Adenoviiruse kapsiidide sisenemisjärgse sorteerimise mõistmine; Võimalus muuta vaktsiini vektori omadusi, 1. osa

Abstraktne:

Adenoviiruse vektoripõhised geneetilised vaktsiinid on kujunenud võimsaks strateegiaks SARS-CoV{2}} tervisekriisi vastu. See edu ei ole ootamatu, sest adenoviirused ühendavad palju geneetilise vaktsiini soovitavaid omadusi. Need on väga immunogeensed ning neil on madal ja hästi iseloomustatud patogeenne profiil, mis on seotud tehnoloogilise lähenemisega. Pidevad jõupingutused adenoviirus-vaktsiini vektorite parandamiseks hõlmavad haruldaste serotüüpide ja mitte-inimese adenoviiruste kasutamist. Selles ülevaates keskendume viiruse kapsiidile ja sellele, kuidas genotüüpide valik mõjutab omastamist ja sellele järgnevat subtsellulaarset sorteerimist. Kirjeldame, kuidas kapsiidi omaduste, näiteks stabiilsuse mõistmine sisenemisprotsessi ajal võib muuta sisenevate osakeste saatust ja kuidas see muutub immuunsuse tulemuste erinevuseks. Arutame üksikasjalikult, kuidas membraani lüütilise kapsiidvalgu VI muteerimine mõjutab C-tüüpi viiruste sisenemisjärgset sorteerimist ja arutleme lühidalt, kas sellistel lähenemisviisidel võib olla laiem mõju vaktsiini ja / või vektori väljatöötamisele.

Klõpsake puhast tsistanšitoode

For more information:1950477648nn@gmail.com

1. Sissejuhatus

Erinevalt bakteriaalsetest infektsioonidest, mida saab ravida antibiootikumidega, on viirusinfektsioonid endiselt ohuks tervisele, kuna viirusevastaseid ravimeid on väga vähe. Seetõttu on vaktsineerimine ainus laialdaselt kasutatav strateegia inimeste (ja loomade) populatsioonide kaitsmiseks viirusnakkuste eest.

Kuni viimase ajani käsitleti viirusnakkuste vastu vaktsineerimist peamiselt lastehaiguste ennetamise kontekstis või iga-aastase gripi ennetamise "gripisüstina". SARS-CoV{1}} tervisekriisi puhkemisega 2020. aastal on vaktsineerimine taas avalikkuse tähelepanu keskpunktis, kuna seda peetakse praegu ainsaks jätkusuutlikuks väljapääsuks sellest pandeemiast. Selles kontekstis on adenoviiruse (Ad) vektoripõhised vaktsiinid kujunenud üheks kahest peamisest edukast vaktsineerimisstrateegiast. Pärast erakorralise heakskiidu saamist süstitakse Ad-vaktsiine nüüd suurele osale maakera elanikkonnast, et luua enneolematu planeedi immuunsus SARS-CoV vastu{5}}.

Adenoviiruse vektorvaktsiine ei kasutatud enne COVID{0}} puhangut laialdaselt, kuid nende edu pole ootamatu. Viirused on üldiselt väga sobivad vaktsiiniplatvormid. Need on bioloogiliselt optimeeritud ja kohandatud nukleiinhapete transpordiks ning kutsuvad esile immuunvastuse. Adenoviirustel on palju omadusi, mis muudavad need eriti ideaalseteks vaktsiinikandidaatideks. Neil on madal ja hästi iseloomustatud patogeenne profiil koos kõrge nakkavusega. Need on tehnoloogiliselt ligipääsetavad ja neid on laialdaselt kasutatud vektoriseerimiseks. Nende kõrge tootlikkus ja stabiilsus võimaldavad tööstuslikku tootmist hea tootmistava (GMP) tingimustes ning pakuvad praktilisi omadusi (st ladustamist) piirkondlikuks turustamiseks väiksemate kuludega [1]. Lisaks on Ad-rakkude kohaletoimetamine antigeeni esitlevatesse rakkudesse tõhus ja nad kutsuvad loomulikult esile kaasasündinud immuunvastuse, mis toimib adjuvandina, et suurendada vaktsineerimise edu [2,3].

Reklaami bioloogia mõistmine on olnud reklaamipõhiste (vaktsiini) vektorite väljatöötamisel ülioluline. Näiteks muude kui inimeste või haruldaste Ad-serotüüpide kasutamine mõnes praegu turustatavas SARS-CoV-2 vaktsiinis valiti teadlikult selleks, et takistada olemasoleva vektori immuunsuse vähendamist vaktsiini tõhusust. Viiruse geenidega kustutatud vektorite kasutamine tagab parema vektori ohutuse. Siiski on endiselt palju viiruse elutsükli aspekte, mida ei ole Ad-põhiste vaktsiinivektorite väljatöötamisel arvesse võetud ning teadmised haruldaste või mitteinimlike genotüüpide kohta, sealhulgas praegu SARS-CoV{8}} vaktsiinidena kasutatavate kohta, on piiratud. . Selle ülevaatega soovime tõsta teadlikkust võimalikest muudatustest, mida saaks ära kasutada meditsiinilistel eesmärkidel, sealhulgas vaktsineerimiseks, reklaamivektorite väljatöötamisel.

Keskendume viiruse kapsiidile ja sellele, kuidas genotüüpide valik mõjutab omastamist ja sellele järgnevat subtsellulaarset sorteerimist. Kirjeldame, kuidas kapsiidi omaduste, näiteks stabiilsuse mõistmine sisenemisprotsessi ajal võib muuta sisenevate osakeste saatust ja milliseid erinevaid immuunsuse tulemusi täheldatakse. Näitena selle kohta, kuidas kapsiidi stabiilsust ja saatust saab muuta, arutame üksikasjalikult, kuidas membraanilüütilise kapsiidvalgu VI muteerimine mõjutab C-tüüpi viirusi. Lõpuks arutleme lühidalt selle üle, kas sellistel lähenemisviisidel on potentsiaali vaktsiinide ja/või vektorite arendamiseks ära kasutada.

1.1. Adenoviirused moodustavad mitmekesise nakkuslike patogeenide perekonna

Ajalooliselt eraldati Ad esmakordselt 1953. aastal hingamisteede infektsioonidega patsientide adenoididest [4] ja varsti pärast seda võeti termin "adenoviirus" üldiselt kasutusele [5]. Adenoviridae perekonnal on rohkem kui 120 liiget, mis jagunevad viide perekonda – olenevalt sellest, kas nad nakatavad imetajaid (nt Mastadenoviridae), linde (nt Aviadenoviridae), roomajaid (nt Atadenoviridae), kahepaikseid (Siadenoviridae) või kalu (Ichtadenoviridae). ) [6,7]. Perekonda Mastadenoviridae kuulub ka rohkem kui 70 tüüpi inimese Ads [8,9], mis on vastavalt nende morfoloogilistele, bioloogilistele ja füüsikalis-keemilistele omadustele liigitatud seitsmesse liiki (A–G), nagu on loetletud tabelis 1 [10, 11].

Lisaks võivad Ads ka spontaanselt rekombineeruda, luues seeläbi uusi liike [12], nagu juhtus AdE4 puhul, mis on ainus inimliigi E viirus ja mis on tõenäoliselt tekkinud inimliigi B ja ahvi Ad vahelisest rekombinatsioonist [13]. ]. Kuigi inimeste nakkused mitteinimliku Ads on loomulikult haruldased, ei ole need võimatud [14,15]. Erinevate inimestest mittekuuluvate reklaamide võime inimrakke nakatada (või transdutseerida) muudab need atraktiivseks (vaktsiini) vektoriplatvormiks. Nende hulgas on reklaame, mis pärinevad šimpansidest [16–18], gorilladest [19], lammastest [20], lehmadest [21], koertest [21, 22] või uue maailma ahvist [23].

Adenoviirusnakkused võivad sõltuvalt nende raku- või koetropismist põhjustada erinevaid patoloogiaid, sealhulgas hingamisteede, silma, kuseteede või seedetrakti haigused (vt tabel 1). Kudede tropism on sageli erinevate reklaamide erineva retseptori kasutamise tulemus ja see võib olla seotud ka osakeste sisemise stabiilsusega [24]. Enamik Adsi infektsioonidest on immuunkompetentse peremeesorganismi puhul kerged või asümptomaatilised. Primaarsed Ad-nakkused esinevad enamasti lapsepõlves ja tagavad tugeva kaitsva immuunsuse. Seevastu immuunsupressiooniga inimestel võivad reklaamid põhjustada kontrollimatuid, raskeid ja eluohtlikke süsteemseid infektsioone, mis põhjustavad tõsist raku toksilisust, mis võib põhjustada liigset põletikku ja mitme organi puudulikkust, mis põhjustab suurt suremust [12].

Kõige paremini uuritud inimeste reklaamid on C-tüüpi 2. ja 5. tüüpi viirused, mida leidub peamiselt ülemiste hingamisteede ja seedetrakti infektsioonidega patsientidel [25] ja mis on käesoleva ülevaate põhirõhk. Adenoviirused võivad põhjustada juhuslikke haiguspuhanguid, nagu B-tüüpi viirused, mis põhjustavad kopsupõletikku (nt Ad3, 7 ja 14) immuunkompetentsete isikute seas [26] või Ad40/41 liikidel F ja Ad12, 18 ja 31 liikidel A , mis nakatavad seedetrakti (vaadatud [26, 27]). Liigi D viirused on väga mitmekesine rühm, mis on altid rekombinatsioonile ning on peamine silmainfektsioonide põhjus [28].

1.2. Adenoviiruse kapsiidid on metastabiilsed struktuurid

Vaatamata nende mitmekesisusele järgivad kõik reklaamid sarnast struktuuri- ja organisatsiooniraamistikku. Adenoviirused on ümbriseta DNA viirused, mis sisaldavad suhteliselt suurt, 26–45 kb pikkust lineaarset kaheahelalist DNA genoomi [29–31]. Kapsiidi läbimõõt on ~ 70–90 nm ja see on ikosaeedri kuju, millel on 20 tahku ja 12 tippu [32]. Kapsiid koosneb kolmest peamisest struktuurvalgust (hekson, penton ja kiud) ja mitmetest väiksematest tsemendivalkudest (st IIIa, VI, VIII ja IX liigi C viirustes), mis stabiliseerivad struktuuri. Mitme Ad-kapsiidi kõrge eraldusvõimega struktuur on saadud krüoelektronmikroskoopia ja röntgenkristallograafia abil [24,33–36]. Ikosaeedrilisel kapsiidil on pseudo-T25 struktuur 720 eksoniga, mis on kokku pandud erinevatesse trimeeridesse sõltuvalt nende asukohast kapsiidis. Kapsiidi 20 tahku koosnevad üheksast kokkupandud eksonist (nn GON üheksa rühma jaoks), samas kui 12 tipus on eksonid kokku pandud GOS-is (kuue rühma jaoks) (lisateabe saamiseks vt [37,38] ). Pentameerne pentoni alus sisestatakse 12 tippu ja see on väljaulatuva trimeerse kiu aluseks [39, 40]. Peamiste ja väiksemate kapsiidivalkude vaheline interaktsioon stabiliseerib kapsiidi, peamiselt interaktsiooni kaudu kuusnurkadega.

Näiteks GON-i stabiliseerib IX [41]; IX ja IIIa stabiliseeritakse nende interaktsiooni kaudu VIII-ga, mis seob need vastavalt GOS-i ja GON-iga [37]. VIII molekulid kirjeldavad GON-i ja aitavad stabiliseerida kuusnurki kapsiidi siseküljel. Valk VI stabiliseerib ka heksonit, sidudes heksontrimeeri keskse õõnsuse, mis on avatud viiruse sisemisele valendikule [42–44].

Kapsiid ümbritseb ja kaitseb viiruse tuuma, mis koosneb viiruse genoomist, viiruse tuuma valkudest (st V, VII, Mu liigi C viiruste puhul) ja terminaalsest valgust (TP), mis on kovalentselt seotud iga 5' otsaga. Ad genoom. Väikesed kapsiidivalgud interakteeruvad tuumavalkudega, luues sideme kapsiidi ja genoomi vahel; nende ruumiline korraldus tuumvalkude hulgas on siiski halvasti mõistetav. On näidatud, et V säilitab DNA kapsiidi sees, toimides koos VI-ga (kapsiidi pool) ja VII-ga (genoomi pool) [45–47] ning tõenäoliselt aitab kaasa genoomi vabanemisele tuumapooris [48]. VII on peamine kapsiidivalk, mis on seotud viiruse DNA-ga ja soodustab selle kondenseerumist kapsiidi sees [49–51]. VII kaitseb ka viiruse genoomi rakuliste tegurite kaudu immuuntuvastuse eest [50,52–54]. Huvitav on see, et kapsiidi valk IX ja valk V esinevad ainult Mastadenoviridae [55, 56] ja viiruse kapsiidid saab toota ilma IX [57] või valgu VII [58]ta, mis näitab kapsiidi struktuuri mõningast paindlikkust.

Inimese reklaamide genoom kodeerib ~45 valku (sealhulgas struktuurseid valke), mis on organiseeritud ajaliselt reguleeritud transkriptsiooniühikuteks [59]. Transkriptsioonifaktor E1A on esimene ekspresseeritud valk ja see on vajalik viiruse geeniekspressiooni algatamiseks [60]. Genoomis on ka 5' kapseldamise järjestus ja igas otsas ümberpööratud terminaalsed kordused (ITR), mis on replikatsiooniks vajalikud [59, 61–64]. Adenoviirused kodeerivad adenoviiruse proteaasi (AVP), mis on pakitud osakesesse ja töötleb mitmeid valke (st IIIa, VI, VII, VIII, µ, TP ja 52,55K liigi C viirustes) [65–67]. See etapp on vajalik küpsete nakkuslike osakeste moodustumiseks ja indutseerib metastabiilsete (st vähem stabiilsete) kapsiidide moodustumist, mis on ettevalmistatud kapsiidi demonteerimiseks rakkude kinnitumisel ja sisenemisel [68, 69].

Inimeste reklaamide struktuuris on ka liigispetsiifilisi erinevusi, nt kiu pikkuses ja paindlikkuses, mis mõjutab otseselt retseptoriga seondumist [70–72]. Erinevusi võib täheldada ka pentoni kokkupanekul. Liigi B viiruste pentonid võivad moodustada pentonitevahelisi kontakte, mille tulemuseks on alternatiivsed ja vähem stabiilsed viirusetaolised osakesed, millel puuduvad genoomid ja mõnikord ka kiududeta. Selliseid osakesi nimetatakse dodekaeedriteks ja neid uuritakse plasmiidide või peptiidide rakkude ülekandmiseks alternatiivina Ad-vektoritele. Dodekaeedrid paljastavad paremini enamiku Ad-liikide pentonis esineva RGD lühikese peptiidi motiivi, mis on vajalik sihtrakkude sidumiseks [73, 74]. Kapsiidi stabiilsuse erinevused, nagu allpool kirjeldatud, võivad olla olulised omadused, mis määravad reklaamiosakeste saatuse.

1.3. Adenoviirused järgivad lüütilist elutsüklit

Reklaami nakatumise tsüklit on mujal põhjalikult läbi vaadatud [75–77]. Siin keskendume lühidalt elutsükli sisenemisosale ja, kui pole öeldud teisiti, viitame liigi C viirustele, mida on kõige paremini uuritud (joonis 1). Adenoviirused kasutavad peamise raku kinnitusmolekulina kapsiidkiudu. Enamik reklaame, sealhulgas liigi C viirused, kasutavad sihtrakkude sidumiseks koksakiviirust ja Ad-retseptorit (CAR) [78–81]. Seevastu mõned B-tüüpi viirused seovad eelistatavalt CD46 retseptorit [82] või desmogleiin 2 [83] ja mõned liigi D viirused interakteeruvad siaalhapetega [84, 85] või otseselt v-integriinidega (vt tabel 1). 86].

Seega on kiudude vahetamine liikide vahel atraktiivne strateegia tropismi muutmiseks [87–89]. Kiudmolekuli esmane roll on vahendada füüsilist seost sihtrakkudega, millele järgneb teine ​​interaktsioon pentoni ja integriinide, nagu v 5, vahel [90]. Seda interaktsiooni vahendab RGD peptiidi motiiv pentoni järjestuses [91]. Selle motiivi puudumine, nagu ka liigi F viiruste puhul, on seotud vähem tõhusa raku sisenemisega [92]. Integriini sidumise tulemuseks on integriinide rühmitamine rakupinnal [93], mis käivitab signaalikaskaadi, mis viib aktiini tsütoskeleti [94, 95] ümberkorraldamiseni ja endotsüütide omastamiseni klatriini vahendatud endotsütoosi või mikropinotsütoosi kaudu [96, 97]. RGD sidumine võib ka kapsiidi destabiliseerida [98], vähendades kontakte pentoni ja heksoni vahel, aidates kapsiidil katmata [99]. Selle tulemusena kaotavad Ad osakesed oma kiudaineid ja endosoomi seest võib leida dissotsieerunud heksoni ja pentooni [100–102]. Endosoom on dünaamiline organell, mis on valmis küpsema lagunevateks lüsosoomideks, ja reklaamid peavad kiiresti tsütosooli pääsema. Endosoomi hapestumine võib kiirendada põgenemisprotsessi, nõrgendades veelgi kapsiidi [100, 103]. Endosoomi läbitungimise protsess sõltub sisemise kapsiidvalgu VI vabanemisest [103, 104].

Vabanenud VI-d iseloomustab N-otsa amfipaatne spiraal, mis seondub endosoomi sisemise voldikuga ja kutsub esile positiivse membraani kõveruse, mille tulemuseks on lokaalselt piiratud membraani rebend [75,103,105,106]. Rakud reageerivad viiruse poolt indutseeritud membraani purunemisele ja aktiveerivad kahjustatud organelli puhastamiseks lokaliseeritud autofagia reaktsiooni [107–109]. Lagunemise vältimiseks peatavad Ads autofagia lühikese PPxY peptiidi motiivi kaudu valgu VI-s, kuni osake on saavutanud tsütosooli ohutuse [104, 108]. Näidati, et C-liigi viirused põgenesid varajastest endosoomidest [110]. Teised liigid, sealhulgas A, B ja D, liiguvad esmalt lüsosoomi, enne kui pääsevad tsütosooli [111–113], mis võib mõjutada nende viiruste poolt käivitatud immuunsüsteemi aktivatsiooni [114].

Kui reklaamid on jõudnud tsütosooli, suhtlevad nad düneiinmootoritega ja kasutavad mikrotuubulite organiseerimiskeskusesse jõudmiseks retrograadset transporti mööda mikrotuubuleid [115–117]. Motoorset sidumist vahendab tõenäoliselt hekson [115] ja see võib nõuda happelist praimimist [118]. Tuuma läheduses vahetavad kapsiidid transpordisuunda, tõenäoliselt seondudes kinesiini motoorsete valkudega ja akumuleerudes tuuma ümbrisesse [115, 117, 119, 120]. Nad dokkivad tuumapooride kompleksi külge, seejärel võetakse kapsiidid täielikult lahti ning genoomid vabastatakse ja imporditakse tuuma [51, 121–124]. Tuumasse sattudes jätkub tsükkel genoomi transkriptsiooniaktiveerimise ja kohese varajase E1A geeni ekspressiooniga, mis toimib transkriptsioonifaktorina kõigi teiste varajase transkriptsiooniühikute jaoks [60, 125–130]. Pärast replikatsiooniensüümide ekspressiooni viiruse genoomid replitseeritakse ja kogunevad replikatsioonikeskuste perifeeriasse [131].

Seejärel ekspresseeritakse hilise ekspressiooniüksuse struktuurvalke peamise hilise promootori kontrolli all [132, 133]. Hiliste geenide ekspressioon kulmineerub kõigi struktuursete valkude tootmise ja tuuma akumuleerumisega, kus need kogunevad järglasteks ja pakendavad äsja sünteesitud genoome. Järgmise põlvkonna reklaamide tuumakoost põhjustab seejärel osakeste väljapääsu ja rakkude lüüsi [42, 134–136]. Nagu eespool mainitud, järgneb kapsiidide kokkupanemisele küpsemine, st mitme kapsiidivalgu proteolüütiline lõhustamine AVP poolt, et tekitada nakkusohtlikke osakesi [66]. Selle protsessi tähtsust illustreerib temperatuuritundlik mutant Ts1, mis algselt tuvastati Ad2 mutageneesi ekraanil. Mittelubaval temperatuuril ei suuda see mutant AVP-d pakkida ja kokkupandud osakesed ei küpse, mille tulemuseks on ülistabiilsed osakesed [137]. Vastutav AVP mutatsioon sisestati geneetiliselt Ad5-sse, säilitades selle fenotüübi. Ts1 kapsiidid on endiselt võimelised kinnituma raku retseptoritele ja endotsütoosile, kuid jäävad seejärel endosoomi lõksu, kuna nad ei suuda vabastada valku VI [103, 138, 139].

2. Adenoviiruse immuuntuvastus

Adenoviirused on laialt levinud ja suur osa elanikkonnast on selle viirusega kokku puutunud, peamiselt lapsepõlves. Adenoviirused on väga immunogeensed ja iga kohtumine kutsub esile spetsiifilise Ad-vastase immuunsuse, nii kaasasündinud kui ka adaptiivse immuunsuse, mis võib kesta kogu elu. See on viirusevastases võitluses oluline ja muudab reklaamid immuunkompetentsele peremeesorganismile vähem kahjulikuks, kuid see võib olla takistuseks, kui Adsi kasutatakse vektorina vaktsiinoloogias või geeniteraapias [140,141]. Mõistmine, kuidas Ad (ja selle vektorderivaadid) aktiveerib immuunsüsteemi, võimaldab meil parandada vaktsiinide tõhusust ja ohutust. Kliinilistes uuringutes osalenud patsientide in vivo vaatlused näitasid selgelt, et reklaamipõhised vektorid võivad esile kutsuda tugeva immuunsüsteemi aktivatsiooni [142, 143], mõnikord surmavate tagajärgedega [144].

Lisaks viitavad mitmed in vitro või loommudelitel tehtud uuringud [145] viiruseosakese enda (st kapsiidi ja inkorporeeritud DNA) võtmerollile esialgse immuunvastuse aktiveerimisel. Siin keskendume lühidalt immuunvastustele, mis on seotud siseneva kapsiidiga; põhjalikuma ülevaate saamiseks vaadake varem avaldatud ülevaateid [146–149].

2.1. Adenoviirused käivitavad rakkude sisemise immuunsuse

Adsi kui vektorite väljatöötamisega sai selgeks, et Adsi poolt indutseeritud rakusisemine või kaasasündinud immuunsus on vastus sissetungivale virionile. Huvitaval kombel aktiveerivad nii replikatiivsed kui ka mittereplitseeruvad viirused (st UV-inaktiveeritud viirused, mittereplikatiivsed vektorid või tühjad kapsiidid) nakatunud rakkudes immuunvastuseid, mis näitab, et kapsiidil on selles vastuses võtmeroll [145,150–156] .

Üldiselt tajuvad rakud reklaame mitmel etapil kogu viiruse elutsükli jooksul ja need aktiveerivad kaasasündinud immuunsusradu (joonis 1). See aktiveerimine algab Ad kiudude seondumisega rakupinna retseptoriga CAR, mis aktiveerib mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaasi (MAPK) signaali, mis viib transkriptsioonifaktori NF-κB aktiveerimiseni. See päästik põhjustab põletikueelsete tsütokiinide (IL-6, IL-8) tootmist [157,158]. Kuid olenevalt Ad liigist võib teiste retseptorite kasutamine moduleerida tsütokiini ekspressioonis osaleva signaalikaskaadi tugevust [159]. Viiruse pentoni ja rakulise integriini vaheline koostoime on immuunsüsteemi aktiveerimise täiendav käivitaja. Uuring hiire makrofaagidega näitas, et see seondumine aktiveerib IL-1 ekspressiooni RGD motiivi kaudu [160]. See võib piirduda immuunrakkudega, kuna teistes rakumudelites (nt HeLa, epiteelirakkude liin) ei kinnitatud integriini/RGD interaktsiooni rolli kemokiinides ja põletikueelsete tsütokiinide tootmises [151,161,162]. See viitab sisemise protsessi enda olulisemale rollile immuunsüsteemi aktiveerimisel kui interaktsioonil integriinidega. Tõepoolest, pentoni seondumine integriiniga aktiveerib ka fosfoinositiidi 3-kinaasi (PI3K) signaaliülekande, et suurendada viiruse sisestamist [163].

Lisaks on näidatud, et PI3K aktiveerimine Ad-nakatamisel vallandab põletikueelsete tsütokiinide, nagu TNF [164], ning internaliseerimisprotsessi on kirjeldatud kui immuunsüsteemi aktiveerimiseks vajalikku [165]. Need uuringud viitavad sellele, et immuunsüsteemi aktiveerumine toimub peamiselt sisemise järgses etapis, rõhutades sisenemisjärgse sortimise tähtsust (vaadatud artiklis [166]).

Endosoomi sattudes puutuvad reklaamid kokku intraluminaalsete patogeenituvastusretseptoritega (PRR), nagu TLR9, mis on kaheahelaline DNA andur, mis on piiratud immuunrakkudega. Hiire makrofaagid võivad tajuda Ad vektoreid TLR9 kaudu, et kutsuda esile põletikueelsete tsütokiinide tootmine [167]. TLR9 oli samuti rangelt vajalik IFN / tootmiseks, kui hiire plasmatsütoidsed dendriitrakud (pDC) nakatati Ad-ga [168]. TLR9 knock-out hiiremudelites toodeti siiski IFN /, mis viitab sellele, et muudes rakkudes peale pDC toimub IFN tootmine sõltumatult TLR9 signaalimisest [168, 169].

Viiruse genoomid (või vektorgenoomid) muutuvad tuvastamiseks kättesaadavaks viiruse endosomaalse põgenemise ajal või pärast seda. Kui nad jõuavad tsütosooli, tunneb neid tsütosoolne kaheahelaline DNA andur cGAS [168, 170]. Viiruse genoomi äratundmisel soodustab cGAS transkriptsioonifaktori IRF3 fosforüülimist ja tuuma translokatsiooni, et juhtida IFN-i / ekspressiooni, kutsudes esile viirusevastase oleku. Endosomaalne läbimine nõuab viiruse poolt indutseeritud endosomaalse membraani kahjustust, et hõlbustada viirusosakeste endosomaalset väljapääsu. Membraani rebend aitab seega oluliselt kaasa immuunsüsteemi aktivatsioonile, mida rõhutab asjaolu, et defektiga Ts1 mutant ei suuda aktiveerida täielikku ja tõhusat immuunvastust [161, 162, 170, 171]. Ad membraani tungimise korral põletikulises vastuses mängib keskset rolli tanki siduv kinaas TBK1, mis arvatakse olevat osa viiruse genoomi allavoolu tsütosoolsest tuvastamisest cGAS/STING raja kaudu [168, 170].

Adenoviiruse membraanikahjustuse tulemuseks on ka katepsiin B vabanemine endolüsosomaalsest sektsioonist, põhjustades oksüdatiivset stressi, mis aktiveerib NLRP3 põletiku, mille tulemuseks on IL-1 küpsemine [114]. Liigi C viirused pääsevad varajastest endosoomidest välja, samas kui liigi B viirused liiguvad kuni hiliste endosoomideni, arvatavasti retseptori kasutuse erinevuste tõttu. Hilise endosoomi/lüsosoomi hapestumine aktiveerib tõenäolisemalt lüsosomaalseid happehüdrolaase. Mõlemad liigid kutsuvad esile põletikulise aktivatsiooni [172], kuid tõenäoliselt endosoomis viibimise aja tõttu on nende reaktsioonide ulatus erinev. Ülemaailmselt kutsuvad B-liigi viirused esile tugevama kaasasündinud ja adaptiivse immuunaktivatsiooni kui liigi C viirused [113,173,174]. See võib selgitada, miks B-liigi viirused on patogeensemad, põhjustades haiguspuhanguid immuunkompetentsetes peremeesorganismides [26]. Lisaks viitab see sellele, et rakud suudavad eristada läbitungimise sektsiooni (st endosoomi vs lüsosoomi [109]) ja kohandada immuunsuse tõhusust. Endosomaalse membraani kahjustus Ad põgenemisprotsessi ajal võib olla ka omaette ohusignaal. Nagu allpool üksikasjalikult arutatud, põhjustab membraanikahjustus intraluminaalsete glükaanide tsütosoolset kokkupuudet, mida rakk tuvastab ohusignaalidena (nagu on läbi vaadatud punktis [109]). Galektiinide poolt eksponeeritud glükaanide tuvastamine aktiveerib seejärel autofagia, käivitades viirusevastase immuunsuse teise haru [108].

2.2. Adenoviirused kutsuvad esile adaptiivse immuunvastuse ja õõnestavad viirusevastast autofagiat rakkude sisenemisel

Adsi või nende vektorite poolt esile kutsutud kaasasündinud immuunvastused muutuvad seejärel adaptiivseks immuunsuseks kemokiini sekretsiooni kaudu, mis tõmbab ligi immuunrakke (neutrofiilid, looduslikud tapjarakud ja makrofaagid) ja tugevdab tugevat antigeeni esitlust [153,154]. Adenoviirused on väga immunogeensed ja nende peamised immunogeenid on peamised kapsiidvalgud (hekson, penton ja kiud), mis käivitavad B-rakkude poolt neutraliseerivate antikehade liigispetsiifilise tootmise [175–177].

Neutraliseerivad antikehad on enamasti suunatud heksonvalgu [178–180] hüpermuutlike silmuste vastu ja kujutavad endast peamist piirangut reklaamide kasutamisel samast serotüübist pärinevate vektoritena. Sellest probleemist on mööda hiilitud, kasutades vähem serovalentseid või mitteinimlikke reklaame [181–185]. Vaatamata sellele vektorivastasele immuunsusele, kui Adsi kasutatakse vaktsiiniplatvormidena (nt kliinilistes uuringutes immuunkaitse esilekutsumiseks Ebola vastu), kutsuvad need esile siiski tugeva B-rakulise vastuse, võimaldades toota soovitud vaktsiini immunogeeni vastaseid antikehi, mis võivad kesta. kuni 6 kuud [186]. Lisaks saab olemasoleva vektori immuunsuse ületada suuremate vaktsiinivektori annustega, nagu SARS-CoV-2 vaktsiinivektori puhul, mis põhineb kõrge seroprevalentsusega AdC5 [187].

Nagu neutraliseerivate antikehade puhul, käivitavad Ad-nakkused püsiva T-rakkude immuunsuse, peamiselt CD4 pluss aktiveerimise kaudu. Seda kaitset võib endiselt leida täiskasvanutel, mis viitab pikaajalisele immuunsusele lapsepõlvest [188–190]. Lisaks on kirjeldatud ka CD8 plussi aktiveerimist, et säilitada tsütotoksiline reaktsioon [191–193]. See T-rakkude aktiveerimine ei pruugi olla serotüübispetsiifiline ja võimaldab ristkaitset erinevate Ad-alarühmade ja serotüüpide vastu [192–194].

Lisaks on Ad-ga nakatunud tüvirakke siirdatud patsientidel kirjeldatud CD4 pluss ja CD8 plus tugevat aktivatsiooni [195]. See aktiveerimine on suunatud heksonpeptiidide vastu ja viib Ad viremia kliirensini, rõhutades nii CD4 pluss kui ka CD8 pluss T-rakkude aktiveerimise olulist rolli immuunkaitses. Kuigi see T-rakkudel põhinev immuunsus on suunatud Ad osakese vastu, käivitavad Ads ka tugeva rakulise immuunsuse, mis põhineb T-raku vastusel vaktsiini antigeeni vastu, mis on pikaajalise immuunsuse eeliseks, kui kasutatakse rekombinantseid Ad vektoreid vaktsiiniplatvormidena [196, 197 ]. Oluline on see, et kliiniliste uuringute andmed on kinnitanud, et kui Ad kasutatakse vaktsiiniplatvormina (soovitava antigeeniga transgeenina), kutsub see esile nii tsütotoksilise CD8 pluss T-raku kui ka CD4 pluss T-rakkude aktivatsiooni, mis viib mäluimmuunsuse tekkeni ekspresseeritud transgeen [184,186,198–202].

T-rakkude aktiveerimine sõltub viiruse peptiidide esitlemisest läbi peamise histocompatibility kompleksi (MHC). Lühidalt, antigeeni esitlemine MHC I klassi poolt tuleneb proteasomaalsest lagunemisest ja saadud peptiidid indutseerivad CD8 pluss T-rakkude aktivatsiooni, võimaldades tsütotoksilise T-raku vastuse praimimist ja proliferatsiooni. MHC II klassi antigeeni esitlus tuleneb lüsosomaalsest proteolüüsist ja saadud peptiidid indutseerivad esitlusel CD4 pluss T-rakkude aktivatsiooni, käivitades järgneva B-rakkude aktivatsiooni [203]. Nüüd on hästi iseloomustatud, et autofagia soodustab peptiidide esitlemist MHC II klassi molekulidele [204]. Pole üllatav, et autofagia on üks vanimaid kaitsemehhanisme nakkuste vastu ja oluline osa raku repertuaarist sissetungivate patogeenide vastu, osaledes nii kaasasündinud kui ka adaptiivsetes immuunvastustes. See võib otseselt eraldada patogeeni lagunemiseks (ksenofagia) ja osaleb selle esitlemisel immuunsüsteemile [205–207]. Makroautofagia (sagedamini nimetatakse autofagiaks) on konserveerunud lüsosomaalne lagunemisrada, mis osaleb paljudes fundamentaalsetes füsioloogilistes protsessides, nagu homöostaas ning kaasasündinud ja adaptiivne immuunsus [208–210]. Autofagiat iseloomustab kahekordse membraaniga vesiikulite moodustumine, mida nimetatakse "autofagosoomiks", mis neelab lagunemisele määratud tsütoplasmaatilised lastid (st organellid, agregaadid ja patogeenid) (joonis 2). Selle protsessi käigus sulanduvad lasti sisaldavad autofagosoomid lüsosoomidega, et neid lagundada ja ringlusse võtta.

Antigeeni esitlemist autofagia kaudu on kirjeldatud nii MHC klassi I kui ka II klassi jaoks [204]. Pärast autofagia esilekutsumist neelatakse intratsellulaarsed antigeenid autofagosoomidesse, sulandudes MHC II klassi sisaldavate sektsioonidega, et varustada neid välise patogeense materjaliga (joonis 2) [211]. Autofagia rolli selles konkreetses MHC II klassi antigeeni esitluses kirjeldati esmakordselt Epstein-Barri viirusinfektsiooni puhul, kus autofagia inhibeerimine põhjustas CD4 pluss T-rakkude aktivatsiooni vähenemise [212, 213]. Praeguseks on näideteks mitu viirust, sealhulgas herpes simplex-viirus [214], gripiviirus [215] ja inimese immuunpuudulikkuse viirus tüüp 1 (HIV{11}}) [216], ning tõenäoliselt laieneb see Adsile (vt allpool). MHC II klassi esitlus on kooskõlas autofagia protsessiga, kuna see on tsütosoolne kaitsemehhanism. Autofagia osaleb ka rakuväliste antigeenide MHC II klassi ristesitluses [214]. Tõepoolest, ekstratsellulaarse ovalbumiini MHC-esitus on tõhusam, kui autofagia mehhanism (ja eriti ATG5) on funktsionaalne, ja on näidatud, et rakuvälise materjali omastamine hõlmab autofagia mittekanoonilist vormi, mida nimetatakse LC3-seotud fagotsütoosiks. LAP) [217].

Kui mõned rakuvälised antigeenid esinevad LAP-s, saab neid eksponeerida MHC II klassi esitluse kaudu [218]. Autofagia on teatud määral seotud ka MHC I klassi esitlusega, kuigi valdav enamus epitoope esitatakse mehhanismi kaudu, mis sõltub rangelt antigeeni töötlemise (TAP) kompleksiga seotud transporterist [219]. Autofagia vahendatud TAP-sõltumatut esitust on seni näidatud ainult TAP-i ammendumise tingimustes [219 220]. Kas see esitusviis on tõesti olemas, jääb vaieldavaks [221] ja seda arutatakse mujal [204 222 223].

MHC-esitluste vältimiseks pühendavad reklaamid suure osa oma genoomist, nimelt E3-piirkonnast, õõnestades MHC-esitlussüsteemi rakkudes [224–228]. Enamikus (vaktsiini)vektorites need geenid puuduvad ja hiljutised tööd näitavad, et MHC poolt antigeeni esitlemise suurendamine võib parandada Ad-vaktsiini efektiivsust [229,230]. Autofagia mängib üliolulist rolli Ad-antigeenide töötlemisel MHC II klassi esitlemiseks Ad-indutseeritud immuunsuse korral [108 229].

Montespan et al. näitasid, et reklaamid indutseerivad endosoomi läbitungimisel autofagiat ja et selles protsessis autofaagia poolt puhastatud osakeste sisenemine esitatakse immuunsüsteemile tõhusalt [108]. See tähelepanek on kooskõlas Kleini jt avaldatud uuringuga. mis näitab, et onkolüütiliste reklaamide kontekstis küpsevad viiruse antigeenid JNK-st sõltuva autofagia vormiga [229]. Autofaagial on vähi kontekstis aga kahekordne roll. Homöostaasi hoidjana piirab autofagia kasvaja teket [231], samas kui kaugelearenenud vähi korral toimib autofagia ellujäämisprotsessina, mis soodustab kasvaja kasvu [232, 233]. Seega tuleks onkolüütiliste vektorite kontekstis hoolikalt hinnata kasvajaspetsiifilisi autofagia tunnuseid.

3. Adenoviirused kui (vaktsiini)vektorid

Viiruse vektoriseerimine hõlmab selle looduslike omaduste ärakasutamist, minimeerides samal ajal sellega seotud bioloogilist riski. Nendes tingimustes on Ads suurepärased vektorkandidaadid vaktsiini väljatöötamiseks [234]. Adenoviiruse vektorid on stabiilsed, neid on lihtne toota kõrge tiitriga ja neil on suur kloonimisvõime. See võimaldab sisestada transgeeni, st ekspresseerida valitud antigeeni. Neil on lai nakkavuse spekter ja nad transdutseerivad mittejagunevaid rakke ning nende genoom ei ole integreeriv [1]. Nagu ülalpool kirjeldatud, kutsuvad nad esile ka põletikulise vastuse antigeeni esitlevates rakkudes (APC), mis täidavad adjuvantfunktsiooni, et võimendada tõhusaks vaktsineerimiseks vajalikku immuunvastust [2,3,142,235,236].

Lisaks on Ad-tuletatud vektoreid laialdaselt kasutatud prekliinilistes ja kliinilistes uuringutes, et tõestada nende ohutust [237,238]. Replikatsioonitsükli soovimatu osa kõrvaldamiseks tuleb viiruse replikatsioon pärssida, et vältida rakkude lüüsi ja viiruse paljunemist. Adenoviiruse vektori väljatöötamine algas 1990. aastate alguses platvormina paljudele terapeutilistele lähenemisviisidele, nagu geeniteraapia, onkolüütilised vektorid ja vaktsiinide väljatöötamine. Enamik varajastest vektorite arengutest olid liigi C viiruste modifitseeritud versioonid.

3.1. Adenoviiruse vektori arendamine, põlvkondlik lähenemine

Ad-vektori esimene põlvkond valmistati, kustutades viiruse genoomist E1 ja E3 piirkonna, mis kodeeris eriti vahetut varast transkriptsioonifaktorit, takistades nende vektorite paljunemist. Nende vektorite kloonimisvõime oli umbes 8 kb, et sisestada regulatoorsete järjestustega transgeen [239–241]. Esimese põlvkonna vektorid toodeti inimese embrüonaalse neeru (HEK) rakkudes, mis olid stabiilselt transformeeritud Ad5 viiruse genoomi osaga, mis täiendab E1 piirkonda transis [242–247]. Selle süsteemi üks peamisi puudusi on see, et see võimaldab pärast spontaanset rekombinatsiooni replikatsioonikompetentsete genoomide taastamist [248]. Täiendav E3 deletsioon, mis pole vektori tootmiseks vajalik, suurendab transgeenikasseti suurust [243] ja soodustab paremat immuunvastust [240].

Kahjuks ei olnud esimese põlvkonna Ad vektorid transkriptsiooniliselt täiesti inertsed ja kutsusid siiski esile tugeva immuunvastuse viiruse kapsiidivalkude vastu, mida ekspresseeriti algtasemel [141,249,250]. See lentivektori immuunsus aitas kaasa vektori toksilisusele ja transdutseeritud rakkude lühiajalisele eliminatsioonile [145]. Teise põlvkonna Ad vektorite puhul eemaldati vektori genoomist E2 ja E4 piirkonnad. E2 kodeerib replikatsiooniensüüme ja E4 täiendavaid regulaatorvalke [251–253]. See võimaldas ruumi 10,5 kb transgeenijärjestustele, sealhulgas kuni neljale ekspressioonikassetile [254]. Samuti vähendasid täiendavad deletsioonid tugevalt soovimatut rekombinatsiooni ja pikendasid transgeeni ekspressiooni [255]. Tõenäoliselt oli see tingitud hälbiva viiruse geeniekspressioonist, mis vähendab veelgi vektorivastast immuunsust [141 250 251]. Kolmanda põlvkonna adenoviiruse vektorid on kontseptuaalselt erinevad. Need koosnevad pakendatud vektori genoomist ja pakkimata viiruse genoomist (abiviirus), mis toodab vektorosakesi. Selliseid vektoreid tuntakse ka kui "abistaja-sõltuvaid", "sisikonnata" või "suure võimsusega" (HC-Ad) vektoreid. Neil on suurim võimalik kloonimisvõime ja nad võivad kanda kuni 36 kb pikkuseid järjestusi [256–258]. Suure võimsusega reklaamidel puudub viirust kodeeriv järjestus, välja arvatud ITR-id ja lühike kapseldamissignaal, mis võimaldab genoomi pakkimist ja mis puudub abistajaviirusest [259–262]. See strateegia on võimaldanud meil lõpuks ületada enamiku vektorivastasest immuunsusest, võimaldades transgeenide pikaajalist ekspressiooni [263–267]. HC-reklaamid ei kuulu aga praegusesse vaktsiinivektorite repertuaari.

3.2. Adenoviirus kui vaktsiini vektor

Enne reklaamivektorite kasutamise uurimist väärib märkimist, et 4. ja 7. tüüpi Ad-tüüpi B viiruste endi vastu töötati välja 1970. aastate alguses [268]. See suukaudne elusvaktsiin on alates 2011. aastast kohustuslik USA sõjaväelaste jaoks ja see on järsult vähendanud nakatumise määra, jõudes praktiliselt nullini [269–271]. See tõi esile Adsi kui vaktsiini olemusliku tõhususe ja ohutuse ning avas võimaluse kasutada Adsi vaktsineerimisplatvormina. Praeguseks on kliinilistes katsetes osalenud üle 200 reklaamipõhise vaktsiini [272]. Paljud neist on suunatud nakkuslike patogeenide, nagu HIV{10}} ja Ebola [230 273 274] vastu. Adenoviirusel põhinevatel vaktsiinidel pole puudusi. Hiljuti välja töötatud HIV-vastases vaktsiinis, mis põhineb liigi C viirusel Ad5, kasutati vektorite segu, mis ekspresseerisid HIV-1 gag, pol ja nef geene [275 276]. Vektorid olid ohutud, immunogeensed ja hästi talutavad. Kahjuks tuli STEP-i kliiniline uuring enneaegselt peatada [277–279]. See vaktsiin ei kaitse mitte ainult HIV-nakkuse eest, vaid epidemioloogilised andmed viitavad sellele, et Ad-ga vaktsineerimine suurendas sel juhul HIV-nakkuse riski [280–282]. Võimaliku vaktsineerimisjärgse riskifaktorina tuvastati varasem immuunsus Ad5 vastu [283,284]. Kuid see tähelepanek ei leidnud sarnastes uuringutes kinnitust [285 286] ja jääb mehaaniliselt ebaselgeks [287 288]. Lisaks HIV-le on Lääne-Aafrikas korduva ohu Ebola (Ad-EBOV) vastu võitlemiseks välja töötatud reklaamipõhised vektorvaktsiinid [289]. Kõik Ad-EBOV vaktsiinid kasutavad vaktsiini antigeenina Ebola glükoproteiini (GP). Esialgsetes prekliinilistes uuringutes näriliste ja primaatidega kasutati Ad5 ja need näitasid kaitset 3 kuu jooksul neutraliseerivate antikehade tootmise ja CD8 pluss aktiveerimisega [273, 290–292]. See vaktsiin läbis II faasi kliinilise uuringu; kuid vaktsineeritud populatsioonis on Ad5 suhtes esinev immuunsus põhjustanud muutusi esilekutsutud neutraliseerivate antikehade tasemes [293–297]. Selle probleemi lahendamiseks on välja töötatud vaktsiinid, mis põhinevad vähem levinud liigil D Ad26 [186 298 299].

Kuid Ad26 on inimestel vähem immunogeenne, mille tulemuseks on vaktsineerimise efektiivsuse vähenemine ja vaja oli esmast võimendust, kasutades leetriviirusel põhinevat vaktsiini (MVA). See vaktsineerimisrežiim on jõudnud III faasi kliiniliste uuringuteni [289 300 301]. Arendamisel on olnud ka mitte-inimese reklaamivektorite kasutamine [184]. Šimpansi ChAd3 kasutamine EBOV-vastase vaktsiiniplatvormina näitas kaitset närilistel ja šimpansitel [302 303] ning neid vektoreid kasutanud kliinilised uuringud on edenemise eri etappides [17 300 301 304–306].

Kuni viimase ajani olid HIV{0}} ja EBOV vaktsiinid kaks peamist näidet reklaamivektoripõhiste vaktsiinide rakendamisest, kuid need pole ainsad. Erinevate patogeenide, nagu Mycobacterium tuberculosis [307–310], dengue viirus [311–313], B- ja C-hepatiit [314–320], marutaudi [321–324] või gripp, vastu on tehtud erinevaid katseid kasutada Ad-vaktsiini vektoreid. [325–328]. Nende tõhusus oli aga alati oodatust väiksem (üksikasju vt [18 142 300 329]). EBOV vaktsiinikandidaat on jäänud ainsaks praktiliselt rakendatavaks Ad-vaktsiiniks ja seda kasutatakse Kongo Demokraatlikus Vabariigis teatud piirangutega. See vaktsiin põhineb Ad26 tüübil (Ad26-ZEBOV/MVA-BN-FILO) ja 2020. aasta mai seisuga sai esimese vaktsineerimisdoosi 20 339 inimest ja täielikult vaktsineeriti 9560 inimest [230 301 330].

Adenoviiruse vektoriseeritud vaktsiinid on vastuseks SARS-CoV-2 pandeemiale saanud suure avalikkuse tõuke. Olukorra kiireloomulisus on võimaldanud ära kasutada nende arengut, sealhulgas varasemaid piirkondlikult piiratud SARS-CoV-1 puhanguid põhjustanud koroonaviiruste vastaste vaktsiinidega saadud kogemusi [331]. Koronaviiruse spike (S) glükoproteiin tuvastati kui parim vaktsiini antigeen immuunsuse tagamiseks koronaviirusnakkuste vastu [332 333]. Praeguseks on neli reklaamivektori vaktsiini, mis kõik kodeerivad spike-antigeeni, täiustatud olekus ja on antud hädaolukorras kasutamiseks suures osas maailmas. Rakendatud vektorstrateegiad on olnud veidi erinevad, kuid hõlmavad põhiliselt esimese põlvkonna vektorite kasutamist. Need ulatuvad liigi C Ad5-põhiste vektorite (Ad5-nCoV) kasutamisest, olemasoleva immuunsuse ületamisest suure vektordoosiga (CanSino) [187 334] kuni vähem levinud D-tüüpi viiruse kasutamiseni. Ad26, kasutades stabiliseeritud piigiglükoproteiini (JNJ-78436735/Ad26.COV2.S) [335]. Alternatiivne lähenemisviis kasutab šimpansi reklaamivektorit ChAdOx1-S-(AZD1222) [336 337]. Ainus kasutatav vaktsiin, mis põhineb heteroloogsel esmasel võimendusstrateegial vektori immuunsuse ületamiseks (Gam-COVIDVac/Sputnik V), rakendab esmalt Ad{26}}põhist vektorit ja seejärel revaktsineerimisel Ad5 vektorit [338,339]. Kõigil juhtudel on kliiniliste uuringute andmed olnud väga paljulubavad, näidates esilekutsutud kaitsva immuunsuse kõrget taset, ja mitmes riigis on reklaamipõhiste vaktsiinide kasutamiseks lubatud erakorraline kasutamine. Lisaks näitavad eri riikides käimasolevate vaktsineerimiskampaaniate epidemioloogilised uuringud reklaamipõhiste SARS-CoV-2 vaktsiinide kasutamise ülekaalukat edu.

4. Adenoviiruse (vaktsiini) vektori efektiivsuse moduleerimine, kapsiid juhib teed

Adenoviiruse (vaktsiini) vektori kavandamisel tuleb arvesse võtta mitmeid tegureid. Need hõlmavad kodeeritud antigeeni pika ja püsiva ekspressiooni säilitamist ja immunoloogilise konteksti aktiveerimist (adjuvandi efekt), mis võimaldab antigeeni ekspressiooni tõhusat translatsiooni püsivaks adaptiivseks immuunsuseks, mis on suunatud immunogeeni, kuid mitte vektori enda vastu. Immunoloogilise konteksti annab kaasasündinud immuunaktivatsioon, mille vaktsiini vektor kutsub esile manustamise ajal. Selles kontekstis on oluline efektiivsus, millega kaasasündinud immuunsensorid vektori tuvastavad, ja see omakorda määrab adaptiivse vastuse amplituudi. Nagu ülaltoodud jaotistes kirjeldatud, toimub kaasasündinud immuuntundlikkus peamiselt sisenemisjärgsel tasemel, samaaegselt Ad endosoomi tungimisega. (Vaktsiini)antigeeni tõhus ekspressioon sõltub siis tasakaalust vektori kliirensi taseme ja vektori genoomide tuuma eduka kohaletoimetamise ja ekspressiooni vahel. Kapsiidi displeivektorite väljatöötamisega ei ole immuunaktivatsiooni esilekutsumiseks vaja transgeeni ekspressiooni. See strateegia põhineb huvipakkuva epitoobi sisestamisel Ad kapsiidi valkudesse, võimaldades selle otsest kokkupuudet immuunsüsteemiga. Isegi kui sellel lähenemisviisil on mõned eelised, toetuvad enamik vaktsiinivektoreid geneetiliselt kodeeritud geenidele. Kapsiidi kuvavektorite kohta lisateabe saamiseks vaadake neid ülevaateid [340 341].

Olemasolev immuunsus viirusvektori vastu (nt 30–90 protsenti liigi C viiruse Ad5 vastu, olenevalt geograafilisest asukohast) võib vähendada vektori omastamist ning vähendada antigeeni ekspressiooni ja sellest tulenevat immuunvastust [342–344]. Vektorivastase immuunsuse vähendamiseks on välja töötatud mitu strateegiat ja need on hiljuti läbi vaadatud [249]. Lühidalt öeldes tunnevad neutraliseerivad antikehad ära peamiselt eksonite hüpervarieeruva ahela ja on seetõttu serotüübispetsiifilised [178–180]. Neid hüpervarieeruvaid silmuseid saab seetõttu asendada mõne teise, vähem levinud serotüübi omadega [178,345]. See hoiab ära vektori neutraliseerimise ja inaktiveerimise. Kuna Ad5 on kõige serovalentsem tüüp, väldiks seda probleemi ka haruldaste serotüüpide, nagu Ad26, Ad35 või mitte-inimese reklaamid, kasutamine [177,346–350].

Haruldaste tüüpide kasutamise peamiseks puuduseks on aga nende madalam immunogeensus, mis muudab need vaktsiini väljatöötamisel vähem tõhusaks [298]. Seetõttu tuleks vektorivastase immuunsuse vähendamise strateegiad välja töötada paralleelselt vektori immunogeensuse suurendamise strateegiatega, et saada kõige tõhusam vektor. Isegi kui vektori vastaste neutraliseerivate antikehade esialgne tase on madal, võib antud vektoritüübiga vaktsineerimine vallandada vastuse, mis takistab selle edasist kasutamist. Vektorivastase vastuse praimimine toimub ka sisenemisjärgsel tasemel, kui vektoriosakesed sorteeritakse ja töödeldakse ise antigeenidena. Vaktsineerimise õnnestumiseks immunoloogiliselt soodsa konteksti esilekutsumine võib toimuda vektori immuunsuse suurenenud praimimise arvelt. Reklaamivektorite saatuse pärast kasutuselevõttu määravate parameetrite mõistmine võib anda võimaluse vektori kujundamiseks.

4.1. Stabiilsus seisneb liikides

Retseptori poolt vahendatud omastamine ja endo-lüsosomaalsest sektsioonist väljapääs on Ad-nakkuse ja vektori transduktsiooni tunnused. Algse omastamise määrab viiruse kiudude ja pentoni molekulide interaktsioon raku retseptoritega. Kiud ja pentoon on ühised kõikidele reklaamidele, kuid olenevalt nende liigist on need seotud erinevate rakuretseptoritega (tabel 1). Liigi C viirused kasutavad CAR-i ja sisenevad osakesed põgenevad varasest endosomaalsest sektsioonist [79]. Kui liigi C viirused (Ad5) on konstrueeritud nii, et need sisaldaksid B-liigi viiruse (Ad16) kiudmolekuli, pääseb saadud osake (Ad5F16) seejärel lüsosomaalsest sektsioonist (nagu näitab värvimine lüsosomaalse markeriga LAMP1), mitte varajase osakese asemel. endosoom [351]. See hilinenud põgenemine lüsosoomidest on funktsioon, mida jagavad kõik testitud liigi B viirused [111 352 353].

Lisaks kutsuvad hübriid Ad5F16 ja B-tüüpi viirused esile tugevama põletikuvastase vastuse kui liigi C viirused [159, 351]. Selle põhjuseks on suurenenud tuvastamine intraluminaalse TLR9 kaudu immuunrakkudes [354]. Lisaks põhjustab lüsosomaalse membraani kahjustus erinevalt varasest endosoomikahjustusest tugevat oksüdatiivset stressi. Lüsosoomi rebend vabastab lüsosomaalsed hüdrolaasid, nagu katepsiin B, mis võivad kahjustada mitokondreid, võimendades seega kahjustusreaktsiooni põletikulise aktivatsiooni kaudu [355–357]. Ad omastamise protsess destabiliseerib kapsiidi, võimaldades viiruse valgu VI vabanemist [103, 106]. Vabanenud valk VI tungib seejärel läbi membraani endolüsosomaalsest sektsioonist, et võimaldada viirusel pääseda tsütosoolile. Liikide C ja B võrdlemine näitab, et mõlemad viirused on võrdselt tõhusad tsütosooli sisenemisel ja genoomi kohaletoimetamisel, kuid erinevad nende põgenemiskineetika poolest [111]. Tähelepanuväärne on asjaolu, et lihtne kiudude vahetus võib kanda sisenemis- ja immunogeensed omadused liigist B üle liigi C viirusele. See tõestab kontseptsiooni, et saab kujundada spetsiifiliste omadustega hübriidvektoreid. Põhiline erinevus näib olevat see, et valgu VI vabanemine on B-liigi viirustes (või hübriidviiruses) hilinenud ja võib nõuda kas hapestamist või mõnda muud, tundmatut lahtivõtmist.

Kuna sel juhul valgu VI vabanemine viibib, võib see kajastada suurenenud kapsiidi stabiilsust. Tõepoolest, liikide C Ad5 viirused vabastavad raku sidumisel kiudaine molekuli, mis eeldatakse, et see nõrgendab kapsiidi ja käivitab demonteerimisprotsessi valgu VI vabanemiseks. Selles kontekstis näidati, et kiududeta Ad5 on vähem stabiilne kui natiivsed osakesed [358]. Seevastu küpsemata, ülistabiilne Ts1 Ad2/5 ei vabasta kiudaineid ega valku VI ning on nõrgad põletiku indutseerijad, kuna nad ei käivita TLR9 ega põhjusta membraanikahjustusi [114,138,359,360].

Seda, kas kiudude vahetamine liigiga B takistab esialgset kiudude vabanemist ja muudab liigi C kapsiidi stabiilsemaks, ei ole uuritud, kuid see on tõenäoline. Kapsiidi stabiilsus võib olla sisenemisjärgse kapsiidi saatuse oluline määraja ja lisaks omadus, mida saab kasutada vektori kujundamisel. Liigi B viirused võivad olla stabiilsemad tänu erinevatele retseptoritele või ainulaadsele kiud-pentoni interaktsioonile. Seevastu liigi F viirused Ad40/41 nakatavad seedetrakti ja neil on suurenenud kapsiidi stabiilsus tänu nende tropismile ja kohanemisele karmi soolestiku keskkonnaga [24 361]. Soolestiku sisetemperatuur on mõne kraadi võrra kõrgem kui C-liigi viiruste sihtmärgiks olevad ülemised hingamisteed (37 ◦ C vs. 33 ◦ C) [362]. Seega on Ad40/41 oma olemuselt termostabiilsemad, toetades nakkusprotsessi [24], mis muudab nende paljunemise raskeks [24 361 363].

Lisaks puudub neil pentoni molekulis RGD motiiv, mille tulemuseks on raku sisenemise veelgi vähenemine [92]. Ei ole teada, kas need ainulaadsed kapsiidi omadused väljenduvad lüsosomaalsest sektsioonist põgenemises või osalises lahtivõtmises/valgu VI vabanemises. Seevastu need omadused võivad pakkuda konteksti suukaudsete vaktsiinirakenduste väljatöötamiseks. Erinevalt liigi B kiududest on liigi F kiudu sisaldavatel vektoritel standardsetes keskkonnatingimustes rakendatud immuunaktivatsioon [364] vähenenud. Kui teatud inimreklaami liik nüüd kontekstist välja võtta ja seda vaktsiinivektorina kasutada, võiks olla kasulik vaadata selle vektori loomulikku tropismi, et otsida vihjeid selle käitumise ennustamiseks. Praegu kasutatav Ad26-l põhinev vaktsiinivektor on D-tüüpi viirus ja selle loomulik tropism on silmad ja seedetrakt [365]. Liigi D viirused, sealhulgas Ad26, on vähem immunogeensed kui Ad5 [366] ja need liiguvad hilisesse endosomaalsesse sektsiooni, hõlmates tõenäoliselt viivitatud valgu VI vabanemist.

Järelikult vähendas hilise endosomaalse sektsiooni hapestumise blokeerimine veelgi selle immunogeensust [113]. Erinevalt inimeste reklaamidest on teadmised ka vaktsineerimisel ja vektoriseerimisel kasutatavate mitte-inimese reklaamide kohta väga piiratud. Šimpansist pärinevad reklaamid, sealhulgas ChAd3, on tihedalt seotud liigi D viirustega [367 368]. Huvitaval kombel on Ad5 vektorid immunogeensemad kui šimpansist pärinevad Ad vektorid ja neil on suurem transduktsioonipotentsiaal. See tähelepanek ei olnud seotud pentoni RGD motiivi või kiu erinevustega ja selle mehaaniline põhjus jääb teadmata [369]. Kapsiidi stabiilsuse võimalikke erinevusi ei ole uuritud. Veel üks vektorina kasutatud reklaam, mis ei ole inimlik, on koerareklaami tüüp 2 (CAV{11}}). Sellel vektoril on märkimisväärne omadus transdutseerida neuroneid selektiivselt, kuid mitte ümbritseda gliiarakke, erinevalt Ad5 kontrollvektorist, hoolimata sellest, et mõlemad vektorid kasutavad sama retseptorit [370–372]. See võime võib olla seotud suurenenud kapsiidi stabiilsusega, võimaldades katmata jätmist ainult neuronaalsetes rakkudes. Koerte kehatemperatuur on ~2 ◦C kõrgem kui inimestel, mis võib põhjustada CAV{16}} kapsiidi stabiilsuse suurenemist [373], mis on analoogselt liigi F viirustega. CAV-2 kutsub halvasti esile kaasasündinud immuunvastuse, mis on kooskõlas sihtrakkude tõhusa lagunemise puudumisega [372]. Seega võivad CAV2 vektorid olla veel üks näide, kus selle loodusliku tropismi või peremeesorganismiga seotud biofüüsikaline omadus võib pakkuda uusi vektoriomadusi.

4.2. Kapsiidi struktuuri peenhäälestus, valgu VI näide liigis C Ad2/5

Kui kapsiidi stabiilsus ja valgu VI vabanemine määravad viiruse kapsiidi allavoolu, tekib küsimus, kas seda saab Ad vektorites muuta, st omistada viirusvektoritele uusi omadusi (joonis 3). Suurem osa meie arusaamast selle kohta, kuidas reklaamid endolüsosomaalsesse sektsiooni tungivad, pärineb liigi C viirustelt Ad2/5. Valgu VI kui membraanilüütilise faktori avastamine oli selle protsessi mõistmiseks hädavajalik [103, 106]. Valk VI kodeerib N-terminaalset amfipaatilist heeliksit, mis on valgu tegelik membraanilüütiline osa. Viiruse tootmise ajal ekspresseeritakse valku VI prekursorvalguna, mis seostub amfipaatilise heeliksi kaudu heksoni trimeeridega [42 374]. Kompleks imporditakse tuuma valgu VI N- ja C-otsas kodeeritud transpordisignaalide kaudu, mis eemaldatakse viiruse kokkupanemise ja küpsemise käigus viiruse proteaasi poolt. C-otsa 11 aminohappest koosnev peptiid aktiveerib ka proteaasi, pakkudes nutikat viisi viiruse koostu sidumiseks amfipaatilise heeliksi varjestusega. Ts1 Ad2/5 mutantsel viirusel on proteaasi pakendamisdefekt ja ühtegi kapsiidivalku, sealhulgas valku VI, ei töödelda. Saadud osakesed on ülistabiilsed, säilitavad kiudaineid ega kasuta VI valku.

Selle tulemusena sorteeritakse Ts1 osakesed retseptori vahendatud endotsütoosi korral lüsosoomideks. Valgu VI täpne asukoht küpses viiruses ei ole selge, kuid lõhustatud N-ots lokaliseerub peripersonaalsete eksonite sisemise heksoni pinnale [37,104,375]. Näidati, et valgu VI kaks punktmutatsiooni, G33A ja S28C, suurendavad Ad5 kapsiidi stabiilsust (joonis 3A) [376 377]. Esimene mutant eelneb valgu VI N-terminaalsele proteaasi lõhustamiskohale ja kahjustab töötlemist. Saadud osakesed on osaliselt ebaküpsed ja neid iseloomustab endosoomi lüüsi defekt, mis viitab sellele, et valgu VI N-ots stabiliseerib virionisiseseid valk-valk interaktsioone [376]. Teine mutant valiti selle võime järgi moodustada molekulisiseseid disulfiidsildu [377].

Viirus sisaldas osaliselt töötlemata valke, sealhulgas potentsiaalselt VII valku, kuid vaatamata suurenenud stabiilsusele ei ilmnenud sellel üllatuslikult mingeid nakkavusdefekte. Ei ole teada, kas kummalgi viirusel on muutunud immuunaktivatsiooniprofiil. Teine valgu VI punktmutatsioon, mis mõjutab viiruse saatust, on valgu VI L40Q mutatsioon, mis asub otse amfipaatilises heeliksis (joonis 3A) [378 379]. Selle mutatsiooniga viirused küpsevad normaalselt, kuid on osaliselt puudulikud endosoomi lüüsi etapis. Erinevalt ülalmainitud mutantidest on L40Q virioonid vähem stabiilsed kui nende metsiktüüpi kolleegid. Viivituse asemel vabanevad L40Q kapsiidist enneaegselt valk VI ja pentoon. L40Q virioonid on vähem nakkavad ja alluvad lüsosoomide osalisele sorteerimisele. Kuid L40Q mutatsioon ei kaota täielikult membraani lüüsi ja mõned viirused pääsevad tsütosooli, mille tulemuseks on L40Q vektori üldine ~ neli korda vähenenud nakkavus [379, 380]. Tähelepanekud viitavad sellele, et amfipaatiline heeliks aitab oma vastasmõjuga kaasa osakeste stabiilsusele. Ei ole teada, kas ja kuidas L40Q mutatsioon muudab Ad5 vektorite immunogeenset omadust. Hiljutised tähelepanekud viitavad sellele, et valgu VI vabanemine kapsiidist on vallandunud sisemisest konkurentsist valgu VII-ga eksonites samade või kattuvate seondumiskohtade pärast [375].

Järjekindlalt ei pääse mutantne viirus, millel puudub valk VII, endosoomist välja ja tal on endosoomi lüüsi defekt [58]. Sisemise kapsiidi (st valk VI) ja tuumvalkude (st valk V ja VII) struktuurse ja dünaamilise korralduse täiendav mõistmine osakeses ja raku sisenemise ajal aitab oluliselt mõista, mis määrab (pöörduva) kapsiidi stabiilsuse.

Ad vektorite immuunaktiveerimise tõhususe kontrollimine on vaktsiinide väljatöötamise jaoks suur huvi ning antigeenide MHC esitluse laiendamine parandaks vaktsiini väljatöötamist [381]. Nagu varem mainitud, reguleerib autofagia immuunsüsteemi aktiveerimist ja toidab peptiide MHC-le. Autofagia on üks vanimaid rakulisi infektsioonivastaseid kaitsemehhanisme, kuid Adsil kui kohandatud inimese patogeenidel ei ole välja töötatud mehhanisme, et vältida autofagiat sisenemisel. Selle asemel näib, et nad võtavad omaks autofagia aktiveerimise ja suunavad vastutuse nakkuse edendamisele. Valk VI mängib keskset rolli raku autofagia vastuse kontrollimisel. Adenoviiruse membraani lüüs valgu VI poolt viib galektiin 3 ja galektiin 8 värbamiseni, mida rakk tunneb ära ohusignaalidena (joonis 3B) [108,109,382]. Ad penetratsioonikohtade tuvastamine galektiinide abil aktiveerib nakatunud rakus selektiivse autofagia, mida illustreerib autofagia retseptorite (nt NDP52 ja p62) värbamine ja LC3 punctae moodustumine [108].

Huvitaval kombel õnnestub Ad5 vektoriosakestel purunenud endosoomist põgeneda ja need võivad liikuda tuuma. Autofagia inhibeerimine ei mõjuta viiruse nakkavust, kuid lükkab edasi nende genoomi kohaletoimetamist tuuma, mis näitab, et Ads kaaperdavad rakusüsteemi oma kasumi nimel [108]. Endosoomist põgenemine võimaldab seega viirusel vältida autofagiast tingitud lagunemist aktiivse protsessi kaudu. Selle protsessi avastas veel üks valgu VI mutant, M1 mutant. Kõik inimreklaamid (ja mitmed mitte-inimese reklaamid) kodeerivad VI valgu kõrgelt konserveerunud PPxY peptiidi motiivi. M1 mutandis muudeti see motiiv PGAA-ks (joonis 3) [104]. Nii metsiktüüp kui ka M1 mutant vabastavad sisenemisel tõhusalt valgu VI ja vallandavad autofagia pärast endosomaalse membraani purunemist. Kuid mutantne M1 viirus ei suuda tõhusalt tsütosooli pääseda ja EM-pildid on näidanud, et M1 mutantsed viirused on lõksus purunenud endosoomidesse, mille sihtmärgiks on autofagia.

Järelikult näidati, et M1 mutantsel viirusel on tugev nakkavuse defekt, mis taastub autofagia farmakoloogilise ja geneetilise inhibeerimise korral. Uuring näitas, et metsiktüüpi viirused kasutavad oma PPxY motiivi ubikvitiini ligaasi NEDD4.2 värbamiseks ja piiravad autofagosoomide küpsemist piisavalt kaua, et pääseda tsütosooli. Lisaks võimaldab see omadus viirusel piirata oma antigeenset esitust [108]. Oluline on see, et hiirtele süstitud M1 mutantvektor andis palju tugevama vektorivastase immuunsuse ja CD8 pluss vastuse vähenemise kodeeritud transgeenile, mis näitab, et lihtsal kapsiidi muutmisel võib olla Ad5 kapsiidi immunogeensusele sügav mõju. Ei ole teada, kas mõni muu valgu VI mutatsioon mõjutab immunogeensust. Siiski võib PPxY motiivi olemasolu L40Q viiruses selgitada, miks vektor säilitab vaatamata membraani lüüsi defektile suhteliselt kõrge nakkavuse [379, 380]. Kuna endosoomide lüüs on vähem efektiivne ja L40Q vektorid satuvad osaliselt lüsosomaalsesse sektsiooni, on mõeldav, et esile kutsutud immuunvastus erineb siiski metsikut tüüpi, Ts1 või M1 Ad5 kapsiididest.