Kombinatoorsed geneetika meetodid kõrgetasemeliste regulatiivsete kombinatsioonide avastamiseks ja neuraalse diferentseerumise geneetiliste ajurite väljatöötamiseks

Sukeldumine tõhusate rakkude diferentseerumisfaktorite otsimisse

Teadlased püüavad endiselt leida paremaid ravimeid, et taastada või aeglustada neuroloogiliste häirete, nagu Parkinsoni tõbi, Alzheimeri tõbi ja Huntingtoni tõbi, progresseerumist. Need häired on neuronaalsete rakkude surma tagajärg aju erinevates osades. Patsientide sümptomite leevendamiseks kasutatavad ravimid või ravimeetodid ei ole hästi kindlaks tehtud.

Klõpsa, et neuroprotektsiooniks saada tubulosa pulbrit

Need ei taasta kahjustatud närvikudesid ja võivad põhjustada soovimatuid kõrvalmõjusid. Seetõttu vaadeldakse üha rohkem uuringuid, et tüvirakud on paljutõotavad ravimeetodid, kuna neil on iseenesliku uuenemise võime ja soovitud rakuliinideks diferentseerumise paindlikkus, mis on ette nähtud patsiendile siirdamiseks, et taastada kaotatud närvikuded.

Enne kui tüvirakke saab neuroloogiliste häirete ravis kliiniliselt kasutada, on siiski valdkondi, mis vajavad nende täieliku potentsiaali avamiseks paremat mõistmist. Tüvirakud on regeneratiivsed ja tempermalmist võimelised muutuma mis tahes rakutüübiks, arvestades õigeid diferentseerumist soodustavaid tegureid. Suures tegurite võrgustikus on aga sügav keerukus.

Oluline on määrata transkriptsioonifaktorite (TF), väikeste molekulide ja/või kasvufaktorite kombinatsioonid, et saavutada tüvirakkude, sealhulgas embrüonaalsete tüvirakkude (ESC) ja indutseeritud pluripotentsete tüvirakkude diferentseerumise optimaalne sünergia kõige kiiremini, mille tulemuseks on neuronaalse liini puhtaimas populatsioonis. Siiski võiks olla strateegiline viis nende tegurite kulutõhusamaks ja ajasäästlikumaks sõelumiseks.

See aitaks optimeerida juba väljakujunenud protokolle, mis on endiselt töömahukad, või neuronaalsete alatüüpide, näiteks keskmise oga neuronite, sensoorsete neuronite ja serotonergiliste neuronite edasiseks iseloomustamiseks. Endiselt on väljakutseks neuronite saatuse tegurid igakülgselt profileerida ja määratleda, kuidas need elemendid regulatiivses võrgus üksteisega suhtlevad.

Mõned rühmad on kasutanud uusi suure läbilaskevõimega sõelumismeetodeid, et selgitada rakkude saatuse regulatiivset võrgustikku, ja andnud informatiivse ülevaate teguritest, mis põhjustavad neuronaalset konversiooni ja ellujäämist. Liu et al. (2018) kasutasid CRISPR-i aktiveerimist (CRISPRa), et otsida TF-e või DNA-d siduvaid tegureid, mis soodustavad ESC-de neuronaalset saatust. Töö piirdus aga üksikute tegurite või paariskombinatsioonide uurimisega.

Veel ühe süstemaatilise sõelumise viisid läbi Tsunemoto jt. (2018), mis uuris TF-ide vahelist seost. Enamikul nende valitud üksikutest TF-idest ei ilmnenud uuringus mingeid mõjusid, kuid nad tuvastasid 76 paarikaupa TF-i kombinatsiooni, et soodustada hiire fibroblastide diferentseerumist indutseeritud neuroniteks.

Eelkõige ei olnud nende tulemustel teatav kooskõla varasemate uuringutega, näiteks ei tuvastatud indutseeritud neuronites dopamiini aktiivset transporterit Slc6a3, mis võib olla tingitud täiendavatest teguritest ilmajäämisest. Teises uuringus määrati kindlaks olulised geenid neuronite ellujäämise säilitamiseks või parandamiseks, viies läbi CRISPR-i häiretel (CRISPRi) põhineva sõeluuringu (Tian et al., 2019). Ja jällegi piirdusid nad üksikute sgRNA-de skriinimisega.

Täiendavad uuringud on vajalikud teiste geneetiliste tegurite erapooletuks skriinimiseks ja faktorite kombinatsioonide arvu suurendamiseks, kuna on näidatud, et eri kontekstides võib vaja minna rohkem kui kahe teguri kokteili, et tõhusalt juhtida diferentseerumist ja ümberprogrammeerimist.

Hea näide on Oct4, Sox2, Klf4 ja c-Myc kombinatsioon, mis on vajalik arendussignaalivõrgu reguleerimiseks ESC-de pluripotentsuse jaoks (Takahashi ja Yamanaka, 2006). Sellistes keerulistes süsteemides on vaja igakülgselt iseloomustada kõrge järgu geneetiliste kombinatsioonide funktsioone suure läbilaskevõimega ja Combinatorial Genetics En Masse (CombiGEM) meetod võib seda lihtsalt teha.

CombiGEM-meetod suure läbilaskevõimega, kõrge järjekorra ja süstemaatilise tegurikombinatsioonide kuvamiseks

CombiGEM ei paku mitte ainult süstemaatilist võimalust suuremahuliste ühendatud ekraanide läbiviimiseks, vaid sellel on ka võime skaleeritavalt kokku panna kõrgetasemelisi kombinatoorseid geneetilisi raamatukogusid (Wong et al., 2015, 2016; Zhou et al., 2020). Ühe poti protsess võimaldab kasutajal sõeluda paljusid geneetilisi kombinatsioone; 1-viis, 2-viis, 3-viis ja teoreetiliselt n-suunalised teegid.

See pakub kiiret alternatiivi tavapärasele huvipakkuvate kandidaatide kombinatsioonide loomise ja testimise protsessile. Kuigi paarikaupa geneetiliste kombinatsioonide uurimiseks töötati välja ka mitmed teised kombinatoorsed CRISPR-sõeluuringu strateegiad (Han et al., 2017; Shen jt, 2017; Najm jt, 2018; Truong jt, 2019; DeWeirdt jt, 2020 ), pakub CombiGEM ainulaadset võimalust hinnata kolme või enama geneetilise kombinatsiooni vahelisi koostoimeid.

Näiteks kui kasutaja soovib kasutada CRISPRa-d või CRISPRi-d vastavalt kandidaat-TF-i kombinatsioonide loendi üleekspresseerimiseks või mahasurumiseks, võib CombiGEM-CRISPR v2 abil kuvada TF-i sihtivate sgRNA-kombinatsioonide vöötkoodiga raamatukogu.0 ( Wong jt, 2016; Zhou et al., 2020), nagu on näidatud joonisel 1.

Ühe poti ligeerimise etappe kasutades liidetakse sgRNA-de raamatukogu ja nende vastavad vöötkoodid lentiviiruse sihtkoha vektorisse, mis teatab fluorestseeruva valgu ekspressioonist pärast neuroniraku tüübispetsiifilise promootori, nagu tubuliin 1, aktiveerimist. sgRNA-de ja eraldi lentiviiruse vektori, mis sisaldab ensümaatiliselt puudulikku Cas9, mis on kas sulandatud transkriptsiooni aktivaatori või repressoriga, saab toimetada soovitud lähterakkudesse.

Aja jooksul, kui rakud hakkavad diferentseeruma, ekspresseerivad fluorestsentsi ainult indutseeritud neuronilaadsed rakud ja neid rakke saab eraldada, kasutades fluorestsents-aktiveeritud rakkude sorteerimist, et leida vöötkoodi järjestuse abil nende TF-kombinatsioonid.

Et paremini mõista kombinatsioone, mis juhivad spetsiifilisi rakuliini, saab neid rakke uurida ka teadaolevate rakuliini reporterite või markerite suhtes, lähtudes kasutaja poolt valitud diferentseerumisetappide eelistustest. Sõltuvalt rakupinna markerite ekspressioonidest võib huvipakkuvate rakkude eraldamiseks kasutada magnetiliselt aktiveeritud rakkude sorteerimist.

Üherakulise RNA sekveneerimise võib siduda kombinatoorse CRISPR-sõeluuringuga näiduna, et profileerida geeni üles- või allareguleerimise tüüpi ja taset ning sihtmärgiks olevate TF-ide kombinatsiooni saab määrata vöötkoodi lugemise kaudu (Replogle et al., 2020). Suure sisaldusega pildistamist saab kasutada rakkude morfoloogia muutuste jälgimiseks neuronite arengu varasest kuni hilisemate etappideni.

Indutseeritud neuronilaadsete rakkude füsioloogilist tähtsust või funktsionaalsust saab määrata neuronite küpsemise spetsiifilise immunotsütokeemilise märgistamise (nt NeuN, TUJ1 ja MAP2) ja elektrofüsioloogiliste meetmete abil. Nagu varem mainitud, on uuringutes kombineeritud TF ja väikesed molekulid, et manipuleerida raku saatusega.

CombiGEM-i saab kasutada ka väikeste molekulide kombinatsioonide tuvastamiseks, mis võivad säilitada tüvirakkude iseeneslikku uuenemist, indutseerida rakuliini diferentseerumist või hõlbustada ümberprogrammeerimist, suurendades tõhusust ja potentsiaalselt asendades geneetilisi tegureid. CombiGEM-i saab rakendada ka signaaliülekanderadade, epigeneetiliste või rakuliste protsessitegurite väikeste molekulide sihtmärkide esmalt kindlaksmääramisel.

Seejärel saab ravitavate sihtmärkide aktiveerimiseks või inaktiveerimiseks sgRNA raamatukogu kavandamise kaudu tuvastada väikeste molekulide tõhusad kombinatsioonid, et suurendada diferentseerumist või ümberprogrammeerimist. Seda kontseptsiooni kajastavad hästi uuringud, mille oleme varem läbi viinud vähi ja Parkinsoni tõve vastaste ravimite sihtmärkide kombinatsioonide avastamiseks (Zhou et al., 2020).

CombiGEM-i kasutamine ei piirdu ainult CRISPR-põhiste häiretega, vaid seda saab rakendada ka muude DNA või RNA regulatoorsete tegurite suhtes, et uurida RNA häiretega funktsiooni kadumise ekraane, aga ka funktsiooni suurenemise ekraane ekspressiooniga. mikroRNA-de (Wong et al., 2015) ja järjestusega kontrollitud inimese avatud lugemisraamid, nagu need, mis on kirjeldatud inimese TFome raamatukogus (Ng et al., 2020).

CombiSEAL-meetod transkriptsioonifaktorite suure läbilaskevõimega konstrueerimiseks

Looduslikult esinevate geneetiliste tegurite ideaalse kombinatsiooni leidmine võib siiski tekitada väljakutseid, näiteks piirdumine genoomi iseloomustatud TF-idega, millel on eelnevad teadmised nende ekspressiooni ja rollide kohta diferentseerumisel. Uuringud on näidanud, et TF-ide konstrueerimine või kunstlike transkriptsioonifaktorite genereerimine avab uued võimalused diferentseerumise kiiruse kiirendamiseks alternatiivsete radade kaudu, ületades sõltuvuse teiste endogeensete kaasfaktorite ekspressiooni eeltingimusest geeniregulatsioonivõrgus või asendades need täielikult. looduslikud TF-id tõhusamatega (Jauch, 2018).

See võimaldab teadlastel kohandada vajalikke tegureid vastavalt nende eksperimentaalsetele vajadustele. Teeme ettepaneku, et kui eesmärk on viia läbi suure läbilaskevõimega mutageneesi mitmel saidil TF-i, mis sisaldab erinevaid domeene, võib CombiSEAL osutuda kasulikuks platvormiks (Choi et al., 2019). CombiSEAL-i meetod koondab aminohappeid kodeerivad DNA fragmendid, mis on kombinatoorselt märgistatud vöötkoodidega (joonis 1).

Joonis 1 ｜ CombiGEM ja CombiSEAL meetodid tõhusate diferentseerumise geneetiliste tegurite väljaselgitamiseks. CombiGEM meetodi näide on samast konstruktsioonist ekspresseeritud mitme sgRNA kokkupanek ja sgRNA kombinatsioonid on esindatud nende ühendatud vöötkoodidega. CombiSEAL-meetod hõlmab mutatsioone, mis on viidud valgu erinevatesse osadesse, nagu transkriptsioonifaktorid, mis on tähistatud kui P1, P2, P(n) ja P(n pluss 1). Ja mutatsioonide kombinatsioone kajastavad nende vastavad ühendatud vöötkoodid. Kasutaja saab seadistusi rakendada teistele DNA kohaletoimetamissüsteemidele ja selles esituses kasutatakse lentiviiruse vektoreid. Skriinimisstrateegiaid saab läbi viia koondvormingus ja selles näites tuvastatakse spetsiifiliseks neuroniliiniks diferentseeruvate rakupopulatsioonide tuvastamine fluorestseeruva valgu ekspressiooni promootori aktiveerimisega, mis on diagrammil märgistatud X-fluorestsentsina. Rakukogumi vöötkoodide järgmise põlvkonna sekveneerimine (NGS) dešifreerib DNA sihtmärgid või transkriptsioonivariandi(d). Erinevate neuronitüüpide diferentseerumist juhtivate tegurite range analüüs võib kasutada massiivipõhiseid meetodeid, nagu rakkude sondeerimine rakuliini markeritega, millele järgneb magnetiliselt aktiveeritud rakkude sorteerimine (MACS) mitme süvendiga plaatidele, mida saab jälgida suure sisuga pildistamine. Alternatiivina võimaldab üherakuline RNA sekveneerimine (RNA-Seq) kasutajal profiilida soovitud fenotüüpidega rakkude geeniekspressioonid ja saada vöötkoode, et tuvastada võtmevariantide sgRNA kombinatsioone või mutatsioonikombinatsioone. FACS: Fluorestsents-aktiveeritud rakkude sorteerimine.

CombiSEAL alustab valgu esimestest osadest, kus soovitakse mutagenees. Kasutaja saab iga jaotise jaoks luua suvalise arvu variante, seejärel märgistada need vöötkoodidega, et tuvastada mutatsioonide asukoht ja kombinatsioon. Seejärel koondatakse iga sektsioonide kogum järjestikku, sisestades need sihtvektorisse, mis sisaldab kavandatud mutageneesi piirkonnas külgnevat tüüpi IIS ensüümidega modifitseeritud metsiktüüpi valgu järjestust.

See valgu mitme osa ühendamise armideta liitskeem on oluline, et vältida valgule soovimatute aminohapete lisamist. CombiSEAL-meetod võimaldab tõhusamalt ja kulutõhusamalt määrata valitud huvipakkuvate variantide kogumi aminohappejärjestusi, vältides vajadust kogu valgu ulatuses pikka aega loetud järjestuse järele, et tuvastada mutatsioonide tüübid ja nende asukoht. valk.

See metoodiline seadistus võimaldab lihtsat analüüsi, viies läbi lühikeste ühendatud vöötkoodide kogumi suure läbilaskevõimega järjestuse, mis järeldab aminohapete mutatsioonide tüüpide ja positsioonide kombinatsiooni või muid soovitud modifikatsioone, nagu domeenivahetus, sisestamine ja kustutamine. algselt projekteeritud ja paigaldatud TF-ile

Järeldus

Võrreldes katse-eksituse meetoditega on tehtud edusamme süstemaatilisemate lähenemisviiside kasutamisel, et määrata kindlaks olulised tegurid või kombinatsioonid, mis on vajalikud ühe rakutüübi muundamiseks neuronaalseks liiniks. Kõrgema järgu kombinatsioonide tuvastamise võime on siiski puudulik ja siin pakume välja, et CombiGEM-meetod võib selliseid piiranguid käsitleda.

CombiGEM kasutab vöötkoodiga ühepotilist ligeerimissüsteemi, et koondada DNA sidumisfaktorite kõrgema järgu kombinatsioonid, et suunata DNA ühe korraga, vältides mitme sõeluuringu protsessi, et kitsendada tabamuste arvu kontrollitava suuruseni allavoolu valideerimiseks. . Veelgi enam, vähem tõhusaid looduslikke TF-e saab geeniekspressiooni paremaks reguleerimiseks asendada kunstlike või konstrueeritud TF-idega. Kirjeldame valgu mutageneesi meetodit CombiSEAL, mis võimaldab kasutajatel luua suuri transkriptsioonifaktori variantide kogumeid, koondades otse mitu vöötkoodidega märgistatud saidi mutatsiooni valgu sees ja nende erinevates domeenides.

See kiirendab ja vähendab sõeluuringute kulusid huvipakkuvate variantide mutatsioonide tüüpide kohta teabe hankimiseks. Loodame, et pakutud meetodid aitavad paremini mõista ja avardada närviregeneratsiooni edendamise võimalusi ning neid saab laialdaselt rakendada ka teistes uurimisvaldkondades.

Cistanche neuroprotektiivse toime mehhanism

Cistanche'il on neuroprotektiivne toime mitme mehhanismi kaudu:

1. Põletikuvastane toime: Cistanche sisaldab ühendeid, mis pärsivad põletikku erinevates ajuosades, mis võivad aidata kaitsta neuroneid kahjustuste eest.

2. Antioksüdantne toime: Cistanche sisaldab ühendeid, millel on tugevad antioksüdantsed omadused. Antioksüdandid aitavad kaitsta neuroneid vabade radikaalide ja oksüdatiivse stressi põhjustatud kahjustuste eest.

3. Neurotransmitterite reguleerimine: on näidatud, et Cistanche reguleerib teatud neurotransmittereid, nagu serotoniin ja dopamiin, mis võivad aidata kaitsta neuroneid ja parandada kognitiivset funktsiooni.

4. Neurotroofse faktori stimulatsioon: on näidatud, et Cistanche stimuleerib neurotroofsete tegurite tootmist, nagu ajust tuletatud neurotroofne faktor (BDNF), mis võib soodustada neuronite kasvu ja ellujäämist.

Üldiselt töötavad need mehhanismid koos, et kaitsta neuroneid kahjustuste eest, soodustada nende kasvu ja ellujäämist ning parandada kognitiivset funktsiooni.

Viited

Choi GCG, Zhou P, Yuen CTL, Chan BKC, Xu F, Bao S, Chu HY, Thean D, Tan K, Wong KH, Zheng Z, Wong ASL (2019) Kombinatoorne mutagenees optimeerib massiliselt SpCas9 genoomi redigeerimistegevust. Nat Methods 16:722-730.

DeWeirdt PC, Sanson KR, Sangree AK, Hegde M, Hanna RE, Feeley MN, Griffith AL, Teng T, Borys SM, Strand C, Joung JK, Kleinstiver BP, Pan X, Huang A, Doench JG (2020) AsCas12a optimeerimine inimese rakkude kombinatoorsete geneetiliste sõeluuringute jaoks. Nat Biotechnol 39:94-104.

Han K, Jeng EE, Hess GT, Morgens DW, Li A, Bassik MC (2017) Sünergistlikud ravimikombinatsioonid vähi jaoks, mis tuvastati CRISPR-sõeluuringus paariliste geneetiliste interaktsioonide jaoks. Nat Biotechnol 35:463- 474.

Jauch R (2018) Rakkude saatuse ümberprogrammeerimine natiivsete transkriptsioonifaktorite kavandamise kaudu. Curr Opin Genet Dev 52:109-116.

Najm FJ, Strand C, Donovan KF, Hegde M, Sanson KR, Vaimberg EW, Sullender ME, Hartenian E, Kalani Z, Fusi N, Listgarten J, Younger ST, Bernstein BE, Root DE, Doench JG (2018) Orthologous CRISPR- Cas9 ensüümid kombinatoorsete geneetiliste ekraanide jaoks. Nat Biotechnol 36:179-189.

Ng AHM, Khoshakhlagh P, Rojo Arias JE, Pasquini G, Wang K, Swiersy A, Shipman SL, Appleton E, Kiaee K, Kohman RE, Vernet A, Dysart M, Leeper K, Saylor W, Huang JY, Graveline A, Taipale J, Hill DE, Vidal M, Melero-Martin JM, et al. (2020) Inimese transkriptsioonifaktorite põhjalik raamatukogu raku saatuse kujundamiseks. Nat Biotechnol doi: 10,1038/s41587-020-0742-6.

Replogle JM, Norman TM, Xu A, Hussmann JA, Chen J, Cogan JZ, Meer EJ, Terry JM, Riordan DP, Srinivas N, Fiddes IT, Arthur JG, Alvarado LJ, Pfeiffer KA, Mikkelsen TS, Weissman JS, Adamson B (2020) Kombinatoorsed üherakulised CRISPR-ekraanid otsese juhitava RNA püüdmise ja sihitud järjestuse abil. Nat Biotechnol 38:954- 961.

Shen JP, Zhao D, Sasik R, Luebeck J, Birmingham A, BojorquezGomez A, Licon K, Klepper K, Pekin D, Beckett AN, Sanchez KS, Thomas A, Kuo CC, Du D, Roguev A, Lewis NE, Chang AN , Kreisberg JF, Krogan N, Qi L jt. (2017) Kombinatoorsed CRISPRCas9 ekraanid geneetiliste interaktsioonide de novo kaardistamiseks. Nat Methods 14:573-576.

Takahashi K, Yamanaka S (2006) Pluripotentsete tüvirakkude esilekutsumine hiire embrüonaalsetest ja täiskasvanud fibroblastikultuuridest kindlaksmääratud teguritega. Lahter 126:663-676.

Tian R, Gachechiladze MA, Ludwig CH, Laurie MT, Hong JY, Nathaniel D, Prabhu AV, Fernandopulle MS, Patel R, Abshari M, Ward ME, Kampmann M (2019) CRISPR-i häiretel põhinev platvorm multimodaalsete geneetiliste ekraanide jaoks inimese iPSC-s - tuletatud neuronid. Neuron 104:239-255.

Truong VA, Hsu MN, Kieu Nguyen NT, Lin MW, Shen CC, Lin CY, Hu YC (2019) CRISPRai samaaegseks geenide aktiveerimiseks ja inhibeerimiseks, et soodustada tüvirakkude kondrogeneesi ja kalvariaalse luu regeneratsiooni. Nucleic Acids Res 47:e74. Wong AS, Choi GC, Cheng AA, Purcell O, Lu TK (2015) Massiivselt paralleelne kõrge järgu kombinatoorne geneetika inimese rakkudes. Nat Biotechnol 33:952-961.

Wong AS, Choi GC, Cui CH, Pregernig G, Milani P, Adam M, Perli SD, Kazer SW, Gaillard A, Hermann M, Shalek AK, Fraenkel E, Lu TK (2016) CombiGEM-i poolt lubatud multipleksitud vöötkoodiga CRISPR-Cas9 sõelumine . Proc Natl Acad Sci USA 113:2544-2549.

Zhou P, Chan BKC, Wan YK, Yuen CTL, Choi GCG, Li X, Tong CSW, Zhong SSW, Sun J, Bao Y, Mak SYL, Chow MZY, Khaw JV, Leung SY, Zheng Z, Cheung LWT, Tan K , Wong KH, Chan HYE, Wong ASL (2020) Kolmesuunaline kombinatoorne CRISPR-ekraan ravimitega kasutatavate sihtmärkide koostoimete analüüsimiseks. Cell Rep 32:108020.

Dawn GL Thean, Alan SL Wong*