Ülekantava elemendi RNA düsregulatsioon mutantsetes KRAS(G12C) 3D kopsuvähi sferoidides

ABSTRAKTNE

Mutantne KRAS reguleerib transponeeritava elemendi (TE) RNA ja interferooniga stimuleeritud geeni (ISG) ekspressiooni, kuid jääb ebaselgeks, kas KRAS-i erinevad mutatsioonid mõjutavad erinevaid TE RNA-sid kogu genoomis. Analüüsisime inimese 3D-kopsuvähi sferoidide transkriptoome, mis sisaldavad KRAS(G12C) mutatsioone, et määrata kindlaks mutantse KRAS(G12C) poolt reguleeritud TE RNA-de maastik. Leidsime, et KRAS(G12C) signaaliülekanne on vajalik LINE- ja LTR-st tuletatud TE RNA-de ekspressiooniks, mis erinevad TE RNA-dest, mida varem näidati olevat reguleeritud mutantse KRAS(G12D) või KRAS(G12V) poolt. Lisaks reguleerib KRAS (G12C) inhibeerimine spetsiifiliselt üles SINE-st tuletatud TE RNA-sid noorimast Alu alamperekonnast AluY. Meie tulemused näitavad, et TE RNA düsregulatsioon KRAS-i juhitud kopsuvähirakkudes on mutatsioonist sõltuv, tuues samal ajal esile ka noorte Alu-st pärinevate TE RNA-de alamhulga, mis aktiveeritakse kooskõlastatult kaasasündinud immuunsusgeenidega KRAS (G12C) inhibeerimisel.

Cistanche tubulosa-Antitumor eelised

SISSEJUHATUS

Transponeeritavate elementide (TE) RNA-d on vähi kontekstis korduvalt reguleerimata 1. Mutantsetes KRAS-i kopsuvähirakkudes on KRAB tsink-sõrme (KZNF) geenid üldiselt allareguleeritud, mis põhjustab LINE-st, SINE-st ja SINE-st pärinevate TE RNA-de ebanormaalset ülesreguleerimist. LTR elemendid 2,3. Lisaks TE RNA-dele reguleeritakse pikad mittekodeerivad RNA-d (lncRNA-d) kooskõlastatult ka RAS-i signaaligeenidega 4 ja nende ekspressioonimustrid on sarnaselt muutunud paljude vähivormide korral 5-8. TE RNA-de puhul kutsub nende ülesreguleerimine vähi korral esile viiruse mimikri seisundi, mis viib kaasasündinud immuunsusgeenide, näiteks interferooniga stimuleeritud geenide (ISG) 3, 9, 10 sisemise aktiveerimiseni. Eelkõige on SINE-de Alu perekond domineeriv immunogeensete TE RNA-de 11 allikas, mis on indutseeritud DNA metüültransferaasi inhibiitoritest (DNMTi) või mutantsest KRAS-vahendatud KZNF inhibeerimisest 3, 9, 10 põhjustatud epigeneetilisest muutusest.

Et uurida, kuidas KRAS-i tavaline mutatsioon mõjutab TE RNA maastikku kopsuvähirakkudes, iseloomustasime KRAS(G12C) mutatsioone sisaldavate 3D kopsuvähi sferoidide transkriptoome mutantse KRAS(G12C) inhibiitori 12 olemasolul või puudumisel. Näitame. et KRAS(G12C) signaaliülekanne on vajalik LINE-st ja LTR-st pärinevate TE RNA-de ekspressiooniks, samas kui KRAS(G12C) inhibeerimine reguleerib spetsiifiliselt nii SINE-st pärinevaid TE RNA-sid kui ka interferooniga (IFN) seotud geenide alamhulka. Meie leiud näitavad mutantse KRAS-i signaaliülekande ja TE düsregulatsiooni keerulist koosmõju kopsuvähirakkudes, kus teatud noorte AluY elementide komplekt on mutatsioonist sõltuval viisil ülesreguleeritud.

Cistanche tubulosa-Antitumor eelised

TULEMUSED

KRAS(G12C) inhibeerimine muudab kodeerivat ja mittekodeerivat transkriptoomi

Et teha kindlaks, kuidas onkogeenne KRAS(G12C) signaalimine reguleerib kodeerivat ja mittekodeerivat transkriptoomi, teostasime RNA sekveneerimise (RNA-seq) 3D mutantse KRAS(G12C) kopsuvähi sferoididel. RNA-seq jaoks kasutasime täispikka protokolli 5' unikaalsete molekulaarsete identifikaatoritega (UMI), et võimaldada täpset RNA loendamist, leevendades samal ajal PCR amplifikatsiooni nihkeid 13 (joonis 1A). Võrdlesime KRAS(G12C) inhibiitoriga ARS-1620 (ARS) töödeldud H358 kopsuvähi sferoidide transkriptoome kontrollsferoididega (DMSO-ga töödeldud) (joonis S1A) ja nägime, et ARS-ravi vähendas oluliselt fosforüülitud ERK taset. (p-ERK) (joonis S1B), mis näitab, et ARS-ravi pärssis allavoolu KRAS(G12C) signaaliülekannet. KRAS(G12C) signaaliülekande pärssimist ARS-raviga tõendas ka sferoidi suuruse ja rakkude elujõulisuse vähenemine (joonis S1C ja S1D).

RNA tasemel hindasime erinevate biotüüpide ja TE superperekondade suhtelist arvukust ARS- või DMSO-ga töödeldud 3D-kopsuvähi sferoidides, mis näitasid TE RNA koostise dünaamilisi muutusi KRAS (G12C) inhibeerimisel (joonis 1B). Kui tuvastasime ainult 32% GENCODE-i annoteeritud valku kodeerivatest geenidest ja 15% lncRNA geenidest, siis 92-96% TE superperekondadest (92% LTR, 95% SINE, 96% LINE) olid meie UMI-märgisega esindatud. RNA-seq andmed, mis näitavad TE RNA-de laiaulatuslikku düsregulatsiooni KRAS (G12C) juhitud transkriptoomis. Kuni veerand kõigist ARS-iga töödeldud kopsuvähi sferoidide tuvastatud RNA molekulidest saadi TE-dest, mis näitab, et TE RNA-d moodustavad märkimisväärse osa mutantsete KRAS (G12C) kopsuvähirakkude transkriptsiooniväljundist.

Tistanche kasulikud omadused meestele - tugevdavad immuunsüsteemi

Cistanche Enhance Immunity toodete vaatamiseks klõpsake siin

【Küsi lisa】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Järgmisena määrasime ARS-i ja DMSO-ga töödeldud 3D-kopsuvähi sferoidide vahel oluliselt erinevalt ekspresseeritud geenid, et tuvastada bioloogilisi protsesse, mida reguleeris onkogeenne KRAS (G12C) signaalimine. Intaktse KRAS(G12C) signaaliülekandega kopsuvähi sferoidid rikastati oluliselt G2M kontrollpunkti, E2F sihtmärkide, MYC sihtmärkide ja mitootilise spindliga seotud geenide suhtes (joonis 1C). KRAS(G12C) inhibeerimisel ekspresseerisid kopsuvähi sferoidid aga oluliselt kõrgemat geenide taset, mis osalesid oksüdatsiooni fosforüülimises, komplemendis ning IFN alfa- ja gammavastustes (joonis 1C), pakkudes täiendavaid tõendeid KRAS-i signaalimise osalemise kohta regulatsioonis. IFN-ga seotud geenidest 2,3.

KRAS(G12C) inhibeerimine indutseerib koordineeritult ISG-sid ja noori AluY elemente

ISG-de sisemise ülesreguleerimise edasiseks selgitamiseks KRAS (G12C) inhibeerimisel tuvastasime, millised geenid ja TE-d ekspresseerusid vastavalt igas geenikomplektis ja TE superperekonnas oluliselt erinevalt. Nii IFN alfa kui ka IFN gamma vastuse geenides oli KRAS(G12C) inhibeerimisel kopsuvähi sferoidides kõige tugevamalt indutseeritud geen RTP4 (joonis 2A), retseptori transportervalk, mis reguleerib negatiivselt TBK1 signaaliülekannet 14. Lisaks oli MHC I klassi kompleks geeni beeta-2-mikroglobuliin (B2M), mis on kopsuvähi 15 korral korduvalt inaktiveeritud, oli samuti oluliselt ülesreguleeritud mõlemas IFN-ga seotud geenikomplektis ARS-iga töödeldud kopsuvähi sferoidides (joonis 2A).

Arvestades onkogeense KRAS-i signaaliülekande otsest rolli TE RNA regulatsioonis 3, uurisime, millised TE RNA-de alamperekonnad sõltusid mutantsest KRAS-ist (G12C). Intaktse KRAS(G12C) signaaliülekandega kopsuvähi sferoidides leidsime, et LINE alamperekonnad L1M6B ja L1PA12 olid tugevalt ekspresseeritud ja sõltusid KRAS(G12C)-st, mida tõendab nende alareguleerimine ARS-iga ravitud kopsuvähi sferoidides (joonis 2B). Veelgi enam, kuigi ainult üks DNA alamperekond MER44D sõltus KRAS(G12C) signaaliülekandest, reguleeris mutantne KRAS(G12C) enam kui tosinat LTR-alamperekonda, sealhulgas MLT1A0-int, LTR51, MER50B. ja LTR1B0 (joonis 2B). Seevastu kõik SINE alamperekonnad olid KRAS (G12C) inhibeerimisel oluliselt ülesreguleeritud ja indutseeritud spetsiifiliste ISG geenidega (joonis 2A) kopsuvähi sferoidides. Kõik need SINE TE RNA-d tuletati AluY alamperekonnast (joonis 2B), mis näitab, et KRAS (G12C) inhibeerimine düsreguleerib noorte AluY elementide spetsiifilist alamhulka.

KRAS(G12C) inhibeerimine reguleerib pikad mittekodeerivad RNA-d alla

KRAS (G12C) inhibeerimise mõju transkriptoomile täiendavaks selgitamiseks uurisime kõiki oluliselt erinevalt ekspresseeritud lncRNA-sid kopsuvähi sferoidides, mida töödeldi ARS-i või DMSO-ga kontrolli all. Leidsime, et suur hulk lncRNA-sid sõltus nende ekspressioonist KRAS(G12C) signaaliülekandest, kuna paljud neist lncRNA-dest olid KRAS(G12C) inhibeerimisel oluliselt alla reguleeritud (joonis 3A). Kolmel neist allareguleeritud lncRNA-dest, AC114546.3, NCMAP-DT ja AC073575.2, ei ole teadaolevaid funktsioone, kuid need kattuvad vastavalt kodeerivate geenide ZNF770, RCAN3 ja ERP29 suhtes antisenss-orientatsioonis. Mittekodeeriva RNA klassina täheldasime kopsuvähi sferoidides ARS-ravi ajal lncRNA-de laialdast allareguleerimist (joonis 3B), mis näitab, et paljud lncRNA-d sõltuvad nende ekspressioonist KRAS(G12C) signaaliülekandest.

Tistanche kasulikud omadused meestele - tugevdavad immuunsüsteemi

ARUTELU

Siin näitame, et onkogeense KRAS(G12C) signaaliülekanne on vajalik spetsiifiliste TE superperekondade, nimelt LINE ja LTR elementide, aga ka lncRNA alamhulga ekspressiooniks, näidates veelgi, kuidas RAS signaalimine reguleerib mittekodeerivat transkriptoomi 2-4. Samuti kasutasime oma KRAS(G12C) inhibiitori katsetes 3D-kopsuvähi sferoidmudelit, kuna on näidatud, et 3D-mudelid võtavad 2D-kultuurimudelitega võrreldes täpsemini kokku in vivo ravimivastuse 16. Lisaks kasutame UMI-l põhinevat täielikku mudelit. -Longth RNA-seq tehnika 13 võimaldas meil täpsemalt tabada TE RNA koostist ja dünaamikat meie kopsuvähi sferoidides, eemaldades meie RNA-seq andmetest PCR duplikaadid.

Meie leiud on kooskõlas varasemate KRAS(G12C) inhibeerimise uuringutega, kus ARS-iga töödeldud H358 kopsuvähirakkudes 17 olid IFN alfa- ja gammavastuse geenid ülesreguleeritud. Tuginedes alumiiniumist pärinevate RNA-de 11 teadaolevatele immunogeensetele omadustele, näitavad meie tulemused, et noorte AluY elementide spetsiifiline ülesreguleerimine KRAS (G12C) inhibeerimisel on vähemalt osaliselt vastutav ISG-de tugeva ülesreguleerimise eest ARS-iga töödeldud kopsuvähi sferoidides. Eelkõige ei hõlma IFN-ga seotud geenide märkimisväärne rikastamine vastusena KRAS(G12C) inhibiitori ravile RNA sensori ISG-de, nagu MDA{10}}, RIG-I või PKR, edasist ülesreguleerimist, mis algselt muutuvad kopsurakud vastuseks onkogeensele KRAS-i signaaliülekandele 2,3.

Oleme varem näidanud, et ainult mutantse KRAS-i signaalimine on piisav TE RNA ülesreguleerimise esilekutsumiseks inimese kopsurakkudes, mis on transformeeritud in vitro 2, 3, ja meie siin kirjeldatud tulemused laiendavad neid tähelepanekuid erineva aktiveeriva KRAS-i mutatsiooniga kopsuvähirakkudele. KRAS(G12D) või KRAS(G12V) mutatsioonid kutsuvad mõlemad esile LTR12C alamperekonna olulise ülesreguleerimise transformeeritud kopsurakkudes 3, kuid me ei näinud meie KRAS(G12C) kopsuvähi sferoidides LTR12C-st pärinevate TE RNA-de olulist rikastumist. Selle asemel nägime LTR51, LTR1B0, LTR14B ja LTR28B ülesreguleerimist, mis viitab sellele, et KRAS-i erinevad funktsioonivõimega mutatsioonid reguleerivad TE RNA transkriptoomi erinevaid aspekte.

Meie töö annab põhjaliku hinnangu selle kohta, kuidas mittekodeeriv / TE RNA transkriptoom reageerib dünaamiliselt KRAS (G12C) inhibeerimisele. Tulevased uuringud võivad anda uusi teadmisi mittekodeerivate / TE RNA-de võimalikest rollidest KRAS (G12C) inhibiitori resistentsuse mehhanismides. Lisaks võivad KRAS-i inhibeerimisel vähirakkudest sekreteeritud TE RNA-d toimida rakuväliste RNA biomarkeritena 2, 3, 5, 18, 19 vastuse ja/või resistentsuse KRAS-i inhibiitorravi suhtes 20.

MATERJALID JA MEETODID

Rakuliinid

KRAS(G12C) mutatsiooni sisaldavaid H358 kopsuvähi rakuliine kultiveeriti niisutatud inkubaatoris RPMI 1640 söötmes (Invitrogen), millele oli lisatud 10% veise loote seerumit (Sigma), temperatuuril 37 kraadi ja 5% CO2. Kõik rakuliinid olid mükoplasma suhtes negatiivsed. Rakuliinid osteti ettevõttest American Type Culture Collection (ATCC).

Rakkude elujõulisuse testid

Sferoidse elujõulisuse analüüside jaoks külvati 10,000 rakku süvendi kohta madala adhesiooniga ümarapõhjalistele 96-süvendiga plaatidele ja inkubeeriti 24 tundi 37 kraadi juures 5% CO2 juures. Seejärel lisati rakkudele seeriaviisiliselt lahjendatud ARS- 1620 või DMSO ja plaate inkubeeriti standardsetes kultiveerimistingimustes 72 tundi, kusjuures värsket ARS-i ja DMSO söödet vahetati iga päev. Rakkude elujõulisust mõõdeti, kasutades Cell Titer-Glo® Luminescent Cell Viability Assay komplekti (Promega) vastavalt tootja protokollile. ARS-iga töödeldud proovide luminestsentssignaal normaliseeriti DMSO kontrolliks. Luminestsentsi mõõdeti SpectraMax iD3 molekulaarse seadmega.

RNA isoleerimine

Kogu RNA kogus eraldati ligikaudu 100 H358 sferoidist (seisundi kohta), kasutades Quick-RNA Mini-Prep komplekti (Zymogen) vastavalt tootja protokollile. RNA kvantifitseeriti spektrofotomeetriga NanoDrop{4}}.

RNA-seq raamatukogu ettevalmistamine

Kohandatud Smart-seq3 protokolli 13 kasutati RNA-seq raamatukogude genereerimiseks kogu RNA-st, et loendada ja hinnata täispikkasid RNA molekule. Lühidalt, 10 ng kogu RNA-st pöördtranskribeeriti, kasutades vöötkoodiga oligoDT praimerit (125 nM), millele järgnes malli vahetamine vöötkoodiga malli lüliti oligoga (125 nM). Need oligojärjestused toimisid PCR amplifikatsiooni praimeritena. Nextera HT komplekti (Illumina) kasutati cDNA raamatukogude teisendamiseks sekveneerimisraamatukogudeks, lisades UMI-spetsiifilist praimerit, et amplifitseerida molekulaarseid vöötkoode sisaldavaid cDNA otsi, nagu on kirjeldatud Smart-seq3 protokollis. cDNA ja raamatukogu kvaliteeti hinnati Agilent bioanalyzer DNA ülitundliku kiibi abil ja kvantifitseeriti, kasutades Qubit 3.0 kõrge tundlikkusega DNA testi.

Lääne blott

Pärast ARS-i või DMSO-ga töötlemist eraldati ligikaudu 100 H358 sferoidi (seisundi kohta). Seejärel inkubeeriti sferoide 15 minutit jääl RIPA puhvris, millele oli lisatud proteaasi inhibiitorit. Seejärel tsentrifuugiti lüsaate 10 minutit temperatuuril 10,000 RCF. Seejärel kanti supernatant uude katsutisse, et SDS-PAGE prooviks ette valmistada Laemmli puhvris, keedeti 5 minutit temperatuuril 95 °C lõppkontsentratsioonini 1 mg/ml. SDS PAGE viidi läbi valgu eraldamiseks suuruse järgi, millele järgnes ülekandmine PVDF membraanile. Membraane inkubeeriti primaarsete p-ERK (CST) ja HSP90 (CST) antikehadega üleöö temperatuuril 4 °C. Seejärel inkubeeriti sekundaarseid antikehi (Abcam) 3 korda TBST-ga pestud membraanidel blokeerimispuhvris järgnevaks pildistamiseks.

Tistanche kasulikud omadused meestele - tugevdavad immuunsüsteemi

UMI deduplikatsioon

Paaritud otsa valgustuse näidud kärbiti adapteriga, kasutades vaikeseadetega FastP 21. UMI-d ekstraheeriti lugemisest ja teisaldati lugemisnimele, kasutades umi_tools_ekstrakti UMI-tööriistade paketist 22, vöötkoodimustriks määrati "NNNNNNNN". UMI eemaldatud lugemised joondati HG38 vastu, kasutades STAR joondusseadet koos GENCODE v38 annotatsioonikomplektiga. Joondatud lugemised eemaldati vaikeseadetega UMI-tools dedup abil.

RNA-seq analüüs

Kõik fastq-failid kärbiti rakendusega Trimmomatic 2 (0.38) 23 ja saadud kärbitud faile hinnati FastQC 24-ga ja seejärel töödeldi järgmise analüütilise torujuhtmega: Salmon (1.3.0): RNA pseudojoondumine -seq loeb rakendusega Salmon 25, kasutades järgmisi argumente: {{1{{20}}}}validateMappings –gcBias --seqBias --recoverOrphans --rangeFactorizationBins 4 kasutades indeks, mis on loodud GENCODE versiooni 35 transkriptsiooni fasta failist, kasutades valikulise joondamise võimaldamiseks peibutusjärjestusi. Täiendav TE-teadlik indeks loodi sarnasel viisil, kuid seda täiendati UCSC Repeat Maskeri rajalt genereeritud järjestustega. DESeq2 (1.32.0): Lõhe väljund imporditi DESeq-objekti, kasutades tximporti 26 ja diferentsiaalekspressiooni analüüs viidi läbi standardsete argumentidega 27. Kõik tulemused filtreeriti nii, et padj < 0,05. Kui kasutati loendusandmeid, normaliseeriti see proovide lõikes, kasutades DESeq.

Geenikomplekti rikastamise analüüs

Erinevalt ekspresseeritud geenid järjestati DESeq2 genereeritud kahanenud log2FoldChange väärtuste järgi. Geenikomplektid saadi R-paketi msigdbr (7.4.1) abil ja filtreeriti, et need sisaldaksid ainult Hallmarki staatusega geenikomplekte. Geenikomplekti rikastamise hinnangute genereerimiseks kasutati R-paketti fgsea (1.18.{7}}), mis filtreeriti tulemusteni, mille pväärtused olid < 0.05.

VIITED

1. Burns, KH (2017). Ülekantavad elemendid vähis. Nat Rev Cancer 17, 415-424. 10.1038/nrc.2017.35.

2. Reggiardo, RE, Maroli, SV, Halasz, H., Ozen, M., Carrillo, D., LaMontagne, E., Whitehead, L., Kim, E., Malik, S., Fernandes, J., et al. (2020). Korduvate mittekodeerivate RNA-de ja IFN-stimuleeritud geenide epigenoomne ümberprogrammeerimine mutantse KRAS-i abil. bioRxiv, 2020.2011.2004.367771. 10.1101/2020.11.04.367771.

3. Reggiardo, RE, Maroli, SV, Halasz, H., Ozen, M., Hrabeta-Robinson, E., Behera, A., Peddu, V., Carrillo, D., LaMontagne, E., Whitehead, L ., et al. (2022). Mutantne KRAS reguleerib ülekantavate elementide RNA-d ja kaasasündinud immuunsust KRAB tsink-sõrme geenide kaudu. Cell Reports 40. 10.1016/j.celrep.2022.111104.

4. Kim, DH, Marinov, GK, Pepke, S., Singer, ZS, He, P., Williams, B., Schroth, GP, Elowitz, MB ja Wold, BJ (2015). Üherakuline transkriptoomianalüüs näitab ümberprogrammeerimise ajal dünaamilisi muutusi lncRNA ekspressioonis. Raku tüvirakk 16, 88-101. 10.1016/j.stem.2014.11.005.

5. Reggiardo, RE, Maroli, SV ja Kim, DH (2022). Põletiku ja vähi LncRNA biomarkerid. Adv Exp Med Biol 1363, 121-145. 10.1007/978-3-030-92034-0_7.

6. Schmitt, AM ja Chang, HY (2016). Pikad mittekodeerivad RNA-d vähiteedes. Vähirakk 29, 452-463. 10.1016/j.ccell.2016.03.010.

7. Rinn, JL ja Chang, HY (2020). Pikad mittekodeerivad RNA-d: organismi funktsioonide molekulaarsed modaalsused. Annu Rev Biochem 89, 283-308. 10.1146/annurev-biochem- 062917-012708.

8. Slack, FJ ja Chinnaiyan, AM (2019). Mittekodeerivate RNA-de roll onkoloogias. Lahter 179, 1033-1055. 10.1016/j.cell.2019.10.017.

9. Chiappinelli, Katherine B., Strissel, Pamela L., Desrichard, A., Li, H., Henke, C., Akman, B., Hein, A., Rote, Neal S., Cope, Leslie M. , Snyder, A. et al. (2015). DNA metüülimise pärssimine põhjustab vähi korral interferoonireaktsiooni dsRNA, sealhulgas endogeensete retroviiruste kaudu. Lahter 162, 974-986. 10.1016/j.cell.2015.07.011.

10. Roulois, D., Loo Yau, H., Singhania, R., Wang, Y., Danesh, A., Shen, Shu Y., Han, H., Liang, G., Jones, Peter A., Pugh, Trevor J. et al. (2015). DNA-d demetüleerivad ained sihivad kolorektaalvähirakke, indutseerides endogeensete transkriptidega viiruse mimikri. Lahter 162, 961-973. 10.1016/j.cell.2015.07.056.

11. Mehdipour, P., Marhon, SA, Ettayebi, I., Chakravarthy, A., Hosseini, A., Wang, Y., de Castro, FA, Loo Yau, H., Ishak, C., Abelson, S ., et al. (2020). Epigeneetiline teraapia kutsub esile ümberpööratud SINE-de transkriptsiooni ja ADAR1 sõltuvuse. Loodus 588, 169-173. 10,1038/s41586-020-2844-1.

12. Ostrem, JM, Peters, U., Sos, ML, Wells, JA ja Shokat, KM (2013). K-Ras(G12C) inhibiitorid kontrollivad allosteeriliselt GTP afiinsust ja efektori interaktsioone. Loodus 503, 548- 551. 10.1038/loodus12796.

13. Hagemann-Jensen, M., Ziegenhain, C., Chen, P., Ramskold, D., Hendriks, GJ, Larsson, AJM, Faridani, OR ja Sandberg, R. (2020). Üherakuline RNA loendamine alleeli ja isovormi eraldusvõimega, kasutades Smart-seq3. Nat Biotechnol 38, 708-714. 10,1038/s{10}}.

14. He, X., Ashbrook, AW, Du, Y., Wu, J., Hoffmann, HH, Zhang, C., Xia, L., Peng, YC, Tumas, KC, Singh, BK jt. (2020). RTP4 inhibeerib IFN-I vastust ja suurendab eksperimentaalset ajumalaariat ja neuropatoloogiat. Proc Natl Acad Sci USA 117, 19465- 19474. 10.1073/pnas.2006492117.

15. Pereira, C., Gimenez-Xavier, P., Pros, E., Pajares, MJ, Moro, M., Gomez, A., Navarro, A., Condom, E., Moran, S., Gomez- Lopez, G. et al. (2017). Kopsuvähi patsientidest pärinevate ksenotransplantaatide genoomne profileerimine tuvastab B2M-i inaktiveerimise, mis kahjustab immuuntuvastust. Clin Cancer Res 23, 3203-3213. 10.1158/1078-0432.CCR-16-1946.

16. Sen, C., Freund, D. ja Gomperts, BN (2022). Kopsu kolmemõõtmelised mudelid: minevik, olevik ja tulevik: miniülevaade. Biochem Soc Trans 50, 1045-1056. 10.1042/BST20190569. 17. Mugarza, E., van Maldegem, F., Boumelha, J., Moore, C., Rana, S., Llorian Sopena, M., East, P., Ambler, R., Anastasiou, P., Romero -Clavijo, P. jt. (2022). Terapeutiline KRAS(G12C) inhibeerimine soodustab tõhusat interferooni poolt vahendatud kasvajavastast immuunsust immunogeensete kopsuvähkide korral. Sci Adv 8, eabm8780. 10.1126/sciadv.abm8780.

18. Khojah, R., Reggiardo, RE, Ozen, M., Maroli, SV, Carrillo, D., Demirci, U. ja Kim, DH (2022). Mutantsete KRAS (G12C) kopsu adenokartsinoomi rakkude ekstratsellulaarsed RNA signatuurid. bioRxiv, 2022.2002.2023.481574. 10.1101/2022.02.23.481574.

19. Wang, J., Ma, P., Kim, DH, Liu, BF ja Demirci, U. (2021). Mikrofluidipõhise eksosoomide eraldamise ja tuvastamise suunas kasvajaravi jaoks. Nano täna 37. 10.1016/j.nantod.2020.101066.

20. Moore, AR, Rosenberg, SC, McCormick, F. ja Malek, S. (2021). RAS-i suunatud ravimeetodid. Nat Rev Drug Discov. 10,1038/s41573-021-00220-6.

21. Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y. ja Gu, J. (2018). fastp: ülikiire kõik-ühes FASTQ eelprotsessor. Bioinformaatika 34, i884-i890. 10.1093/bioinformatics/bty560.

22. Smith, T., Heger, A. ja Sudbery, I. (2017). UMI-tööriistad: unikaalsete molekulaarsete identifikaatorite järjestusvigade modelleerimine, et parandada kvantifitseerimise täpsust. Genome Res 27, 491- 499. 10.1101/gr.209601.116.

23. Bolger, AM, Lohse, M. ja Usadel, B. (2014). Trimmomatic: paindlik trimmer Illumina järjestuse andmete jaoks. Bioinformaatika 30, 2114-2120. 10.1093/bioinformatika/btu170.

24. Brown, J., Pirrung, M. ja McCue, LA (2017). FQC armatuurlaud: integreerib FastQC tulemused veebipõhisesse, interaktiivsesse ja laiendatavasse FASTQ kvaliteedikontrolli tööriista. Bioinformaatika. 10.1093/bioinformaatika/btx373.

25. Patro, R., Duggal, G., Love, MI, Irizarry, RA ja Kingsford, C. (2017). Lõhe pakub transkripti ekspressiooni kiiret ja eelarvamusteadlikku kvantifitseerimist. Nat Methods 14, 417-419. 10,1038/nmeth.4197.

26. Soneson, C., Love, MI ja Robinson, MD (2015). RNA-seq diferentsiaalanalüüsid: transkriptitaseme hinnangud parandavad geenitaseme järeldusi. F1000Res 4, 1521. 10.12688/f1000research.7563.2.

27. Love, MI, Huber, W. ja Anders, S. (2014). RNA-seq andmete korduvuse ja dispersiooni mõõdukas hinnang DESeq2-ga. Genome Biol 15, 550. 10,1186/s13059-014- 0550-8.

TUNNUSTUS

Täname Kim Labi liikmeid kasulike arutelude eest. Seda tööd toetasid Baskini insenerikooli vahendid (DHK-le). DC-d toetati tubakaga seotud haiguste uurimisprogrammi (T30DT0997) doktorikraadieelse stipendiumi auhinnaga, RER-i toetas riiklike tervishoiuinstituutide F99/K00 NIDDK KUH eeldoktoraadist järeldoktorandi stipendiumi auhind (1F99DK{). {7}}) ja asepresidenti toetati tubakaga seotud haiguste uurimisprogrammi (T32DT4904) doktorikraadieelse stipendiumi auhinnaga.

AUTORI KAASALAD

DHK kontseptualiseeris uuringuid, DC ja DHK kavandasid uuringuid, DC, JL ja GM tegid katseid, RER ja VP analüüsisid andmeid ning DC ja DHK kirjutasid artikli autorite panusega.

ARVANDMED

Joonis 1. KRAS(G12C) inhibeerimine muudab kodeerivat ja mittekodeerivat transkriptoomi A. Eksperimentaalne skeem. B. GENCODE'i kodeerivatele, lncRNA-le ja TE/korduvatele superperekondadele määratud loenduste jaotus ARS-iga töödeldud (ars) või DMSO-ga töödeldud (dmso) kopsuvähi sferoidse RNA-seq raamatukogudes, kus iga veerg esindab bioloogilist replikatsiooni. C. DMSO-ga töödeldud (parempoolne, positiivne NES) või ARS-ga töödeldud (vasakpoolne, negatiivne NES) kopsuvähi sferoidide puhul täheldatud olulise geenikomplekti rikastamise analüüsi tulemused, kasutades erinevalt ekspresseeritud geene, mis on järjestatud normaliseeritud rikastamise skoori (NES) järgi.

Joonis 2. KRAS(G12C) inhibeerimine indutseerib koordineeritult ISG-sid ja noori AluY elemente

A. Vulkaanidiagrammid, mis kujutavad olulist diferentsiaalset ekspressiooni, mida täheldati võtmegeenide komplektides DMSO-ga töödeldud (parempoolne, positiivne kordne muutus) või ARS-iga töödeldud (vasakpoolne, negatiivne voldimuutus) kopsuvähi sferoidide vahel. B. Vulkaanidiagrammid, mis kujutavad TE superperekondades täheldatud olulist diferentsiaalset ekspressiooni DMSO-ga töödeldud (parempoolne, positiivne voldimuutus) või ARS-iga töödeldud (vasakpoolne, negatiivne voltimuutus) kopsuvähi sferoidide vahel.

Joonis 3. KRAS(G12C) inhibeerimine vähendab pikki mittekodeerivaid RNA-sid

A. GENCODE-i valku kodeerivate RNA-de ja lncRNA-de olulise diferentsiaalse ekspressiooni vulkaanidiagramm DMSO-ga töödeldud (parempoolne, positiivne kordne muutus) või ARS-iga töödeldud (vasakpoolne, negatiivne voldimuutus) kopsuvähi sferoidide vahel. B. GENCODE-i valku kodeerivate RNA-de ja lncRNA-de olulise diferentsiaalse ekspressiooni kastdiagramm DMSO-ga töödeldud (ülemine, positiivne voldimuutus) või ARS-iga töödeldud (alumine, negatiivne voldimuutus) kopsuvähi sferoidide (Wilcoxon) vahel.

TÄIENDAV JOONIS

Joonis S1.

A. H358 3D kopsuvähi sferoidid, mida on ravitud ARS-i või DMSO-ga. B. Western blot p-ERK ja HSP90 jaoks, kasutades H358 3D kopsuvähi sferoide, mida on töödeldud ARS-i või DMSO-ga. C. ARS-i või DMSO-ga töödeldud H{5}D-kopsuvähi sferoidide läbimõõdu mõõtmised (mikromeetrites) (vasak graafik) ja rakkude elujõulisus (Cell Titer-Glo® luminestsentsrakkude elujõulisus suhtelistes fluorestsentsühikutes) (parem graafik) 3 või 5 päeva ravi (500 nM ARS-1620 või DMSO). D. H358 3D kopsuvähi sferoidide läbimõõt (mikromeetrites), mida on töödeldud ARS-1620 (nM) erineva kontsentratsiooniga 7 päeva jooksul.