Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Neeruepiteelile suunatud mitokondriaalse transkriptsioonifaktori A puudulikkus põhjustab progresseeruvat mitokondriaalset ammendumist, mis on seotud raske tsüstilise haigusega--I osa

Ken Ishii^1,2,11 et al

Ebanormaalne mitokondriaalne funktsioon on ägeda ja kroonilise haiguse hästi äratuntav tunnusneerud haigused. Et saada ülevaade mitokondrite rollistneerudhomöostaasi ja patogeneesi sihiks oli mitokondriaalne transkriptsioonifaktor A (TFAM), valk, mis on vajalik mitokondriaalse DNA replikatsiooniks ja transkriptsiooniks, mis mängib olulist rolli mitokondriaalse massi ja funktsiooni säilitamisel. Uurida mitokondriaalse funktsiooni katkemise tagajärgineerudepiteelirakud, inaktiveerisime TFAM-i siinuse okulisega seotud homeoboksis 2-ekspresseeridesneerudeellasrakud. TFAM-i puudulikkus põhjustas märkimisväärselt vähenenud mitokondriaalse geeniekspressiooni, mitokondriaalse ammendumise, nefronite küpsemise pärssimise ja raske sünnijärgse tsüstilise haiguse arengu, mis põhjustas enneaegse surma. Seda seostati ebanormaalse mitokondriaalse morfoloogia, hapnikutarbimise vähenemise ja glükolüütilise voolu suurenemisega. Lisaks leidsime, et TFAM-i ekspressioon vähenes hiirel ja inimeselpolütsüstilised neerud, millega kaasnes mitokondrite ammendumine. Seega näitavad meie andmed, et TFAM-i ekspressiooni düsregulatsioon ja mitokondriaalne ammendumine on rakkude molekulaarsed tunnused.neerudtsüstiline haigus, mis võib kaasa aidata selle patogeneesile.

MÄRKSÕNAD: glükolüüs; neerude areng; mitokondrid;polütsüstiline neeruhaigus; TFAM

cistancheon hea jaokspolütsüstiline neeruhaigus

Tõlkeavaldus

Oleme kasutanud hiire geneetikat, et mõista mitokondriaalse düsfunktsiooni rollineerudhomöostaas. Mitokondriaalse transkriptsioonifaktori A (TFAM) inaktiveerimine siinuse okulisega seotud homeobox 2 epiteeli eellasrakkudes põhjustasneeru-ebaõnnestumineraske tõttupolütsüstiline neer haigus. Meie leiud näitavad, et progresseeruv mitokondriaalne düsfunktsioon on seotud puuduliku epiteeli diferentseerumisega janeeru-tsüstogenees. Lisaks tegime kindlaks, et TFAM-i ekspressioon ja mitokondrite arv vähenesid inimestelpolütsüstiline neerpabertaskurätik. Meie uuringud näitavad, et terapeutilised strateegiad, mille eesmärk on parandada mitokondriaalset tervist, võivad olla kasulikud autosomaalse dominantsusega patsientide ravis.polütsüstiline neerhaigus.

Mitokondriaalne (mt) düsfunktsioon on üldtunnustatud patoloogiline tunnusneerud haigusedja võib vallandada rakukahjustuse, põletiku ja fibroosi.1 Aastalneerud, on torukujulised epiteelirakud väga sõltuvad oksüdatiivsest fosforüülimisest (OXPHOS) tekkivast adenosiintrifosfaadist (ATP), kuna nad täidavad mitut energiat tarbivat epiteeli transpordifunktsiooni. Seetõttu on efektiivse mt ATP tootmise säilitamine normaalse neerufunktsiooni ja süsteemse elektrolüütide homöostaasi jaoks hädavajalik. Lisaks näitavad hiljutised tõendid, et mitokondritel on oluline roll geeniregulatsioonis, rakkude signaaliülekandes ja rakkude diferentseerumises vahemetaboliitide ja reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) tekke kaudu.2 Vaatamata nendele edusammudele on mt signaaliülekande roll tavaliste haiguste patogeneesis.neerudhaigusedpole hästi arusaadav.

Mt funktsiooni uurimiseksneeru-homöostaasi ja patogeneesi puhul võtsime sihikule mitokondriaalse transkriptsioonifaktori A (TFAM). TFAM on tuumaga kodeeritud faktor, mis on oluline mt funktsiooni, mt koopiate arvu säilitamise ja mt DNA struktuurse stabiilsuse jaoks, kuna see reguleerib mt genoomi replikatsiooni ja transkriptsiooni promootor-DNA painutamise teel.3,4 Imetajate mt DNA sisaldab 37 geeni, 13 millest kodeerivad hingamisahela kompleksi valgu subühikuid, 22 kodeerivad ülekande-RNA-sid ja 2 ribosomaalset RNA-d.3 Seega osaleb TFAM otseselt mt elektronide transpordi ja ATP sünteesi reguleerimises geenide, näiteks mitokondriaalse kodeeritud tsütokroom b () transkriptsiooni kaudu. MT-CYB), mitokondriaalselt kodeeritud tsütokroom c oksüdaasi subühik 1 (MT-CO1) ja mitokondriaalselt kodeeritud ATP süntaasi membraani subühik 6 (MTATP6).3,5 Ilma TFAM-ita kaotavad rakud võime toota ATP-d OXPHOS-i kaudu, ei suuda tekitada märkimisväärses koguses mt ROS-i ja mitokondrite järkjärguline ammendumine.6–9 Geneetilised uuringud on näidanud, et TFAM on normaalse embrüogeneesi jaoks hädavajalik, kuna globaalne homosügootne Tfam inaktiveerimine põhjustas emakasisene letaalsus embrüonaalseks päevaks 10.5, samas kui heterosügootne puudulikkus, kuigi see vähendas mt koopiate arvu ~ 40 protsenti ja põhjustas hingamisahela puudulikkust, ei põhjustanud embrüonaalset letaalsust.6 Seega on TFAM-i geneetiline sihtimine kasulik eksperimentaalne strateegia rolli uurimiseks. progresseeruv mt düsfunktsioon rakkude diferentseerumises ja kudede homöostaasis. Tfami rakutüübispetsiifiline tingimuslik inaktiveerimine viitas sellele, et OXPHOS ja/või mt ROS genereerimine on rakkude diferentseerumise, funktsiooni ja normaalse füsioloogia jaoks kriitilise tähtsusega.6–10

Esineda võivad tuuma- või mt-geenimutatsioonidest tingitud primaarsed mt-häiredneerud haigusavaldub kõige sagedamini tubulointerstitsiaalse vigastusena või isoleeritud tubulaarse düsfunktsioonina.11,12 Kuigi see on seotud teatud inimeste haiguste, näiteks neurodegeneratiivsete häirete,13 patogeneesiga, põhjustavad TFAM-i spetsiifilised mutatsioonid.neeru-haigust ei ole teatatud. Hiljuti on TFAM-i ekspressiooni vähenemine seostatud krooniliseganeerudhaigus. Mt terviklikkuse kaotus Tfam inaktiveerimise tõttu põhjustas tubulointerstitsiaalse haiguse janeeru- ebaõnnestuminehiirtel, mis oli osaliselt tingitud mt DNA stressist indutseeritud tsüklilise GMP-AMP süntaasi (cGAS) – interferooni geenide stimulaatori (STING) – sõltuva põletikulise reaktsiooni aktiveerimisest.

Siin teatame, et hiirtel, kellel on tingimusliku Tfam inaktiveeritud sine okulisega seotud homeobox 2 (SIX2) - ekspresseerivates nefroni eellasrakkudes15, tekib raske tsüstiline haigus ja nad surevad enneaegselt.neeru-ebaõnnestuminenoorte alaealiste hiirtena.Tfam^-/- hiiri iseloomustasid nefronite küpsemise defektid, mis olid seotud mt ammendumise, OXPHOSi vähenemise ja metaboolse nihkega glükolüüsi suunas.Tfam^-/- neeru-epiteel. Arvestades tsüstilise haiguse tõsidustTfam^-/- hiirtel, analüüsisime 2 hiiremudelitpolütsüstiline neerhaigus(PKD), mis tulenevad mutatsioonidest kummagi polütsüstiini-1 (PKD(polütsüstiline neeruhaigus)1) või tsüstiin-1 (Cys1), aga ka autosomaalse domineeriva polütsüstilise neeruhaigusega (ADPKD) patsientide inimkuded. Me tuvastame selleTfam^-/- on nii hiire kui ka inimese PKD tsüstides düsreguleeritud(polütsüstiline neeruhaigus), koed. Kokkuvõttes näitavad meie uuringud, et TFAM-i düsregulatsioon ja mt ammendumine on iseloomulikud tunnusedneeru-tsüstilised haigused ja neil võib olla oma osa nende patogeneesis.

cistancheon hea jaokspolütsüstiline neeruhaigus

TULEMUSED

Tfami inaktiveerimine SIX2 liini rakkudes põhjustab tõsist tsüstilise haiguse, mille tulemuseks onneeru-ebaõnnestumineMt funktsiooni uurimiseksneeru-epiteeli, inaktiveerisime Tfami kuues{0}}ekspresseerivates eellasrakkudes, millest tekivad kõik nefronisegmendid, välja arvatud kogumiskanal (CD).15 Selleks ristasime Tfam flokseeritud alleeli bakteriaalsete tehiskromosoomide transgeensete hiirtega, mis ekspresseerivad. täiustatud rohelise fluorestseeruva valgu/Cre rekombinaasi liitvalk (eGFP/Cre), mis on Six2 promootori transkriptsiooni kontrolli all (joonis 1a).16 Hiired, mis on homosügootsed Tfam floxed alleeli suhtes ja heterosügootsed transgeeni eGFP/Cre suhtes (Kuus2-eGFP/Cretg/^{tg pluss}; Tfam^fl/fl) on edaspidi nimetatud kuueks2-Tfam^-/- mutandid. Kuus2-Tfam^-/- hiired sündisid eeldatava Mendeli suhtega ega olnud sünnihetkel visuaalse kontrolliga eristatavad Cre pesakonnakaaslaste kontrollidest. Kuid kuue{0}} kehakaalu erinevusedTfam^-/- mutandid ja Cre pesakonnakaaslaste kontrollid ilmnesid 14. sünnijärgsel päeval (P) (5,7 pluss -0,3 g mutantide puhul vs. 7,5 pluss -0,3 g kontrollide puhul, kumbki n=4, P =0.004; lisatabel S1). Kuus2-Tfam^-/- mutantseid hiiri iseloomustas suurenenudneerudvõrreldes kontrollidega (neerudkehamassi suhe 1,45 protsenti pluss -0,19 protsenti mutantide puhul vs. 0,60 protsenti pluss - 0,02 protsenti kontrolli jaoks, n {{8} } igaüks, P < 0,001;="" joonis="" 1b,="" täiendav="" tabel="" s1)="" ja="" suri="" vanuses="" p20="" kuni="" p30="" (joonis="" 1b).="" juveniilne="" letaalsus="" mutantse="" kohordis="" oli="">neeru-ebaõnnestumineraske tsüstilise haiguse tõttu vere uurea lämmastiku tasemega 68,40 pluss -5,32 mg/dl mutantsete hiirte puhul versus 16.8 2.0 mg/dl kontrollide puhul ( n= 6 ja vastavalt 7; P < 0,0001;="" joonis="" 1b="" ja="" c).="" lisaks="" tekkis="" kuuel="" 2-tfam/mutandil="" märkimisväärne="" albuminuuria="" (uriini="" albumiini/kreatiniini="" suhe="" 43,58="" pluss="" -362.475,18="" mg/g="" kuues2-tfam/mutandis="" vs.="" 3,39="" mg/g="" kontrollides="" vastavalt="" p14,="" n="6" ja="" 10="" juures;="" p="">< 0,0001).="" see="" on="" kooskõlas="" cre="" rekombinaasi="" ekspressioonimustriga="" six2="" nefroni="" eellasrakkudes,="" mis="" põhjustavad="" korgi="" mesenhüümist="">neeru-tuubulid ja podotsüüdid.15 Erinevalt kuuest2-Tfam^-/- mutandid, hiired, kellel oli heterosügootne Tfam puudulikkus SIX2 eellasrakkudes, arenesid normaalselt, olid viljakad ja ei arenenud selgeltneerudhaigus(täiendav joonis S1).

Joonis 1|Tfami inaktiveerimine SIX2 liini rakkudes põhjustab raske tsüstilise haiguse ja neerupuudulikkuse. (a) Skeem, mis illustreerib eksperimentaalset lähenemist ja sihtjärjestuste asukohta Tfam floxed alleelis. Pesakonnakaaslaste kontrollist (Cre ) ja kuuest eraldatud kogu genoomse neeru DNA polümeraasi ahelreaktsiooni analüüs2-Tfam^-/-hiired sünnijärgse päeva vanuses (P) 7; mitterekombineeriv Tfam floxed alleel on tähistatud 2-lox (2); rekombineeritud alleel 1-lox, metsiktüüpi alleel wt; þ või – näitavad Six2-eGFP/Cre transgeeni olemasolu või puudumist. (b) Vasakpoolsed paneelid, fotod Cre kontrolli ja kuue neerudest2-Tfam^-/- hiired vanuses P20. Neerude kaal (KW) on väljendatud protsendina kehamassist (BW) (n= 4–14). Parempoolsed paneelid, vere uurea lämmastiku (BUN) tase Cre pesakonnakaaslaste kontrollis (co) ja kuues2-Tfam^-/-hiired vanuses P7 (vastavalt n=7 ja 6) ning Kaplan-Meieri ellujäämiskõverad Cre kontrolli ja kuue2- jaoksTfam^-/- hiired võrreldes log-rank testiga (n=10–13). (c) Formaliiniga fikseeritud, parafiiniga manustatud neerusektsioonide representatiivsed kujutised Cre kontrollist ja kuuest2-Tfam^-/-hiired vanuses P7 ja P29 värviti hematoksüliini ja eosiiniga (H&E) ning analüüsiti immunohistokeemiaga a-silelihase aktiini (ACTA2) ja klastri diferentseerumise (CD) antigeeni 31 suhtes. Numbrimärgid kujutavad tsüstilisi struktuure ja tärnid kujutavad glomeruleid. Vardad ¼ 1 mm terve neeru ristlõigete jaoks, 100 mm suure võimsusega H&E kujutiste ja 50 mm IHC kujutiste jaoks. Andmed on väljendatud kui keskmine pluss – SEM ja neid analüüsiti 2-sabaga Studenti t-testiga. ***P < 0,001.="" selle="" pildi="" vaatamise="" optimeerimiseks="" vaadake="" selle="" artikli="" veebiversiooni="" aadressil="">

Kuue analüüs2-Tfam^-/- hiired, kes ekspresseerisid ka ROSA26-ACTB-tdTomato,-eGFP Cre reporteralleeli, mida siin nimetatakse kuueks2-mT/mG;Tfam^-/- hiirtel, mis näitab, et valdav enamus tsüstilistest struktuuridestTfam^-/- neerud saadi rakkudest, mille anamneesis oli Six{0}}eGFP/Cre ekspressioon (täiendav joonis S2). Tsüstid kuues2-Tfam^-/- neerudnäitasid proliferatsiooni tõendeid, mida näitas Ki67-positiivsete tsüsti vooderdavate epiteelirakkude olemasolu (keskmiselt w40 protsenti kõigist tsüsti vooderdavatest epiteelirakkudest), samas kui lõhustatud kaspaas 3 suhtes positiivseid rakke tsüstides ei tuvastatud (täiendav joonis S3 ). Need leiud on kooskõlas suurenenud fosforüülitud ekstratsellulaarse signaaliga reguleeritud kinaasi (p-ERK) ja b-kateniini tasemega kuues2-Tfam^-/- neerukude (täiendav joonis S3). Kokkuvõttes näitavad meie andmed, et kuus2-Tfam^-/- neerudel on molekulaarsed omadused, mida sageli seostatakseneeru-tsüstilised haigused.

Joonis 3 |Tfam^-/-tsüstid ei väljenda ühiseid nefronisegmendispetsiifilisi markereid. (a) Six2-mT/mG formaliiniga fikseeritud, parafiiniga manustatud neerusektsioonide representatiivsed kujutised;Tfam^-/-mice at age postnatal day (P) 14 stained for enhanced green fluorescent protein (eGFP), megalin, uromodulin, thiazide-sensitive sodium chloride cotransporter (NCC), and aquaporin 2 (AQP2) by immunofluorescence (IF). 4',6-diamidino-2-phenylindole was used for nuclear staining (blue fluorescence). Arrows depict tubular structures expressing respective nephron segment-specific markers. Nephron segment marker expression was assessed in cysts with a maximal diameter of >50 mm. (b) Formaliiniga fikseeritud, parafiiniga manustatud neerulõikude tüüpilised kujutised Six2-mT/mG-st;Tfam^-/-hiired vanuses P14 värviti eGFP ja uromoduliini suhtes IF abil. Tärnid kujutavad intraluminaalse uromoduliiniga tsüste. Intraluminaalse uromoduliini olemasolu uuriti tsüstides, mille maksimaalne läbimõõt oli kas 50–100μm või tsüstides, mille maksimaalne läbimõõt on üle 100 mm. Vardad=(a,b) 100 mm. Selle pildi vaatamise optimeerimiseks vaadake selle artikli veebiversiooni aadressilwww.kidney-international.org.

cistancheon hea jaoksneerud

Six{0}}Tfamis on nefronite küpsemine defektne^-/-hiired

Kuna koespetsiifilise Tfam-inaktivatsiooniga hiirtel võib kuluda mitu nädalat, kuni areneb patoloogia,17 uurisime järgmiseks haiguse aja kulgu.neeru-haiguse areng kuues2-Tfam^-/-hiired. Kogusime kontroll- ja mutanthiirte neerud vanuses P0, P7 ja P14 ning kasutasime histoloogilisi meetodeid, immunofluorestsentsvärvimist (IF) ja geeniekspressiooni analüüsi.neerudväljavõtted hindamiseks. IF värvimine SIX2 ja E-kadheriiniga vanuses P0 näitas, et kontroll- ja kuue2- neerudTfam^-/-olid histoloogiliselt sarnased. Kortikaalsete nefrogeensete tsoonide struktuuride moodustumine, nagu SIX2þ korgi mesenhüüm, E-kadheriini ekspresseerivad kusejuhade tipud ja tekkivad nefronistruktuurid, naguneeru-vesiikulid ning koma- ja S-kujulised kehad ei blokeeritud kuues2-Tfam^-/-neerud (joonis 2a). Need histoloogilised leiud olid kooskõlas nefrogeenseid markereid kodeerivate geenide ekspressioonitasemetega. Six2, paariskasti 2 (Pax2), LIM homeoboksi valgu 1 (Lhx1) ja spalt-like transkriptsioonifaktori 1 (Sall1) mRNA tasemed ei erinenud oluliselt kontrolli ja kuue mRNA tasemed2-Tfam^-/- hiired kokkuneerudhomogenaadid P0-stneerud(Joonis 2b). See viitas sellele, et TFAM-i inaktiveerimine SIX2 nefroni eellasrakkudes ei mõjutanud oluliselt nefrogeensete struktuuride moodustumist.

Kuigi tekkivate nefronistruktuuride moodustumist ei pärsitud, näitas Alcian Blue/Periodic acid-Schiffi ja lootose tetragonolobuse lektiiniga värvimine kuues kehas defektset terminaalset nefroni küpsemist2-Tfam^-/-hiired vanuses P{{0}}. Alcian sinine / perioodiline hape – Schiff, mis värvib torukujulisi alusmembraane ja harja piire, ja lootose tetragonolobuse lektiin, mis tuvastab spetsiifilisi oligosahhariide proksimaalsete tuubulite rakkude harja piiril, vähenesid mutantsetes neerudes. Joonisel 2c on kujutatud alcian sinine/perioodhape – Schiffi värvimine ajapunktides P0, P7 ja P14. Lotus tetragonolobuse lektiini histokeemia ja IF-värvimine Wilmsi kasvaja 1 valgu jaoks ajapunktides P{{10}}, P7 ja P14 on näidatud lisajoonisel S4. Vanuses P0 oli lootose tetragonolobuse lektiiniga positiivselt värvunud suhteline pindala 2,10 protsenti, 0,51 protsenti ja {{30}},39 protsenti 0,1 protsenti vanuses P7 versus 6,25 protsenti 0,28 protsenti ja 6,2 protsenti 1,1 protsenti kontrollide puhul (vastavalt n ¼ 3–4, P ¼ 0,0004 ja 0,0007; lisajoonis S4). Kooskõlas nende histoloogiliste leidudega on glomerulaar- ja nefronisegmendispetsiifilisi markereid podotsiini, nefriini, akvaporiini 1 (Aqp1), naatriumfosfaadi kotransporterit 2a (NaPi2a), uromoduliini, naatrium-kaaliumkloriidi 2 (kaastransporter 2) kodeerivate geenide ekspressiooni oluline vähenemine. Nkcc2) ja tiasiiditundlikku naatriumkloriidi kotransporterit (Ncc) kuues2-Tfam^-/-hiired (joonis 2b). Kokkuvõttes näitavad need andmed, et kuus2-Tfam^-/- neerudküpsete proksimaalsete nefronisegmentide ja glomerulite arvu järkjärguline vähenemine.

Kuna Six{0}}eGFP/Cre aktiivsus põhjustab TFAM-i puuduliku cap-mesenhüümist tuletatud nefronisegmente, ennustasime, et kuseteede pungadest pärinevate CD-epiteelirakkude küpsemine ei mõjuta kuues{{2} }Tfam^-/-neerud. Selle arusaamaga on kooskõlas see, et värvimine Dolichos biflorus aglutiniiniga, mis reageerib N-atsetüül-D-galaktoosiga distaalses tuubulis ja CD-s, näitas Dolichos biflorus aglutiniini positiivsete struktuuride suhtelist üleesindatust kuues2-Tfam^-/-neerud. Vanuses P7 moodustasid Dolichos bifloruse aglutiniini suhtes positiivselt värvunud alad 13,91 protsenti 0,9 protsenti mutantide kogupindalast versus 1,93 protsenti 0,1 protsenti kontrollis (n ¼ 3, P ¼ { {10}}.0002; lisajoonis S4). Naatriumkanali epiteeli 1 alfa subühiku (Scnn1a) või akvaporiin 2 (Aqp2), mis mõlemad ekspresseeritakse CD epiteelirakkudes, mRNA ekspressioon ei vähenenud võrreldes kontrolliga oluliselt (joonis 2b). Erinevalt kuuest2-Tfam^-/-neerud, Tfam inaktiveerimine homeobox B7 (HOXB7) eellasrakkudes, mis tekitavad CD epiteelirakke, mille tulemuseks on CD nefronimarkerite ekspressiooni kadumine ja kerge tubulaarne dilatatsioon, kuid mitte tsüstogenees (täiendav joonis S5). Kokkuvõttes näitavad meie andmed, et TFAM-i funktsiooni kadumine SIX2 eellasrakkudes ei blokeeri tekkivate nefronistruktuuride arengut, vaid pärsib nefroni terminaalset küpsemist.

Tfam^-/-tsüstidel puuduvad tavalised nefronisegmendi markerid

Iseloomustada histogeneetiline päritoluTfam^-/- neeru-tsüstid, tegime IF analüüsidTfam^-/- neerudat age P14 and examined the expression of nephron segment markers megalin (proximal tubule), uromodulin (medullary thick ascending limb of Henle), thiazide sensitive sodium chloride cotransporter (distal tubule), and aquaporin 2 (CD). The majority of cysts with a maximal diameter of >50 mm did not express these segment-specific markers, indicating a lack of cellular differentiation (Figure 3a, Supplementary Figure S6). Furthermore, approximately 50% of cysts with a maximal diameter of >50 mm iseloomustasid uromoduliini intraluminaalsed ladestused, mis viitasid proksimaalsest tuubulist distaalsetest nefroni segmentidest ja Henle laskuvast ahelast (joonis 3b).

Progresseeruvad kõrvalekalded mt funktsioonis ja morfoloogiasTfam^-/- epiteelirakud

Tfami deletsiooni metaboolsete tagajärgede aja iseloomustamiseks uurisime esmalt Tfami ja TFAM-iga reguleeritud mt-Co1, mt-Cyb ja mt-Atp6 mRNA tasemeidTfam^-/- neerudvanuses P0, P7 ja P14. Nagu oodatud, vähenesid Tfam, mt-Co1, mt-Cyb ja mt-Atp6 mRNA tasemed oluliselt (joonis 4a).Tfam^-/-eGFP-ga märgistatud epiteelirakud (Kuus{0}}mT/mG; Tfam / hiired) näitasid MT-CO1 valgu ekspressiooni olulist vähenemist (täiendav joonis S7). Mt DNA koopiate arv vähenes 63 protsenti, mis on kooskõlas mt ammendumisega, mis on TFAM-i puudulikkuse tunnus (joonis 4a). Seevastu nikotiinamiidadeniini dinukleotiidi kodeerivate tuumageenide ekspressioon: ubikinoonoksidoreduktaasi tuumasubühik 3 (Ndufs3) ja suktsinaatdehüdrogenaasi kompleksi flavoproteiini subühik A (Sdha) ei mõjutanud vanuses P0, kuid vähenes vanuses P7 ja P14 (Figure P4a). Need mt geeni ja valgu analüüsi tulemused on kooskõlas mt koopiate arvu järkjärgulise kadumisega Tfamis / epiteelis.

Järgmisena uurisime Tfami inaktiveerimise metaboolseid toimeid primaarsetes proksimaalsetes tuubulite epiteelirakkudes (PTEC), mis eraldati vanuses P7.Tfam^-/- PTEC-de baashapnikutarbimise määrad vähenesid oluliselt (40.77 4.10 mutantide puhul vs. 61.75 5.18 pmol/min/104 rakku kontrollide puhul, igaüks n=3, P =0.034), ATP-seotud hingamine (33.11 3.91 mutantide puhul vs. 46.{15}}.91 pmol/min/104 rakku kontrollide puhul, n{{18} } igaüks, P=0.093), maksimaalne hingamine (116.8 14.19 mutantide puhul vs. 225.5 13.55 pmol/min/104 rakku kontrollide puhul, n{{ 28}} kumbki, P=0.005) ja vaba hingamismaht (76.05 10.18 mutantide puhul vs. 163.7 8.61 pmol/min/104 rakku kontrollide puhul , n =3 igaüks, P=0,003; joonis 4b).

Mt ammendumise ja kahjustuse astme täiendavaks iseloomustamiseks uurisimeTfam^-/- neerudülekandeelektronmikroskoopia ja {{0}}mõõtmelise struktureeritud valgustusmikroskoopia (3D SIM) abil. P7 vanuses ilmnesid mitokondritel ebakorrapärased kujud ja õhupallid, mis on kooskõlas varasemate leidudega Tfam knockout hiirtel. Transmissioonelektronmikroskoopiline analüüs näitas, et mitokondrite struktuursed kõrvalekalded, nagu suurenenud suurus ja ebanormaalsed kristallid, progresseerusid postnataalselt, kuna mutantide ja kontrollrühma morfoloogilised erinevused olid vanuses P0 vähem ilmsed ja muutusid vanuse kasvades raskemaks (joonis 4c). ). 3D SIM-kaarti kasutati mt helitugevuse ja võrgu suuruse uurimiseks kuues{6}} mT/mG; Tfam / mutandid võrreldes kuue 2-mT/mG kontrollhiirega vanuses P7; mt mahtu mõõdeti 5–8 tuubuli ristlõigetes sektsiooni kohta, uurides 25–40 eGFP-positiivset kortikaalset epiteelirakku, mis olid värvitud pingest sõltuva aniooniselektiivse kanali 1 suhtes IF-värvimisega. Leidsime, et mt kogumaht eGFP positiivse raku kohta vähenes oluliselt (62.66 16.46 mm3/rakk mutantide puhul vs. 177.4 30.17 mm3/rakk kontrollide puhul, igaüks n ¼ 3 raku kohta , P ¼ 0.0289) ja see oli seotud rakkude kogumahu ja rakkude kogumahu suhte muutumisega 0.230 0.01-lt kontrollrühmades 0-le.{{ 33}},016 kuues2-Tfam / mutantides (mõlemad n ¼ 3, P ¼ 0,0017; joonis 4c). Maksimaalset mt-võrgu suurust, mis mõõdab kõigis uuritud eGFP-positiivsetes rakkudes leitud suurimat mt-võrku, vähendati kuues2-Tfam^-/- neerud(143.2 23.2 mm3 mutantide puhul vs. 318.3 49.45 mm3 kontrollide puhul, igaüks n ¼ 3, P ¼ 0.0327). Kokkuvõttes on ultrastrukturaalsed ja SIM-leiud ning mt geeni- ja valguanalüüsi tulemused kooskõlas mt koopiate arvu järkjärgulise kadumisegaTfam^-/- epiteel.

Cistancheon hea jaokspolütsüstiline neeruhaigus

TFAM-i puudulikkus nihutab neerude epiteeli metabolismi glükolüüsi suunas

PTEC-idneerudkasutavad ATP genereerimiseks rasvhapete b-oksüdatsiooni ja OXPHOS-i ning on glükoneogeneetilised.18 Täiendava ülevaate saamiseks Tfami inaktiveerimisega seotud metaboolsetest muutustest viisime läbi RNA järjestusanalüüsineerudkuuest2-Tfam^-/-ja Cre pesakonnakaaslaste kontrollhiired vanuses P7. Leidsime, et glükolüüsis osalevad peamised regulatoorsed geenid, nagu heksokinaas 2 (Hk2) ja enolaas 2 (Eno2), olid ülesreguleeritud. Seevastu vähenes enamiku trikarboksüülhappe tsüklis osalevate geenide ekspressioon (nt isotsitraatdehüdrogenaas 1 [Idh1]), nagu ka rasvhapete b-oksüdatsioonis osalevate geenide, nagu atsetüülkoensüüm A atsüültransferaas 1B, ekspressioon. Acaa1b), keskmise ahelaga atsüül-koensüüm A dehüdrogenaas (Acadm) (joonis 5a ja b, täiendav joonis S8). Kooskõlas trikarboksüülhappe tsüklis osalevate geenide ekspressiooni vähenemisega - oksüdatsioonigeenid oli neutraalsete lipiidide akumuleerumine, mis tuvastati külmutatud õli punase O värvimisega.neerudlõigud vanuses P14 (joonis 5c).

Vähendatud TFAM-i ekspressioon hiire ja inimese PKD kudedes on seotud mt ammendumisega

Sest kuus2-Tfam^-/- neerudsarnanes tugevalt PKD-ga(polütsüstiline neeruhaigus) neerud, hindasime järgmisena, kas TFAM oli PKD-s düsreguleeritud(polütsüstiline neeruhaigus)koed. Esmalt uurisime TFAM-i ja TFAM-i reguleeritud geeniekspressiooni kahes väljakujunenud geneetilises PKD hiiremudelis. Tfam mRNA tasemed vähenesid märkimisväärselt Pkd kogu neeru homogenaatides^-/- ja Cys^cpk/cpkhiired, kes kannavad mutatsioone kas PKD1-s(polütsüstiline neeruhaigus)või Cys1. Seda seostati mitokondriaalselt ja tuumaga kodeeritud mt geenide ekspressiooni vähenemisega, samuti glükolüütilise geeni düsreguleeritud ekspressiooniga. Sarnane kuuele2-Tfam^-/-neerud, PKD(polütsüstiline neeruhaigus)^-/- ja Cys^cpk/cpk neerudiseloomustasid kõrgenenud Eno2 ja Hk2 ning oluliselt vähenenud fosfoglütseraadi kinaasi (Pgk) 1, püruvaatdehüdrogenaasi kinaasi (Pdk) 1 ja Pdk4 transkripti tase (joonis 6a). TFAM-valgu ekspressioon, mida hinnati IF-värvimisega, vähenes tsüsti vooderdavates epiteelirakkudes võrreldes külgnevate mittetsüstiliste tuubulite epiteelirakkudega (joonis 6b). Seda seostati mt-Co1 ja mt-Atp6 ekspressiooni vähenemisega RNA fluorestsentsi in situ hübridisatsiooni abil (joonis 6b, täiendav joonis S9); 3D SIM-iga määratud mt maht vähenes 55 protsenti võrreldes kas külgnevate mittetsüstiliste tuubulite epiteelirakkude või normaalse kontrolli PTEC-dega.neerud. Tavaliste kontroll-PTEC-de ja mittetsüstiliste tuubulite PTEC-de mt mahu erinevusi ei leitud (joonis 6c).

Uurida, kas TFAM-i ekspressiooni kadumine on inimese PKD ühine molekulaarne tunnus(polütsüstiline neeruhaigus), analüüsisime 5 ADPKD patsiendi nefrektoomia proove immunohistokeemia, IF-värvimise, RNA fluorestsentsi in situ hübridisatsiooni ja 3D-SIM-i abil. TFAM-i ekspressiooni vähenemist täheldati 75,2 protsendil pluss -7,5 protsendilneeru-immunohistokeemia abil analüüsitud tsüstid. See oli seotud MT-CO1 ja MT-ATP6 ekspressiooni vähenemisega RNA fluorestsentsi in situ hübridisatsiooniga (joonis 7a, täiendav joonis S10); 3D SIM-i järgi hinnates vähenes mt maht tsüsti vooderdavates epiteelirakkudes ligikaudu 70 protsenti (joonis 7b). Kokkuvõttes analüüsiti 2 PKD(polütsüstiline neeruhaigus)hiiremudelid ja inimese ADPKD koed näitasid, et TFAM-i puudulikkus ja mt-de ammendumine on PKD-s tavalised leiud(polütsüstiline neeruhaigus)kudedesse ja võivad tõenäoliselt mõjutada nende patogeneesineeru-tsüstiline haigus.

cistanche on heapolütsüstiline neeruhaigus

Arutelu

Selle artikli II osa (Arutelu) kohta teabe saamiseks klõpsake siin.

Väljavõte: 'Neerepiteelile suunatud mitokondriaalse transkriptsioonifaktori A puudus põhjustab progresseeruvat mitokondriaalset ammendumist, mis on seotud raske tsüstilise haigusega (Ken Ishii 1, 2, 11 jt).

---NeerInternational (2021) 99, 657–670