Biomphalaria Alexandrina biokeemilised ja histopatoloogilised vastused RIPEXile (taimede kasvuregulaator)Ⅰ

Abstraktne

Taust

Taimekasvuregulaatoreid kasutatakse põllumajanduses laialdaselt taimede kasvu ja küpsemise kiirendamiseks, kuid need ohustavad veeökosüsteemi. Käesolevas uuringus hinnati subletaalse kokkupuute mõju RIPEXi 48-protsendilise EÜ kontsentratsiooniga (8 ja 16 µL/L) oksüdatiivse stressi parameetritele, suguhormoonidele, immuunpotentsiaali ensüümidele, diferentsiaalsele hemotsüütide arvule ning seedenäärmete ja munarakkude histopatoloogiale. Biomphalaria alexandrina teod.

Klõpsake testosterooni herba lisamiseks

Tulemused

Kokkupuude RIPEXiga põhjustas B. Alexandrina superoksiidi dismutaasi ja glutatioon-S-transferaasi aktiivsuse üldise suurenemise. Kuid äärmuslik RIPEX-i kokkupuude pärsib SOD-i aktiivsust tigudes. Malondialdehüüdi aktiivsus näitas mõlema kontsentratsiooniga kokkupuutel B. Alexandrina suurenemist pärast kõiki kokkupuuteperioode. RIPEX põhjustas ka märkimisväärset testosterooni tõusu tigudel, kes puutusid kokku 16 µL/l, kuid vähendas hormooni taset tigudel, kes olid 7 päeva jooksul kokku puutunud 8 µL/l. Östradiooli puhul ilmnes märkimisväärne tõus pärast 3-päevast kokkupuudet 16 µl/l-ni ja 7-päevast kokkupuudet 8 µl/l-ni. RIPEXi kokkupuude suurendas ka müeloperoksidaasi ja adenosiindeaminaasi ensüümide aktiivsust tigude seedenäärmetes. See suurendas paljastatud tigude hemotsüütide koguarvu ja granulotsüütide arvu. Tigude seedenäärmetes ja munatestis ilmnesid pärast 7-päevast RIPEXiga kokkupuudet patoloogilisi muutusi.

Järeldused

Need leiud viitavad sellele, et RIPEX on B. Alexandrinale toksiline ja seda tigu saab kasutada taimede kasvuregulaatoritega keskkonna saastumise bioindikaatorina.

Märksõnad

Biomphalaria alexandrina, RIPEX, testosteroon, östradiool, müeloperoksidaas, adenosiindeaminaas, histopatoloogia

1 Taust

Pinnavee agrokeemiline reostus on kasvav ülemaailmne keskkonnaprobleem, eriti piirkondades, kus põllumajandus kiiresti laieneb ja intensiivistub. Saagikoguse ja kvaliteedi muutmiseks, et rahuldada klientide vajadusi, kasutatakse mitmesuguseid sünteetilisi kemikaale, nagu pestitsiide või väetisi [7, 40]. Taimekasvu soodustavad ained on paljudes riikides levinud agrokemikaalid [18].

Kui neid kemikaale hingatakse otse sisse või tarbitakse koos saastunud köögiviljadega, kahjustavad need inimeste tervist [39]. Fosfororgaaniline pestitsiid etefoon (2-kloroetüülfosfoonhape) on etüleeni vabastav sünteetiline kemikaal, mida kasutatakse tavaliselt taimede kasvuregulaatorina (PGR), et soodustada seemnete esilekutsumist, viljade valmimist ja muid füsioloogilisi reaktsioone. See on heaks kiidetud kasutamiseks mitmesugustel toidu-, sööda-, toiduks mittekasutatavatel taimedel, kasvuhoonete puukoolide ja ilutaimede puhul, mida kasvatatakse õues [3, 50]. Etefooni toksilisuse laboratoorsed hinnangud näitasid, et etefoon põhjustas Daphnia magna teise antenni, sensoorsete harjaste, sabalüli ja rostrumi morfomeetrilisi väärarenguid, mis põhjustasid funktsiooni kaotuse ja surma [54].

Abd-El Azeem [1] registreeris kasvukiiruse, DNA kahjustuste ja apoptootiliste mõjude vähenemise nälkja Deroceras reticulatum seedenäärmerakkudes pärast kokkupuudet etefooniga. Paljud autorid kiitsid heaks Ethephoni toksilisuse rottidele ja lindudele [2, 17, 55]. Lisaks põhjustas kokkupuude etefooniga hiirtel genotoksilisust, oksüdatiivset stressi ja reproduktiivtoksilisust [16]. Teratogeensust ja sugunäärmete süsteemi düsfunktsiooni hiirtel on seostatud ka etefooni kokkupuutega [2, 16]. Samuti on näidatud, et etefoon on immunotoksiline, omab mutageenset toimet [26], suurendab oksüdatiivset stressi ning vähendab desoksüribonukleiin- ja ribonukleiinhapete kontsentratsiooni [4].

Veekogudes olev etefoon võib ohustada veefaunat; andmed selle mõju kohta veeorganismidele on aga napid. Taimede kasvuhormoonide tuvastamiseks veesüsteemides on kasutatud mitmeid veeliike. Mõne neist organismidest on aga keeruline laboris manipuleerida ja säilitada, mistõttu on nende kasutamine ökotoksikoloogilistes hindamistes keerulisem [54]. Veemoluskid, sealhulgas teod, on viimasel ajal pälvinud tähelepanu katseorganismidena, kuna on vaja välja töötada selgrootute mudelid veesaasteainete keskkonnaseireks [21, 45]. Teod on veesüsteemides kõige arvukam molluskirühm. Teod on bioindikaatoritena kõrgematele selgroogsetele vähem ekspluateeriv alternatiiv, kuna neid saab kasutada mitmesugustes katsetes ilma eetilist heakskiitu taotlemata ning nende hankimine ja hooldamine on odav [13].

Sellega seoses on Biomphalaria alexandrina tigu laialdaselt kasutatud pestitsiididega magevee reostuse indikaatororganismina [29, 30]. Lisaks bioindikaatori potentsiaalile toimib see tigu Schistosoma mansoni ülekande vaheperemehena [35]. Seetõttu võivad agrokeemilised kontsentratsioonid keskkonnas mõjutada skistosomiaasi ülekannet otsese ja kaudse mõju kaudu vahepealsele peremeesorganismile ja parasiitide tihedusele [27]. Käesoleva uurimise eesmärk oli uurida subletaalse kokkupuute mõju taimekasvuregulaatoriga RIPEX 48% EC (etefooni kaubanimi, 2-kloroetüülfosfoonhape) B. alexandrina erinevatele biokeemilistele, immunoloogilistele ja histoloogilistele aspektidele. teod kui bioindikaatororganism.

2 meetodid

2.1 Testorganism

Biomphalaria alexandrina teod koguti Egiptuses Dakahlia kubermangus El-Matareyas asuvast Manzalah' järvest (31 kraadi 11′ N 32 kraadi 2′ E) ja neid hoiti hästi õhustatud kraanivees konstantsel temperatuuril 20 kraadi. Neid toideti iga päev värskete salatilehtedega. Pärast 4-nädalast hooldust laboritingimustes kasutati järgmistes katsetes terveid küpseid tigusid (koore läbimõõt 10–12 mm).

2.2 Katsematerjal ja kokkupuutetingimused

Taimekasvuregulaator RIPEX (lahusevorm, mis sisaldab 48 protsenti etefooni [2- kloroetüülfosfoonhapet (C2H6ClO3P)] ja 52 protsenti inertseid koostisosi) osteti ettevõttelt Chema Industries (New Nubaria linn, Behira, Egiptus; registrilitsentsi nr. . 1840). Valmistati rida kontsentratsioone. Eksponeeriti puude koopiad, millest igaühes oli kümme teod. Pärast 1-päevast kokkupuudet loendati surnud teod ja eemaldati need ning LC50 ja LC90 arvutati sotsiaalteaduste statistilise tarkvara abil (SPSS; IBM Corp. Armonk, NY, USA).

2.3 Eksperimentaalne disain

Kasutati kahte subletaalset kontsentratsiooni, mis esindasid LC10 ja LC20 (8 ja 16 µL/L). 90 tigu jagati kolme rühma, igas rühmas oli kolm kordust (kümme tigu korduse kohta): kontrollrühm, 8 µl/l eksponeeritud rühm ja 16 µl/l eksponeeritud rühm. 1-, 3- ja 7-päevaste intervallidega hinnati oksüdatiivse stressi biomarkereid ja immuunpotentsiaali ensüüme seedenäärmetes. steroidhormoone hinnati Ovotestises. Hinnati diferentsiaalset hemotsüütide arvu ning seedenäärmete ja ovotestise histoloogiat. Biokeemilisteks uuringuteks homogeniseeriti igast rühmast 0,5 g kude (seedenäärmed või munarakk) 0,5 ml fosfaatpuhvris (pH 6,5), kasutades klaashomogenisaatorit ja tsentrifuugiti 10 minutit 10, 000 × g, 4 kraadi juures. . Saadud supernatante kasutati järgmistes analüüsides.

2.4 Oksüdatiivse stressi markerite määramine

2.4.1 Superoksiiddismutaas (SOD, EC 1.15.1.1)

SOD aktiivsus määrati EnzyChrom™ Superoxide Dismutase Assay Kitiga (kat. nr: ESOD{{0}}; BioAssay Systems, Hayward, CA, USA) vastavalt tootja juhistele. Kudede homogenaati, kasutades külma lüüsipuhvrit (50 mM kaaliumfosfaat, 0,1 mM EDTA ja 0,5% Triton X-100), tsentrifuugiti 12, 000g juures 5 minutit 4 kraadi juures. ja supernatant koguti SOD määramiseks [43]. SOD aktiivsust mõõdeti optilise tiheduse (OD) juures 440 nm juures.

2.4.2 Glutatioon-S-transferaas (GST, EC 2.5.1.18)

Ti ensüüm katalüüsib GSH konjugatsiooni {{0}}kloro-2, 4-dinitrobenseeniga (CDNB). Seda mõõdetakse spektrofotomeetriliselt 340 nm juures. Reaktsioonisegu sisaldab kaaliumfosfaatpuhvrit 0,1 M, pH 6,5, kaaliumfosfaatpuhvris lahustatud GSH-d (140 mg/100 ml) ja CDNB-d 4 mg/ml etüülalkoholis. Üks ensüümi aktiivsuse ühik on defineeritud kui ensüümi kogus, mis katalüüsib 1 μmooli S-konjugaadi moodustumist minutis [11].

2.4.3 Malondialdehüüd (MDA)

Malondialdehüüd tervetes homogenaatides määrati tiobarbituurhappega reaktiivsete ainetena (TBARS) vastavalt Ohkawa et al. standardmeetodile. [37]. Reaktsioonisegu sisaldas 0,1 ml koe homogenaati, võrdses mahus naatriumdodetsüülsulfaadi lahust, 0,75 ml äädikhapet, 0,75 ml tiobarbituurhapet, ja 0,3 ml destilleeritud vett. Need komponendid segati keerises ja inkubeeriti keevas veevannis 1 tund, seejärel jahutati toatemperatuurini. Igasse katseklaasi lisati kümme 0,5 ml destilleeritud vett ja 2,5 ml n-butanooli ning segati jõuliselt keerisega, seejärel pöörati tsentrifuugis kiirusel 2500 × g 10 minutit. Neelduvus loeti 532 nm juures.

2.5 Hormoonide määramine

2.5.1 Testosteroon

Testosterooni määramiseks kasutati testosterooni ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi (ELISA) komplekti (kat. nr: ADI-900-065; Enzo Life Sciences, NY, USA). Testosteroon on peamine androgeen, mis mõjutab nii esmast kui ka sekundaarset seksuaalset arengut. seksiisu. 100 µL standardset lahjendit (testipuhver 3 või koekultuuri sööde) pipeteeriti mittespetsiifilise sidumise ja maksimaalse seondumise (0 pg/mL standard) süvenditesse. Seejärel lisage vastavatesse süvenditesse 100 µl standardset nr 1 kuni 5. Proov (100 µL) pipeteeriti sobivatesse süvenditesse ja 50 µl analüüsipuhvrit 3 mittespetsiifilistesse sidumissüvenditesse. Samuti lisati igasse süvendisse 50 ui kollast antikeha, välja arvatud tühikatse, koguaktiivsuse ja mittespetsiifilise seondumise süvendid. Plaadi inkubeerimine toatemperatuuril plaadiloksutil 1 tund kiirusel 500 p/min. Pärast seda lisati igasse süvendisse 50 ui sinist konjugaati, välja arvatud kogu aktiivsus ja tühjad süvendid. Pärast süvendite sisust tühjendamist pesti, lisades igasse süvendisse 3 korda 400 µL pesulahust. Sinine konjugaat (5 µL) lisati kogu aktiivsuse süvenditesse ja 200 µL p-nitrofenüülfosfaadi lahust lisati igasse süvendisse ja inkubeeriti 37 kraadi juures 1 tund ilma loksutamata. Plaadi lugemine 405 nm juures viidi läbi pärast 50 µL stopplahuse lisamist igasse süvendisse [12, 48].

2.5.2 Östradiool

Östradiooli määramiseks kasutati östradiooli ELIZA komplekti (kat. nr: 501890; Cayman Chemical, Michigan, USA) vastavalt tootja protokollidele. Selle reaktsiooni põhimõte põhineb sellel, et östradioolatsetüülkoliinesteraasi (AChE) märgistusaine kontsentratsioon on konstantne, kuid loomulik östradiooli kontsentratsioon varieerub, mistõttu östradiooli atsetüülkoliinesteraasi (AChE) märgistusaine kogus, mis seondub östradiooli antiseerumiga, on pöördvõrdeline loodusliku östradiooli kontsentratsiooniga. kaevus. Mittespetsiifilise sidumise ja maksimaalse sidumise süvenditesse lisati 100 ui ELISA puhvrit. 50 µl tuubi nr 8 lisamine mõlemasse madalaimasse standardsüvendisse (standard 8) ja 50 µL torust nr 7 igasse järgmisesse standardsüvendisse (standard 7). Igasse süvendisse lisati proov (50 µL). Östradiool AChE märgistusaine (50 ui) lisati igale koguaktiivsusele ja tühjadele süvenditele. Seejärel lisati igasse süvendisse östradiooli ELISA antiseerum (50 ui), välja arvatud koguaktiivsuse, mittespetsiifilise seondumise ja tühjad süvendid. Pärast orbitaalloksuti inkubeerimist (2 tundi toatemperatuuril) mõõdeti neeldumine 414 nm juures [52].

2.6 Immuunpotentsiaalsete ensüümide määramine

2.6.1 Müeloperoksidaas (MPO, EC 1.11.2.2)

Üks MPO aktiivsuse ühik on defineeritud kui ensüümi kogus, mis hüdrolüüsib substraati ja tekitab tauriinklooramiini, mis kulutab 25 kraadi juures 1.0 μmooli TNB minutis. MPO määrati müeloperoksidaasi kolorimeetrilise aktiivsuse analüüsi komplekti (kat. nr: MAK068; Sigma-Aldrich, MO, USA) abil. Neeldumist mõõdeti lainepikkusel 412 nm.

2.6.2 Adenosiindeaminaas (ADA, EC 3.5.4.4)

ADA on ensüüm, mis katalüüsib adenosiini ja 2'-deoksüadenosiini muundumist inosiiniks ja 2'-deoksüinosiiniks. ADA määrati tehnilise bülletääni adenosiindeaminaasi aktiivsuse analüüsi komplekti (Kat. nr: MAK400; Merck KGaA, Darmstadt, Saksamaa) põhimõtete kohaselt. Üks adenosiindeaminaasi ühik on ensüümi kogus, mis hüdrolüüsib adenosiini, andes 37 kraadi juures 1,0 μmol inosiini minutis. Reaktiivid on 1 × ADA analüüsipuhver (41 μL), ADA Converter (2 μL), ADA arendaja (2 μL) ja ADA substraat (5 μL).

2.7 Diferentsiaalne hemotsüütide arv

Hemolümf koguti teolt (kontroll, eksponeeritud) vastavalt Sminiale [47]. Pärast Pasteuri pipetiga puudutamist pea-jala vastu oli tigu sunnitud sügavale oma kesta sisse tõmbuma ja hemolümfi välja pressima, mis koguti diferentsiaalse hemotsüütide arvu määramiseks. Levitamiseks määriti mikroskoobi alusklaasile hemolümfi. Pärast 5-minutilist fikseerimist 99,8-protsendilises metanoolis pöörati alusklaas toatemperatuuril kuivatamiseks 45-kraadise nurga all ja värviti 20 minutiks Giemsa peitsiga. Hemotsüütide diferentseerumine määrati proportsionaalseks 100 loendamisega.

2.8 Histoloogilised uuringud

Histoloogilised uuringud viidi läbi pärast 7-päevast kokkupuudet 8 ja 16 µl/l RIPEXiga. Seedenäärmed ja ovotestis lõigati välja ja fikseeriti kohe Bouin᾿s vedelikus. Pärast 1-päevast fikseerimist dehüdreeriti proovid läbi mitmete alkoholide ja puhastati ksüleenis. Valmistati parafiinvahaplokke [42]. Kümme sekti. (paksus 5–7 μm) lõigati ja värviti hematoksüliini ja eosiiniga (Mayeri H ja E). Värvimisele järgnes korralik kraaniveega pesemine. Histoloogilised lõigud pildistati fotoautomaatse kaameraga (Optika, Itaalia).

2.9 Statistiline analüüs

Andmed väljendati keskmise ± standardhälbena ja analüüsiti sotsiaalteaduste statistilise tarkvaraga (SPSS; IBM Corp. Armonk, NY, USA). Kahesuunalist ANOVA dispersioonanalüüsi kasutati, et teha kindlaks erinevused kontroll- ja eksponeeritud rühma vahel, erinevate kontsentratsioonide ja kokkupuute ajapunktide vahel. Olulisuse tasemeks määrati p Väiksem kui 0,05 või sellega võrdne.

Cistanche mehhanism suurendab testosterooni toimet

On leitud, et Cistanche tõstab testosterooni taset mitmel viisil. Esiteks sisaldab see ehhinakosiidi ja akteosiidina tuntud ühendeid, mis on näidanud, et need suurendavad luteiniseeriva hormooni (LH) tootmist hüpofüüsis. LH stimuleerib Leydigi rakke munandites testosterooni tootma. Cistanche sisaldab ka polüsahhariide ja fenüületanoidglükosiide, millel on tõestatud antioksüdantsed ja põletikuvastased omadused. See võib aidata vähendada oksüdatiivset stressi ja põletikku munandites, mis võib kahjustada testosterooni tootmist. Lisaks on leitud, et Cistanche suurendab testosterooni sünteesis osalevate geenide ekspressiooni ja vähendab testosterooni lagundavate ensüümide aktiivsust, nagu {{1} }alfa-reduktaas. Üldiselt arvatakse, et nende mehhanismide kombinatsioon aitab kaasa Cistanche'i testosterooni suurendavale toimele.

Hoda H. Abdel-Azeem1*, Azza H. Mohamed1 ja Mohamed R. Habib2