teatatud, et Rarres1 aktiveerib retseptori türosiinkinaasi Axl ja soodustab sel viisil NF-kB signaaliülekande rada põletikulise rinnavähi korral,20 hindasime, kas Axl on Rarres1 potentsiaalne funktsionaalne partner neerukoes. TGF-b1-indutseeritud NF-kB aktivatsiooni võib inhibeerida R428, Axl kinaasi selektiivne väikesemolekuliline inhibiitor21, 22 (joonis 2d) ja Rarres1 üleekspressioon korreleerus positiivselt Axl kinaasi konstitutiivse aktiveerimisega (joonis 2e). Axl-i aktiivsuse vähenemine R428-ga, kuid mitte Axl-i geenide vaigistamine siRNA-ga, võib vähendada epiteeli-mesenhümaalse üleminekuga seotud geenide Rarres-indutseeritud ekspressiooni, mida tõendab mRNA taseme langus (joonis 2f). Pange tähele, et mittekanooniliste NF-KB radade aktiveerimist ei tuvastatud (täiendav joonis S1). Seega soodustas Rarres1 NF-kB signaaliülekannet kultiveeritud podotsüütides Axl kinaasi aktiveerimise kaudu.

Miks võib retinoehappe retseptori reageerija1 soodustada glomerulaarsete haiguste arengut?

Rarres1 inaktiveerimine podotsüütides ei põhjusta glomerulaarseid kõrvalekaldeid ega moduleeri nefropaatia tulemust glomerulaarse basaalmembraani (GBM) GN mudelis

Et analüüsida Rarres1 rolli podotsüütides in vivo, genereerisime uudse Rarres1flfl/flfl (floxed) hiireliini ja ristasime selle podocin-Cre hiirtega, et saada Podocin-Cre Rarres1flfl/flfl hiiri (Creþ/Rarres1flfl/flfl) (joonis 3a). ). Floxed/Cre alleelide genotüübid tuvastati kõrva genotüpiseerimisega (joonis 3b). Tubulointerstitsiaalsete ja glomerulaarsete fraktsioonide, aga ka maksakoe polümeraasi ahelreaktsiooni analüüs kinnitas eksoni 3 deletsiooni spetsiifiliselt glomerulites (täiendav joonis S2A) ja Rarres1 valgu tase vähenes Creþ / Rarres1flfl / flfl hiirte glomerulites (joonis) 3c).

Joonis 4|Rarres1 ülesreguleerimine glomerulaarsetes ja peritubulaarsetes kapillaaride endoteelirakkudes kroonilise neeruhaigusega patsientidel. (a) Rarres1, kollageen1a2 (COL1A2) ja nefriini (NPHS1) geeniekspressiooni analüüsid diabeetilise nefropaatiaga (DN), vaskuliidi, IgA nefropaatiaga (IgAN) ja kontrollrühma (Ctrl.) patsientidelt eraldatud glomerulite mikrokiibi andmetes. 4,6,24–26 *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0="" .001="" versus="" kontrollsubjektid.="" (b)="" kvantitatiivne="" polümeraasi="" ahelreaktsiooni="" analüüs="" rarres1,="" col1a2="" ja="" nphs1="" geenide="" jaoks="" isoleeritud="" glomerulites="" patsientidel,="" kellel="" on="" dn="" (n="5)" ja="" kontrollrühmad="" (n="5)." **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001="" võrreldes="" kontrollisikutega.="" (c)="" rarres1="" ja="" col1a2="" geeniekspressiooni="" analüüsid="" dn-st,="" vaskuliidist,="" igan-ist="" ja="" kontrollpatsientidest="" eraldatud="" tubulaarse="" fraktsiooni="" mikrokiibi="" andmetes.="" *p="">< 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001="" võrreldes="" kontrollisikutega.="" (d)="" tüüpilised="" mikrofotod="" rarres1="" immunohistokeemilisest="" värvumisest="" inimese="" neerukoorekoes="" kontrollrühmadelt="" ja="" patsientidelt,="" kellel="" on="" dn="" (n="5)," anti-neutrofiilide="" tsütoplasmaatiline="" autoantikeha="" (anca)="" vaskuliit="" (n="4)" ja="" igan="" (="" n="5)." nooled="" näitavad="" rarres{42}}positiivseid="" podotsüüte="" (kontroll)="" ja="" endoteelirakke="" (ec)="" (dn,="" igan="" ja="" vaskuliit).="">

Joonis 4|(Jätkub) (e) Tüüpilised konfokaalsed mikroskoopilised kujutised, mis näitavad Rarres1 ekspressiooni DN-ga patsientide glomerulites. CD31 kasutati EC-de markerina. Vardad=50/10 mm. (f) RNAskoobi tüüpilised konfokaalsed FL fluorestseeruvad pildid, mis näitavad Rarres1 geeni ekspressiooni PECAM{6}}koekspresseerivates rakkudes DN-ga patsientide tubulaarses fraktsioonis. Andmed on väljendatud keskmisena ± SEM. Kahe rühma võrdlemiseks kasutati õpilase t-testi. Vardad=50/10 mm. Selle pildi vaatamise optimeerimiseks vaadake selle artikli veebiversiooni aadressil www.kidney-international.org.

Creþ / Rarres1flfl / flfl hiired sündisid eeldatava Mendeli pärilikkuse suhtega ning nad olid elujõulised ja viljakad (andmeid pole näidatud). Rutiinse valguse ja elektronmikroskoopilise uuringuga analüüsimisel ei olnud neerud kontroll-pesakonnakaaslastest (Cre- / Rarres1flfl/flfl ) eristatavad (täiendav joonis S2B ja C). Samuti ei mõjutanud podotsüütide valkude nefriini ja sünaptopodiini jaotus Creþ / Rarres1flfl / flfl hiirtel (täiendav joonis S2D)

Et selgitada välja Rarres1 rolli neerukahjustuses in vivo, raviti Creþ/Rarres1flfl/flfl NTS-iga, mis põhjustas IgG ladestumist GBM-is, albuminuuriat ja progresseeruvat GN-i.23 Albuminuuria tase oli sarnane nii Creþ/Rarres1flfl/flfl kui ka kontrollrühmas. hiired (joonis 3d). Valgusmikroskoopiline uuring ei näidanud olulisi erinevusi mõjutatud glomerulite osakaalus (joonis 3e). Elektronmikroskoopia ei näidanud erinevust GBM-i ega jalaprotsesside eemaldamise paksuses ning GEC-d tundusid olevat mõlemas rühmas sarnaselt mõjutatud (joonis 3f). Podotsüüdi markerid nefriini, Wt1 ja sünaptopodiini mõjutasid mõlemas rühmas sarnaselt (täiendav joonis S3A). Samuti ei näidanud EC-de värvimine CD31 abil erinevusi rühmade vahel glomerulites ega peritubulaarsetes kapillaarides (täiendav joonis S3B ja C). Lisaks oli fifibroosi ja põletikuga seotud geenide ekspressioon sarnaselt kõrgenenud mõlemas NTS-iga ravitud rühmas (täiendav joonis S4).

Rarres1 ekspressioon indutseeritakse kroonilise neeruhaiguse (CKD) glomerulaarsetes ja peritubulaarsetes kapillaar-EC-des

Rarres1 rolli uurimiseks CKD-s analüüsisime selle ekspressiooni avalikult kättesaadavates RNA andmekogumites. Me täheldasime DN-i, ANCA-ga seotud vaskuliidi ja IgAN-iga patsientidelt eraldatud glomerulites (joonis 4a), 4, 6, 24–26 märkimisväärselt suurenenud Rarres1 taset, samas kui teised podotsüütidega seotud geenid, näiteks nefriin, olid oluliselt allareguleeritud või muutumatud. . Meie kvantitatiivne polümeraasi ahelreaktsiooni analüüs DN-ga (n=5) patsientidelt isoleeritud glomerulite kohta kinnitas Rarres1 ekspressiooni indutseerimist (joonis 4b). Podotsüütide kadumise tõttu väheneb podotsüütide geenide ekspressioon tavaliselt järk-järgultglomerulaarsed haigused,6 ja glomerulaarse Rarres1 ja nefriini ekspressiooni suhe suurenes DN-s tervete glomerulitega võrreldes ligikaudu 20- korda (joonis 4b). Rarres1 ekspressioon oli ülesreguleeritud ka tubulointerstitsiaalse koe andmekogumites DN, ANCA-ga seotud vaskuliidi ja IgAN korral (joonis 4c).8–11

Järgmisena analüüsisime Rarres1 ekspressiooni immunohistokeemiliselt DN (n ¼ 5), IgAN (n ¼ 5) ja ANCA-ga seotud vaskuliidiga (n ¼ 4) patsientide neerubiopsiates. Haigestunud glomerulites näis Rarres1 värvumine olevat lokaliseeritud GEC-dele, nagu näitas immunoreaktiivsus kapillaaride seinte sisepinnal (joonis 4d, sisetükid), samas kui podotsüütide signaal tundus nõrgem. Tubulointerstitsiaalses ruumis tuvastati värvumine peritubulaarsetes kapillaarides (joonis 4d, sisetükid), mis viitab EC ekspressioonile. Topeltimmunomärgistamine CD31-ga kinnitas lokaliseerumist EC-dele nii glomerulites kui ka peritubulaarsetes kapillaarides (joonis 4e). Samamoodi näitasid topelt-RNAskoobi katsed Rarres1 mRNA kolokaliseerumist PECAM1 mRNA-ga DN-is (joonis 4f). Kokkuvõttes oli Rarres1 ekspressiooni esilekutsumine glomerulaarsetes ja peritubulaarsetes kapillaar-EC-des kroonilise neeruhaiguse korral tavaline nähtus.

Rarres1 üleekspresseeriva hiireliini genereerimine ja iseloomustamine EC-des

Kuna Rarres1 indutseeritakse inimese CKD-s, genereerisime uudse transgeense hiireliini, milles Rarres1 cDNA viidi Rosa26 lookusesse CAG promootori all, 27 koos lox-STOP-lox kassetiga splaissingu aktseptori saitide vahel (joonis 5a). Rarres1_Tie2_KI hiirte genereerimiseks ületati joon Tie2-cre joonega ja hiired tuvastati kõrva genotüpiseerimisega knockini ja Cre alleelide osas (joonis 5a). Rarres1_Tie2_KI hiirtel ilmnes märkimisväärselt suurenenud Rarres1 valgu tase neerukoes (joonis 5b) ja edukat knockin-strateegiat kinnitati veelgi Rarres1 mRNA ekspressiooni analüüsiga FACS-sorteeritud GFP-positiivsetes hiirtes. GEC-d (joonis 5c).

Fenotüpiseerisime Rarres{0}}Tie2_KI hiirte neerud ja kontrollhiirte vanuserühmad. Valgusmikroskoopilise uurimise põhjal oli neerude morfoloogia Rarres1_Tie2_KI hiirtel kontroll-pesakonnakaaslastest eristamatu (joonis 5d). Samamoodi näitas elektronmikroskoopia muutumatut GBM paksust ja podotsüütide jala protsessi laiust (joonis 5e). Veelgi enam, podotsüütide markerite nefriini ja sünaptopodiini ekspressioon ei tundunud Rarres1 üleekspresseerivates glomerulites (joonis 5f). Pange tähele, et teistel suurematel elunditel ei ilmnenud makroskoopiliselt ega mikroskoopiliselt mingeid ilmseid kõrvalekaldeid (andmeid pole näidatud).

Joonis 5|Endoteelirakkude spetsiifiliste Rarres1 knockin (Rarres1_Tie2_KI) hiirte loomine. ( a ) Tingimuslike knockin-hiirte põlvkond, milles Rarres1 ekspressioon indutseeritakse spetsiifiliselt endoteelirakkudes (EC), kasutades Cre-LoxP rekombinatsioonisüsteemi. Tie2-Cre hiired ristati hiirtega, kes ekspresseerisid sihtvektorit (Rarres1_casetteþ), mis sisaldasid splaissi vahel lox-STOP-lox kassetti (jätkub)

Joonis 5|(jätkub) aktseptorsaidid ja Rarres1 cDNA CAG promootori all, mis viidi Rosa26 lookusesse, tuvastati kõrva genotüpiseerimisega. Genotüpiseerimine kinnitati kõrva ettevalmistamise ja polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) abil 4 nädala vanuselt. (b) Tüüpiline Western blot, mis näitab Rarres1 suurenenud ekspressiooni EC-spetsiifiliste Rarres1 knockin (Rarres1_Tie2_KI) hiirte neerukoores. **P < 0.01="" versus="" kontroll="" (ctrl;="" cre-="" arres1_tie2_ki,="" n="5," mann-whitney="" u="" test).="" (="" c="" )="" kvantitatiivne="" pcr="" rarres1="" jaoks="" isoleeritud="" ec-des.="" **p="">< 0,01="" versus="" kontroll="" (cre-="" arres1_tie2_ki,="" n="3," studenti="" t-test).="" (="" d="" )="" perioodilise="" happe-schiffiga="" värvitud="" lõikude="" tüüpilised="" mikrofotod,="" mis="" näitavad="" tüüpilisi="" glomerulaarstruktuure="" erinevates="" hiirte="" rühmades.="" (e)="" tüüpilised="" mikrofotod="" ja="" glomerulaarse="" alusmembraani="" (gbm)="" keskmise="" paksuse="" ning="" pilude="" arvu="" 1="" mm="" gbm="" kohta="" erinevates="" hiirte="" rühmades="" transmissioonielektronmikroskoopia="" analüüside="" abil="" (õpilase="" t-test).="" (f)="" tüüpilised="" konfokaalsed="" mikroskoopilised="" kujutised,="" mis="" näitavad="" podotsüütide-spetsiifilise="" markeri="" sünaptopodiini="" ja="" nefriini="" ekspressiooni="" ec-spetsiifilistel="" rarres1="" knock-in="" hiirtel="" (rarre1_tie2_ki)="" ja="" ctrl.="" hiired.="" vardad="10" mm.="" andmed="" on="" väljendatud="" keskmistena="" ±="" sem.="" selle="" pildi="" vaatamise="" optimeerimiseks="" vaadake="" selle="" artikli="" veebiversiooni="" aadressil="">

Rarres1 indutseerimine EC-des moduleerib NF-kB signaaliülekande rada ja nefropaatia tulemust, reguleerides Axl aktiveerimist

Et hinnata, kas Rarres1 ekspressioon EC-des moduleerib haiguse progresseerumist, indutseerisime transgeensetes hiirtes ja nende pesakonnakaaslastes GN-i ühe NTS-i süstiga. Rarres1_- Tie2_KI hiirtel tekkis 3 päeva pärast oluliselt kõrgem albuminuuria tase kui kontrollrühma hiirtel, samas kui 7, 10 ja 14 päeva pärast albuminuurias olulist erinevust ei täheldatud (joonis 6a). Histoloogiline analüüs 14 päeva pärast induktsiooni näitas, et Rarres1_Tie2_KI hiirtel ei esinenud rohkem glomerulaarseid muutusi, nagu sklerootilisi ja poolkuu kahjustusi (joonis 6b). Elektronmikroskoopiline hindamine näitas aga märkimisväärselt paksemat GBM-i ja suuremat jalajälgede kadumist Rarres1_Tie2_KI hiirtel (joonis 6c). Lisaks ilmnes Rarres{15}}Tie2_KI hiirtel neerukoores suurenenud silelihase aktiini tase (joonis 6d). Podotsüüdi markerite nefriini, sünaptopodiini ja WT1 analüüs näitas põhjalikku vähenemist, mis viitab diferentseerumisele ja podotsüütide olulisele kadumisele (joonis 6d). Oluline on see, et Rarres{21}}Tie2_KI glomerulites oli kontrollloomadega võrreldes vähem WT1-positiivseid podotsüüte, mis näitab, et EC-ekspresseeritud Rarres1 soodustas podotsüütide kahjustusi. Samuti avastati rohkem fibriini trombe Rarres1_Tie2_KI glomerulites (joonis 6e). Kooskõlas sellega oli erinevate põletiku, fifibroosi ja neerutuubulite vigastusega seotud geenide ekspressioon Rarres1_- Tie2_KI hiirtel märkimisväärselt ülesreguleeritud, nagu näitas reaalajas polümeraasi ahelreaktsiooni analüüs Il. -1beeta, Col1a1, TGF-b1 ja neerukahjustuse molekul-128 neerukoore koes (joonis 6f). Siiski ei tuvastatud rühmade vahel erinevusi vere uurea lämmastiku ja S-kreatiniini väärtustes (joonis 6g). Samuti ei näidanud EC-de värvimine CD31 abil erinevusi rühmade vahel glomerulites ega peritubulaarsetes kapillaarides (täiendav joonis S5A ja B). Kokkuvõttes süvendas Rarres1 ekspressiooni EC-spetsiifiline indutseerimine glomerulaarset patoloogiat NTS-indutseeritud nefropaatias.

Mehaaniliselt analüüsisime, kas Rarres1 üleekspressioon EC-des soodustas Axl ja NF-KB signaaliülekande aktiveerimist in vivo, sarnaselt meie in vitro vaatlustele (joonis 2). Nii Rarres1_Tie2_KI kui ka kontrollhiirtel, keda raviti NTS-iga, ilmnes Axl signaaliraja aktiveerumine, mida näitab suurenenud Axl fosforüülimine (joonis 6h). See aktiveerimine oli aga olulisem Rarres1_- Tie2_KI hiirtel (joonis 6h). Vastavalt sellele soodustati nendel hiirtel NF-kB raja aktivatsiooni, mida näitab pP65--positiivsete tuumade arv glomerulites (joonis 6i). Kui pP65 taset mõõdeti Western blot analüüsiga, tuvastasime sarnase suundumuse NF-KB raja aktiveerimisel, kuigi see ei olnud märkimisväärne, võib-olla ühe kõrvalekalde tõttu (täiendav joonis S5C).

Rarres1 inaktiveerimine EC-des vähendab glomerulaarseid kahjustusi GBM-vastases glomerulonefriidi mudelis

EC-st pärineva Rarres1 patogeense rolli kinnitamiseks kroonilise neeruhaiguse korral genereerisime hiireliini, milles Rarres1 kustutati EC-des, kasutades Tie2-Cre-d (joonis 7a). Floxed ja Cre alleelide genotüübid tuvastati kõrva genotüpiseerimisega (joonis 7b). NTS-ga ravitud hiirtel esines Rarres1 ülesreguleerimise suundumus, mis kaotati Rarres1_Tie2_KO hiirtel (joonis 7c). Hiirtel ei ilmnenud ilmseid neeruhäireid (andmeid pole näidatud). NTS-i süstimine kutsus esile sarnase albuminuuria Rarres{11}}Tie2_KO-s ja kontrollides (joonis 7d). Kuid histoloogiline analüüs 14 päeva pärast induktsiooni näitas vähem glomerulaarseid muutusi Rarres1_- Tie2_KO hiirtel (joonis 7e). Elektronmikroskoopias näitasid Rarres1_Tie2_KO hiirtel jalalaba protsessi vähem tuhmumist ja GBM-i paksenemist (joonis 7f). Immunovärvimine ei näidanud olulisi erinevusi aSMA, nefriini ega sünaptopodiini puhul (joonis 7g). Kuid WT1-positiivsete podotsüütide arv oli Rarres1_Tie2_KO hiirtel oluliselt suurem (joonis 7g). Värvimine pP65 jaoks näitas positiivsete tuumade arvu vähenemist Rarres1_Tie2_KO glomerulites, mis viitab NF-kB signaaliraja osalemisele (joonis 7h).

Joonis 6|(jätkub) keskmise glomerulaarse basaalmembraani (GBM) paksuse ja pilude arvu 1 mm GBM kohta kvantifitseerimine erinevates hiirte rühmades transmissioonielektronmikroskoopia analüüsi osade abil (Ctrl., n=4; NTS-ctrl., n { {3}}; NTS-Rarres1_Tie2_KI, n=12). ( d ) Tüüpilised konfokaalsed mikroskoopilised kujutised, mis näitavad nefriini, sünaptopodiini, ⍺-silelihase aktiini (⍺Sma) ja WT1 ekspressiooni neerudes erinevatest hiirte rühmadest. Vardad {{10}}/10 mm. ⍺Sma-positiivne ala loendati kortikaalse ristlõike kohta ja WT1 loendati glomeruli kohta (Ctrl., n=2; NTS-ctrl., n=3; NTS-Rarres{{18} }Lips2_KI, n {{20}}). (e) Trihhoomiga värvimisega tuvastatud fibriini trombide olemasolu glomerulites (loendatakse glomerulaarse ristlõike kohta) (Ctrl., n=3; NTS-ctrl., n=4; NTS-Rarres{{ 26}}Lips2_KI, n=5). (f) Erinevate põletike, fifibroosi ja neerutuubulite vigastusega seotud geenide suhtelised mRNA tasemed NTS-ga ravitud hiirte neerukoores (Ctrl., n=4; NTS-ctrl., n=6 –10; NTS-Rarres1_Viis2_KI, n=6–10). (g) Seerumi kreatiniini ja vere uurea lämmastiku (BUN) tase NTS-ctrl-s. (n=3) ja NTS-Rarres1_Tie2_KI (n=3) hiired. (h) Tüüpilised Western blot dokumendid ja kokkuvõtlikud andmed, mis näitavad Paxili suhtelist valgusisaldust neerukoores erinevates NTS-ga ravitud hiirte rühmades (NTS-ctrl., n=4; NTS-Rarres1_ Viis2_KI, n=5). (i) Tüüpilised mikrofotod pP65 immunohistokeemilisest värvimisest neerukoore koes erinevatest NTS-ga töödeldud hiirte rühmadest. pP65-positiivsed tuumad glomerulite kohta kvantifitseeriti erinevates hiirte rühmades (Ctrl., n=7; NTS-ctrl., n=8; NTS-Rarres1_Tie 2_KI, n=14). EÜ-spetsiifilised Rarres1 knock-in hiired (Rarres1_Tie2_KI hiired); Kontrollina kasutati Rarres1 kassetiga ja ilma Cre ekspressioonita hiiri (Ctrl.). #P < 0,05,="" ##p="">< 0,01,="" ###p="">< 0,001="" versus="" töötlemata="" kontroll="" (ctrl.),="" *p="">< 0,05="" versus="" nts-ga="" töödeldud="" kontroll="" (nts-ctrl.).="" andmed="" on="" väljendatud="" keskmistena="" ±="" sem.="" kahe="" rühma="" võrdlemiseks="" kasutati="" õpilase="" t-testi.="" kolmest="" või="" enamast="" rühmast="" koosnevate="" rühmade="" puhul="" kasutati="" ühesuunalist="" dispersioonanalüüsi,="" millele="" järgnes="" tukey="" järeltest.="" selle="" pildi="" vaatamise="" optimeerimiseks="" vaadake="" selle="" artikli="" veebiversiooni="" aadressil="">

ARUTELU

Rarres1 tuvastati esmakordselt tasaroteeniga töödeldud nahaparvekultuurides29 ja on näidatud, et see toimib eesnäärmevähi rakuliinides invasiooni repressorina.30 Põletikulise rinnavähi korral reguleerib Rarres1 vähirakkude invasiooni in vitro Axli signaaliraja vahendusel. . Üksikasjalikult stabiliseerib Rarres1 Axli, pärssides Axli proteasoomist sõltuvat lagunemist. Lisaks reguleerib Rarres1 vähenemine SUM149 rakkudes Axl ekspressiooni ja inaktiveerib NF-kB, mis viib põletikuliste rinnavähirakkude invasiooni vähenemiseni.20 Lisaks indutseeritakse Rarres1 ekspressioon kaugelearenenud fibroosiga patsientidel ja Rarres1 on profibrootiline roll. soovitatud roti kopsufibroosi mudelis ja maksa tähtrakkude fibrogeense aktiveerimise ajal.31 Kokkuvõttes viitavad varasemad in vitro uuringud Rarres1 rollile fifibroosis, põletikus ja vähi invasioonis.

Esialgu tõstis Rarres1 meie huvi, kuna see oli podotsüütide rakkudes väga rikastatud. Võiksime näidata, et Rarres1 soodustas Axl-vahendatud NF-KB raja aktiveerimise kaudu podotsüütides põletikulist ja profibrootilist signaaliülekannet. Teisest küljest ei näidanud podotsüütide-spetsiifilised knockout-loomad tervislikes tingimustes ega GN-i hiiremudeliga võrreldes selget erinevust võrreldes kontrollidega. See võib olla tingitud kompenseerivatest mehhanismidest, kuna NF-KB signaalirada reguleerivad mitmed molekulid ja bioloogilised protsessid.

Diabeediga patsientide molekulaarne profiilide koostamine näitas, et DN-is indutseeriti Rarres1 glomerulaarsetes ja peritubulaarsetes kapillaaride EC-des. Oluline on see, et nefropaatiata diabeedihaigetel EC-des Rarres1 ekspressiooni ei tuvastatud. Seetõttu oletame, et Rarres1 võib olla diabeetilise mikrovaskulaarse haiguse uus marker ning uuringud plasma- ja uriiniproovidega on näidustatud, et uurida Rarres1 kui mitteinvasiivse biomarkeri teostatavust. Tuvastasime Rarres1 indutseerimise ka IgAN-i ja vaskuliidiga patsientidel. On ahvatlev oletada, et Rarres1-l on nendes glomerulopaatiates patogeenne roll ja see aitab kaasa haiguse progresseerumisele. Funktsionaalselt näitasime, et Rarres1 indutseerimine EC-des suurendas GN-i hiiremudelis neerukahjustust, samas kui Rarres1 inaktiveerimine EC-des leevendas vigastust. Fenotüüpne analüüs näitas, et EC-des Rarres1 üleekspresseerivatel hiirtel olid mõjutatud podotsüüdid. See võib olla Rarres1 otsene mõju podotsüütidele, kuna on kirjeldatud Raresi lahustuvat vormi.32 Alternatiivina võib podotsüütide kahjustus olla sekundaarne glomeruluse filtreerimisbarjääri kahjustuse tõttu.

Varem on näidatud, et endoteeli NF-KB aktivatsioon mängib vaskuliidi neeruhaiguse tekkes patogeenset rolli.13 Eelkõige katkestas endoteeli NF-kB raja inhibeerimine poolkuu GN mudelis progresseerumise. Axl inhibiitorid on osutunud kasulikuks eksperimentaalse GBM-vastase nefriidi korral. Hiirtel, keda raviti kõige selektiivsema väikesemolekulilise inhibiitoriga R428, säilis oluline neerufunktsioon ja vähenes põletikuliste tsütokiinide tootmine.33 See näitab, et see rada võib olla ravivõimalusglomerulaarhaigusprotsessid. Kuna aga nii Axl kui ka NF-kB moduleerivad mitmeid erinevaid rakulisi protsesse kogu kehas, ei ole see tõenäoliselt hea kandidaat kroonilise neeruhaiguse farmatseutiliseks sihtimiseks. Rarres1 võib pakkuda rohkem neerudega seotud sihtmärki.

On näidatud, et Tie2-Cre juhib ekspressiooni hematopoeetiliste rakkude alampopulatsioonis.34 Mõned neist rakkudest võivad moduleerida põletikulist vastust NTS-indutseeritud mudelis ja seetõttu ei saa välistada, et vereloomerakkudest pärinev Rarres1 aitab kaasa haiguse progresseerumine Tie{5}}Cre liinides. Kuna me aga ei tuvastanud infiltreeruvates immuunrakkudes ilmset Rarres1 ekspressiooni, arvame, et see on vähem tõenäoline.

Selle käsikirja ettevalmistamise ajal teatasid Chen et al.32 Rarres1 lahustuvast vormist, mis soodustabglomerulaarhaigusprogresseerumist. Nad tuvastasid sarnaselt meiega Rarres1 ülesreguleerimise tavaliste inimese glomerulaarhaiguste korral. Uuring toetab meie järeldust, et suurenenud Rarres1 ekspressioon korreleerub neerufunktsiooni langusegainimese glomerulaarhaigus. Kuid erinevalt meie tulemustest järeldasid nad, et Rarres1 ülesreguleerimine oli tingitud podotsüütide üleekspressioonist. Me ei saa seda võimalust välistada, kuid inimeste haiguste puhul tuvastasime EC-des Rarres1 ekspressiooni selge indutseerimise. Üks meie leide selgitav mehhanism võib olla see, et podotsüütide poolt toodetud Rarres1 lahustuva vormi võtavad GEC-d omaks. Tulemused, mille kohaselt tuvastasime EC-des in situ hübridisatsiooni teel Rarres1 mRNA ja et Rarres1 indutseeriti ka peritubulaarsetes kapillaar-EC-des, toetavad tugevalt ideed, et Rarres1 ekspressioon neeruhaiguste korral on peamiselt endoteeli päritolu.

Joonis 7|Rarres1 endoteelispetsiifiline ablatsioon nõrgendab neerukahjustust nefrotoksilise seerumi (NTS) saanud hiirtel. ( a ) Tingimuslike knockout hiirte genereerimine, kus Rarres1 eemaldatakse spetsiifiliselt endoteelirakkudes, kasutades Cre-LoxP rekombinatsioonisüsteemi. Ekson 3 kustutatakse Tie2-Cre-vahendatud rekombinatsioonil. (b) Genotüpiseerimist kinnitati saba ettevalmistamise ja polümeraasi ahelreaktsiooniga (jätkub)

Joonis 7|(jätkub) 4 nädala vanuselt. (c) Tüüpilised Western blot dokumendid ja kokkuvõtlikud andmed, mis näitavad Rarres1 suhtelist valgusisaldust neerukoores erinevates NTS-ga ravitud hiirte rühmades (NTS-ctrl., n=4; NTS-Rarres1_ Viige 2_KO, n=4) ja ravimata hiired (juhtimine [Ctrl.], n {{10}}). **P < 0.01.="" (d)="" uacr="" (uriini="" albumiini="" ja="" kreatiniini="" suhe)="" erinevates="" nts-ravi="" saavate="" hiirte="" rühmades="" (ctrl.,="" n="7–11;" rarres1_tie2_ko,="" n="" {="" {19}}–8).="" (e)="" mikrofotod="" ja="" kvantifitseerimised,="" mis="" näitavad="" tüüpilisi="" glomerulaarstruktuuri="" muutusi="" erinevates="" hiirte="" rühmades.="" glomerulaarsed="" kahjustused="" tuvastati="" perioodilise="" happega="" schiffiga="" värvitud="" lõikudes="" (ctrl.,="" n="3;" nts-ga="" töödeldud="" kontroll="" [nts-ctrl.],="" n="12;" nts="" rarres1_tie{="" {27}}ko,="" n="8)." (f)="" tüüpilised="" mikrofotod="" ja="" keskmise="" glomerulaarse="" alusmembraani="" (gbm)="" paksuse="" ja="" pilude="" arvu="" kvantifitseerimine="" glomerulaarmembraani="" (gbm)="" mm="" kohta="" erinevates="" hiirte="" rühmades="" transmissioonielektronmikroskoopia="" analüüside="" lõikude="" abil="" (ctrl.,="" n="6;" nts-ctrl.="" ,="" n="13;" nts-rarres1_viis2_ko,="" n="16)." (="" g="" )="" tüüpilised="" konfokaalsed="" mikroskoopilised="" kujutised,="" mis="" näitavad="" nefriini,="" sünaptopodiini,="" silelihase="" aktiini="" (sma)="" ja="" wt1="" ekspressiooni="" neerudes="" erinevatest="" hiirte="" rühmadest.="" vardad="50/10" mm.="" sma-positiivne="" ala="" loendati="" kortikaalse="" ristlõike="" kohta="" (nts-ctrl.,="" n="8;" nts-rarres1_tie2_ko,="" n="4)." (h)="" tüüpilised="" mikrofotod="" pp65="" immunohistokeemilisest="" värvimisest="" neerukoore="" kudedes="" erinevatest="" nts-ga="" töödeldud="" hiirte="" rühmadest.="" pp65-positiivsed="" tuumad="" glomerulite="" kohta="" kvantifitseeriti="" erinevates="" hiirte="" rühmades="" (nts-ctrl.,="" n="7;" nts-rarres1_tie2_ko,="" n="" {{="" 56}}).="" ####p="">< 0,001="" versus="" töötlemata="" ctrl,="" *p="">< 0,05="" versus="" nts-ctrl.="" andmed="" on="" väljendatud="" keskmistena="" ±="" sem.="" kahe="" rühma="" võrdlemiseks="" kasutati="" õpilase="" t-testi.="" kolmest="" või="" enamast="" rühmast="" koosnevate="" rühmade="" puhul="" kasutati="" ühesuunalist="" dispersioonanalüüsi,="" millele="" järgnes="" tukey="" järeltest.="" selle="" pildi="" vaatamise="" optimeerimiseks="" vaadake="" selle="" artikli="" veebiversiooni="" aadressil="">

Selles uuringus on mõned piirangud, mida tuleks tunnistada. Esiteks on podotsüütides läbi viidud in vitro uuringud, samas kui in vivo manipuleerisime ekspressiooniga EC-des. Seetõttu ei saa me Rarres1 otse siduda Axli aktiveerimisega EC-des. Teiseks, kuigi me suutsime tuvastada Rarres1--indutseeritud (Axl-sõltuva) NF-kB signaaliülekande aktivatsiooni podotsüütides, ei uurinud me selle protsessi taga olevat molekulaarset mehhanismi. Eelmise järelduse uurimiseks, et Rarres1 soodustab Axli aktivatsiooni, inhibeerides selle proteasoomist sõltuvat lagunemist, on vaja rohkem uuringuid. Lõpuks vaidlustasime oma knockout/-in loomad ainult NTS-indutseeritud nefropaatia mudeliga. Seetõttu on näidustatud rohkem uuringuid loommudelites, et näha, kas Rarres1-l on patogeenne roll ka muudes haigusprotsessides.

Kokkuvõtteks võib öelda, et meie uuring näitab, et tavaliste inimese glomerulopaatiate korral indutseeritakse EC-des podotsüütidega rikastatud valk Rarres1, mis põhjustab põletikku, podotsüütide vigastust ja fifibroosi. Seda võib potentsiaalselt vahendada NF-kB signaaliülekanderaja tõhustamine retseptor-türosiinkinaasi Axl aktiveerimise kaudu (joonis 7). Rarres1 on uus mikrovaskulaarsete vigastuste biomarker ja võib potentsiaalselt olla uudne terapeutiline sihtmärk põletiku ja fibroosi mahasurumisel kroonilise neeruhaiguse korral

AVALIKUSTAMINE

ML on Rootsis Göteborgis asuva AstraZeneca töötaja. JP uurimistööd toetab AstraZeneca. Kõik teised autorid ei deklareerinud konkureerivaid huve.

TUNNUSTUS

Seda uuringut toetasid KM-H Diabetes Wellness Sverige'ist ja JP KI/AZ integreeritud ainevahetuskeskusest, Marianne ja Marcus Wallenbergi sihtasutus, Rootsi Diabeedifond, Rootsi Neerufond ja Innovaatilise Meditsiini Keskus.

AUTORI KAASALAD

KM-H, ML ja JP kavandasid uurimistöö; KM-H, DD, EC, SZ ja GG viisid läbi uuringud; KM-H ja XL analüüsisid andmeid; AW andis inimproove; ning KM-H ja JP kirjutasid paberi.

Miks võib retinoehappe retseptori reageerija1 soodustada glomerulaarsete haiguste arengut?

LISAMATERJAL

Täiendav fail (PDF)

Tabel S1. Selles uuringus kasutati reaalajas RT-PCR jaoks sihtgeenide praimeripaare.

Tabel S2. Selles uuringus kasutati antikehi. Täiendav fail (PowerPoint)

Joonis S1. Rarres1 üleekspressioon ei aktiveeri mittekanoonilist NF-KB signaalirada. Tüüpiline Western blot dokument ja kokkuvõtlikud andmed, mis näitavad, et Rarres1 üleekspressioon ei aktiveeri p100/p52 podotsüütides, mida on töödeldud 10 ng/ml TGF-b1-ga (n=2). Andmed on väljendatud keskmistena ± SD. Kahe rühma võrdlemiseks kasutati õpilase t-testi. TÜ, ravimata.

Joonis S2. Podotsüüdispetsiifiliste Rarres1 knockout (Creþ/Rarres1flfl/flfl) hiirte loomine. (A) Tavapärane PCR-analüüs torukujulistes ja glomerulaarfraktsioonides, samuti maksakoes. (B) Neerupatoloogia histoloogiline uurimine (PAS-värvimine) Cre–/Rarres1flfl/flfl ja Creþ/Rarres1flfl/flfl hiirtel. (C) Tüüpilised transmissioonielektronmikroskoopid (TEM) ja glomerulaarse basaalmembraani (GBM) keskmise paksuse kvantifitseerimine ja pilude arv GBM mm kohta erinevates hiirerühmades (n=3). (D) Tüüpilised konfokaalsed mikroskoopilised kujutised, mis näitavad podotsüütide-spetsiifiliste markerite, sünaptopodiini ja nefriini ekspressiooni podotsüütide-spetsiifilistel Rarres1 knockout (Creþ/Rarres1flfl/flfl) ja kontroll- (Cre–/Rarres1flfl/flfl) hiirtel. Riba=10 mm.

Joonis S3. Podotsüüdi markerite ja CD31 ekspressioonitasemed NTS-ga töödeldud hiirte neerudes. (A) Tüüpilised konfokaalsed mikroskoopilised kujutised, mis näitavad nefriini, WT-1 ja sünaptopodiini ekspressiooni podotsüütides NTS-ga töödeldud Rarres1 podotsüütidespetsiifilistelt knockout-hiirtelt (Creþ/Rarres1flfl/flafl) ja kontroll-pesakonnakaaslastelt (Cres1flR/reflar). flfl). Riba=10 mm (NTS Cre– /Rarres1flfl/flfl , n=4; NTS-Creþ/Rarres1flfl/flfl, n=5). (B) CD{15}}positiivsete kapillaaride osakaal peritubulaarsetes piirkondades. Hiire kohta hinnati 30 peritubulaarset piirkonda. (NTS Cre– /Rarres1flfl/flfl, n= 4; NTS-Creþ/Rarres1flfl/flfl, n=4). Õpilase t test. (C) CD31 signaali poolkvantitatiivne hindamine glomerulites: 0=signaal puudub, 1=nõrk signaal, 2=mõõdukas signaal, 3=tugev signaal. Igalt hiirelt hinnati kümmet glomeruli (NTS Cre–/ Rarres1flfl/flfl , n=4; NTS-Creþ/Rarres1flfl/flfl, n=4). Õpilase t test.

Joonis S4. Fibroosi, põletiku ja torukujulise vigastuse markerite ekspressioonitasemed NTS-ga ravitud hiirte neerudes. (A) Tüüpilised konfokaalsed mikroskoopilised kujutised, mis näitavad -Sma ekspressiooni neerudes NTS-ga töödeldud Rarres1 podotsüütide spetsiifilistelt knockout hiirtelt (Creþ/Rarres1flfl/flfl) ja kontroll-pesakonnakaaslastelt (Cre–/Rarres1flfl/flfl). Riba=100 mm. (B) Erinevate põletiku-, fifibroosi- ja neerutuubulite vigastustega seotud geenide suhteline mRNA tase NTS-iga ravitud hiirte neerukoores. #P < 0.05,="" ##p="">< 0,01="" versus="" kontroll="" (ctrl);="" andmed="" on="" väljendatud="" keskmistena="" ±="" sem.="" kahe="" rühma="" (võlts="" n="2;" nts–="" cre–="" arres1flfl/flfl,="" n="3;" nts-creþ/rarres1flfl/flfl,="" n="3)" võrdlemiseks="" kasutati="" studenti="" t-testi.="">

Joonis S5. C31 ja aktiveeritud P65 ekspressioon NTS-ga töödeldud neerudes. (A) CD31-positiivsete kapillaaride osakaal peritubulaarsetes piirkondades. Hiire kohta hinnati 30 peritubulaarset piirkonda (NTS Cre–/ Rarres1flfl/flfl, n=4; NTS Creþ/Rarres1flfl/flfl, n=4). Üliõpilase t-test. (B) CD31 signaali poolkvantitatiivne hindamine glomerulites: 0=signaal puudub, 1=nõrk signaal, 2=mõõdukas signaal, 3 =tugev signaal. Igal hiirel hinnati kümmet glomeruli (NTS Cre –/Rarres1flfl/flfl, n =4; NTS-Creþ/Rarres1flfl/flfl, n= 4). Üliõpilase t-test. (C) Tüüpilised Western blot dokumendid ja kokkuvõtlikud andmed, mis näitavad pP65 suhtelist valgu taset neerukoores NTS-ga ravitud hiirte ja ravimata kontrollide erinevates rühmades (ctrl.) (ctrl., n=3; NTS-ctrl. , n=9; NTS-Rarres1_Viis2_KI, n=10). Andmed on väljendatud keskmistena ± SEM. Kahe rühma võrdlemiseks kasutati õpilase t-testi.

VIITED

1. Reidy K, Kang HM, Hostetter T, Susztak K. Diabeetilise neeruhaiguse molekulaarsed mehhanismid. J Clin Invest. 2014;124:2333–2340.

2. Lai KN, Tang S, Schena F jt. IgA nefropaatia. Nat Rev Dis krundid. 2016;2:16001.

3. Lal MA, Patrakka J. Podotsüüdi bioloogia mõistmine uudsete neeruravimite väljatöötamiseks. Eesmine Endokrinool (Lausanne). 2018;9:409.

4. Ju W, Greene C, Eichinger F jt. Rakutüübi spetsiifilisuse määratlemine inimese haiguste transkriptsiooni tasemel. Genome Res. 2013; 23:1862–1873.

5. Ju W, Nair V, Smith S jt. Epidermise kasvufaktori kudede transkriptoomipõhine tuvastamine kroonilise neeruhaiguse biomarkerina. Sci Transl Med. 2015;7:316ra193.

6. Woroniecka KI, Park A, Mohtat T jt. Inimese diabeetilise neeruhaiguse transkriptsioonianalüüs. Diabeet. 2011;60:2354–2369.

7. Wiggins JE, Patel S, Shedden K jt. NFkappaB soodustab põletikku, koagulatsiooni ja fibroosi vananevas glomerulites. J Am Soc Nephrol. 2010;21:587–597.

8. Prakoura N, Kavvadas P, Korman R jt. NFkappaB-indutseeritud periostiin aktiveerib integriin-beeta3 signaaliülekande, et soodustada neerukahjustust GN-is. J Am Soc Nephrol. 2017;28:1475–1490.

9. Chang AS, Hathaway CK, Smithies O, Kakoki M. Transforming growth factor-beeta1 ja diabeetiline nefropaatia. Am J Physiol Renal Physiol. 2016;310:F689–F696.

10. Mudge SJ, Paizis K, Auwardt RB jt. Tuumafaktor-kappa B aktiveerimine podotsüütide poolt passiivse Heymanni nefriidi autoloogses faasis. Kidney Int. 2001;59:923–931.

11. Tomita T, Takano M, Tomita R jt. NFkappaB transkriptsioonifaktori peibutus inhibeerib tsütokiini ja adhesioonimolekuli ekspressiooni reumatoidartriidist saadud sünoviaalrakkudes. Reumatoloogia (Oxford). 2000;39:749–757.

12. Zambrano S, Möller-Hackbarth K, Li X jt. GPRC5b moduleerib põletikulist reaktsiooniglomerulaarsed haigusedNF-kappaB raja kaudu. J Am Soc Nephrol. 2019;30:1573–1586.

13. Choi M, Schreiber A, Eulenberg-Gustavus C jt. Endoteeli NF-kappaB blokaad tühistab ANCA-indutseeritud GN. J Am Soc Nephrol. 2017; 28:3191–3204.

14. Zheng L, Sinniah R, Hsu SI. Aktiveeritud NF-kappaB in situ glomerulaarne ekspressioon inimese luupusnefriidi ja muu mitteproliferatiivse proteinuurse glomerulopaatia korral. Virchows Arch. 2006;448:172–183.

15. Takemoto M, He L, Norlin J jt. Neeruglomerulite arengu ja funktsiooniga seotud geenide ulatuslik identifitseerimine. EMBO J. 2006;25:1160–1174.

16. Saleem MA, O Hare M, Reiser J et al. Tinglikult immortaliseeritud inimese podotsüütide rakuliin, mis demonstreerib nefriini ja podotsiini ekspressiooni. J Am Soc Nephrol. 2002;13:630–638.

17. Kisanuki YY, Emoto N, Ohuchi T jt. Madal vererõhk endoteelirakkude spetsiifilistel endoteliin 1 knockout hiirtel. Hüpertensioon. 2010;56:121–128.

18. McAdoo SP, Pusey CD. Anti-glomerulaarne basaalmembraani haigus. Clin J Am Soc Nephrol. 2017;12:1162–1172.

19. Qi XM, Wang J, Xu XX jt. FK506 vähendab albuminuuriat, parandades podotsüütide nefriini ja podotsiini ekspressiooni diabeetilistel rottidel. Inflflamm Res. 2016;65:103–114.

20. Wang X, Saso H, Iwamoto T jt. TIG1 soodustab Axl kinaasi aktiveerimise kaudu põletikulise rinnavähi teket ja progresseerumist. Cancer Res. 2013;73:6516–6525.

21. Holland SJ, Pan A, Franci C jt. R428, Axl kinaasi selektiivne väikesemolekuliline inhibiitor, blokeerib kasvaja levikut ja pikendab metastaatilise rinnavähi mudelite elulemust. Cancer Res. 2010;70:1544–1554.

22. Myers SH, Brunton VG, Uniti-Broceta A. AXL-i inhibiitorid vähis: meditsiinilise keemia perspektiiv. J Med Chem. 2016;59:3593–3608.

23. Salant DJ, Darby C, Couser WG. Eksperimentaalne membraanne glomerulonefriit rottidel. Glomerulaarsete immuunladestuste moodustumise kvantitatiivsed uuringud isoleeritud glomerulites ja tervetes loomades. J Clin Invest. 1980;66:71–81.

24. Berthier CC, Bethunaickan R, Gonzales-Rivera D jt. Liikidevaheline transkriptsioonivõrgu analüüs määratleb ühised põletikulised reaktsioonid hiire ja inimese luupuse nefriidi korral. J Immunol. 2012;189:988–1001.

25. Grayson P, Eddy S, Taroni J jt. Ainevahetusteed ja immunometabolism haruldaste neeruhaiguste korral. Ann Rheum Dis. 2018;77: 1226–1233.

26. Liu P, Lassen E, Nair V jt. Transkriptoomiline ja proteoomiline profiilide koostamine annab ülevaate mesangiaalsete rakkude funktsioonist IgA nefropaatias. J Am Soc Nephrol. 2017;28:2961–2972.

27. Niwa H, Yamamura K, Miyazaki J. Tõhus valik kõrge ekspressiooniga transfektantidele uue eukarüootse vektoriga. Gene. 1991;108:193–199.

28. Loefflfler I, Wolf G. Diabeetilise nefropaatia epiteeli-mesenhümaalne üleminek: fakt või väljamõeldis? Rakud. 2015; 4:631–652.

29. Nagpal S, Patel S, Asano A jt. Tazaroteeni indutseeritud geen 1 (TIG1), uudneretinoehaperetseptoritele reageeriv geen nahas. J Invest Dermatol. 1996;106:269–274.

30. Jing C, El-Ghany M, Beesley C jt. Tazaroteeni poolt indutseeritud geeni 1 (TIG1) ekspressioon eesnäärme kartsinoomides ja selle seos tuumorigeensusega. J Natl Cancer Inst. 2002;94:482–490.

31. Teufel A, Becker D, Weber SN jt. RARRES1 tuvastamine maksafibroosi põhiregulaatorina. J Mol Med (Berl). 2012;90:1439–1447.

32. Chen A, Feng Y, Lai H jt. Lahustuv RARRES1 indutseerib podotsüütide apoptoosi soodustamiseksglomerulaarhaigusprogresseerumist. J Clin Invest. 2020;130:5523–5535.

33. Zhen Y, Lee IJ, Finkelman FD, Shao WH. Axl retseptori türosiinkinaasi sihipärane inhibeerimine leevendab GBM-i-indutseeritud luupuse-taolist nefriiti. J Autoimmuun. 2018;93:37–44.

34. Tang Y, Harrington A, Yang X jt. Tie2 liini panus primitiivsetesse ja lõplikesse vereloomerakkudesse. Genesis. 2010;48:563–567