Uriini podotsüütide markerid neeruhaiguste korral

lisateabe saamiseks:ali.ma@wecistanche.com

Lingfeng Zeng jt

Abstraktne

Podotsüüdid mängivad olulist rolli neerufunktsiooni säilitamisel ja on paljude jaoks esmatähtisneerudhaigused. Podotsüüdi kahjustus põhjustab podotsüütidest pärinevate rakuliste fragmentide ja podotsüütidele spetsiifiliste molekulaarsete sihtmärkide eritumist uriini, mis võivad toimida rakkude biomarkeritena.neerudhaigused. Intaktsed podotsüüdid, kas elujõulised või surnud, ja podotsüütidest pärinevad mikrovesiikulid saab kvantifitseerida uriinis erinevate tsentrifuugimise, visualiseerimise ja kultiveerimise meetoditega. Podotsüüdi-spetsiifilised valgu sihtmärgid tuumast, tsütoplasmast, piludiafragmast, glomerulaarkapillaaride alusmembraanist ja tsütoskeletist, samuti nendele vastavat messenger-RNA-d (mRNA) uriinis, saab kvantifitseerida Western blot analüüsi, ELISA või kvantitatiivse polümeraasi abil. ahelreaktsiooni. Kuigi mõned neist tehnikatest võivad praegu olla kallid või töömahukad, võivad need tehnoloogia ja automatiseerimise täiustumise tõttu tulevikus laialdaselt kättesaadavaks muutuda. Taotluskuseteedepodotsüütidemarkerid erinevate diagnoosimiseks ja jälgimiseksneerudhaigusedon uuritud, kuid avaldatud andmed selles valdkonnas ei ole piisavalt süstemaatilised ja neil puudub väline kinnitus. Edasised uuringud peaksid keskenduma laboratoorsete meetodite standardimisele, võrdlemisele ja automatiseerimisele, samuti nende lisaväärtuse määratlemisele tavapäraste kliiniliste testide jaoks.

Märksõnad:Podotsüüt, Biomarker, mRNA, miRNA, nefriin, podotsiin, podokalüksiin, sünaptopodiin,Kroonilineneerudhaigus

Cistanche vars võib ravida kroonilist neeruhaigust

1. Sissejuhatus

1.1. Kroonilise neeruhaiguse epidemioloogia

Kroonilineneerudhaigus(CKD) on oluline ja kulukas mittenakkuslik haigus [1]. Neeruasendusravi kättesaadavuse korral on kroonilise neeruhaiguse raviks kasutatavad tervishoiukulud (Ckroonilineneerudhaigus)tõusis järsult pärast 1960. aastaid [2,3]. 2015. aastal sai kogu maailmas neeruasendusravi üle 2,5 miljoni patsiendi ning prognooside kohaselt kahekordistub see arv 2030. aastaks [4]. Tõhusad vahendid diagnoosimiseks, raviks ja jälgimiseksneerudhaiguson väga vajalikud.

1.2. Podotsüüt neeruhaiguse fookusena

Neerude esmane ülesanne on metaboolsete jäätmete ja liigse kehavee väljutamine [5], mis saavutatakse kolme protsessiga: (1) ringleva vere filtreerimine läbi glomeruli, et moodustada Bowmani ruumis ultrafiltraat; (2) kasulike ainete selektiivne reabsorptsioon neerutuubulite kaudu; ja (3) muude metaboolsete jäätmete selektiivne sekretsioon peritubulaarsest kapillaarist tubulaarsesse vedelikku [6]

Kuigi neer koosneb mitmest rakutüübist, mis on paigutatud õrna 3-mõõtmelise arhitektuuri järgi, mängib podotsüütidel võtmerolli normaalse neerufunktsiooni säilitamisel ja see on paljude inimeste peamiseks fookuseks.neerudhaigused. Podotsüüdid on väga spetsiifilised terminaalselt diferentseerunud rakud, mis koos endoteelirakkude ja glomerulaarkapillaaride alusmembraaniga (GCBM) moodustavad glomerulaarfiltratsiooni barjääri [7]. Podotsüütidel on mahukas rakukeha, mis on GCBM-ist eraldatud subpototsüütide ruumiga [8]. Rakukehast tekivad pikad primaarsed protsessid, mis ulatuvad GCBM-i suunas ja on viimase külge kinnitatud ulatuslike jalaprotsesside hulgaga [8].

Podotsüütidel on mitmeid füsioloogilisi funktsioone. Nad säilitavad glomerulaarse vaskulaarse ahela morfoloogiat, reguleerivad glomerulaarfiltratsiooni ja osalevad kohalikus immunoloogilises ja põletikulises vastuses. Lisaks vastutavad podotsüüdid osaliselt GCBM [9] sünteesi ja käibe eest, samuti parakriinsete tegurite, nagu vaskulaarse endoteeli kasvufaktori (VEGF) tootmise eest, mis on oluline endoteelirakkude läbilaskvuse ja proliferatsiooni reguleerimisel. [10]. Podotsüütide düsfunktsioon mängib paljude patogeneesis ja progresseerumises keskset rollineerudhaigused. Tulemuseks on mitmesuguste podotsüütidega seotud geenide mutatsioonidneerudhaigused, mis esinevad tavaliselt kliiniliselt steroidresistentse nefrootilise sündroomina ja histoloogiliselt fokaalse glomeruloskleroosina (FGS). Teisest küljest põhjustavad omandatud podotsüütide düsfunktsioonid, sealhulgas podotsüütide arvu või tiheduse vähenemine ja podotsüütide jalaprotsesside sulandumine, sekundaarse endoteeli ja GCBM kahjustuse, GCBM negatiivse laengu kadumise, hiataalse membraani valgu kõrvalekalde ja lõpuks proteinuuria erinevate mehhanismide kaudu. 11,12].

Podotsüütide vigastuse iseloomulik tagajärg on nõrgenenud interaktsioon GCBM-iga, mis kumuleerub podotsüütide eraldumiseks GCBM-ist. Kuna podotsüütidel on piiratud regenereerimis- ja funktsionaalse kompensatsiooni võime, ei suuda ülejäänud podotsüütidel säilitada GCBM-i mehaanilisi ja laengubarjääri funktsioone, mis võivad pöördumatult kahjustuda ning lõpptulemuseks on proteinuuria [13]. Sõltuvalt solvamise tõsidusest võib podotsüütide kahjustus põhjustada jalaprotsesside kadumist, vakuoolide ja pseudotsüstide moodustumist, diferentseerumist ja apoptoosi. Seejärel mõjutatakse naaberstruktuure, sealhulgas parietaalsete epiteelirakkude vohamist, GCBM-i kokkutõmbumist, glomerulaarse kapillaartufi kadu ja lõpuks glomeruloskleroosi [14].

1.3. Kirjanduse ülevaate meetod

Tegime kirjanduse ülevaate, kasutades otsingutermineid, sealhulgas "podotsüüt", "podotsüüdiga seotud molekulid" või "biomarker" ja "kroonilineneerudhaigus", "äge neerukahjustus", "glomerulonefriit", "diabeetiline nefropaatia" või "diabeetilineneerudhaigus", kasutati asjakohase kirjanduse otsimiseks Medline'i, Embase'i ja Cochrane'i raamatukogust. Täiendavate potentsiaalsete paberite leidmiseks uuriti asjakohaste väljaannete viiteid. Abikõlblikud uuringud hõlmasid enne 2020. aasta juulit avaldatud inimeste ja loomade uuringuid. Väljaanded ebaoluliste teemadega, nagu podotsüütide rakubioloogia, membraanifüsioloogia ja podotsüütide molekulaarne manipuleerimine jäeti välja.

1.4. Podotsüüdi-spetsiifilised sihtmärgid biomarkeritena

Podotsüüdi kahjustus põhjustab mitmesuguste podotsüütidest pärinevate molekulide levikut kuseteedesse ja võib toimida kuseteede biomarkerina.neerudhaigused(joonis 1). Podotsüüdi rakukehad võib jagada kolme anatoomiliselt ja funktsionaalselt erinevaks osaks: põhiosa, ülemine osa ja libiseva diafragma (SD) osa [15]. Igas osas on spetsiifilised rakumembraani valgud ja nende koostoime tsütoplasmaatilise tsütoskeleti süsteemiga vastutab podotsüütide struktuuri ja funktsiooni stabiilsuse eest [16]. Peamised podotsüütidest pärinevad molekulid, mis on biomarkerite arendamise potentsiaalsed sihtmärgid, on kokku võetud tabelis 1.

Joonis 1. Podotsüüdi vigastus ja võimalikud podotsüütidest pärinevad markerid uriinis. Podotsüütide vigastus põhjustab 3 omavahel seotud patoloogilist protsessi: morfoloogiline muutus, apoptoos ja eraldumine. Podotsüüdid võivad jääda elujõuliseks, kuid avalduda morfoloogiliste muutustena, millel on funktsionaalsed tagajärjed, nagu proteinuuria ja tubulointerstitsiaalne fibroos. Podotsüüdi apoptoos võib areneda kumuleeritud morfoloogiliste muutuste tulemusena või otse konkreetsete solvangute tõttu. Podotsüütide kadu glomerulites (st podotsütopeenia) põhjustab glomerulaarse kapillaari ahela arhitektuurilisi muutusi ja põhjustab glomeruloskleroosi. Podotsüüdid, kas apoptootilised või elujõulised 3 1 integriini kadumise tõttu, võivad eralduda kuseteedest, identifitseerida uriinis ja ollaneerudhaigus. Vigastatud või apoptootilistest podotsüütidest pärinevaid vesiikuleid, mikroosakesi või podotsüütidespetsiifilisi molekule võib tuvastada ka uriinis ja need toimivad biomarkeritena. (GCBM, glomerulaarne kapillaaride basaalmembraan; AgII, angiotensiin II; TGF-, transformeeriv kasvufaktor-beeta; ROS, reaktiivsed hapniku liigid).

1.5. Tuuma- ja tsütoplasmaatilised sihtmärgid

Wilmsi kasvaja supressorgeen-1 (WT1) on podotsüütide tuumas olev tsingi sõrmetaoline transkriptsioonifaktor ja tõenäoliselt kõige sagedamini kasutatav podotsüütide spetsiifiline marker histoloogilistes uuringutes [17]. WT1 geen koosneb 10 eksonist, millest eksonid 7 kuni 10 kodeerivad DNA-d siduva domeeni 4 tsinkisõrme. WT1 ekspresseerub spetsiifiliselt podotsüütides ja tõenäoliselt reguleerib see nefriini ekspressiooni [18]. Heterosügootsed mutatsioonid WT1 geeni eksonites 8 ja 9 põhjustavad Denys-Drashi sündroomi, mis avaldub nefrootilise sündroomi, meeste pseudohermafroditismi ja Wilmsi kasvajaga [19].

Teisi podotsüütide tuuma- ja tsütoplasmaatilisi valke on biomarkeritena vähem uuritud. AarF domeeni sisaldav kinaas -4 (ADCK4) esineb spetsiifiliselt roti podotsüütide jalaprotsesside mitokondrites [20]. ADCK4 vastutab CoQ kompleksi stabiliseerimise eest ja see on vajalik podotsüütide normaalse homöostaasi funktsiooni jaoks [20]. Podotsüüdi-spetsiifiline ADCK4 ablatsioon hiirtel põhjustab jala protsessi tuhmumist, filtreerimispilu disorganiseerumist, laienenud ja düsfunktsionaalseid mitokondreid ning CoQ10 vähenemist [21] ning ravi taastas CoQ10, mitokondriaalse funktsiooni, parandas podotsüütide morfoloogiat ja takistas jala protsessi kadumist [21]. ,22].

1.6. Pilu-diafragma valgukompleks

Podotsüüdi pilu diafragma valgukomponente on laialdaselt uuritud kui biomarkereid.neerudhaigused. Selle rühma peamised valgud on nefriin, podotsiin, CD{0}}seotud valk (CD2AP) ja podoplaniin [23]. Nefriin on transmembraanne valk, millel on ekstratsellulaarsed domeenid, mis moodustavad pilu diafragma südamiku. See toimib nii füüsilise sõela tõkkena kui ka signaalkarkassina [24]. Nefriini geeni mutatsioonid olid esimene teadaolev kaasasündinud nefrootilise sündroomi põhjus inimestel [25]. Podotsiin ja CD2AP vastutavad nefriini ühendamise eest rakumembraani all oleva aktiini tsütoskeletiga. Podotsiin on stomatiini perekonda kuuluv juuksenõelalaadne valk ja seda ekspresseeritakse eranditult podotsüütides [26]. Seda kodeerib NPHS2 geen, mis koosneb kaheksast eksonist ja asub kromosoomi 1q25-q31 piirkonnas [27]. NPHS2 geeni mutatsioonid põhjustavad autosoom-retsessiivset steroidresistentset nefrootilist sündroomi nii lastel kui ka täiskasvanud patsientidel [27, 28]. CD2AP on karkassimolekul, mis interakteerub otseselt filamentse aktiini ja teiste rakumembraani valkudega ning on seotud aktiini dünaamilise ümberkujundamise ja membraanikaubandusega [29]. Podoplaniin on väike transmembraanne glükoproteiin, millel on suur hulk O-glükosiidahelaid. Podoplaniini selektiivne kadu podotsüütides põhjustab proteinuuria, millele järgneb muutusi podotsüütide morfoloogias spontaanse proteinuuria rotimudelis [30].

Kaugus on neerudele hea

1.7. GCBM-iga seotud sihtmärgid

Podotsüütide basaalpiirkonna peamised valgukomponendid on 3 1 integriin ja -düstroglükaan (-DG). Need valgud ankurdavad podotsüüdid GCBM-i külge ja mängivad olulist rolli podotsüütide õige asendi ja filtreerimismembraani terviklikkuse säilitamisel [31, 32]. Integriin 3 1 on transmembraanne valk, mille ekstratsellulaarne domeen on seotud GCBM-is oleva laminiini 521 laminiini G-sarnase domeeniga G (LG), samas kui selle tsütoplasmaatiline piirkond on ühendatud podotsüütide tsütoskeletiga -aktiniini {{ abil. 9}}. Glükosüülitud valk -DG on ühendatud tsütoskeletiga utrofiini kaudu ning podotsüütide ja GCBM-iga interaktsiooni kaudu laminiiniga 521.

1.8. Sihib ülemist membraani

Podokalüksiin on peamine transmembraanne valk podotsüütide apikaalsel küljel. See on negatiivselt laetud siaalhappevalk, mis aitab kaasa glomerulaarfiltratsiooni laengubarjäärile [33]. Podokalüksiinil on kolm funktsiooni: (1) takistada negatiivselt laetud valgu lekkimist uriini; (2) külgnevate podotsüütide eraldatuse säilitamine; ja (3) vältida adhesiooni epiteelirakkude ja kapillaarsilmuste vahel [34]. Podokalüksiin on ühendatud aktiini tsütoskeletiga ezriini ja naatrium-prootonvaheti reguleeriva faktori 2 (NHERF2) kaudu.

1.9. Aktiiniga seotud sihtmärgid

Mitmed podotsüütide-spetsiifilised valgud on seotud aktiini tsütoskeletiga ja säilitavad podotsüütide 3-mõõtmelise struktuuri. Selle rühma kõige paremini uuritud sihtmärgid on sünaptopodiin ja -aktiniin-4. Mõlemad seostuvad aktiini skeletiga, interakteerudes ümberpööratud orientatsiooniga membraaniga seotud guanülaatkinaasiga -1 (MAGI-1) [35]. Sünaptopodiin on proliinirikas lineaarne valk, mida kodeerib SYNPO geen [36] ja mida ekspresseeritakse diferentseerivates podotsüütides, kui nad arendavad jalaprotsesse. Selle tulemusena peetakse sünaptopodiini küpsete podotsüütide markeriks [37].

2. Õppemeetodid

2.1. Intraglomerulaarsed podotsüütide markerid

Kuigi selle ülevaate keskmes onkuseteedepodotsüütidemarkereid, on loogiline lühidalt arutada nende markerite tuvastamist neerukoes. Podotsüütide ammendumine võib olla absoluutne (pototsüütide kadu) või suhteline (vähenenud podotsüütide arv glomeruli mahu kohta) [38]. Kuldstandard meetod podotsüütide kvantifitseerimiseks neerudes on stereoloogilised metoodikad (valgus- või elektronmikroskoobid, konfokaalsed laserskaneerivad mikroskoobid, ultraheli, kompuutertomograafia või magnetresonantstomograafia) [39]. Kõik need on aga aega- ja töömahukad. Hiljuti on Venkatareddy et al. hindas meetodit podotsüütide tiheduse hindamiseks üksikute parafiiniga manustatud formaliiniga fikseeritud sektsioonide abil, milles podotsüütide tuumad visualiseeriti kaudse immunofluorestsentsi abil WT1 vastaste antikehade või transdutsiinitaolise lõhestumise võimendajaga [40]. Hilisem uuring näitas, et see meetod andis täpse podotsüütide loendamise selektiivse podotsüütide kahanemise transgeenses hiiremudelis, kinnitades, et see lähenemisviis pakub tõhusat kvantitatiivset vahendit podotsüütide ammendumise analüüsimiseks kogu glomerulites [41]. Sellest hoolimata nõuab see meetod siiski neeru biopsiat ja seetõttu ei sobi see seeriaseireks.

2.2. Uriini podotsüütide kvantifitseerimine ja kultiveerimine

Kuna podotsüüdid fikseeritakse oma füsioloogilisse asendisse ainult jalaprotsesside kaudu, on nad haavatavad elujõuliste rakkudena uriiniga kadumisele [42]. Tegelikult on tervete inimeste ja haigete patsientide uriinis tuvastatavad terved podotsüüdidneerudhaigused[43] ja uriinikaotus on tõenäoliselt peamine podotsüütide vähenemise mehhanism kroonilise neeruhaiguse progresseerumise ajal.(Ckroonilineneerudhaigus)[42]. Traditsiooniline meetod podotsüütide identifitseerimiseks uriinis hõlmab tsütospiini tehnikaid ja immunofluorestsentsuuringut spetsiifiliste podokalüksiinivastaste antikehadega [44], mille puhul on automatiseerimine osaliselt teostatav. Selle tehnika tundlikkus ja spetsiifilisus on aga piiratud, kuna uriinisetetes on rakujäätmed.

Alternatiivina võib podotsüüte tuvastada podotsüütide-spetsiifiliste trüptiliste peptiidide tuvastamise teel vedelikkromatograafiaga, mis on ühendatud tandem-massispektromeetriaga (LC-MS/MS). Kuigi selle tehnika seadmete maksumus on kõrge, on selle eeliseks see, et see on operaatorist sõltumatu ja hästi reprodutseeritav [45] ning seda kasutatakse tõenäoliselt kliinilises laboris.

Varasemad uuringud näitasid, et tsütospiini immunofluorestsentsi tehnikaga eritavad terved inimesed vähem kui 0,5 podotsüütide/mg kreatiniini, aktiivse glomerulaarhaigusega patsiendid aga kuni 400 podotsüütide/mg kreatiniini [43]. Enamuskuseteedepodotsüüdidon propiidiumjodiidi välistamise ja TUNEL-värvimisega testimisel elujõulised [43]. Teoreetiliselt parandaks elujõuliste podotsüütide kultuur ex vivo podotsüütide identifitseerimise spetsiifilisust, eemaldades surnud ja mittespetsiifilised rakud. Podotsüüdid aga tavaliselt in vivo ei prolifereeru ja nende kasvatamiseks ex vivo on vaja spetsiaalseid katsetingimusi [46]. Varasemad aruanded näitasid, et podotsüüte saab kõigepealt kasvatada kasvu lubavates tingimustes, kus immortaliseeritud podotsüüdid paljunevad [46]. Selleks otstarbeks mõeldud rakukultuurisööde koosneb tavaliselt Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 või Dulbecco modifitseeritud Eagle'i söötmest, mis sisaldab 10 protsenti veise loote seerumit, millele on lisatud 20–100 U/ml hiire gamma-interferooni (INF-). kultiveerimisnõud on tavaliselt kaetud I tüüpi kollageeniga, et soodustada podotsüütide proliferatsiooni [46]. Sellel meetodil on translatsiooniuuringutes ja terapeutilise sihtmärgi tuvastamisel suur väärtus, kuid see on rutiinseks kliiniliseks kasutamiseks liiga keeruline.

Cistanche võib parandada neerufunktsiooni

2.3. Kuseteede podotsüütidest pärinevad fragmendid

Ekstratsellulaarsed vesiikulid (EV-d) on sfäärilised membraanilised kehad, mida vabastavad erinevad rakutüübid [47]. Kuseteede süsteemis erituvad apikaalset membraani ja rakusisest vedelikku sisaldavad EV-d kõigist nefroni segmentidest, sealhulgas podotsüütidest, neerutuubulitest epiteelirakkudest ja uroepiteelirakkudest uriini. Kuseteede EV-d sisaldavad düsfunktsiooni ja neeru struktuurikahjustuse valgumarkereid. Hiljutised uuringud näitavad lisaks, et elektrisõidukid võivad olla olulised rakkudevahelise suhtluse jaoks [48]. Lisaks näitasid varasemad uuringud ka, et vigastatud podotsüütidest erituvad apikaalsete rakumembraanide fragmendid uriini [49] ja neid saab elektronmikroskoopia abil tuvastada podokalüksiini-positiivsete granulaarstruktuuridena (PPGS) [49]. Diabeedi põdevate hiirte mudelites saab podotsüütidest uriini eksosoome eraldada seeriatsentrifuugimise teel ja mikroosakesi kvantifitseerida voolutsütomeetria abil, kasutades anneksiin V antikeha (mis tuvastab kõik mikroosakesed), millele järgneb podokalüksiini või podoplaniini vastane antikeha (mis identifitseerivad spetsiifiliselt podotsüütidest pärinevaid mikropartikleid). [50,51]. Täiendavat valguse hajumise analüüsi saab kasutada mikroosakeste suuruse edasiseks määramiseks [52]. Nende keerukate meetodite abil on näidatud, et podotsüütidest pärinevate mikroosakeste hulk suureneb hiirtel kõrge glükoosisisaldusega kokkupuutel [51], samuti diabeetilistel hiirtel enne albuminuuria tekkimist [52]. Esimesel juhul surus kõrvalekalde alla Rho-kinaasi inhibiitor, mis näitab, et tsütoskeleti ümberkorraldamine on mikroosakeste vabanemise peamine käivitaja [51]. Kuid nende tehnikate rakendamine inimeseleneerudhaigusei ole uuritud.

Selle asemel, et mõõta podotsüütidest pärinevate EV-de ja mikroosakeste arvu ja suurust uriinis, on viimasel ajal kasvanud huvi podotsüütide-spetsiifiliste molekulide mõõtmise vastu uriini eksosoomides. Näiteks on podotsüütidest pärinevaid signaaliülekandefaktoreid (PDSTF-id) uriini EV-des pakutud potentsiaalse kandidaadina podotsüütide vigastuste hindamisel [52]. Nende kliinilised rakendused on siiski väljatöötamisel.

2.4. Kuseteede podotsüütide spetsiifilised valgu sihtmärgid

Mitme podotsüütide-spetsiifilise valgu sihtmärgi taset uriinis on lihtne mõõta ja nende rolli biomarkeritena.neerudhaiguson uuritud. Podokalüksiini taset uriinis saab mõõta kaudse immunofluorestsentsi, ELISA või voolutsütomeetriaga [53] ning seda on pakutud markerinakuseteedepodotsüütideloendama. Varasem uuring näitas aga, et uriinis leiduv podokalüksiin pärineb enamasti vigastatud podotsüütide apikaalsest membraanist, mitte uriiniga purustatud puutumatutest, ja selle tase suureneb varase neerukahjustuse korral [49]. Podokalüksiin ja nefriin, teine ​​oluline podotsüütide-spetsiifiline valgu sihtmärk uriinis, ei ole tervete inimeste uriinis tuvastatavad traditsioonilise Western blot analüüsiga [54], kuid need on preeklampsiaga patsientidel tuvastatavad tavapärase ELISA abil [55]. Lisaks korreleerub nefriini tase uriinis proteinuuria raskusastmega [56] ja neerufunktsiooniga [57]. Plasma nefriini taset saab samuti mõõta [57], kuid selle bioloogilist või kliinilist tähtsust ei ole kindlaks tehtud. Podotsüüdispetsiifiliste valgu sihtmärkide uriinisisalduse kliinilise biomarkerina kasutamise peamine probleem on madal kontsentratsioon (tavaliselt vahemikus ng/ml) ja uriini kontsentratsiooni-lahjenduse segav toime.

2.5. Kuseteede podotsüütide spetsiifilised mRNA-d

Mõõtminekuseteedepodotsüütide-spetsiifiline mRNA tase on pakutud alternatiivse meetodina uriini podotsüütide arvu määramiseks. Podotsüüdispetsiifilise mRNA kogus uriinis ei ole tavaliselt tavapärase Northern blot uuringu jaoks piisav, kuid seda mõõdetakse kergesti reaalajas kvantitatiivse polümeraasi ahelreaktsiooni (RT-QPCR) abil. Kaks varasemat uuringut näitasid, et uriini nefriini mRNA tasemetel oli tihe korrelatsioon uriini podotsüütide arvuga [56,58]. Glomerulaarse basaalmembraanivastase haiguse hiiremudelis koos seeria neerubiopsiagakuseteedepodotsüütide-spetsiifilised mRNA tasemed korreleerusid glomerulaarse podotsüütide kadumise kiirusega [52].

Hiljutised uuringud on aga nihutanud fookuse tuletatud uriini mRNA indeksitele kui podotsüütide stressi või suhtelise podotsüütide vigastuse asendusmarkeritele. Rotimudelis seostati progresseeruvat glomerulaarhaigust nefriini vähenemisega võrreldes podotsiini mRNA tasemega ning uriini podotsiini ja nefriini mRNA suhe korreleerus histoloogilise progresseerumise raskusastmega [59]. Järgmises uuringus leiti, et tervete inimeste keskmine arteriaalne rõhk korreleerub uriini podotsiini mRNA ja kreatiniini suhtega (podotsüüdi eraldumise marker), podotsiini ja nefriini mRNA suhtega (podotsüüdi stressi marker) ja uriini podotsiiniga. -akvaporiini-2 mRNA suhe (suhtelise podotsüütide vigastuse ja torukujulise vigastuse marker) [60]. Glomerulaarkahjustus on spetsiifiliselt seotud suurenenud podotsiini ja akvaporiini-2 ja nefriini ja akvaporiini-2 mRNA suhtega [61].

2.6. Podotsüütidele spetsiifilised uriini miRNA markerid

Mikro-RNA-d (miRNA-d) on lühikesed mittekodeerivad RNA-d, mis reguleerivad paljusid bioloogilisi radu, sihites spetsiifilisi mRNA-sid [62]. Sarnaselt mRNA-ga saab uriini miRNA-d hõlpsasti kvantifitseerida RT-qPCR abil [63]. Biomarkerite arendamise seisukohast on miRNA eeliseks lagunemiskindlus, mis hõlbustab nii selle kliinilist kasutamist kui ka arhiiviproovide uurimist [63]. Aastal on täheldatud mitmeid spetsiifilisi miRNA muutusineerudhaigused[9]. Näiteks leiti, et funktsionaalsete miRNA-de, sealhulgas miR-23b, miR-24 ja miR-26a podotsüütide-spetsiifiline kadu põhjustab kiireid glomerulaar- ja tubulaarseid vigastusi [64]. Täpsemalt reguleerib miR-27b podotsüütide ellujäämist adenosiiniretseptori 2B sihtimise kaudu [65]. Samuti teatati, et uriini miR-21, miR-124 ja miR-192 tasemed korreleeruvad neerufunktsiooni häire raskusastmega (albuminuuria ja hinnanguline GFR) jakuseteedepodotsüütidemarkerid (nefriin, sünaptopodiin ja podokalüksiin) diabeediga patsientidel [66]. Hiljutised uuringud tuvastasid lisaks mitmete miRNA-de spetsiifilisi allavoolu teid, mis võivad olla olulised patogeneesi või progresseerumise jaoks.neerudhaigused. Eelkõige pärsib miR-193a WT- 1 ekspressiooni, mis mõjutab podotsüütide diferentseerumist [67] ja võib mängida rolli glomerulaarhaiguse patogeneesis [68]. Teisest küljest inhibeerib miR-21 metalloproteinaas 3 (TIMP3) koeinhibiitori ekspressiooni [69,70], miR-26a inhibeerib transformeerivat kasvufaktori beeta-1 (TGF{{) 11}}) ekspressioon [71,72], miR-23b sihib Ras GTPaasi aktiveerivat valku SH3 domeeni siduvat valku 2 (G3BP2) [73], miR-29c sihib Sprouty homoloogi 1 (Spry1) ) [74]; mis kõik on seotud diabeetilise nefropaatia progresseerumisega.

Tistanche neerufunktsiooni parandamiseks

Podotsüüt moodustab aga vaid väikese osa uriini miRNA-st. Mis tahes spetsiifilised podotsüütides täheldatud miRNA muutused ei pruugi olla uriinis kergesti eristatavad, samas kui mis tahes muutused uriini miRNA tasemetes võivad kajastada patoloogilisi muutusi teistes neerurakkude tüüpides [75, 76]. Näiteks kuigi miR-155, miR-663 ja miR-1915 tase uriinis on FGS-i või minimaalse muutusega nefropaatiaga (MCN) patsientide ja tervete kontrollide puhul oluliselt erinev [77] pole tõestatud, et miR-155, miR-663 või miR-1915 pärinevad spetsiifiliselt podotsüütidest. Olulised korrelatsioonid paljude miRNA tasemete ja torukujuliste vigastuste markerite, sealhulgas N-atsetüül- -D-glükosaminidaasi (NAG) ja neerukahjustuse molekuli-1 (KIM-1) tasemed uriinis [66], samuti on teatatud. Teisisõnu on raske kinnitada nende spetsiifilisust podotsüütide vigastuse markeritena. Märkimisväärne erand sellest reeglist on miR{15}}a. Hiljutine uuring näitas, et uriini eksosomaalse miR-26a tase oli luupusnefriidi korral oluliselt kõrgem kui tervel kontrollil, miR-26a oli normaalse C57BL/6 hiire glomerulites kõige rikkalikumalt ekspresseeritud miRNA ja miR-26a vastutas podotsüütide diferentseerumise ja tsütoskeleti terviklikkuse reguleerimise eest [78]. Sellegipoolest tuleb kinnitada uriini miR{22}a roll podotsüütide-spetsiifilise markerina.

2.7. Ringlevad podotsüütide markerid

Paljusid ülalnimetatud podotsüütide markereid, eriti podotsüütide-spetsiifilisi valgu sihtmärke ja mRNA-sid, saab mõõta süsteemses vereringes [56, 79, 80] ja nende plasmataset biomarkerina.neerudhaigusedon uuritud [55,81–84]. Täielik arutelu sellel teemal jääb aga käesoleva ülevaate raamidest välja. Ülalnimetatud metoodikate peamised eelised ja puudused on kokku võetud tabelis 2.

3. Kuseteede podotsüütide markerid spetsiifiliste neeruhaiguste korral

3.1. Diabeetiline neeruhaigus

Diabeetikneerudhaigus(DKD) on kroonilise neeruhaiguse kõige levinum põhjus(Ckroonilineneerudhaigus)üle maailma ning mitmesuguste kasutamise kohta on palju kirjandustkuseteedepodotsüütidemarkerid DKD diagnoosimiseks ja jälgimiseks. Näiteks Jim jt [14] teatasid, et nefriini tase uriinis oli tuvastatav kõigil albuminuuriaga DKD patsientidel, kuid ainult 54 protsendil albuminuuriata patsientidel. Uriini nefriini tase korreleerus albuminuuria tasemega ja pöördvõrdeline neerufunktsiooniga [14]. Ma jt teatasid, et DKD korral suurenes uriini angiopoetiinitaoline -4 (Angptl4) tase [85]. Uriini podokalüksiini tase tõusis diabeediga patsientidel enne mikroalbuminuuria tekkimist ja oli tõenäoliselt tundlikum kui mikroalbuminuuria DKD varajaseks avastamiseks [86]. Väljakujunenud DKD korral korreleerus uriini podokalüksiini tase positiivselt HbA1c taseme ja albumiini ja kreatiniini suhtega [87,88]. Kokkuvõttes näitavad saadaolevad tulemused, et mitme podotsüütide-spetsiifilise sihtmärgi uriinisisaldus on DKD varajased näitajad ja uriini podokalüksiini tase on selles osas kõige lootustandvam marker [54].

Samuti on uuritud podotsüütide-spetsiifilise sihtmärgi tasemeid uriini üksikutes komponentides.KuseteedepodotsüütideVoolutsütomeetriaga määratud mikroosakeste tase oli I tüüpi diabeedi korral kõrgem kui tervetel kontrollidel ja tase tõusis veelgi hüperglükeemilise klambriga [89]. Uriini eksosomaalne WT-1 tase korreleerus proteinuuria raskusastme, neerufunktsiooni, glomerulaarkahjustuse ja neerufunktsiooni languse määraga diabeetikutel [58,90]. Teises uuringus oli glükogeeni süntaasi kinaasi (GSK) 3 tase uriiniga kooritud rakkudes täpsem kui albuminuuria progresseeruva neerukahjustusega ja ilma selleta diabeediga patsientide eristamisel [91]. Selle analüüsi metoodika on aga kohmakas ja ei pruugi olla tavapärases kliinilises praktikas rakendatav.

Mis puudutab podotsüütide-spetsiifilisi mRNA markereid uriinis, siis näitas eelmine uuring, et nefriini, podotsiini, sünaptopodiini, WT-1 ja -aktiini-4 mRNA tase uriinis oli kõrgem DKD-ga patsientidel kui tavalistel kontrollidel. [92]. Erineva raskusastmega albuminuuriaga diabeedihaigetel esines oluline erinevus nefriini, podotsiini, -aktiniini-4 ja CD2--seotud valgu mRNA-s uriinis [93]. Nefriini, podotsiini, sünaptopodiini, WT-1 ja -aktiini-4 mRNA tase uriinis korreleerus samutikuseteedepodotsüütidearv, nefriini tase uriinis, albuminuuria ja neerukahjustuse raskusaste [93]. Hiljuti leiti, et uriini podotsüütide-spetsiifilised mRNA tasemed eelnesid II tüüpi diabeediga patsientidel mikroalbuminuuria tekkele [94] ning uriini podotsüütide mRNA ja kreatiniini suhe, mis on podotsüütide eraldumise marker, korreleerus oluliselt järgneva neerufunktsiooni langus [94]. Lisaks oli uriini sünaptopodiini mRNA tase madalam pärast 12-nädalast angiotensiini konverteeriva ensüümi (ACE) inhibiitori ja angiotensiini retseptori blokaatori (ARB) kombinatsioonravi võrreldes AKE inhibiitori monoteraapiaga [95]. Kokkuvõttes näitavad olemasolevad tõendid, et podotsüütide-spetsiifilise mRNA taseme mõõtmine uriinis võib olla väärtuslik riskide stratifitseerimiseks ja terapeutilise vastuse jälgimiseks DKD korral.

3.2. Minimaalne muutus nefropaatias ja fokaalses glomeruloskleroosis

MCN-i ja FGS-i peetakse sageli podotsüütide haigusteks ja nende rollikskuseteedepodotsüütidesihtmärke on testitud. Zhou et al. [96] teatasid, et uriini eksosomaalne WT-1 tase, mõõdetuna immunoblotanalüüsi meetodil, oli FGS-iga patsientidel oluliselt kõrgem kui steroiditundliku nefrootilise sündroomiga (SSNS) või tervetel vabatahtlikel. Uriini eksosomaalne WT-1 tase langes oluliselt pärast kortikosteroidravi ja FGS-i või SSNS-i remissiooni [96]. Teises uuringus oli tavapärase ELISA testiga mõõdetud nefriini tase uriinis FGS-ga täiskasvanutel oluliselt kõrgem kui teiste nefrootilise sündroomi põhjuste puhul [97].

Samuti on uuritud podotsüütide-spetsiifilise mRNA taset uriinis. Varajane uuring näitas, et uriini nefriini ja podotsiini mRNA tasemed ei erinenud oluliselt MCN-ga patsientide ja tervete vabatahtlike vahel ning nende tase oli oluliselt madalam kui DKD-ga patsientidel [98]. Hilisem uuring näitas, et uriini nefriini ja podotsiini mRNA tase oli MCN-ga patsientidel madalam kui FGS-i või tervete kontrollide puhul ning vähenemise ulatus korreleerus proteinuuria astmega [99]. Selles uuringus leiti, et uriini sünaptopodiini mRNA tasemed korreleeruvad FGS-patsientide järgneva neerufunktsiooni languse määraga [99], mis viitab sellele, et uriinis võib tuvastada FGS podotsüütide kvalitatiivset muutust.

3.3. Membraanne nefropaatia

Kuigi membranoosse nefropaatia (MGN) peamine patoloogiline muutus on immuunkompleksi ladestumine subepiteliaalsesse ruumi, mille tulemuseks on glomerulaarfiltratsiooni barjääri muutumine, on uuringudkuseteedepodotsüütideMGN-i markereid on vähe. Nefriini, podotsiini ja sünaptopodiini uriinisetete mRNA tase oli MGN-i korral oluliselt kõrgem, kuid tasemed eristasid MGN-i usaldusväärselt teistest nefrootilise sündroomi põhjustest [98]. Hiljuti teatasid Lu jt [100], et arvkuseteedepodotsüütide-st pärinevate mikroosakeste arv vähenes samaaegselt kliiniliste parameetrite paranemisega pärast immunosupressiivset ravi, mis viitab rollile MGN jälgimisel.

3.4. IgA nefropaatia

Kuigi immunoglobuliin A nefropaatia (IgAN) on peamiselt mesangiaalne haigus, onkuseteedepodotsüütidebiomarkerina arvestamist on uuritud. Nimelt leidsid Shen jt [101], et IgAN-i patsientidel suurenes podotsüütide kadu uriinis, vähenes podotsüütide arv glomerulites ja neerubiopsia proovides oli jalaprotsesside sulandumine raskem. Selles uuringus tuvastati uriini podotsüüdid podokalüksiini kaudse immunofluorestsentsuuringuga jakuseteedepodotsüütidearv korreleerus seerumi kreatiniini ja proteinuuriaga [101]. Järgnev uuring näitas, et segmentaalse skleroosiga IgAN-i patsientidel oli uriini podotsüütide arv suurem kui segmentaalse skleroosiga patsientidel [102]. Hara jt [103] näitasid IgAN-i või Henoch-Sch¨ online-purpura nefriidiga lastel, et kumulatiivne podotsüütide kadu uriinis korreleerus histoloogilise kahjustuse raskusastmega ja glomeruloskleroosi astmega neerubiopsias ning patsientidel, kellel oli püsiv haigus.kuseteedepodotsüütideeritumisel oli histoloogiline kiire progresseerumine.

Uuringud uriinis leiduvate podotsüütide-spetsiifiliste molekulide kui IgAN-i biomarkerite kohta on killustatud ja mittetäielikud. Uriini podokalüksiini tase korreleerus oluliselt täiskasvanud IgAN-i ägedate ekstrakapillaaride kahjustuste raskusastmega [102]. On teatatud, et uriini podotsiini mRNA tase peegeldab aktiivse glomerulaarkahjustuse raskust neeru biopsias ja annab prognostilist teavet, mis täiendab proteinuuria taset [104]. Kuna IgAN on kõige levinum primaarne glomerulonefriit kogu maailmas, on selles valdkonnas kindlasti vaja rohkem uuringuid.

Lisaks IgAN-ile on rollkuseteedepodotsüütidemarkereid on uuritud teiste mesangiaalsete glomerulopaatiate puhul. Näiteks,kuseteedepodotsüütidekadu on märgatavalt suurenenud nii difuusse mesangiaalse skleroosi päriliku kui omandatud vormide korral [102]. Sellegipoolest on seda piirkonda vähem uuritud, tõenäoliselt selle patoloogilise klassifikatsiooni heterogeensuse tõttu.

3.5. Lupus nefriit

Kuseteedepodotsüütideluupusnefriidi korral on uuritud. Eelmine aruanne näitas, et major ofkuseteedepodotsüüdidaktiivse luupusnefriidiga patsientidel olid elujõulised, kuid dediferentseerunud ja apoptootiliste podotsüütide osakaal uriinis oli oluliselt väiksem kui tervetel kontrollidel [105]. Selles uuringus tõusid uriini podokalüksiini, sünaptopodiini, podotsiini, nefriini ja WT-1 tasemed (mõõdetuna Western blot analüüsiga) süsteemse luupuse, eriti aktiivse luupuse nefriidi korral, ning nende tasemed korreleerusid oluliselt proteinuuria raskusastmega. ja histoloogiline aktiivsus [105]. Hilisemas uuringus teatati veel, et nefriini, podotsiini ja sünaptopodiini mRNA tase uriinis oli aktiivse luupusnefriidiga patsientidel oluliselt kõrgem kui vaikses luupuses [106]. Täpsemalt, uriini nefriini mRNA tase korreleerus proteinuuria ja süsteemse haiguse aktiivsusega, kuid mitte luupusnefriidi histoloogilise klassiga, samas kui uriini podotsiini mRNA tase oli järgneva neerufunktsiooni languse sõltumatu ennustaja [107].

3.6. Neutrofiilide vastaste tsütoplasmaatiliste antikehadega (ANCA) seotud vaskuliit

Kuigi podotsüüdid ei ole ANCA-ga seotud glomerulonefriidi neerukahjustuse peamine sihtmärk, on intraglomerulaarne podotsüütide tihedus iseloomulikult vähenenud [108]. Zou jt [108] leidsid, et podotsüütide uriinist eraldumise määr ennustab järgnevat neerufunktsiooni kaotust ANCA-ga seotud glomerulonefriidi korral ning Minakawa jt [109] teatasid, et uriini podotsiini ja nefriini mRNA suhe, mis on intraglomerulaarse podotsüütide asendusmarker stress, mis on korrelatsioonis poolkuu moodustumise protsendiga [109]. Viimases uuringus patsientidel, kellel oli kõrgekuseteedepodotsüütide-st tuletatud mRNA-l oli soodne neerutulemus, arvatavasti parema glomerulaarse podotsüütide reservi ja pöörduvuse potentsiaali tõttu [109].

3.7. Muu krooniline neeruhaigus

Kasulikkuskuseteedepodotsüütidemarkerid konkreetsetesneerudhaigusedon kokku võetud tabelis 3. Mitmeid podotsüütide-spetsiifilisi markereid uriinis on uuritud ka kroonilise neeruhaiguse üldiste markeritena(Ckroonilineneerudhaigus). Näiteks,kuseteedepodotsüütide- saadud ekstratsellulaarsete mikrovesiikulite arv, nagu mõõdeti voolutsütomeetriaga, suurenes oluliselt neerufunktsiooni kahjustusega hüpertensiivsetel patsientidel kui neil, kellel ei olnud neerukahjustust [110]. Uriini sünaptopodiini tase, mis on määratud Western blot analüüsiga, korreleerus neerufunktsiooniga nii diabeetilise kui ka mittediabeetilise kroonilise neeruhaiguse korral(Ckroonilineneerudhaigus), olenemata albuminuuria astmest, mis viitab sellele, et uriini sünaptopodiin on podotsüütide kahjustuse üldine marker [110]. Podotsüüdispetsiifiliste uriini mRNA sihtmärkide paneeli hulgas oli uriini ajust pärineva neurotroofse faktori (BDNF) mRNA tase parim korrelatsioon kuseteede neerukahjustuse molekuliga -1 (KIM-1), mis on üldine marker. neerukahjustusest [111]. MiRNA sihtmärkide puhul suurenes uriini eksosomaalne miR-21 tase nii podotsüütide vigastuse kui ka kroonilise neeruhaiguse loommudelites(Ckroonilineneerudhaigus)patsientidel [112], kuid miR-21 rakulist päritolu selles uuringus ei määratud.

Siiski on oluline märkida, et mitte kõikneerudhaigusedon podotsüütide vigastus. Kasv sissekuseteedepodotsüütidekaotust on teatatud mitmesuguste glomerulaarhaiguste korral, kuid mitte autosomaalse domineeriva polütsüstilise korralneerudhaigus(ADPKD) [113]. Veelgi olulisem on see, et podotsütuuria ja proteinuuria vaheline seos varieerus erinevate glomerulaarhaiguste vahel märkimisväärselt, mis viitab sellele, etkuseteedepodotsüütidemarkereid tuleks paremini pidada haigusspetsiifilisteks [113].

4. Järeldus

Podotsüütide vigastus mängib paljude patogeneesis ja progresseerumises olulist rollineerudhaigused. Podotsüüdist pärinevatel raku fragmentidel ja podotsüütide spetsiifilistel molekulaarsetel sihtmärkidel uriinis on suur potentsiaal välja töötada biomarkeritena, et diagnoosida ja jälgidaneerudhaigused. Biomarkerite väljatöötamise protsess hõlmab spetsiifiliste markerite identifitseerimist, mõõtmismetoodika määramist ja kliinilise konteksti otsustamist rakenduse kohta (joonis 2). Tänu meie arusaamadele podotsüütide bioloogiast ja uute tehnoloogiate kättesaadavusest,kuseteedepodotsüütideEeldatakse, et markeritel on laienev kasutusala nii uute sihtmärkide tuvastamise kui ka nende kvantifitseerimise uudsete meetodite väljatöötamise tõttu. Vastutasuks võib uriini podotsüütide markerite valideerimine valgustada meie arusaama patofüsioloogiast.neerudhaigused. Podotsüüdi ja erinevate podotsüütide spetsiifiliste markerite kvantifitseerimiseks uriinis on palju meetodeid. Järgmisel kümnendil peaksid teadusuuringud keskenduma laborimeetodite standardiseerimisele, võrdlemisele ja automatiseerimisele, samuti nende lisaväärtuse määratlemisele tavapäraste kliiniliste testide jaoks.

Joonis 2. Aspektid, mida tuleb arvesse võtta uriini podotsüütidega seotud biomarkerite väljatöötamiselneerudhaigused. (GCBM, glomerulaarne kapillaaride basaalmembraan; CKD,kroonilineneerudhaigus; DKD, diabeetikneerudhaigus; FGS, fokaalne glomeruloskleroos).

Konkureerivate huvide deklaratsioon

Autorid kinnitavad, et neil ei ole teadaolevaid konkureerivaid finantshuve ega isiklikke suhteid, mis oleksid võinud mõjutada käesolevas artiklis käsitletud tööd.

Tunnustus

Seda uuringut toetasid Richard Yu Hiina ülikooli Hongkongi (CUHK) PD uurimisfond ja CUHK uurimiskontod 6905134 ja 8601286. Rahastajatel ei olnud mingit rolli uuringu kavandamisel, andmete kogumisel ja analüüsimisel, avaldamise otsustamisel ega käsikirja ettevalmistamisel. Autorid ei deklareeri muid huvide konflikte. Käesolevas artiklis esitatud tulemusi ei ole varem tervikuna ega osaliselt avaldatud.

Parandage neeruhaigust{0}}Cistanche akteosiidi

Alates: "Uriini podotsüütide markerid sisseneerudhaigused' kõrvalLingfeng Zeng jt

---Clinica Chimica Acta 523 (2021) 315–324