Hamstri beebi kleepunud ja suspensioonide neerurakkudel on erinev tsütoskelett ja pinnaretseptorite repertuaar

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Veronika Dill¹, Florian Pfaff¹, Aline ZimmerID², Martin Beer¹, Michael EschbaumerID^1*

Abstraktne

Loomade rakukultuur, milles kasvavad üksikud rakudpeatamine, ideaalis keemiliselt määratletud keskkonnas, on biofarmatseutilise tootmise alustala. Sünteetilises keskkonnas puuduvad eksogeensed kasvufaktorid ja see nõuab tavaliselt aeganõudvat kohanemisprotsessi, et valida rakukloonid, mis prolifereeruvad.peataminekõrge rakkude arvuni. Kohanemist hõlbustavad ja raku sees toimuvad molekulaarsed mehhanismid on suures osas teadmata. Eriti viiruse antigeenide tootmiseks kasutatavate rakuliinide puhul, nagu hamstripoegi (BHK) rakud, on viiruse kasvu piiramine ebasoovitavate rakuomaduste evolutsiooni kaudu väga soovimatu. Kleepuvalt kasvavate BHK-rakkude ja erinevate suspensioonrakkude võrdlusvastuvõtlikkusSuu- ja sõrataudiviiruse suhtes ilmnes erinevusi rakuliste retseptorite, nagu integriinid ja heparaansulfaadid, ekspressioonis ning aktiini tsütoskeleti struktuuris. Transkriptsiooni analüüsid ja kasvkineetikademonstreeris BHK rakuliinide mitmekesisust ja kinnitas hästi iseloomustatud vanemrakkude kloonide ja tähelepaneliku sõeluuringu olulisust tagamaks, et olulised rakuomadused ei läheks kohanemise ajal kaduma.

Cistanche tubulosa hoiab ära neeruhaiguse, proovi saamiseks klõpsake siin

1. Sissejuhatus

Loomade rakukultuuri tehnoloogiat kasutati esmakordselt viiruse antigeeni tootmiseks vaktsiini tootmisel, kuid viimasel ajal on rekombinantsete valkude bakterite või pärmi tootmisplatvormid üle viidud ka imetajate rakusüsteemidele [1, 2]. Mõlemas kontekstis on olulised beebi hamstri neerurakud (BHK), mis on saadud Süüria kuldhamstrist (Mesocricetus auratus). Algselt olid BHK-rakud kleepuvalt kasvav, ankrust sõltuv imetaja rakuliin, millel oli fibroblastide kasvumuster standardsetes rakukultuuri tingimustes, sealhulgas veiseloote seerumis (FBS) [3, 4]. Adherentsete BHK-rakkude kohaneminepeataminekasv seerumivabas söötmes koos suuremahuliste kultiveerimistingimustega on edulugu kõrge saagisega rekombinantsete valkude (nt VIII faktori) tootmisel [1, 2]. Lisaks on BHK-rakud vastuvõtlikud paljudele viirustele, sealhulgas suu- ja sõrataudi viiruse (FMD) suhtes [5]. Et rahuldada paljudes maailma paikades kasvavat nõudlust suu- ja sõrataudi vaktsiinide järele, tuleb võimalikult odavalt toota suuri koguseid antigeeni, mis on saavutatav elujõuliste rakkude tiheduse suurendamisega raku poolel ja kulude vähendamisega, lihtsustades üles- ja allavoolu töötlemist. antigeeni tootmispoolel [6]. Loomsete komponentide vaba sööde (ACFM) vähendab juhuslike ainetega saastumise ohtu ja lihtsustab veelgi protsessi, kui seerumit ei ole vaja lisada [6, 7]. Rakkude kohandamine ilma seerumita suspensioonis ja ACFM-is kasvamiseks on aga aeganõudev ja järkjärguline protsess [6, 8]. BHK-rakud saavutavad suspensioonis kergesti rakutiheduse 3,5 × 106 rakku/ml, kuid kohanemisega kaasneb alati risk, et võrreldes algpopulatsiooniga võivad tekkida ebasoovitavad rakuomadused, mis võivad põhjustada kehva kasvu, ebapiisava rakuspetsiifilise saagise või tuumorigeenseid varasid. [5, 7]. Omakorda võivad muutused rakkudes põhjustada ootamatuid viiruse variante kultuurilise kohanemisprotsessi käigus. Eriti vaktsiini antigeeni tootmisel on viiruse omaduste ja antigeensuse muutumine väga ebasoovitav. BHK-rakud erinevad juba oma tundlikkuse ja võimaluse poolest teatud FMDV viirustüvede paljundamiseks [9]. Ilmselgelt kaasnevad üleminekuga kinnituskohast sõltuvast fibroblastilisest kasvust agregatsiooni ja sferoidide moodustumise kaudu suspensioonis iseseisvalt kasvavateks rakkudeks olulised muutused rakus endas [4, 6]. Integriini signaaliülekande kadumine ekstratsellulaarse maatriksi ja raku kontakti katkemise tõttu põhjustab muutusi membraanivalgu ekspressioonis ja aktiini tsütoskeleti organisatsioonis, mis on integriini vahendatud signaalimise oluline saaja [6, 10]. Samal ajal on neil integriinidel oluline roll suu- ja sõrataudi nakatumises, kuna nad on FMDV retseptorid loomulikus peremeesorganismis ja primaarsed retseptorid rakukultuuris [11].

Põhjalikum arusaam rakulistest erinevustest kleepuvalt kasvavate HK-rakkude ja rakkude vahelpeatamineavab uusi võimalusi rakutehnoloogiaks ja lihtsustab vaktsiini antigeeni tootmiseks sobivate rakukloonide valikut.

Selles uuringus kleepuvad kasvavad BHK rakud ja ACFM-iga kohandatudpeatamineBHK rakke uuriti rakuliste retseptorite, nagu integriinid ja heparaansulfaadid (HS), ekspressiooni, nende võime esitleda raku pinnal valke ja raku aktiini skeleti korraldust. Transkriptoomianalüüsid ja kasvukineetika annavad teavet testitud BHK rakuliinide mitmekesisuse kohta.

cistanche võib toita neere ja parandada neerufunktsiooni

2. Materjalid ja meetodid

2.1 Rakuliinid ja rakukultuur

Peamised kasutatud rakuliinid olid kaks kleepuvat BHK{0}} klooni 13 derivaati (Ameerika tüüpkultuuride kollektsioonist [ATCC] CCL-10, CCLV-RIE 164 ja 179 veterinaarmeditsiini rakuliinide kollektsioonis , Friedrich-Loeffler-Institut, Greifswald, Saksamaa; lühidalt: BHK164 või BHK179) japeataminerakuliinid BHK21C13-2P (BHK-2P), mida pakuvad Euroopa autentitud rakukultuuride kogu (ECACC; 84111301) ja BHK-InVitrus (BHK-InV, nimetatakse ka "liiniks #8"). nagu meie varasemas väljaandes [12]; Sigma-Aldrich, St. Louis, USA).

Kasvukineetika jaoks kasutati lisaks järgmisi rakuliine: BHK{0}}P, mida hoiti kas Glasgow's Minimal Essential Mediumis (GMEM) 10% FBS-iga ("liin #2") või kohandatud ACFM Cellvento™ BHK200-ga ( Merck KGaA, Darmstadt, Saksamaa) kahes erinevas protsessis (liinid #4 ja #5), pluss veel nelipeataminerakuliinid: BHK21C13, mis on kohandatud kasvukspeatamineseerumi (rida #3), BHK21-C (rida #6), BHK21-Hektori (rida #7) ja tootmis-BHK (rida #9) [12] järkjärgulise eemaldamisega. Kõik need rakud tarnis Merck KGaA.

Kõik uuringus kasutatud BHK-21 rakud pärinevad lõpuks Macphersoni ja Stokeri BHK-21 klooni 13 rakuliinist [13]. Mõistet "rakuliin" kasutatakse lõdvalt; mitte kõik käesolevas uuringus kirjeldatud üheteistkümnest BHK-21 liinist ei ole pigem erinevad rakuliinid kui erinevates tingimustes kultiveeritud derivaadid. Lihtsamaks viitamiseks on ridade nummerdamine kooskõlas meie eelmise väljaande [12] nummerdamisega.

Käesolevasse uuringusse ei kaasatud eelmise väljaande rakuliini nr 1 ja seetõttu seda numbrit ei kasutata. Selle asemel viitab iga viide BHK-2P lahtritele, mis ei maini reanumbreid #2, #4 või #5peataminerakuliin BHK21C13-2P (ECACC84111301), mida tutvustati selle jaotise alguses.

Kleepuvad hiina hamstri (Cricetulus griseus) munasarja (CHO) rakuliinid CHO-K1 (ATCCCCL-61, mida peetakse CCLV-RIE 134) ja CHO677 (CRL 2244, CCLV-RIE 1524) ning IB-RS Kasutati -2 rakke (Instituto Biologico-Rim Suı´no-2, CCLV-RIE 103) ja Madin-Darby veise neerurakke (lühidalt: MDBK, CCLV-RIE261). kontrollidena voolutsütomeetria katsetes.

Kultiveerimistingimused olid 37 ˚C, 5 protsenti CO2 japeataminerakud 320 p/min TubeSpin bioreaktorites (TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Šveits) suhtelise õhuniiskuse juures 80%. Kõiki kleepuvaid rakuliine kultiveeriti Minimum Essential Medium Eagle'is (MEM), mida oli täiendatud Hanksi ja Earle'i sooladega (Sigma-Aldrich) koos 10% FBS-iga. Kõik suspensioonrakuliinid kohandati kasvama Cellvento™ BHK200 söötmes (Merck KGaA), välja arvatud rakuliin nr 2, mida kultiveeriti ülalkirjeldatud viisil.

Rakkude tiheduse ja elujõulisuse mõõtmiseks kasutati trüpaansinist (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) ja automaatset rakuloendurit (mudel TC20, Bio-Rad).

2.2 Suspensioonirakkude kasvukõvera analüüs

Kasvukõvera analüüsid viidi läbi partiikatsetena, mis viidi läbi kahes eksemplaris, kaks korda eraldi, külvitihedusega 0,6 × 106 rakku/ml. Elujõuliste rakkude tihedust (VCD) ja elujõulisust protsentides mõõdeti iga päev kuni kuus päeva pärast rakkude inokuleerimist.

Rakuspetsiifilised arvutused viidi läbi vastavalt võrranditele, mis on esitatud [14]:

X: VCD (ml kohta); t: proovivõtu ajapunktid (tund); n ja n-1: kaks järjestikust proovivõtupunkti.

Rakkude jagunemise number (cd):

2.3 Voolutsütomeetria

Voolutsütomeetrilised analüüsid viidi läbi voolutsütomeetria seadmega FACSCanto II (BD Biosciences, Oxford, UK). Rakkude praht eraldati edasi- ja külghajumise mustrite põhjal. Aktiini värvimiseks mõõdeti otse Alexa 488 kanali fluorestsentsi intensiivsuse keskmine. Kõigi antikehade plekkide puhul määrati Alexa 488 või PE-positiivsete rakkude protsent intervalliga, mille alumine piir määrati isotüübi kontrolli põhjal. Kõik katsed viidi läbi kolm korda sõltumatult.

2.3.1 Rakupinna retseptorite antikehade värvimine.

pinnale. MDBK rakud toimisid positiivse kontrollina v 3 ekspressiooni suhtes, IB-RS-2 rakud toimisid positiivse kontrollina v 8 ekspressiooni suhtes ja CHO-K1 rakud toimisid positiivse kontrollina HS ekspressiooni suhtes . CHO677 rakud ei ekspresseeri ühtegi testitud integriini ega HS-i ja seetõttu toimisid need kõigis katsetes negatiivse kontrollina. Kasutati järgmisi antikehi: v 3 jaoks PE-konjugeeritud kloon LM609 (lahjendus 1:20) (mAb1976H, Merck KGaA); v 8 jaoks, primaarne antikeha 11E8, kloon 68, hiire IgG2a (lahjendus 1:100) (lahkelt pakkuda dr StephenNishimura) sekundaarse antikehaga kitse hiirevastase IgG2a (lahjendus 1:1000), mis on konjugeeritud Alexa Fluor 488 (Thermo Fisherific) ); HS jaoks, kloon 10E4, hiire IgM (lahjendus 1:200) (Amsbio, Abingdon, UK) koos sekundaarse antikehaga kitse hiirevastase IgM mu-ahelaga (lahjendus 1:2000), mis on konjugeeritud Alexa Fluor 488-ga (ab150121, Abcam, Cambridge, UK) . Igas katses kasutati ainult ühte primaarset antikeha.

Suspensioonirakke pesti fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS). Adherentsed rakud eraldati 10 mM EDTA-ga PBS-is ja pesti seejärel PBS-iga. Pärast pesemist filtriti rakud läbi rakusõela (nailonvõrk, pooride läbimõõt 70 μm, VWR, Radnor, USA), et eemaldada rakutükid ja enne 1 μL LIVE/-i määrati kontsentratsioon 1 × 106 rakku/ml. DEAD FixableViolet surnud rakkude plekk (Thermo Fisher Scientific) lisati 1 ml rakususpensioonile 30 minutiks. See samm ja kõik järgmised toimingud viidi läbi valguse eest kaitstult ja temperatuuril 4 ˚C. Primaarset antikeha inkubeeriti 30 minutit ja sekundaarset antikeha 20–30 minutit. Pärast kõiki etappe viidi läbi pesemisetapp 2 ml FACS puhvriga (PBS, 0,1 protsenti naatriumasiid, 0,1 protsenti BSA) ja tsentrifuugimine 300 x g, 5 minutit, 4 ˚C. Lõpuks resuspendeeriti värvitud rakud 300 µl FACS puhvris.

2.3.2 Aktiini värvimine.

Filamentne aktiin värviti Phalloidin-iFluor 488 reagendiga (ab176753, Abcam), mis oli valmistatud vastavalt andmelehele. BHK179, BHK-2P ja BHK-InV rakud eraldati ülalkirjeldatud viisil ja fikseeriti 4% formaldehüüdiga 20 minutit toatemperatuuril (RT). Rakke pesti kaks korda PBS-ga ja 1 × 106 fikseeritud rakku permeabiliseeriti 0,1% Triton X-100-ga (Sigma-Aldrich) PBS-is, millele järgnes inkubeerimine toatemperatuuril 3 minutit. Rakke pesti kaks korda PBS-iga (tsentrifuugimine kiirusel 300 x g, 5 minutit), enne kui lisati valmistatud falloidiini põhilahus, lahjendati 1:1000 FACS-puhvris ja inkubeeriti 20 minutit toatemperatuuril. Lõpuks pesti rakke kaks korda FACS puhvriga ja resuspendeeriti 300 µl FACS puhvris. Värvitud rakke analüüsiti otse fluorestsentsmikroskoobiga ja kasutati FACS-analüüsiks.

2.3.3 Transfektsioonikatsed.

BHK164 ja BHK-2P rakud transfekteeriti kas EGFP-N1-ga, plasmiidiga, mis ekspresseerib täiustatud rohelist fluorestsentsvalku (EGFP) (Clontech), või mõnes teises katseseerias pVSV-G-ga, vesikulaarset G-valku ekspresseeriva plasmiidiga. stomatiit Indiana viirus (VSV), kasutades Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific) vastavalt tootja juhistele. Lühidalt, 2 ug plasmiidset DNA-d ja 1,875 μL või 3,75 μLof lipofektamiini, mis oli lahjendatud Cellvento™ BHK200 söötmes, segati ja inkubeeriti toatemperatuuril 20 minutit, et võimaldada kompleksi moodustumist. Seejärel kanti need segud süvendiplaatide rakkudesse (ligikaudu 4 × 105 rakku/ml) ja söödet lisati kuni 200 μL. Rakke inkubeeriti 37 ˚C juures 24 tundi.

FACS analüüsi jaoks koguti süvendite kogu sisu 24 tunni pärast. pEGFP-ga transfekteeritud rakke pesti kolm korda PBS-ga ja resuspendeeriti 300 μL FACS-puhvris. Üks pVSV-G-ga transfekteeritud rakkude duplikaat permeabiliseeriti PBS-iga, mis sisaldas 0,1% (maht/maht) TritonX-100, 5 minutit toatemperatuuril enne antikehade värvimist, samas kui teine ​​jäi mittepermeabiliseerituks. Antikehade värvimine viidi läbi ülalkirjeldatud viisil polüklonaalse küüliku seerumiga VSV 274/E (lahjendus 1:500, lahkelt andis dr Stefan Finke) ja sekundaarsete küülikuvastaste antikehadega (H pluss L), mis oli konjugeeritud Alexa Fluor 488-ga (lahjendus 1: 1000; Thermo Fisher Scientific).

2.4 Statistiline analüüs

Andmeid analüüsiti GraphPad Prismi versiooniga 07.04 Windowsile (GraphPad Software, La Jolla, USA). Tavaline ühesuunaline dispersioonanalüüs tehti Tukey post-hottest abil, et hinnata erinevusi ravirühmade vahel. Statistilise olulisuse läveks määrati p-väärtus 0,001.

2.5 Transkriptoomi analüüs

2.5.1 RNA ekstraheerimine, raamatukogu ettevalmistamine ja sekveneerimine.

Transkriptoomianalüüsiks kasutati kolme sõltumatut partiid igast kleepuvast BHK179 rakuliinist ning BHK-2P ja BHK-InV suspensiooni rakuliinidest. TRIzol Reagendis (Thermo Fisher Scientific) lüüsiti keskmiselt 8,3 × 105 BHK179 rakku, 1,6 × 107 BHK-2Prakku ja 1,4 × 107 BHK-InV rakku. Pärast 0,2 mahuosa triklorometaani lisamist rakulüsaadile, inkubeerimist ja tsentrifuugimist, vesifaas koguti ja segati ühe mahuosa 100% etanooliga. Sellest ekstraheeriti kogu RNA, kasutades RNeasy Mini komplekti (Qiagen, Hilden, Saksamaa) koos kolonnis oleva DNaasi seedimisega RNaasivaba DNaasi komplektiga (Qiagen), järgides tootja juhiseid. Lisati ERCC RNA Spike-In Mix 1 (Thermo Fisher Scientific) ja seda kasutati kõigi järgmiste etappide sisekontrollina. Järgmisena eraldati Dynabeads mRNA DIRECT Micro komplekti (ThermoFisher Scientific) abil polüadenüülitud mRNA 1–3 ug kvaliteetsest kogu-RNA-st. Seejärel mRNA fragmenteeriti ja seda kasutati cDNA sünteesiks ja raamatukogu valmistamiseks, kasutades TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit (Illumina, San Diego, USA) vastavalt tootja juhistele. Sekveneerimine viidi läbi Heinrich-Pette-Institutis, Hamburgis, kasutades seadmeid NextSeq 500 (2x75 bp) ja HiSeq 4000 (1x50 bp) (Illumina).

2.5.2 Diferentsiaalse geeniekspressiooni statistiline analüüs.

Iga sekveneerimisteegi töötlemata lugemite kvaliteedikontroll viidi läbi FastQC-ga (versioon {{0}}.11.9; Babrahami instituut, Cambridge, Ühendkuningriik), rõhuasetusega lugemispikkuse jaotusele ja adapteri saastumisele enne ja pärast adapterit. trimmimine, kasutades Trim Galore'i (versioon 0.6.{5}}dev, Babraham Institute) ja Cutadapti (versioon 2.10) [15]. Lõhet [16] kasutades kanti kärbitud toornäidud seejärel peaaegu kaardile Süüria kuldhamstri genoomiga.

Lühidalt, GCF{{0}.1_MesAur1.0 genoomsed ja transkriptsiooniviited saadi riiklikust biotehnoloogia teabekeskusest (NCBI) ja kombineeriti ERCC spike-i võrdlusjärjestustega. juhtelementides. Koostati peibutusteadlik transkriptoomi indeks [17], et võimaldada selektiivset joondust lõhega. Kvantifitseerimiseks kasutati kümmet alglaadimiskorda ja lubati järjestusspetsiifiliste nihete, GC nihke ja 5' või 3' positsiooni nihke kompenseerimine.

Seejärel korreleeriti ERCC spike-in kontrollide kvantifitseerimisandmed nende teoreetilise kontsentratsiooniga, et tuvastada probleeme proovi ettevalmistamise ajal.

Veelgi enam, geenispetsiifilised kvantifitseerimisandmed filtreeriti algselt (ainult geenid, mis esinevad rohkem kui ühes korduses üle 15 loendusega), normaliseeriti korrapärase logaritmi teisenduse (rlog) abil ja kasutati uurimuslikuks andmeanalüüsiks, nt PCA-ga. Erinevalt ekspresseeritud geenid tuvastati ja neid kasutati seejärel raja analüüsiks, kasutades DESeq2 [18]. Ekspressiooniandmeid analüüsiti oluliselt erinevalt ekspresseeritud geenide suhtes rakuliinipaaride BHK-2P ja BHK179, BHK-InV ja BHK-2P ning BHK-InV ja BHK179 vahel. Seejärel korrigeeriti saadud binaarset logaritmilist (log2) kordamismuutust DESeq2 funktsioonide "lfcShrink" ja "apglm" abil, et kompenseerida madalat või muutuvat lugemiste arvu, mis võib viia dispersiooni ülehindamiseni [19].

Oluliselt erinevalt ekspresseeritud geeni kriteeriumid määrati maksimaalseks kohandatud väärtuseks {{0}}.05 ja kahanenud log2-kordse muutuse minimaalseks absoluutväärtuseks 1. Tee ja kriteeriumid oluliselt erinevalt ekspresseeritud geeni jaoks määrati maksimaalseks kohandatud väärtuseks 0,05 ja kahanenud log2-kordse muutuse minimaalseks absoluutväärtuseks 1. Raja ja rikastamise analüüs viidi läbi, kasutades funktsiooni "rikastada" klastri profiilis (versioon 3.16.0).

cistanche võib toita neere ja parandada neerufunktsiooni

3. Tulemused

3.1 Rakuliini tundlikkus FMDV suhtes ei sõltu selle individuaalsest kasvukiirusest ja rakkude jagunemisarvust

Kuue päeva jooksul viidi läbi partiikatsed üheksa erineva BHK suspensiooni rakuliiniga ning elujõuliste rakkude tihedust (VCD) ja elujõulisust mõõdeti iga päev. Tuginedes varasematele tähelepanekutele, et rakuliinid erinesid oma tundlikkuse poolest FMDV serotüübi Aasia suhtes{{0}} [12], uuriti, kas suurenenud rakkude metabolism ja kasvukiirus on seotud vähenenud vastuvõtlikkusega selle nakkuse suhtes. viirus (tabel 1). Kaks kolmest vastuvõtlikust BHK suspensiooni rakuliinist on aeglaselt kasvavad rakud väikese rakkude jagunemisarvuga (cd) 0,60 (#3) ja 0,70 (#9), samal ajal kui kolmandal vastuvõtlikul rakuliinil (#8) on suurim kasvukiirus ja cd (μ=0.035, cd=1.62) kõigi testitud rakuliinide seas.

Seerumi eemaldamine ja kasvuga kohanemine ACFM-is ei mõjutanud meie uuritud rakuliinide tundlikkust FMDV suhtes. Rakuliin nr 2 on aeglaselt kasvav, seerumist sõltuv BHK-2P rakuliini prekursor, mida hoitakse suspensioonis GMEM-iga koos veise loote seerumiga. ACFM-i kasvuga kohanemise ajal valiti rakud kõrge VCD jaoks, mis oli seotud kõrge kasvukiiruse ja cd-ga. Nagu peamine uuringus kasutatud BHK-2P rakuliin, on ka rakuliinid #4 ja #5 tuletatud rakuliinist #2, kuid erinevad ACFM-iga kohanemise viisi poolest. Kõik ACFM-is säilitatud BHK-2P-rakuliinid näitasid väga sarnast kasvuprofiili. Ükski neist rakuliinidest ei omandanud ACFM-iga kohanemise ajal tundlikkust suu- ja sõrataudi serotüübi Asia -1 suhtes, tõenäoliselt seetõttu, et algne liin nr 2 oli juba olnud resistentne. Samamoodi ei täheldatud tundlikkuse muutust suspensiooni rakuliini nr 3 puhul. Adherentsel kasvamisel (vt rakuliini nr 1 punktis [12]) olid rakud vastuvõtlikud FMDV Asiale-1 ja nad säilitasid selle tunnuse suspensioonis kasvuga kohanemisel. Samal ajal ei omandanud nad teiste suspensioonrakkude kiiret kasvuprofiili.

3.2 Suspensioonrakkude pinnal on vähem primaarseid retseptoreid, kuid rohkem sekundaarseid retseptoreid FMDV jaoks kui kleepunud BHK-rakkudel

Esimene samm viiruse edukaks nakatamiseks on viiruseosakeste seondumine rakupinnal olevate retseptormolekulidega. Adherentselt kasvavate BHK-rakkude ja suspensioonis olevate BHK-rakkude erinevuste analüüsimiseks testiti rakuvälise maatriksi interaktsioonis osalevate rakuliste retseptorite antikehi, millel on teadaolevalt oluline roll FMDV-nakkuses. Integriine v 3 ja v 8 uuriti kui tüüpilisi raku retseptoreid, mis tunnevad ära RGD (Arg-Gly-Asp) sidumismotiivi ja interakteeruvad seerumi komponentide ja rakuvälise maatriksiga, kuid mida FMDV kasutab ka oma loomulike primaarsete retseptoritena. Kumbki testitud suspensiooni rakuliin (BHK-InV ja BHK{5}}P) ei ekspresseerinud rakupinnal integriini v3 ega v8. Kuigi erinevus kleepunud BHK ja suspensiooni BHK vahel ei olnud integriin v 8 puhul oluline (joonis 1b), ekspresseeris kleepunud BHK179 oluliselt suurem protsent integriini v 3 võrreldes suspensiooni rakuliinidega BHK-InV ja BHK-2P ( joonis 1a).

Mõlema suspensiooni rakuliini pinnal oli suur kogus HS-i. HS ekspressioon oli kleepuvate BHK179 rakkude replikatsioonikultuuride vahel väga erinev. Võrreldes suspensiooni rakuliinidega oli vähem rakke BHK179 kultuurides HS-positiivseid, kuigi erinevus ei olnud etteantud olulisuse tasemel oluline (joonis 2).

Värvimine ja mikroskoopiline analüüs näitasid suuri erinevusi aktiini tsütoskeleti paigutuses kleepuvate ja suspensioonrakkude vahel (joonis 3). Kleepuvates BHK179 rakkudes olevad aktiini filamendid on ühtlaselt jaotunud kogu rakus peene retikulaarse mustriga (joonis 3a), samas kui suspensioonis kasvavatel rakkudel oli difuusne aktiini värvumine (joonis 3b). Huvitaval kombel oli filamentse aktiini kogus suspensioonrakuliinide BHK-InV ja BHK{5}P vahel erinev. Keskmine fluorestsentsi intensiivsus (MFI) pärast falloidiiniga värvimist oli BHK-InV rakkudes oluliselt kõrgem võrreldes BHK-2P-ga, mis näitab kõrgemat filamentse aktiini sisaldust nendes rakkudes (joonis 3c).

3.3 Suspensioonrakud erinevad transfektsiooni efektiivsuse poolest, kuid mitte nende võime poolest pinnavalke kuvada

Adherentsete ja suspensioonirakkude aktiini konformatsiooni erinevuste tõttu uuriti rakke nende ülekantavuse ja nende pinnal valkude esitlemise võime osas. Üldiselt väheneb transfektsiooni efektiivsus, mõõdetuna EGFP ekspressiooniga, suspensioonirakkudes (joonis 4a). Transfektsioonireagendi väikese annuse kasutamisel ekspresseeris EGFP-d oluliselt suurem protsent kleepuvaid rakke kui suspensioonrakud. Kui kasutati transfektsioonireagendi suurt annust, transfekteeriti edukalt suurem protsent suspensioonirakkudest, kuigi erinevus suurte ja väikeste annuste vahel ei olnud märkimisväärne. Et vastata küsimusele, kas suspensioonrakud on endiselt võimelised esitlema oma pinnal selliseid valke nagu rakulised retseptorid, transfekteeriti rakud VSV G-valku kodeeriva plasmiidiga (joonis 4b). Üks rakkude seeria permeabiliseeriti enne värvimist, et võtta arvesse võimalust, et G-valk ekspresseeriti, kuid seda ei kuvata raku pinnal. VSV G-valgu ekspressiooni ja esitlemise võimes ei ilmnenud olulist erinevust kleepuvate ja suspensioonirakkude vahel, ei madala või suure transfektsioonireagendi annuse kasutamisel.

3.4 Transkriptoomianalüüs näitab erinevusi rakuvälise maatriksiga seotud geenide ekspressioonis suspensioonirakkude vahel

Transkriptoomianalüüs viidi läbi, et täiendavalt uurida erinevusi kleepuvalt kasvavate BHK-rakkude ja suspensioonis olevate BHK-rakkude vahel ning selgitada, miks suspensioonrakud erinevad FMDV-le tundlikkuse poolest. Kleepuv BHK rakuliin (BHK179), mida kasvatati MEM-is, millele on lisatud FBS, samuti kiiresti kasvav FMDV-le tundlik rakuliin (BHK-InV) ja kiiresti kasvav resistentne rakuliin (BHK-2P), mõlemad ACFM-iga kohandatud, valiti analüüsiks.

Põhikomponentide analüüs (PCA) tõi esile tiheda seose üksikute rakuliinide bioloogiliste replikatsioonide vahel (joonis 5a). Kõik sama rakuliini replikatsioonid asuvad graafikul tihedalt koos, ilma et partii-partii efektid ilmneksid. Esimest põhikomponenti (mis moodustab 81 protsenti normaliseeritud andmestiku dispersioonist) tõlgendati kui transkriptsioonilist erinevust suspensioonis kasvavate rakkude ja nakkumisel kasvavate rakkude vahel, samas kui teine ​​põhikomponent (15 protsenti dispersioonist) kujutas erinevust suspensioonrakuliinid BHK-2P ja BHK-InV, mis võivad olla seotud vastuvõtlikkusega FMDV infektsioonile. Üheskoos suutsid kaks esimest peamist komponenti selgitada 96 protsenti andmekogumis leitud dispersioonist, mis näitab, et transkriptoomianalüüs tuvastas kolme rakuliini vahel olulised erinevused.

Väikseim arv erinevalt ekspresseeritud geene leiti BHK-InV ja BHK-2P võrdlemisel (590 ülesreguleeritud; 304 allareguleeritud). Sarnaseid numbreid nähti kas BHK-2P või BHK-InV võrdlemisel eraldi BHK179-ga (1527 ja 1519 ülesreguleeritud; vastavalt 1308 ja 943 allareguleeritud) (joonis 5b). Kui kaks suspensiooni rakuliini (BHK-InV ja BHK-2P) kombineeriti ja võrreldi kleepuva BHK179 rakuliiniga, ekspresseeriti erinevalt 1814 geeni. Kui BHK179 ja BHK-InV võrdlemisel ekspresseeritakse 411 geeni eranditult erinevalt, siis peaaegu kaks korda rohkem (701 geeni) ekspresseeritakse BHK179 ja BHK{25}}P vahel eranditult erinevalt. Kahe suspensioonrakuliini vahel ekspresseeriti ainult 104 geeni eranditult erinevalt.

Kui võrrelda FMDV-le tundlike rakuliinide BHK179 ja BHK-InV erinevalt ekspresseeritud geenide komplekti FMDV-resistentse rakuliiniga BHK-2P, leiti, et 553 geenist koosnev alamhulk ekspresseerub mõlemas võrdluses erinevalt ( joonis 5c). Kuna need geenid võivad olla seotud FMDV tundlikkusega, viidi läbi GO termini rikastamise analüüs ja selgus, et paljud neist geenidest on seotud rakuvälise maatriksi (ECM), rakumembraanide ja raku-raku ühendustega (joonis 5d). .

Kuna me täheldasime erinevusi ECM-i interaktsioonidega seotud rakuliinide vahel, analüüsiti transkriptoomi uuesti, keskendudes integriinide v 1, v 3, v 6, v 8, aga ka aktiini ekspressioonile, mis kõik võivad olla olulised FMDV nakkuse suhtes vastuvõtlikkuse seisukohalt. (Joonis 5e). Kui välja arvata ACTA2, ei olnud aktiiniga seotud geenide ekspressioonis mRNA tasemel olulisi erinevusi BHK-InV ja BHK{8}}P rakkude vahel. Kõigi uuritud aktiiniga seotud geenide normaliseeritud geenide arv oli kleepunud rakuliinis BHK179 oluliselt kõrgem kui suspensioonrakuliinides (S1 joonis 1).

Kõik kolm rakuliini ekspresseerisid sarnases koguses ITGAV-i transkripte, mis kodeerisid integriini subühikut v, kuid näitasid integriini subühikute erinevat ekspressiooni. Üksikasjalikult väljendasid suspensioonrakuliinid BHK{0}}P ja BHK-InV oluliselt vähem ITGB1, ITGB3 ja ITGB6, võrreldes kleepuva rakuliiniga BHK179. ITGB3 ja ITGB8 ekspresseerusid oluliselt erinevalt suspensiooni rakuliinide BHK-2P ja BHK-InV vahel. Huvitaval kombel oli ITGB8 ainus integriini subühikut kodeeriv geen, mis oli nii FMDV-le tundlikes rakuliinides BHK179 kui ka BHK-InV tugevalt üleekspresseeritud, võrreldes FMDV-resistentse rakuliiniga BHK-2P (joonis 5e).

cistanche võib toita neere ja parandada neerufunktsiooni

4. Arutelu

Rakkude kohandamine kasvama suspensioonis ja seerumivabas söötmes on aeganõudev ja järkjärguline, kuid vajalik protsess biotehnoloogias, et luua kõrge tootlikkusega rakuliine, mida kasutatakse antikehade, vaktsiini antigeenide või muude valkude tootmiseks [1, 8 ]. Tõepoolest, selle protsessiga kaasneb alati oht, et rakud omandavad algse rakumaterjaliga võrreldes ebasoovitavaid omadusi [7]. Vaktsiini antigeeni tootmise puhul on rakuliini tundlikkus sihtviiruse suhtes väga oluline. Suu- ja sõrataudi viiruse (FMDV) puhul on üldtuntud nähtus, et teatud BHK rakuliinid on infektsiooni suhtes resistentsed või kaotavad korduva subkultuuri käigus oma vastuvõtlikkuse [20–22]. Lisaks võivad viiruse antigeensed omadused peremeesrakust olenevalt olla erinevad [9].

Suspensioonrakud kasvavad pinnast sõltumatult ja on haaratud hapnikurikkast toitainekeskkonnast, võimaldades neil kiiresti kasvada. Rakkude kiire paljunemine on vajalik funktsioon, et kasvatada kultuuri lihtsalt ja lühikese aja jooksul suurte kogusteni. Seerumi eemaldamine söötmest on vajalik kulude vähendamiseks, saastumise ohu vähendamiseks ja protsesside vähendamiseks [23, 24].

Erinevate BHK suspensioonrakuliinide partii kasvuanalüüs oli mõeldud selleks, et teha kindlaks, kas seerumivabades tingimustes kiiresti kasvava rakupopulatsiooni suunas valimine kahjustab FMDV paljunemist. Tegelikult kasvasid kaks kolmest vastuvõtlikust rakuliinist aeglaselt, kuid leiti, et nende tundlikkus FMDV suhtes ei sõltu nende kasvu metabolismist. On tõenäolisem, et suu- ja sõrataudi vastuvõtlikkus on juba kadunud (või säilinud) esialgsel kohanemisel suspensioonis kasvuga. Rakkude eraldumine pinnast ja seerumi eemaldamine suspensiooni kasvuga kohanemise järgmistes etappides põhjustab muutusi pinnavalkude ja tsütoskeletis osalevate valkude ekspressioonitasemes [7].

Integriinid on oluline rakupinna retseptorite perekond, mis on integreeritud rakumembraani ja vahendavad rakkudevahelist signaaliülekannet, samuti tugevat sidet raku ja pinna vahel rakuvälise maatriksi (ECM) komponentide sidumise kaudu [10, 25 ]. Rakutsükli regulatsioon, tsütoskeleti organiseeritus ja tekkivate retseptormolekulide translokatsioon rakumembraanile sõltuvad integriinidest [25]. Paljude integriinide puhul vahendab ECM-i seondumist, aga ka rakkudele kultiveerimissöötmele seerumi lisamise kaudu pakutavate ligandide seondumist RGD motiiv [6, 25] ja see tõenäoliselt muutub, kui rakud lülituvad kleepuvalt kasvult suspensioonile. FMDV kasutab RGD motiivi äratundmist integriinide poolt ka viirusosakese retseptor-vahendatud endotsütoosi algatamiseks [26]. FMDV VP1 RGD motiiv on väga konserveerunud [27] ning integriinid v 1, v 3, v 6 ja v 8 on tuntud retseptorid, mida FMDV in vivo ja in vitro kasutavad [28–31]. Kuna oletatavad erinevused rakupinna proteoomides kleepuvate ja suspensioonirakkude vahel võivad samuti olla määrava tähtsusega FMDV-nakkuse vastuvõtlikkuse erinevuste osas, kasutati kleepunud BHK-rakuliini värvimiseks integriiniga v3 ja v8 seonduvaid antikehi. tundlik ja resistentne suspensiooni BHK rakuliin. V 6 värvimist ei tehtud, kuna varem on näidatud, et see integriin ei ekspresseeru BHK rakkude pinnal [32], kuigi ITGB6 mRNA on tuvastatav. Samamoodi, vaatamata BHK179 ja BHK-InV rakkudes tuvastatud ITGB8 mRNA ekspressiooni kõrgele tasemele, ei paista v 8 integriini BHK rakkude pinnal üldiselt esinevat. Integriin v3 leiti vähesel määral kleepunud rakuliinil, kuid mitte suspensioonrakuliinidel.

Peale integriinide võivad ligandi sidumist, internaliseerumist ja rakusisest signaalimist vahendada heparaansulfaadi (HS) proteoglükaanid [33] ning HS-i omandamist sekundaarse retseptorina täheldatakse sageli pärast FMDV korduvat kulgemist kultuuris [34]. Spetsiifiline antikehade värvimine näitas rohkesti HS-i mõlemal suspensioonrakuliinil ja vähemal määral ka kleepuvatel BHK-rakkudel. On teada, et mutatsioonid FMDV genoomis, mis põhjustavad muutusi viiruse kapsiidivalkudes, et võimaldada HS-i kasutamist retseptorina, nõrgendavad viirust loomulikus peremeesorganismis [35]. HS-i kättesaadavus võib seetõttu olla otsustava tähtsusega tegur selle rakuliini FMDV sõltumatuse muutunud antigeensuses, millega viirus on kohanenud.

Kuna rakkude eraldumine on seotud muutustega aktiini-müosiini kontraktiilses mehhanismis [7] ja rakkude kultiveerimine suspensioonis toob kaasa erinevad nõuded ellujäämiseks, nt vastupidavus suurele nihkepingele, mis on tingitud kultiveerimisvedeliku segamisest [6], on aktiini skelett muudetud. selle uuringu vastu suurt huvi pakkuv. Mikroskoopiline analüüs näitas tsütoskeleti konformatsioonilist ümberkorraldamist kleepunud kasvavate rakkude retikulaarsest jaotusest suspensiooni tingimustes tiheda sfäärilise struktuurini. See võib olla reguleerimismehhanism ülalmainitud suure nihkepinge suhtes ja teadaolevalt esineb samades tingimustes ka CHO rakkudes [6]. Kuid tähelepanuväärne on ka see, et kuigi enamiku aktiinigeenide ekspressioonis ei olnud BHK-InV ja BHK{6}}P rakkude vahel mRNA tasemel olulisi erinevusi, tuvastati FMDV-le tundlikus BHK-s oluliselt rohkem filamentset aktiinivalku. -InV kui FMDV-resistentses BHK-s{10}}P. See võib olla seotud globulaarse aktiini erinevate polümerisatsioonikiirustega filamentseks aktiiniks.

Vähemalt adherentsetes rakkudes sõltub FMDV sisenemine aktiini dünaamikast. Viiruse sisenemine kutsub esile aktiini volangid ja nakkuse varases staadiumis on kirjeldatud aktiini filamentide võrgustiku katkemist filamentse aktiini muundamise kaudu globulaarseks aktiiniks [36–38]. Otsustades tsütopaatilise efekti (CPE) põhjal, mida täheldati kleepuvates BHK rakkudes pärast FMDV-ga nakatumist, läbib tsütoskelett paljudes selle komponentides intensiivseid ümberkorraldusi [38]. Sellist CPE-d ei esine suspensioonirakkudes nende juba sfäärilise kuju tõttu, kuid kõrgenenud aktiinisisaldus võib viirusele teatud eeliseid anda. Aktiini tsütoskeleti erinevuste tõttu viidi läbi transfektsioonikatsed, et võrrelda transfektsiooni efektiivsust suspensiooni ja kleepuva BHK vahel ning teha kindlaks, kas suspensioonirakkude tihe tsütoskelett takistab valkude esitlemist raku pinnal. On üldteada, et suspensiooni rakuliine on väga raske transfekteerida, mis on tingitud transfektsioonikompleksi vähenenud kinnitumisest rakumembraanile ja sellest tulenevalt vähenenud DNA kasuliku koormuse omastamisest [39]. Seda kinnitasid ka meie katsed. Kuid kuigi transfektsiooni efektiivsus oli BHK-2P-rakkudes vähenenud võrreldes kleepuva BHK-rakuliiniga, ei olnud erinevusi võimes kuvada transfekteeritud VSV G-valku raku pinnal. BHK-2P-rakkudes täheldati pEGFP-N1 ja pVSV-G ekspressiooniplasmiidide vahel värvitud rakkude protsendi erinevust. Seda ei uuritud edasi, kuid selle põhjuseks võib olla erinev tuvastamispiir VSV-G visualiseerimiseks kasutatud immunofluorestsentsvärvimise ja EGFP kaasasündinud fluorestsentsi vahel.

Lõpuks viidi läbi transkriptoomianalüüs, et saada rohkem teavet transkriptsiooniliste erinevuste kohta ühelt poolt kleepuvate ja suspensiooni BHK-rakkude vahel ning teiselt poolt FMDV-tundlike ja FMDV-resistentsete BHK-rakuliinide vahel. Meie tulemused on kooskõlas teiste CHO, MDCK või HEK rakkude transkriptoomiliste muutuste uuringutega üleminekul kleepuvalt kasvult suspensioonile. Üldiselt on enamik muutusi seotud tsütoskeleti struktuuri, raku metabolismi ja ECM-i komponentide interaktsioonidega ning neid reguleeritakse suspensioonirakkude puhul [7, 40, 41]. Üllataval kombel näitas FMDV-resistentne BHK{6}}P suspensioonrakk nende geenikomplektide allareguleerimist, mis võib samuti seletada BHK-2P aktiini taseme langust võrreldes BHK-InV rakkudega. Integriini subühiku ekspressiooni spetsiifiline analüüs näitas integriini subühiku V transkriptide sarnaseid tasemeid kõigis kolmes rakuliinis. Kõrgeim ekspressioon kõigis rakuliinides leiti integriini subühikul 1. Oluline on märkida, et integriin 1 võib moodustada kümne erineva ahelaga heterodimeere ja seda ekspresseerivad konstitutiivselt enamik imetajarakke [6, 42]. Samamoodi on V-subühik võimeline moodustama viie erineva ahelaga heterodimeeri, kuid 6 ja 8 on rakupinnal ainult koos V-ga [42]. Seda peegeldab täpselt üksikute integriini subühikute transkriptide täheldatud arvukus. 3 kõrgenenud transkriptsioon kleepuvates rakkudes korreleerub hästi ka integriini v3 kõrgema signaaliga antikehade värvimise katsetes. Teisest küljest ei kajastunud täheldatud erinevused ITGB3 ja ITGB8 mRNA tasemetes BHK-2P ja BHK-InV vahel pinna värvumises. Me ei suutnud lahendada, kas see oli tingitud ainult mRNA ja valgu kvantifitseerimismeetodite erinevast tundlikkusest või viitab valgu ekspressiooni või pinna esitluse transkriptsioonijärgsele plokile [43]. Üldiselt ekspresseerisid suspensioonrakuliinid BHK-2P ja BHK-InV oluliselt vähem ITGB1, ITGB3 ja ITGB6 mRNA-d võrreldes kleepuva rakuliiniga.

5. JäreldusedIn

Kokkuvõtteks võib öelda, et suspensioonrakkude valmistamisel on kriitilise tähtsusega hästi tuntud omadustega vanemraku klooni kasutamine ja saadud rakupopulatsiooni hoolikas sõelumine kohanemisprotsessi ajal, et tagada rakuliini oluliste omaduste säilimine, antud juhul , vastuvõtlikkus suu- ja sõrataudile. Lisaks tuleks tootmisrakuliinide edasiseks iseloomustamiseks kasutada kaasaegseid meetodeid, nagu FACS-analüüs ja transkriptoomika.

cistanche võib toita neere ja parandada neerufunktsiooni

Tänuavaldused

Täname Patrick Zitzowi suurepärase tehnilise toe eest.

Autori kaastööd

Kontseptualiseerimine:Veronika Dill, Michael Eschbaumer.

Ametlik analüüs:Veronika Dill, Florian Pfaff.

Rahastuse omandamine:Aline Zimmer, Martin Beer.

Uurimine:Veronika Dill.

Metoodika:Veronika Dill, Florian Pfaff, Michael Eschbaumer.

Projekti administreerimine:Martin Beer.Ressursid: Aline Zimmer.

Järelevalve:Michael Eschbaumer.

Visualiseerimine:Veronika Dill, Florian Pfaff, Michael Eschbaumer.

Kirjutamine – algne mustand:Veronika Dill.

Kirjutamine – ülevaatamine ja toimetamine:Veronika Dill, Florian Pfaff, Aline Zimmer, Martin Beer, MichaelEschbaumer.

Viited

1. Merten OW. Edusammud rakukultuuris: ankurdussõltuvus. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.2015; 370(1661):20140040.

2. Dingermann T. Rekombinantsed terapeutilised valgud: tootmisplatvormid ja väljakutsed. Biotechnol J.2008; 3(1):90–7.

3. Hernandez R, Brown DT. Beebi hamstri neeru (BHK) rakkude kasv ja säilitamine. Curr ProtocMicrobiol. 2010; 4. peatükk: liide 4H. mca04hs17 PMID: 20440683

4. Cruz HJ, Moreira JL, Stacey G, Dias EM, Hayes K, Looby D jt. Rekombinantset valku tootvate BHK-rakkude kohandamine seerumi- ja valguvaba söötmega. Tsütotehnoloogia. 1998; 26(1):59–64.

5. Guskey LE, Jenkin HM. BHK-21 rakkude kohanemine kasvuga loksutamiskultuuris ja sellele järgnev nakatamine Jaapani entsefaliidiviirusega. Rakendus Microbiol. 1975; 30(3):433–8. https://doi.org/10.1128/am. 30.3.{11}}.1975 PMID: 1237269

6. Walther CG, Whitfield R, James DC. Integriini ja aktiini tsütoskeleti vahelise interaktsiooni tähtsus CHO rakkude suspensiooni kohandamisel. Appl Biochem Biotechnol. 2016; 178(7):1286–302.

7. Kluge S, Benndorf D, Genzel Y, Scharfenberg K, Rapp E, Reichl U. Proteoomi muutuste jälgimine MDCK rakuliini astmelise kohandamise ajal alates kinnipidamisest kuni kasvuni suspensioonis. Vaktsiin. 2015; 33(35):4269–80.

8. Costa AR, Withers J, Rodrigues ME, McLoughlin N, Henriques M, Oliveira R jt. Rakkude seerumivabade tingimustega kohanemise mõju Hiina hamstri munasarjarakkude toodetud monoklonaalse antikeha glükosüülimisprofiilile. N Biotehnoloogia. 2013; 30(5):563–72. https://doi.org/10.1016/j.nbt.2012.12. 002 PMID:23247406

9. Bolwell C, Brown AL, Barnett PV, Campbell RO, Clarke BE, Parry NR jt. Suu- ja sõrataudi viiruse antigeensete variantide peremeesrakkude valik. J Gen Virol. 1989; 70 (Pt 1):45–57.

10. Wiesner S, Legate KR, Fassler R. Integriini ja aktiini interaktsioonid. Cell Mol Life Sci. 2005; 62(10):1081–99.

11. O'Donnell V, Pacheco JM, Gregg D, Baxt B. Suu- ja sõrataudi viiruse integriini retseptori ekspressiooni analüüs naiivsete ja nakatunud veiste kudedes. J Comp Pathol. 2009; 141(2–3):98–112. PMID: 19515380

12. Dill V, Hoffmann B, Zimmer A, Beer M, Eschbaumer M. FMDV Asia-1 kohanemine suspensioonikultuuriga: rakkude resistentsus on ületatud viiruse kapsiidi muutustega. Viirused. 2017; 9 lõige 8. https://doi.org/10. 3390/v9080231 PMID:28820470

13. Macpherson I, Stoker M. Hamstri rakukloonide polüoomi transformatsioon – raku pädevust mõjutavate geneetiliste tegurite uurimine. Viroloogia. 1962; 16:147–51.

14. Rourou S, van der Ark A, van der Velden T, Kallel H. Mikrokandja rakukultuuri protsess marutaudiviiruse paljundamiseks Vero rakkudes, mida kasvatatakse segatavas bioreaktoris täielikult loomsete komponentideta tingimustes. Vaktsiin. 2007; 25(19):3879–89.

15. Martin M. Cutadapt eemaldab suure läbilaskevõimega järjestuste lugemistest adapterjärjestused. EMBnet Journal. 2011; 17:10–2.

16. Patro R, Duggal G, Love MI, Irizarry RA, Kingsford C. Salmon pakub transkripti ekspressiooni kiiret ja eelarvamusteadlikku kvantifitseerimist. Nat meetodid. 2017; 14(4):417–9.

17. Srivastava A, Malik L, Sarkar H, Zakeri M, Almodaresi F, Soneson C jt. Joondamine ja kaardistamise metoodika mõjutavad transkriptsiooni arvukuse hindamist. Genome Biol. 2020; 21(1):239.

18. Love MI, Huber W, Anders S. RNA-seq andmete korduvuse ja dispersiooni modereeritud hinnang DESeq2-ga. Genome Biol. 2014; 15(12):550.

19. Zhu A, Ibrahim JG, Love MI. Jadade loendusandmete tugevad eelnevad jaotused: müra eemaldamine ja suurte erinevuste säilitamine. Bioinformaatika. 2019; 35(12):2084–92.

20. Clarke JB, Spier RE. BHK populatsioonide ja kloonitud rakuliinide tundlikkuse erinevus suu- ja sõrataudi viiruse kolme tüve suhtes. Arch Virol. 1980; 63(1):1–9.