Lüsosomaalne lipiidide peroksüdatsioon reguleerib kasvaja immuunsust

Palmitoüülvalgu tioesteraasi 1 (PPT1) inhibiitorite, nagu DC661, poolt esile kutsutud lüsosomaalne inhibeerimine võib põhjustada rakusurma, kuid selle mehhanismi ei mõisteta täielikult. DC661 tsütotoksilise toime saavutamiseks ei olnud vaja programmeeritud rakusurma teid (autofagia, apoptoos, nekroptoos, ferroptoos ja püroptoos). Katepsiinide inhibeerimine või raua või kaltsiumi kelaatimine ei päästnud DC661-indutseeritud tsütotoksilisust. PPT1 inhibeerimine indutseeris lüsosomaalse lipiidide peroksüdatsiooni (LLP), mis viis lüsosomaalse membraani permeabiliseerumiseni ja rakusurma, mida antioksüdant N-atsetüültsüsteiin (NAC), kuid mitte muud lipiidide peroksüdatsiooni antioksüdandid, võib tagasi pöörata. Lüsosomaalne tsüsteiini transporter MFSD12 oli vajalik NAC lüsosomaalseks transpordiks ja LLP päästmiseks. PPT1 inhibeerimine tekitas kalretikuliini pinnaekspressiooniga rakusisese immunogeensuse, mida sai tagasi pöörata ainult NAC-ga. DC661-töödeldud rakud tekitasid naiivseid T-rakke ja suurendasid T-rakkude poolt vahendatud toksilisust. DC661-töödeldud rakkudega vaktsineeritud hiired tekitasid adaptiivse immuunsuse ja tuumori äratõukereaktsiooni „immuunse kuumade” kasvajate puhul, kuid mitte „immuunse külma” kasvajate puhul. Need leiud näitavad, et LLP põhjustab lüsosomaalset rakusurma, rakusurma ainulaadset immunogeenset vormi, osutades teele immunoteraapia ja lüsosomaalse inhibeerimise ratsionaalsetele kombinatsioonidele, mida saab kliinilistes uuringutes testida.

Cistanche tubulosa-Antitumor eelised

Sissejuhatus

Julgustav tegevus kliinilistes uuringutes, mis hõlmavad lüsosomaalset inhibiitorit hüdroksüklorokviini (HCQ) (1), palmitoüülvalgu tioesteraasi 1 (PPT1) tuvastamist klorokiini derivaatide molekulaarse sihtmärgina (2) ja uudsete PPT1 inhibiitorite kasutuselevõttu kliinilistes tingimustes. uuringutes (3, 4), on vaja mõista mehhanismi, mille abil lüsosomaalsed inhibiitorid kutsuvad esile rakusurma, ja lüsosomaalse inhibeerimise mõju kasvaja immuunsusele. HCQ puhul kirjeldatud lüsosomaalse rakusurma kanooniline mehhanism hõlmab lüsosomaalse membraani permeabiliseerimist (LMP), katepsiinide lekkimist ja kaspaasi poolt vahendatud apoptoosi aktiveerimist (5, 6). Oleme varem näidanud, et lüsosomaalne inhibiitor DC661 tungib happelise kasvaja mikrokeskkonna rakkudesse ja lokaliseerub lüsosoomile tõhusamalt kui HCQ (2, 7). DC661 põhjustab paljudes vähirakuliinides tugevat rakusurma (2). DC661 seob ja inhibeerib PPT1, hapestab lüsosoomi ja pärsib autofagiat. DC661 indutseerib ka LMP-d ja suurendab lõhustatud kaspaas 3 taset (2, 7). Viimastel aastatel on määratletud uudsed rakusurma mehhanismid, millel on immunogeensed tagajärjed ja mis hõlmavad nekroptoosi, ferroptoosi ja püroptoosi (8). On näidatud, et lüsosoomist sõltuv autofagia lagundab MHC I klassi (9) ja ka immunoproteasoomi komponente (10), mis viitab sellele, et autofagia inhibeerimine võib suurendada antigeeni töötlemist. Lüsosomaalse inhibeerimise ja sellest tuleneva rakusurma immunogeenset mõju ei ole siiski täielikult iseloomustatud. Selle teadmiste puudujäägi lahendamiseks uurisime DC661 mõju kanoonilistele rakusurma mehhanismidele, et teha kindlaks, kas lüsosomaalne rakusurm on selle rakusurma vorm või lihtsalt mõne muu väljakujunenud mehhanismi eelkäija. Leidsime, et HCQ ja DC661 indutseerisid melanoomi proteoomis vaid väikese arvu valkude märkimisväärse suurenemise ja enamik neist olid autofagia ja apoptoosiga seotud valgud. Programmeeritud rakusurma (apoptoos, nekroptoos, ferroptoos ja püroptoos) inhibiitorid ei leevendanud tsütotoksilist toimet pärast DC661 lüsosomaalset kahjustust. Lüsosomaalne lipiidide peroksüdatsioon (LLP) on LMP-indutseeritud rakusurma peamine tegur, mis on seotud kalretikuliini (CALR) ekspressiooniga rakupinnal. Seda rakusurma vormi saab tagasi pöörata ainult antioksüdanti N-atsetüültsüsteiini (NAC) kasutades. NAC aktiivsust kahjustas lüsosomaalse tsüsteiini importija MFSD12 inhibeerimine. LLP kutsus esile immunogeensed fenotüübid, mis soodustasid T-rakkude poolt vahendatud tapmist. Need leiud näitavad, et lüsosomaalne rakusurm on potentsiaalselt ainulaadne immunogeense rakusurma vorm.

cistanche taime suurendav immuunsüsteem

Tulemused

Lüsosomaalne inhibeerimine kutsub esile olulisi muutusi autofagia ja apoptoosiga seotud proteoomides. Lüsosomaalsete inhibiitorite tsütotoksilise toime kindlakstegemiseks hindasime vakuolaarse H+-ATPaasi inhibiitori bafilomütsiin-A1-ga ravitud A375P melanoomi, RKO käärsoolekartsinoomi ja MIA PaCa-2 pankreasevähi rakuliinide elujõulisust (1 00 nM); PPT1 inhibiitorid DC661 (3 μM) või HCQ (10 μM või 30 μM); palmitaat-mimeetiline heksadetsüülsulfonüülfluoriid (HDSF; 60 μM); katepsiini inhibiitorid pepstatiin A (PepA; 10 ug/ml), E64 (PepA; 10 ug/ml) või PepA+E64; ja lüsosomaalse membraani lõhkuja Leu-Leu metüülestervesinikbromiidi (20 μM) 48 tunni jooksul. Ainult bafilomütsiin-A1 ja DC661 põhjustasid rakkude elujõulisuse olulist vähenemist vähirakuliinides (joonis 1A ja täiendav joonis 1A; selle artikliga on veebis saadaval lisamaterjal; https://doi.org/10.1172/JCI164596DS1), kusjuures DC661 tootis rakkude elujõulisuse sügavam vähenemine kui bafilomütsiin-A1. Nende andmete ja klorokiini derivaatide farmakoloogiliste ravimisarnaste omaduste põhjal keskendusime oma uuringus klorokiini derivaatidele kui vahenditele lüsosomaalse rakusurma mõistmiseks. Erapooletut globaalset proteoomianalüüsi rakendati A375P melanoomirakkudele, mida töödeldi DC661-ga (3 μM) või vähem tugevama HCQ-ga (10 μM või 30 μM) 24 tunni jooksul. 4264 kõrge usaldusväärsusega kvantifitseeritud valgust suurenesid DC661 (3 μM) ja HCQ (30 μM) puhul oluliselt ainult 87 ja 55 valku; lisaks vähenes DC661 (3 μM) ja HCQ (30 μM) puhul oluliselt 14 ja 15 valku (absoluutne korduv muutus suurem kui 2; q < 0,05) vastavalt DC661 (3 μM) või HCQ (30 μM) korral. , võrreldes sõiduki kontrolliga. Väiksem HCQ annus (10 μM) ei näidanud olulisi valgu muutusi võrreldes vehiikuli kontrolliga. 50 parimat valku, mis pärast DC661-ravi oluliselt suurenesid, olid peamiselt seotud autofagia ja apoptoosiga ning sarnaseid muutusi täheldati ka HCQ suurema annuse puhul (joonis 1B). Nendel põhjustel otsustasime keskenduda edasistele uuringutele võimsamale DC661-le. Mõnede suurimate autofagia ja apoptoosiga seotud valgumuutuste näited olid tax1-siduv valk 1 (TAX1BP1; suurenenud 15- korda); BCL2-interakteeruv valk 3 (BNIP3; suurenenud 6- korda); BRCA1 geeni 1 valgu naaber (NBR1; suurenenud 12- korda); sekvestosoom-1 (SQSTM1/p62; suurenenud 5-korda); tuumaretseptori koaktivaator 4 (NCOA4; suurenenud 3- korda); ja LC3B (MAP1LC3B; suurenenud 3- korda). Apolipoproteiin B-100 (APOB; suurenenud 66- korda) saadi vasika loote seerumist ja seda ei uuritud edasi. Immunoblotanalüüs kinnitas, et ravi DC661 või kõrgemate kontsentratsioonidega HCQ suurendas oluliselt autofagia lastiretseptorite NBR1, TAX1BP1, SQSTM1/p62 ja NCOA4 ekspressiooni annusest ja ajast sõltuval viisil (täiendav joonis 1, B ja C). PPT1 CRISPR / Cas9 KO A375P rakkudes fenokopeeris DC661 mõju nendele valkudele võrreldes nende WT kolleegidega (täiendav joonis 1D). Kuid autofagia lastiretseptorite ekspressioon ja DC661-ravi indutseeritud suhteline suurenemine olid käärsoolevähi, kõhunäärmevähi ja teiste melanoomi rakuliinide puhul, milles DC661 demonstreerib tsütotoksilisust (täiendav joonis 1E). See viitas sellele, et autofagia lastiretseptorid ise, kuigi valgu tasemel suurenenud, ei ole tõenäoliselt vastutavad rakusurma eest pärast DC661-ravi. Selle kinnitamiseks keskendusime autofagia lastiretseptoritele TAX1BP1 ja BNIP3, kuna neil on vähirakkudes teadaolevad proapoptootilised toimed (joonis 1C). TAX1BP1 on autofagia lastiadapter (11) ja reguleerib ka valgusünteesi inhibiitorite või DNA-d kahjustavate ainete poolt vähirakkudes indutseeritud apoptoosi (12). TAX1BP1 hävitamine siRNA poolt (joonis 1D) ei mõjutanud DC{119}}indutseeritud tsütotoksilisust lühiajalistes (joonis 1E) ja pikaajalises elujõulisuse testis (joonis 1F). Need tulemused näitasid, et TAX1BP1 ei mängi DC{126}}vahendatud tsütotoksilisuses olulist rolli. BNIP3 on proapoptootiline valk, mis kahjustab mitokondriaalset bioenergeetikat ja reguleerib mitofaagiat (13). BNIP3 tõhus katkestamine (joonis 1G) ei mõjutanud DC{131}}indutseeritud tsütotoksilisust (joonised 1, H ja I). Need tulemused näitasid, et DC661 tsütotoksilised toimed ei sõltu BNIP3 ekspressioonist. Järgmisena uurisime autofagosoomide tootmiseks vajalike kanooniliste autofagia geenide rakkude kahanemise mõju DC661 efektiivsusele, hävitades unc{136}} nagu autofagia aktiveeriv kinaasi 1 (ULK1) ja autofagiaga seotud geen 7 (ATG7). ULK1 või ATG7 (täiendav joonis 2, A ja B) efektiivne pärssimine inhibeeris autofagilist voogu (täiendav joonis 2C), kuid ei mõjutanud DC{146}}indutseeritud tsütotoksilisust (joonis 1, J–M). Need tulemused näitasid, et olulise autofagia põhimasina puudumine ei tühista DC661 tsütotoksilist toimet. Lüsosomaalne inhibeerimine DC661 poolt kutsub esile mitu programmeeritud rakusurma rada. Kanooniline seisukoht on, et lüsosomaalsete rakkude surm on tingitud apoptoosist (5). Immunoblotanalüüs näitas, et ravi DC661-ga põhjustas kaspaaside -3, -7 ja -9 aktiveerumise ning PARP-1 lõhustumise, kinnitades, et DC661 aktiveeris apoptoosi (joonis 2A). Pan-kaspaasi inhibiitor Z-VAD-FMK takistas kaspaaside aktiveerimist DC661 poolt, kuid ei inhibeerinud LC3B ja p62 akumulatsiooni, näidates, et apoptoosi aktiveerimine ja autofagia blokaad on pärast lüsosomaalset inhibeerimist eraldatavad (joonis 2B). Apoptoosi blokeerimine ZVAD-FMK-ga ei suurendanud ega piiranud DC661 tsütotoksilisust, mis viitab sellele, et apoptoos on lüsosomaalse rakusurma jaoks hädavajalik (joonis 2, C ja D). DC661 tsütotoksilised toimed olid sarnased Bax / Bak topeltKO primaarsetes luuüdi rakkudes, mis ei olnud võimelised apoptoosi läbima, ja WT rakkudes (joonis 2E). Apoptoosi blokaad ei mõjutanud DC{171}}indutseeritud tsütotoksilisust ka käärsoolevähi ja kõhunäärmevähi rakkudes (täiendav joonis 2, D–F). Kuna leidsime, et DC{173}}indutseeritud rakusurma puhul on apoptoos hädavajalik, uurisime, kas DC661 kutsub esile nekroptoosi, mis on programmeeritud rakusurma teine ​​vorm, mida reguleerivad retseptoritega interakteeruv proteiinkinaas (RIPK) ja segaliini kinaasi domeenitaoline valk ( MLKL). RIPK ja MLKL fosforüülitud ja aktiveeritud vormide tase tõusis pärast DC661-ga töötlemist 0, 1–1 μM (joonis 2F). 3 μM DC661 juures puudus fosforüülitud RIPK1, kuid püsis fosforüülitud MLKL, mis viitab sellele, et selle kõrgema kontsentratsiooni korral võib kaasata rakusurma täiendavaid vorme. Eeltöötlemine RIPK1 inhibiitorite necrostatin{186}} või necrostatin-1s või MLKL inhibiitori nekrosulfoonamiidiga takistas RIPK1 fosforüülimist pärast DC661 (1 μM) töötlemist melanoomirakkudes (joonis 2G), kuid ei suutnud päästa DC{{192 }}indutseeritud tsütotoksilisus melanoomirakkudes (joonis 2H) või käärsoolevähi või kõhunäärmevähi rakkudes (täiendav joonis 2G). Need leiud viitavad sellele, et nekroptoos on aktiveeritud, kuid DC{195}}vahendatud rakusurma jaoks hädavajalik.

Joonis 1. Lüsosomaalne autofagia inhibeerimine kutsub esile olulisi muutusi apoptoosis ja autofagia valkudes. (A)

Lüsosoomid on üks peamisi raua ladustamiskohti. Düsreguleeritud rakusisene raua metabolism koos vähenenud redutseerimisvõimega võib vallandada mitteapoptootilise rakusurma, mida nimetatakse ferroptoosiks. Ferroptoosi iseloomulik tunnus on prostaglandiini-endoperoksiidi süntaasi 2 (PTGS2), katioonitranspordi regulaatori homoloogi 1 (CHAC1) ja tsüsteinüül-tRNA süntetaasi (CARS) ülesreguleerimine (14). Kõik kolm neist ferroptoosimarkeritest olid DC661-raviga transkriptsiooniliselt ülesreguleeritud (joonis 3A), mis viitab sellele, et lüsosomaalne inhibeerimine kutsub esile ferroptoosi. DC661 kutsus esile fluorestsentsi nihke C11-BODIPY-ga töödeldud A375P rakkudes, mis näitab ferroptoosile iseloomulikku lipiidide peroksüdatsiooni. See DC661-indutseeritud nihe pöördus ferroptoosi inhibiitorite ferrostatiini-1 või huuleroksstatiini-1 efektiivses kontsentratsioonis (joonis 3B ja täiendav joonis 3A) manulusel oluliselt tagasi, mis näitab veelgi, et DC661 indutseeritud ferroptoos. Kuid ferroptoosi inhibeerimine ei päästnud DC661-ga seotud tsütotoksilisust (joonis 3, C ja D). Vähirakkude töötlemine raua kelaativa deferoksamiini (DFO) ja DC661-ga ei päästnud DC661 tsütotoksilisust (joonis 3E). Ravi ferrostatiin-1, huuleroksstatiin-1 või DFO-ga ei päästnud DC661 lühiajalise elujõulisuse või pikaajalise klonogeense kasvu inhibeerimist melanoomi-, käärsoole- ja kõhunäärmevähirakkudes (täiendav joonis 3, B –E ja lisajoonis 4, A–D). Need andmed näitavad, et ferroptoos on aktiveeritud, kuid DC661-vahendatud rakusurma jaoks hädavajalik. Püroptoos on programmeeritud rakusurma vorm, mis on seotud põletikulise reaktsiooniga, mis hõlmab gastriini (GSDM) töötlevate kaspaaside aktiveerimist, võimaldades plasmamembraanil pooride moodustumist ja sellele järgnevate kahjustustega seotud molekulaarmustrite, näiteks suure liikuvusega, vabanemist. rühmakast 1 (HMGB1). DC661 ravi mitmes melanoomi rakuliinis (A375P, A375, WM35 ja WM793) põhjustas püroptoosile tüüpilise initsiaatorkaspaasi-8 ja -9 ning timukakaspaasi-7 aktiveerumise ja produtseerimise. täispika GSDME lõhustamine, mis on oma ulatuselt sarnane teadaoleva püroptoosi indutseerijaga PLX4720 ja PD0325901 (täiendav joonis 5A). DC661 põhjustas HMGB1 tugevama ekstratsellulaarse vabanemise kui tuntud püroptoosi indutseerija BRAF ja MEK inhibeerimine 1% FBS-is (15), mis peegeldab aktiveeritud püroptoosi funktsionaalset tagajärge. Järgmisena testisime, kas püroptoosi pärssimine GSDME KO-ga parandaks DC661 tsütotoksilist toimet. DC661-ravi indutseeris LC3II ja SQSTM1 / p62 akumulatsiooni ja kaspaasi aktivatsiooni, kuid HMGB1 vabanemine GSDME-KO WM35 inimese rakkudes peaaegu täielikult tühistati, näidates, et püroptoosi inhibeerimise funktsionaalne tagajärg saavutati (joonis 3F). DC661-ga töötlemine tekitas aga võrdse tsütotoksilisuse YUMM1.7 WT, tühja vektoriga (EV) ja Gsdme KO1 ja KO2 rakkudes nii 10% kui ka 1% FBS tingimustes (joonis 3G ja täiendav joonis 5B). Rakusurma mitme vormi üks levinud tagajärg on LDH vabanemine. DC661 suurendas märkimisväärselt LDH vabanemist ja seda ei saanud apoptoosi, nekroptoosi ega ferroptoosi inhibeerimisega ümber pöörata (täiendav joonis 5C). Need tulemused näitasid, et DC661 kutsub esile mitmeid rakusurma viise, sealhulgas apoptoosi ja püroptoosi, aga ka nekroptoosi ja ferroptoosi, kuid ükski neist rakusurma viisidest ei ole DC{73}}indutseeritud rakusurma jaoks vajalik. Katepsiini inhibeerimine või kaltsiumi kelaatimine ei takista rakusurma lüsosomaalse membraani permeabiliseerimisest. Olles näidanud, et kaspaaside aktiveerimine (mis on vajalik apoptoosi ja püroptoosi jaoks) on DC661-indutseeritud rakusurma jaoks hädavajalik, oletasime, et katepsiini vabanemine lüsosoomidest võib põhjustada kaspaasist sõltuvat rakusurma. PPT1 keemiline (DC661) või geneetiline (PPT1 siRNA [siPPT1]) inhibeerimine põhjustas lüsosomaalse membraani permeabilisatsiooni (LMP), samas kui HDSF, vähem tugev PPT1 pöördumatu inhibiitor, mis rakukultuuris kiiresti ammendub, ei suutnud mõõdetuna LMP-d esile kutsuda. galektiin-3-positiivse puncta poolt (joonis 4A). LMP põhjustab katepsiinide ja muu lüsosomaalse sisu vabanemist tsütoplasmasse ja arvatakse, et see on lüsosoomipõhise rakusurma peamine proksimaalne tunnus. DC661 poolt indutseeritud LMP-d seostati tsütoplasmaatilise katepsiin-L aktiivsuse olulise suurenemisega, mis oli märkimisväärselt blokeeritud tsüsteiini proteaasi inhibiitoriga E64 (joonis 4B). Varasemad aruanded on näidanud, et katepsiini vabanemine purunenud lüsosoomidest soodustab kaspaaside aktivatsiooni, mis põhjustab apoptootilise rakusurma (16–18). Katepsiini täielik inhibeerimine ei takistanud kaspaasi lõhustumist (joonis 4C) ega päästnud DC661-indutseeritud tsütotoksilisust lühi- ja pikaajalises elujõulisuse testides melanoomi (joonis 4, D ja E), käärsoolevähi ja pankrease korral vähirakud (täiendav joonis 6, A–C). Need tulemused on vastuolus kanoonilise vaatega lüsosomaalse rakusurma kohta, mis on tingitud katepsiini poolt vahendatud rakusurmast. Lisaks katepsiini vabanemisele lekkivatest lüsosoomidest on kaltsiumi vabanemine lüsosoomidest seotud raku düsfunktsiooniga, kui PPT1 on kahjustatud (19). DC661 ravi põhjustas ulatusliku kaltsiumi vabanemise, mis tühistati raku püsiva kaltsiumi (Ca{101}}) kelaatori BAPTA-AM eeltöötlemisega. (Joonis 4F). Nimelt ei takistanud BAPTA-AM DC{105}}indutseeritud LMP (joonis 4G) ega kaspaasi lõhustumist (täiendav joonis 6, D ja E) ning mis kõige tähtsam, ei päästnud DC{108}}indutseeritud tsütotoksilisust ( Joonis fig 4H). Neid leide täheldati ka nii RKO kui ka MIA PaCa{110}} rakuliinidel, kus BAPTA-AM ja DC661 puhul ei täheldatud olulisi erinevusi IC50 väärtustes (täiendav joonis 6F), mis viitas sellele, et LMP-ga seotud rakusurm ei sõltu kaltsiumist ega katepsiinidest.

Joonis 2. DC661-indutseeritud apoptoos ja nekroptoos. (A)

Joonis 3. DC661-indutseeritud ferroptoos ja püroptoos. (A)

LLP juhib LMP-d. Olles kindlaks teinud, et peamiste rakusurmaradade (apoptoos, nekroptoos, ferroptoos ja püroptoos), katepsiinid (PepA ja E64) ja ioonide kelaatorid (BAPTA-AM [Ca2+] ja DFO [Fe{{3}) }]) ei hoidnud ära rakusurma DC661 poolt ja leides tõendeid lipiidide peroksüdatsiooni kohta C-11-BODIPY poolt, teostasime 2 ja 4 tundi pärast ravi DC661-ga globaalse lipidoomianalüüsi. DC661 kutsus esile varajase ja püsiva 3- kuni 10-kordse tõusu igas lüsofosfolipiidide klassis (joonis 5A). Seevastu fosfolipiidide klassides, sealhulgas fosfatidüülkoliinis, fosfatidüületanoolamiinis, fosfatidüülseriinis, fosfatidüülinositoolis, fosfatidüülglütseroolis ja fosfatiidhappes, täheldati minimaalseid muutusi või üldse mitte (täiendav joonis 7A). Lüsofosfolipiidi liike saab tekitada ROS, mis oksüdeerib küllastunud rasvhapete ahelat, mis seejärel fosfolipaaside poolt lõhustatakse (20). Et teha kindlaks, kas antioksüdandid võivad ära hoida ROS-vahendatud lipiidide kahjustusi, uurisime DC{16}}indutseeritud tsütotoksilisust pan-ROS-i püüdja ​​N-atsetüültsüsteiini (NAC) (21, 22) ja oletatavate lipiidide peroksüdatsiooni inhibiitorite Trolox (23) juuresolekul. ) ja C-vitamiini (askorbiinhape) (24, 25). Erinevalt kõigist teistest seni testitud ainetest päästis NAC-ga töötlemine DC661-seotud tsütotoksilisuse mitme rakuliini vahel (joonis 5B ja täiendav joonis 7B). Pikaajalised CFU testid näitasid, et erinevalt kõigist siin testitud rakusurma inhibiitoritest, ioonide kelaatoritest ja katepsiini inhibiitoritest hoidis NAC ära DC661 tsütotoksilise toime A375P, RKO, MIA PaCa-2, B16F10 ja MC38 rakkudes. Joonis 5C ja lisajoonis 7C). Huvitaval kombel ei päästnud Trolox ja C-vitamiin DC661 tsütotoksilisust inimese melanoomi, kolorektaalse vähi, kõhunäärmevähi rakkude ning hiire melanoomi ja kolorektaalse vähi rakkude puhul (joonis 5D ja täiendav joonis 7, D – H). See erinevus ajendas meid testima, kas NAC, Trolox ja C-vitamiin mõjutasid LMP-d. Meie tulemused näitasid, et NAC oli ainus antioksüdant, mis vähendas oluliselt DC661-indutseeritud LMP-d (joonis 5E). Hüpoteesisime, et LLP juhib LMP tootmist DC661 abil, mida NAC võib tagasi pöörata, kuid mitte Trolox ja C-vitamiin. LLP protsessi uurimiseks kasutasime fluorestseeruvat sondi FOAM-LPO (26), mis lokaliseerub spetsiifiliselt lüsosoomile ja toodab lipiidperoksiididega kokkupuutel spektraalne nihe 586-lt 512 nm-le (punane roheliseks). Leidsime, et DC661 indutseeris LLP-d võrreldes kontrolliga (joonis 5F). NAC vähendas lipiidide peroksüdatsiooni DC661--ga töödeldud melanoomirakkude lüsosoomides, samas kui Trolox ja C-vitamiin ei suutnud LLP-d vähendada (joonis 5F). NAC, Trolox ja C-vitamiin eraldi ei avaldanud lipiidide peroksüdatsioonile olulist mõju. PPT1 katkestamine (täiendav joonis 8A) või töötlemine HCQ kõrge kontsentratsiooniga (täiendav joonis 8B) indutseeris ka LMP, mida NAC võis muuta, samas kui ULK1 keemiline inhibeerimine ei indutseerinud LMP-d (täiendav joonis 8C). Oluline on, et siPPT1 katkestamine hõlmas ka LLP-d, mida sai NAC-iga tagasi pöörata (täiendav joonis 8D). Need tulemused näitasid, et PPT1 inhibeerimine indutseerib LLP-d, mida NAC saab päästa ja mis on tõenäoliselt PPT1- inhibeerimisest põhjustatud LMP põhjus. Lisaks näitasid need leiud, et LLP on lüsosomaalsete rakkude surma jaoks kriitilise tähtsusega.

Hiina herb tsitanche taim-kasvajavastane

Tsüsteiini import lüsosoomidesse MFSD12 abil nõrgendab lüsosomaalsete rakkude surma. Kolmest lipiidide peroksüdatsiooni inhibiitorist takistas LLP-d ainult NAC. Hiljutine aruanne näitas, et 12 sisaldav peamine hõlbustaja superperekonna domeen (MFSD12) on lüsosoomide ja melanosoomide tsüsteiini importija oluline komponent (27). Põhjendasime, et NAC või selle metaboliit tsüsteiin transporditakse lüsosoomi MFSD12 kaudu, kus tsüsteiin oksüdeeritakse selle disulfiidiks, tsüsteiiniks. Selle hüpoteesi testimiseks võrdlesime NAC-i võimet päästa DC661 tsütotoksilisust siNT ja siMFSD12 A375P-hGal3-EGFP rakkudes. Meie tulemused näitasid, et NAC päästis siNT rakkudes DC661-indutseeritud LMP, kuid ei päästnud LMP-d siMFSD12 rakkudes (joonis 6A). NAC vähendas DC661-töödeldud siNT-A375P rakkude, kuid mitte siMFSD12 rakkude LLP-d. DMSO või NAC-ga töödeldud siMFSD12 rakkudel oli suurenenud basaal-LLP (joonis 6B) võrreldes siNT rakkudega. Kui NAC päästis siNT rakkudes DC661 tsütotoksilisuse, siis NAC-i võime päästa DC661 tsütotoksilisust tühistati siMSFD12 rakkudes täielikult (joonis 6C). See näitas, et MFSD12 knockdown blokeerib NAC tsütoprotektiivset toimet DC661 vastu. NAC deatsetüülitakse atsülaasi toimel tsütosoolis (28). Et teha kindlaks, kas NAC-ravi põhjustab tsüsteiini või tsüstiini akumuleerumist lüsosoomides, kasutasime lüsosomaalse immunosadestamise (Lyso-IP) tehnikat (29), et puhastada lüsosoomid DMSO ja NAC-ga töödeldud A375P rakkudest (joonis 6D ja lisajoonis 9A). sihipärane metaboloomika NAC ja sellega seotud metaboliitide kvantifitseerimiseks. Nagu oodatud, tuvastati NAC NAC-ga töödeldud täisrakulüsaadis ja sellega seotud seondumata fraktsioonides. L-tsüsteiini tase tõusis NAC-ga töödeldud lüsosoomides oluliselt. L-tsüstiin oli tuvastatav ainult NAC-ga töödeldud lüsosoomides. Silmatorkavalt ei leidnud me NAC-ga töödeldud rühmades glutatiooni (vähendatud) sisalduse olulist suurenemist (joonis 6E); see oli üllatav, sest üldiselt arvatakse, et NAC-ravi kutsub esile glutatiooni tootmise suurenemise, korrigeerides redoks-tasakaalu. Need tulemused viitavad sellele, et MFSD12 importija kaudu lüsosoomidesse imporditud tsüsteiin on LLP, LMP ja lüsosomaalse rakusurma päästmisel kriitilise tähtsusega. LLP on immunogeenne. Mõned DC661 poolt indutseeritud reguleeritud rakusurma vormid (püroptoos, nekroptoos, ferroptoos) on tuvastatud kui immunogeensed. Varem on keemiaravi ravimite puhul kirjeldatud immunogeenset rakusurma iseloomulike tunnuste põhjal, mis hõlmavad kahjustusega seotud molekulaarsete mustrite kuvamist, sealhulgas CALR-i rakupinna ekspressiooni ning HMGB1 valgu ja adenosiintrifosfaadi (ATP) vabanemist (30). CALR toimib raku stressi ajal rakupindadega kokkupuutel "söö mind" signaalina. HMGB1 ja ATP rakuväline vabanemine toimib "leida mind" signaalina, mille fagotsüütrakud tunnevad ära. Võrdlesime kahte mudelit: B16F10 rakud, mis süngeensetes kasvajamudelites on peaaegu täielikult puuduvad kasvajasse infiltreeruvad lümfotsüüdid, ja MC38 rakud, millel on süngeensete kasvajamudelite korral kasvajasse infiltreeruvad lümfotsüüdid. Esiteks näitasime, et DC661 või siPpt1 töötlemine indutseerib märkimisväärselt pinna CALR ekspressiooni, mille saab NAC-i kaastöötlemisega MC38 rakkudes täielikult tühistada (joonised 7, A ja B). Sarnaseid leide täheldati ka B16F10 rakkudes (joonis 7C). Peamiste rakusurmaradade (apoptoos, nekroptoos, ferroptoos ja püroptoos) inhibiitorid ei suutnud takistada CALR-i pinnaekspressiooni (joonis 7D). Et teha kindlaks, kas DC661 poolt indutseeritud immunogeenne rakusurm on tingitud MHC I klassi ülesreguleerimisest, töödeldi B16F10 ja MC38 rakke DC661 (3 μM) või DMSO-ga 24 tundi. Leidsime, et DC661 ravi ei suurendanud MHC I klassi ekspressiooni ja immunoproteasoomi ülesreguleerimist (joonis 7E ja täiendav joonis 9, B ja C).

Joonis 4. Katepsiini inhibeerimine või kaltsiumi kelaatimine ei takista DC661-indutseeritud rakusurma. (A)

Et mõista autofagia inhibeerimise mõju T-rakkude praimimisele, viisime läbi in vitro praimimise ja kooskultuuri katse, kasutades C57BL6/J splenotsüüte, nagu eelnevalt kirjeldatud (31). Praimimiseks eksponeerisime splenotsüüdid DC661- või DMSO-ga töödeldud B16F10 või MC38 rakkudega. Järgmisena kultiveeriti neid praimitud splenotsüüte elusate B16F10 või MC38 rakkudega ja mõõdeti tsütotoksilisust (joonis 8A). DC661-töödeldud B16F10 rakkudega praimitud splenotsüüdid suurendasid oluliselt IFN-i, võrreldes DMSO-ga töödeldud B16F10 rakkudega kokku puutunud splenotsüütidega. Prolifereeruvate B16F10 rakkude praimitud T-rakkude poolt vahendatud tapmine suurenes DC661-praimitud splenotsüütides oluliselt võrreldes DMSO-ga praimitud splenotsüütidega (joonis 8, B ja C). DC661-ga töödeldud MC38 rakud tekitasid B16F10 rakkudega võrreldes veelgi rohkem IFN-i ja praimitud T-rakkude tsütotoksilisust (joonis 8, D ja E). NAC-i kaastöötlemine DC661-ga suutis täielikult tühistada IFN-i vabanemise splenotsüütidest ja nüri praimitud T-rakkude tsütotoksilisuse (joonis 8, F ja G). Kalretikuliini pärssimine siCalri poolt MC38 rakkudes (täiendav joonis 9D) tühistas DC661-ravi praimimise efektiivsuse ja vähendas oluliselt praimitud T-rakkude tsütotoksilisust (joonis 8, H ja I). Kokkuvõttes toetavad need andmed LLP-ga seotud CALR-i ülesreguleerimise mehhaanilist rolli kasvajavastase raku T-rakkude immuunsuse edendamisel. Järgmisena laiendasime neid in vitro leide in vivo kasvajavastase vaktsineerimise uuringule immunokompetentsete ja immuunpuudulikkusega hiirte mudelitega. Selle testi jaoks süstiti in vitro külmutatud-sulatatud või DC{40}}töödeldud B16F10 või MC38 rakke subkutaanselt vasakule küljele, et kaitsta immunokompetentseid C57BL/6 või NOD/SCID hiiri uuesti nakatumise eest sama tüüpi elusate kasvajarakkudega. 7 päeva hiljem paremasse serva (joonis 9A). DC661--ga töödeldud B16F10 rakud ei suutnud vaatamata in vitro analüüsidele vältida kasvaja äratõukereaktsiooni, mis viitab sellele, et DC661 kutsus esile immunogeense rakusurma (joonis 9B ja täiendav joonis 9E). Seevastu ühe külje inokuleerimine DC661--ga töödeldud MC38 rakkudega soodustas vastasküljele siirdatud elusate MC38 rakkude täielikku äratõukereaktsiooni (joonis 9C ja täiendav joonis 9F). Et teha kindlaks, kas DC661-l näis olevat MC38 kasvajate puhul vaktsiiniefekti jaoks kriitilise tähtsusega adaptiivne immuunsus, kordasime katset NOD/SCID hiirtel. Üllatavalt avastasime, et DC661-töödeldud MC38 rakud ei kutsunud esile immuunpuudulikkusega NOD/SCID hiirte kasvajate tagasilükkamist (joonis 9D ja täiendav joonis 9G), mis näitab, et täheldatud vaktsiiniefekti jaoks oli vajalik adaptiivne immuunsus. Selle leiu kindluse testimiseks valisime teise hästi tuntud immunogeense hiire vähi rakuliini CT26 ja teostasime vaktsineerimiskatse nagu ülal. Ootuspäraselt tekitas DC{67}}töödeldud CT26 rakkude implanteerimine hiire ühte külge vaktsiinitaolise efekti ja takistas teisele küljele siirdatud elusate CT26 rakkude väljakasvu (joonis 9E ja täiendav joonis 9H). Meie leiud näitasid, et DC661-indutseeritud LLP on LMP-vahendatud immunogeense rakusurma jaoks ülioluline, mida muudab vastupidiseks tsüsteiini import lüsosoomi lüsosomaalse transporteri MFSD12 abil (joonis 9F).

Arutelu

Lüsosomaalne inhibeerimine näib olevat paljulubav ravimeetod prekliinilistes uuringutes ja HCQ kliinilised uuringud on andnud julgustavaid, kuid vastuolulisi tulemusi (1, 32). PPT1 on HCQ molekulaarne sihtmärk ja tugevamad PPT1 inhibiitorid, nagu DC661 (2) ja GNS561 (3), kutsuvad in vitro esile LMP-vahendatud rakusurma. Lüsosomaalsete rakkude surma täpne mehhanism ja selle roll kasvaja immunogeensuses ei ole täielikult välja selgitatud. Kasvajavastane immuunsus suureneb, kui autofagia inhibeerimist kombineeritakse immunoteraapiaga (9, 10, 31). Rakusisese immunogeensuse kavandatud mehhanismid pärast autofagia inhibeerimist hõlmavad MHC I klassi ja immunoproteasoomi ülesreguleerimist, mis mõlemad toetavad antigeeni paremat töötlemist ja esitlust. Lisaks suurendas autofagia valkude kadumine või autofagia inhibeerimine klorokiini poolt CD8+ T-rakkude vastust, suurendades dendriitrakkudes I klassi MHC pinna taset (33). Varem näitasime, et süsteemne PPT1 inhibeerimine võib makrofaagid repolariseerida M2 fenotüübist M1. PPT1 inhibiitorid võivad tõsta STING-i taset, põhjustades IFN-i vabanemist ja T-rakkude poolt vahendatud tapmist melanoomimudelites (31). Siin näitasime, et LLP ise tekitab kasvajarakkudele omase immunogeense rakusurma vormi. Leidsime, et lüsosomaalne inhibeerimine indutseeris vähirakkudes väga vähe valgu muutusi ja kõige olulisemate valkude hulka kuulusid autofagia lastiretseptorid ja apoptoosi regulaatorid. Meie lähenemisviis, mis oli suunatud mõnele neist geenidest erinevate funktsioonide vahel, näitas, et ravimite poolt indutseeritud valgud ei olnud tõenäoliselt rakusurma peamised regulaatorid. ULK1 või ATG7 geneetiline pärssimine ei päästnud ka DC661 tsütotoksilisust. Näitasime, et lüsosomaalne inhibeerimine aktiveerib programmeeritud rakusurma mitmeid vorme, sealhulgas apoptoosi, nekroptoosi, ferroptoosi ja püroptoosi, kuid igaüks neist oli ravimitest põhjustatud tsütotoksilisuse jaoks asendamatu. Pange tähele, et programmeeritud rakusurma mehhanismid võivad kattuda ja mitme rakusurma mehhanismi sihtimine võib pakkuda tsütokaitset rakusurma vastu pärast lüsosomaalse membraani läbilaskvust. Meie töö on välistanud lüsosomaalse rakusurma katepsiinist ja kaltsiumist sõltuvad mehhanismid ning rõhutanud elukestva õppe olulisust rakusurma kriitilise määrajana. Leidsime tõendeid LLP kohta, mis oli pöörduv antioksüdandiga, mis transporditi lüsosoomi, NAC ja mis oli lüsosomaalse membraani läbilaskvuse ja tsütotoksilisuse jaoks kriitiline. NAC oli ainus aine, mis suutis DC661-indutseeritud rakusurma leevendada või tagasi pöörata ja see võime sõltus lüsosomaalse tsüsteiini transporteri MFSD12 olemasolust. Lüsosomaalse läbitungimise puudumine on tõenäoline, miks teised oletatavad lipiidide peroksüdatsiooni inhibiitorid, Trolox ja C-vitamiin, ei suutnud DC661 tsütotoksilisust ära hoida. NAC muundatakse tsüsteiiniks, mis imporditakse lüsosoomidesse ja oksüdeerub disulfiidvormiks tsüstiiniks. Tsüstiini ekspordib tsütosooli teine ​​lüsosomaalne transporter, tsüstinoos, kus see redutseeritakse tsüsteiiniks, mis remobiliseerib sisemised toitainete allikad, taasaktiveerib rapamütsiini kompleksi 1 sihtmärgi ja soodustab autofagiat (34). See tsüsteiini oksüdatsiooni-redutseerimise tsüsteiiniks (lüsosoomideks) ja tagasi tsüsteiiniks (tsütosooliks) muutumine võib olla NAC-i võimalik päästemehhanism DC661 tsütotoksilisuse või üldisema lüsosomaalse kahjustuse vastu teistes haiguste kontekstis, kus NAC on osutunud terapeutiliselt kasulikuks (35). . NAC ei muutnud mitte ainult DC661-indutseeritud LLP-d ja LMP-d, vaid ka immunogeense rakusurma markeri kalretikuliini pinnaekspressiooni. CALR-valgu rakupinna ekspressioon oli vajalik DC661-praimitud splenotsüütide poolt indutseeritud suurenenud T-rakkude poolt vahendatud tsütotoksilisuse jaoks, mis näitab, et lüsosomaalne inhibeerimine tekitab rakule omase immunogeensuse spetsiifilise vormi.

Kuigi varasemad uuringud on näidanud, et lüsosomaalne inhibeerimine võib tugevdada immuunsüsteemi kontrollpunkti inhibeerimise kasvajavastast toimet väljakujunenud külgmiste kasvajate korral (9, 31), on meie uuring esimene, mis meile teadaolevalt demonstreerib vaktsiinitaolist toimet MC38 kasvajate, kuid mitte B16 kasvajate puhul. kasvajarakud, mida enne implanteerimist töödeldi DC661-ga. See näitab, et lüsosomaalne rakusurm võib esile kutsuda rakusisese immunogeensuse, kuid need muutused iseenesest ei ole piisavalt tõenäolised, et muuta "immuunse külma" kasvaja mikrokeskkonda "immuunse kuuma" kasvaja mikrokeskkonnaks. Meie varasemad uuringud immuunkülma kasvaja mikrokeskkonna mudelite B16 ja BRafCA PtenloxP Tyr kohta: CreERT2 geneetiliselt muundatud hiiremudelid (31) näitasid, et süsteemne lüsosomaalne inhibeerimine avaldas mõju kasvajaga seotud makrofaagidele ja müeloidrakkudest pärinevatele supressorrakkudele, mis olid piisavad, et tugevdada. immunoteraapia efektiivsus. Võib juhtuda, et rakkudele omane immunogeensus mängib rolli ka nende immuunkülma kasvajate puhul, mis muutuvad pärast lüsosomaalset inhibeerimist ICD-le paremini reageerivaks. Kontrollitud laborikeskkonnas täheldatud lüsosomaalse inhibeerimise vaktsiinitaoline toime võib, kuid ei pruugi avalduda kliinikus, kuid see võib selgitada, miks mõnel dabrafeniibi, trametiniibi ja HCQ-ga ravitud patsientidel oli varem ravitud BRAF-i mutantse melanoom nii sügav ja vastupidav. reageerida sellele raviskeemile (32). Täiendavad uuringud on vajalikud, et mõista, kuidas PPT1 inhibeerimine tekitab lüsosomaalset ROS-i ja lipiidide peroksüdatsiooni. V-ATPaasi ja lüsosomaalse hapestumise PPT1-sõltuv regulatsioon ei ole piisav selgitus, sest bafilomütsiin inhibeerib lüsosomaalset hapestumist, kuid ei tooda LMP-d (andmeid pole näidatud). Nende leidude tagajärjed viitavad sellele, et lüsosomaalseid inhibiitoreid, mis suurendavad kasvajarakkude sisemist immunogeensust, saab ratsionaalselt kombineerida ravimeetoditega, mis suurendavad T-rakkude aktivatsiooni või infiltratsiooni kasvaja mikrokeskkonda, mis võib anda sünergistlikke efekte.

Joonis 5. N-atsetüültsüsteiin hoiab ära DC661-indutseeritud rakusurma. (A)

meetodid

Rakukultuur. Human A375P (CRL-3224), RKO (CRL-2577), DLD-1 (CCL- 221), MIA PaCa-2 (CRL-1420) ), A549 (CRM-CCL-185) ja hiire B16F10 (CRL-6475) rakuliinid osteti ATCC-lt. Inimese A375 (CRL-1619, ATCC), WM35, WM793 ja hiire YUMM1.7 (WT, Gsdme EV ja Gsdme KO1 ja KO2) liinid saadi ettevõttesiseselt. Hiire MC38 ja CT26 rakud tarnis Andy Minn Pennsylvania ülikoolist. FL5.12 ja IL-3-sõltuvad Bax−/−Bak−/− (Bax/Bak DKO) primaarsed luuüdi rakud saadi Kathryn E. Wellenilt, Pennsylvania ülikoolist. Inimese Panc-1 (CRL-1469, ATCC) rakuliini hankis Ben Z. Stanger Pennsylvania ülikoolist. Hiire YUMMER 1.7 rakuliin saadi ettevõttest Xiaowei (George) Xu, Pennsylvania ülikool. Kõiki rakuliine testiti Mycoplasma suhtes kaks korda aastas Pennsylvania ülikooli tuumarajatiste poolt ja autentimine tehti Wistar Institute Genomics core'i lühikese tandem-sõrmejälgede abil. A375P, RKO, DLD-1, A549, CT26, FL5.12 ja Bax/ Bak DKO rakuliine kultiveeriti RPMI 1640-s (Invitrogen, 11875); A375, MIA PaCa-2, Panc-1, B16F10 ja MC38 rakuliine kultiveeriti DMEM-is (Invitrogen, 11995); ja YUMMER1.7, YUMM1.7 WT, Gsdme EV ja Gsdme KO1 ja KO2) rakke (15) kultiveeriti DMEM/F12 50/50-s (Corning, 10-092-CV). Kultuurisöötmele lisati 10% veise loote seerumit (12306C, MilliporeSigma) ja 1x antibiootikumi antimükootilist lahust (Gibco, 15140-122). FL5.12 ja Bax/Bak DKO rakuliine hoiti täielikus RPMI söötmes, millele oli lisatud 50 µM merkaptoetanooli (Life Technologies, 21985-023), 10 mM HEPES-i (H3537, MilliporeSigma) ja 0,35 ng/mL ja 3 ug. /mL IL-3. YUMMER1.7 ja YUMM1.7 (WT, Gsdme EV ja Gsdme KO) rakuliine hoiti täielikus söötmes, millele oli lisatud 1 × MEM NEAA (Gibco, 11140-050). WM35 ja WM793 rakke kultiveeriti MCDB söötmes 153 (MilliporeSigma, M7403), mis sisaldas 10% FBS-i 1 × Leibovitz L-15 söötmes (Corning, 10-045-CV), 7,5% (mass/maht) naatriumvesinikkarbonaati ( Corning, 25-035-CI), 1 × antibiootikumi antimükootiline lahus (Gibco, 15140-122) ja 5 ug/ml insuliini (MilliporeSigma, I0516). Rakke kasvatati 37 kraadi juures 5% CO2 juuresolekul. Kemikaalid ja reaktiivid. Ostetud kemikaalide hulka kuulusid HCQ sulfaat (Spectrum Chemicals, 747-36-4) ja DC661 (Selleckchem, S8808). Fluo-4, AM (Thermo Fisher Scientific, F14201) kasutati rakkude värvimiseks kaltsiumiga vastavalt tootja juhistele. Antikehade ja inhibiitorite loend on esitatud lisatabelis 1 ja täiendavas tabelis 2.

Joonis 6. NAC pöörab LLP-d ümber MFSD{1}}sõltuval viisil. (A–C)

Valkude ekstraheerimine ja lagundamine vedelikkromatograafia jaoks – proteoomika tandem-massispektromeetria analüüs. {{0}},7 × 106 A375P melanoomi rakku kultiveeriti 60 mm kultuuritassides. Rakke töödeldi DMSO-ga (kontroll), DC661-ga (3 µM), HCQ-ga (10 µM) või HCQ-ga (3{{70}} µM) 24 tundi temperatuuril ligikaudu 5{{ 112}}% liitumissagedus. Külmutatud rakupelletid lüüsiti 50 mM Tris pH 7,4, 1% SDS, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,15 mM PMSF, 1 ug/mL pepstatiiniga, ja 1 ug/ml leupeptiini. Selitatud lüsaadid (igaüks 10 ug) elektroforeesiti 0,5 cm ulatuses bis-tris-geeliks, millele järgnes fikseerimine ja värvimine kolloidse Coomassiega. Iga 0,5 cm geelirada lõigati välja, eemaldati värvist, redutseeriti tris(2-karboksüetüül)fosfiiniga, alküüliti jodoatseetamiidiga ja digereeriti trüpsiiniga, nagu eelnevalt kirjeldatud (36). Seediseid (1 ug) analüüsiti vedelikkromatograafia-tandem-massispektromeetria (LC-MS/MS) abil massispektromeetril Q-Exactive Plus (Thermo Fisher Scientific) kooskõlas nanoAQUITY UPLC-ga (Waters). Analüütiline eraldamine viidi läbi 1,7 μm × 250 mm peptiid BEH C18 kolonnis (Waters, 186003546), kasutades 245-minutilist gradienti 0,1% sipelghappega vees (liikuv faas A) ja atsetonitriili (liikuv faas B) järgmiselt. : 5%–30% B 225 minuti jooksul, 30%–80% B 5 minuti jooksul, 15-minuti hoidmine 80% B juures ja naasmine algtingimustesse. Täielikud MS-spektrid saadi eraldusvõimega 70,000, skaneerimisvahemikuga 400–2,000 m/z, automaatse võimenduse reguleerimise sihtmärgiks 3 × 106 iooni ja maksimaalse süstimisajaga 50 millisekundit. Andmetest sõltuvad MS2 spektrid saadi 20 kõige levinuma iooni jaoks eraldusvõimega 17 500, isolatsiooni laiusega 1, 5 m/z, automaatse võimenduse reguleerimise sihtmärgiga 5 × 104 iooni ja maksimaalse süstimisajaga 50 millisekundit. Peptiidide sobivus määrati eelistatuks ning määramata ja üksikult laetud ioonid lükati tagasi (37). MS töötlemata andmeid analüüsiti rakendusega MaxQuant 1.6.5.0 (https:// maxquant.net/perseus/) koos Uniproti inimese järjestuste andmebaasiga (juurdepääs 10. oktoobril 2019) ja tavalise saasteainete andmebaasiga, sealhulgas trüpsiin, keratiinid, veisevalgud, ja mükoplasma (38). Otsingus kasutati trüptilise peptiidi spetsiifilisust maksimaalselt 2 vahelejäänud lõhustamisega, tsüsteiini fikseeritud modifikatsiooni (karbamidometüülimine) ja muutuvat metioniini oksüdatsiooni või N-terminaalset atsetüülimist (39). Peptiidide ja valkude jaoks kasutati 1% FDR-i piiri. Match jooksude vahel oli lubatud; valkude kvantifitseerimiseks kasutati märgisevaba kvantifitseerimist (40). Statistiline analüüs viidi läbi, kasutades Perseus 1.6.2.3 (https:// maxquant.net/perseus/) (41, 42). Valgud pidid olema identifitseeritud vähemalt 3 unikaalse peptiidiga ja neil peab olema proovirühmas 3 kehtivat väärtust (mitte-null-kvantitatsioon) ning saasteained ja pöördvalgud filtreeriti andmekogumist välja. Puuduvad väärtused imputeeriti normaaljaotusest. Tingimuste paaripõhised võrdlused viidi läbi valgu tasemel, kasutades 2-sabaga Studenti t-testi permutatsioonipõhise FDR-iga s0=0.1 ja 250 randomiseerimisega. Olulised muutused määratleti kui FDR alla 5% ja absoluutne kordne muutus suurem kui 1,5 või 2,0, nagu täpsustatud. Lyso-IP. A375P rakud nakatati pLJC5-Tmem192-3xHA lentiviirusega ja valiti 1 mg/ml puromütsiini (MilliporeSigma, P4512) abil. Ligikaudu 3 × 106 HA-märgistatud A375P rakku töödeldi eelnevalt kirjeldatud kultiveerimistingimustes 24 tunni jooksul kas 10 mM NAC või vesivehiikuli kontrolliga. Pärast töötlemist pesti rakke PBS-s, koguti 0,5 ml külmas KPBS-is ja homogeniseeriti õrnalt, kasutades 20 lööki 2 ml Dounce homogenisaatoris. Umbes 2,5% homogenaadist reserveeriti kogu rakulüsaadi analüüsiks ja ülejäänud osa tsentrifuugiti 3,{120}}g juures 2 minutit 4 kraadi juures, et eemaldada rakumembraani jäägid. Seejärel kanti homogenaadi supernatant puhtasse 1,5 ml tuubi ja inkubeeriti 50 µl anti-HA helmestega (Pierce, 88836) või anti-DDK/Flag helmestega (OriGene, TA150042) 15 minutit 4 kraadi juures. Seejärel sadestati proovid, asetades katseklaasid DynaMagile (Thermo Fisher Scientific, 12321D) ja loksutati õrnalt 2 minutit toatemperatuuril. Supernatant reserveeriti sidumata fraktsioonide analüüsiks. IP pesti 3 korda KPBS-ga, mis sisaldas 8 mM CaCl2. Lyso-IP ekstraheeriti metaboolse analüüsi jaoks 80% MeOH-s. Lipiidide ekstraheerimine ja analüüs LC-MS/MS abil globaalse lipidoomi jaoks. Melanoomi A375P rakud külvati 60 mm tassidesse 0, 7 × 106 rakku tassi kohta. Kui rakud olid ligikaudu 50% konfluentsusel, töödeldi neid DMSO-ga (kontroll), DC661-ga (3 μM) või HCQ-ga (30 μM) 24 tundi. Rakke pesti 2 korda HBSS-ga, kaabiti jääkülma metanooli ja kanti klaastorudesse lipiidide ekstraheerimiseks kloroformi/metanooli/0,88% NaCl-ga (2:1:1), mis sisaldas EquiSPLASH sisemist lipiidistandardit (Avanti Polar Lipids). Proove segati vorteksiga ja seejärel töödeldi veevannis ultraheliga 5 minutit jääl. Pärast tsentrifuugimist 500 g juures 15 minutit 40 kraadi juures viidi alumine faas üle teise klaastorusse. Ülemine faas ekstraheeriti uuesti, kasutades sünteetilist alumist faasi. Pärast ultrahelitöötlust ja tsentrifuugimist ühendati alumine faas esimese madalama faasi kogumisega. Proovid kuivatati lämmastiku all, resuspendeeriti 10% kloroformis/90% metanoolis ja kanti üle klaasist LTQ viaalidesse. Lipiidide proove analüüsiti massispektromeetriga Thermo Fisher Scientific QExactive HF-X ja Vanquish Horizon UHPLC süsteemiga. Analüütiliseks eraldamiseks kasutati Accucore C30 kolonni (2,1 mm × 150 mm, Thermo Fisher Scientific), milles oli 50:50 atsetonitriil/vesi ja 88:10:2 isopropanool/atsetonitriil/vesi, millest igaüks sisaldas 5 mM ammooniumformiaati ja 0,1% sipelghapet. LC-MS/MS andmed koguti eraldi positiivse ja negatiivse polaarsusega järgmiste instrumendi parameetritega: MS1 skaneerimine 120, 000 eraldusvõime; andmetest sõltuv MS2 20 suurima iooni hulgas eraldusvõimega 15,{184}}; 0,4 m/z isolatsiooni laius; ja astmeline normaliseeritud kokkupõrkeenergia 20:30:40 (43).

Joonis 7. N-atsetüültsüsteiin takistab DC661-indutseeritud kalretikuliini pinnaekspressiooni. (A–D)

Lipiidid tuvastati ja kvantifitseeriti LipidSearch 4.2 (Thermo Fisher Scientific) abil. Tuvastatud lipiidiliigid filtreeriti eeldatavate aduktide ja klassi alusel identifitseerimisastme järgi. Rakkude arvu varieeruvuse korrigeerimiseks normaliseeriti piigipiirkonnad toetatud klasside EquiSPLASH standarditele ja normaliseeriti täiendavalt iga proovi kogupindala põhjal. Statistiline analüüs viidi läbi logaritmiliselt teisendatud andmetel, kasutades Perseus 1.6.2.3 (https://maxquant.net/perseus/) (41, 42). Metaboliitide ekstraheerimine ja analüüs, kasutades metabalooni jaoks LC-MS/MS-i. Polaarsed metaboliidid ekstraheeriti tervetest rakkudest, Lyso-IP-ga seondumata fraktsioonidest ja Lyso-IP-ga seotud proovidest, kasutades 80% metanooli ning neid säilitati enne vedelikkromatograafiat temperatuuril –8{{30}}. –massispektromeetria (LC-MS) analüüs. Ekstrakte analüüsiti LC-MS-ga, kasutades Thermo Scientific Q-Exactive HF-X massispektromeetrit koos HESI II sondiga kooskõlas Thermo Vanquish Horizon UHPLC süsteemiga. LC eraldamiseks kasutati ZIC-HILIC kolonni (2,1 mm × 150 mm, osakeste suurus 5 μm, EMD Millipore) koos ZIC-HILIC kaitsekolonniga (2,1 mm × 20 mm, EMD Millipore), mida hoiti voolukiirusega 45 kraadi juures. 0,2 ml/min. Kromatograafia viidi läbi happelistes tingimustes, et vähendada tioolrühmade reaktsioonivõimet. Liikuv faas A oli vesi ja B atsetonitriil, mis mõlemad sisaldasid 0,1% sipelghapet. LC gradient oli 85% B 2 minuti jooksul, 85% B kuni 20% B 15 minuti jooksul, 20% B kuni 85% B 0,1 minuti jooksul ja 85% B 8,9 minutit. Automaatset proovivõtturit hoiti 4 kraadi juures ja igast proovist süstiti analüüsi kohta 4 μl. Kasutati järgmisi MS parameetreid: mantligaasi voolukiirus, 40 AU; abigaasi voolukiirus, 10 AU; pühkimisgaasi voolukiirus, 2 AU; lisagaasikütte temperatuur, 350 kraadi; pihustuspinge, 3,75 kV positiivsel režiimil ja 3,5 kV negatiivsel režiimil; kapillaaride temperatuur, 375 kraadi; ja lehtri RF tase, 40%. Kõiki proove analüüsiti täis-MS-ga polaarsuse vahetamisega. Täielikud MS-skaneeringud saadi vahemikus 65–975 m/z eraldusvõimega 120,{59}} automaatse võimenduse reguleerimise sihtmärgiga 1 × 106 iooni ja maksimaalse süstimisajaga 100 millisekundit. Algandmeid analüüsiti programmiga TraceFinder 4.1 (Thermo Fisher Scientific). Suunatud metaboliidid tuvastati täpse massi ja retentsiooniaja järgi nende eelistatud polaarsuses, mis põhinevad analüütilistel standarditel. Piigi tuvastamisel kasutati ICIS-i algoritmi silumisega 1. Suhteline kvantifitseerimine viidi läbi integreeritud piigi pindala abil ja need väärtused korrigeeriti kogusummale proovi kohta (määratleti piigi kogupindalana). PPT1-CRISPR/Cas9 redigeerimine. A375P PPT1-mittesiht- ja KO-rakud valmistati eelnevalt kirjeldatud viisil (44). pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) oli kingitus Feng Zhangilt (Addgene plasmiid, 48139). Juht-RNA oligod (IDT) anniiliti, fosforüüliti ja ligeeriti seejärel BbsI-ga lõhutud ja defosforüülitud pX459 plasmiidi, järgides Zhangi laboriprotokolle, mis on saadaval Addgene'i kaudu. Ligeeritud plasmiidid transformeeriti Stbl3 rakkudesse (Invitrogen). Plasmiidipreparaatide sekveneerimine kinnitas soovitud juht-RNA järjestuste olemasolu. A375P rakud transfekteeriti, kasutades Lipofectamine 3000 (Invitrogen, L3000015), millele järgnes puromütsiini selektsioon. Maamõõtjate testid kinnitasid PPT1 geeni redigeerimist CRISPR/Cas9 abil ja PPT1 knockdowni kinnitas Western blot PPT1 antikehaga (Origene). Juht-RNA oligode järjestused on järgmised: mittesihtmärgi juht-RNA edasi (CACCGTAGCGAACGTGTCCGGCGT), mittesihtmärgi juht-RNA tagasisuunamine (AAACACGCCGGACACGTTCGCTAC), inimese PPT1 juht-RNA 1 edasi (CACCGTTTGGACTCCTCGATGCCC), inimese PPTPTCCRNA1 juht (AAGAACGATCCAG1) 3 edasi (CAACCGCCTCGTGCAAGCCGAATAC) ja inimese PPT1 juht-RNA 3 tagurpidi (AAACGTATTCGGCTTGCACGAGGC). Selles artiklis kasutatud üksikutest rakkudest kasvatatud kloonid hõlmavad järgmist: kloon C8 on inimese juht 1 ja kloon B5 on inimese juht 3. Immunoblotanalüüs. Üks miljon rakku kanti 10 cm tassile ja ravi viidi läbi järgmisel päeval; rakud koguti kraapides. Terve raku lüsaadid valmistati SDS lüüsipuhvriga. Valgu kontsentratsiooni mõõdeti Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, 23225) abil. SDS-PAGE jaoks kasutati 30–50 ug valku ja see kanti üle PVDF membraanile (Bio-Rad, 1620177). Membraan blokeeriti 5% BSA või 5% kooritud piimaga vastavalt optimeeritud tingimustele ja inkubeeriti primaarse antikehaga öö läbi temperatuuril 4 °C. PVDF membraane pesti 1 × TBS-T-ga (Cell Signaling Technology Inc., CS-9997) ja inkubeeriti 1 tund toatemperatuuril liigispetsiifilise HRP-ga konjugeeritud sekundaarse antikehaga. Seejärel pesti membraane ja arendati, kasutades Pierce ECL Western Blotting substraati (Thermo Fisher Scientific, 32106) ja autoradiograafiafilme (Lab Scientific Inc., XAR ALF 1318). Püroptoosiuuringute jaoks eraldati valgulüsaadid SDS-PAGE abil ja kanti üle PVDF membraanidele. Pärast blokeerimist 5% BSA-s inkubeeriti PVDF-i membraane näidatud primaarsete antikehadega üleöö temperatuuril 4 °C, pesti PBS/Tweeniga ja inkubeeriti peroksidaasiga seotud sekundaarsete antikehadega. Immunoreaktiivsus tuvastati HRP-ga konjugeeritud sekundaarsete antikehade (CalBioTech), kemoluminestsentssubstraadi (Thermo Fisher Scientific) ja ChemicDoc MP-kuvamissüsteemi (Bio-Rad) abil. Supernatanti hõlmavate katsete jaoks kultiveeriti rakke FBS-vabas söötmes, et vältida SDS-PAGE moonutusi. Rakkude supernatandid koguti ja tsentrifuugiti 10 minutit 500 g juures 4 kraadi juures, et eemaldada rakujäänused. Saadud supernatandid kontsentreeriti 10 korda, kasutades Amicon Ultra 10K (MilliporeSigma), tsentrifuugides 30 minutit 4500 g juures 4 kraadi juures. Kontsentraadid segati proovipuhvriga ja analüüsiti ülalkirjeldatud viisil Western blot meetodil. Valgu geeliga värvimine viidi läbi, kasutades Ponceau punast värvimist. LMP ja katepsiin L aktiivsuse test. Inimese pEGFP-hGal3 plasmiid oli Tamotsu Yoshimori (Addgene plasmiid, 73080) kingitus ja seda kasutati A375P-Galectin{139}} liini loomiseks. osteti pEGFP-C1 kontrollplasmiidvektori karkass (novo prolabs, V012024). Plasmiidid transfekteeriti (1 ug/ml) A375P rakkudesse, kasutades Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668019) vastavalt tootja protokollile; transfekteeritud rakud selekteeriti stabiilselt, kasutades G418 (Gibco, 10131035). LMP puhul loendati mitmel pildiväljal kokku 25 A375P-galektiini{152}} punktpositiivset rakku. Punktpositiivsete rakkude protsent arvutati igal väljal eraldi ja iga rühma jaoks arvutati keskmine protsent. Magic Red Cathepsin L analüüsikomplekti (Abcam, ab270774) kasutati vastavalt tootja protokollile. Rakud pildistati Zeiss Axio Observer 7 pöördmikroskoobi all. Magic Redi töötlemata integreeritud intensiivsus arvutati Fiji - ImageJ tarkvara (NIH) abil. MTT (3-[4, 5-dimetüültiasool-2-üül]-2, 5-difenüültetrasooliumbromiid) rakkude elujõulisuse test. 2000 rakku plaaditi kolmes korduses 96-süvendi plaadi igasse süvendisse ja 3-päevased MTT testid viidi läbi, kasutades raku elujõulisuse komplekti (Roche, 11465007001) vastavalt tootja protokollile. Inhibiitori eeltöötlus viidi läbi 1 tund, millele järgnes rakkude töötlemine inhibiitoritega DC661-ga või ilma. IC50 arvutamiseks kasutati mittelineaarse regressiooni (kõvera sobitamise) meetodit.

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

Cistanche Enhance Immunity toodete vaatamiseks klõpsake siin

【Küsi lisa】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Kolooniate moodustumise analüüs. 2,000 rakku süvendi kohta külvati 6-süvendiga plaadile ja töödeldi järgmisel päeval; rakke hoiti ravi all kokku 8 päeva. Igas süvendis moodustunud kolooniaid pesti PBS-ga, fikseeriti külma metanooliga temperatuuril –20 20 minutit ja värviti kristallvioletse 0,5% vesilahusega (V5265; MilliporeSigma).

Trüpaansinise värvaine välistamise test. Reaktsioonisegu trüpaansinise testi jaoks valmistati segades 1 osa 0,4% trüpaansinist (25- 900-CI, Corning) ja 1 osa lahjendatud rakuproove. Segu inkubeeriti 1 minut ja rakud loendati seadmega Cellometer Vision (Nexcelom, Vision-310-0208).

Joonis 8. DC661-indutseeritud kalretikuliini pinnaekspressioon käivitab T-rakud kasvajarakkude vastu. (A)

Joonis 9. DC661-töödeldud rakkude inokuleerimine põhjustab spetsiifilistes kontekstides kasvaja äratõukereaktsiooni. (A)

VAHT-LPO. LLP-d uuriti fluorestsentssondi FOAMLPO abil. FOAM-LPO sünteesiti nagu eelnevalt kirjeldatud (26). Rakke kultiveeriti 8 süvendiga μSlide'il (samas, 80807) ja töödeldi inhibiitoritega ja DC661-ga või ilma. Rakke inkubeeriti FOAM-LPO (1 M) sisaldava söötmega 5% CO2 ja 95% õhu atmosfääris 5 minutit temperatuuril 37 °C. Rakke pesti kaks korda söötmega ja seejärel vaadeldi rakke mikroskoobi all (Zeiss Axio Observer 7 invertmikroskoop), et tuvastada fluorestsentsi nihkumist 586 nm-lt 512 nm-le vastuseks LLP-le. qRT-PCR ja praimerid. A375P (3 × 105 uM) rakke kultiveeriti 60 mm tassidel ja töödeldi DMSO või DC661-ga (3 μM) 24 tundi. Kogu RNA eraldati RNA isolatsioonikomplektiga (QIAGEN, 74134) vastavalt tootja protokollile. cDNA sünteesiti, kasutades iScripti pöördtranskriptaasi komplekti 500 ng puhastatud RNA-ga vastavalt tootja protokollile (Thermo Scientific, K1642). QPCR reaktsioon seadistati, kasutades SYBR Green PCR Master Mixi (BioRad, 1725121), mis sisaldas 1 μL cDNA-d. Kõik mõõtmised viidi läbi kolmes eksemplaris ja BACTIN-i kasutati ΔCT arvutuste sisestandardina. Geeniekspressiooni analüüs viidi läbi järgmiste praimerite abil: PTGS2/COX-2 edasi (CGGTGAAACTCTGGCTAGACAG), PTGS2/COX-2 tagurpidi (GCAAACCGTAGATGCTCAGGGA), CARS edasi (CTGGACTACTCCAGCAACACCA), CARS tagurpidi (CHACAGTAGGATGTC). (GTGGTGACGCTCCTTGAAGATC), CHAC1 tagurpidi (GAAGGTGACCTCCTTGGTATCG), BACTIN edasi (CAACTGGGACGACATGGAGAAAAT) ja BACTIN tagurpidi (CCAGAGGCGTACAGGGATAGCAC).

siRNA transfektsioon. Inimese ULK1, ATG7, TAX1BP1, BNIP3, PPT1 ja MFSD12 geneetilised knockdowni uuringud viidi läbi A375P rakuliinides. Hiire Ppt1 ja Calretikuliini geneetilise inhibeerimise uuringud viidi läbi MC38 rakkudes. Mittesihtmärk siRNA (sc{{10}}), inimese ULK1 (sc-44182), ATG7 (sc-41447), TAX1BP1/T6BP (sc-106831), BNIP3 (sc{{20}}), PPT1/CLN1 (sc-105216), MFSD12 (sc-97888), hiire Ppt1/Cln1 (sc-142398) ja kalretikuliini /Calregulin (sc-29895) siRNA-d osteti ettevõttest Santa Cruz Biotechnology. Need siRNA-d koosnevad 3–5 sihtmärgispetsiifilise siRNA kogumist. Voolutsütomeetria. Ferroptoosi esilekutsumist mõõdeti kasutades C11- BODIPY (BODIPY 581/591 C11, Thermo Fisher Scientific, D3861). A375P rakud külvati 6-süvendiga plaadile ja töödeldi DMSO, ferrostatiini{{40}} (10 μM), huule roksstatiiniga-1 (2 μM), elastiiniga (5 μM) ), DC661 (3 μM) või kombinatsiooni 24 tunniks. Rakud koguti tsentrifuugimisega 300 g juures 5 minutit. Rakud resuspendeeriti 500 µl 1X HBSS-s (Corning, 21-023-CV), mis sisaldas 1 µM C11-BODIPY, ja inkubeeriti 37 kraadi juures 15 minutit. Rakud pelleteeriti ja resuspendeeriti 500 µl 1X HBSS-s ning fluorestsentsi intensiivsust mõõdeti BD LSRII tsütomeetril, kasutades 530/30 Blue (Pennsylvania Ülikooli Flow Core Facility). Kalretikuliini rakupinna ekspressiooni kvantifitseerimine immunogeense rakusurma jaoks viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud (45) voolutsütomeetria abil. B16F10 või MC38 rakke kultiveeriti ja töödeldi NAC-ga (10 mM) või DC661-ga (3 μM) 24 tundi. MC38 rakke töödeldi siPpt1 või siNT-ga 48 tundi 10 mM NAC juuresolekul või puudumisel 24 tundi. Rakud värviti CALR-i antikehaga (Cell Signaling Technology, 12238), Alexa Fluor 647 kitse küülikuvastase teise antikehaga (Invitrogen) ja propiidiumjodiidiga (PI) (Biolegend, 421301). Värvitud proovid koguti BD LSRII voolutsütomeetriga, kasutades PI ja CALR fluorestsentsi hõivamiseks vastavalt 710/50 sinist ja 670/30 punast (Pennsylvania Ülikooli Flow Core rajatis), ning analüüs piirdus CALR-positiivsete ja PI-negatiivsete rakkudega. valepositiivsete sündmuste vältimiseks. T-rakkude praimimine ja tsütotoksilisuse protsent. B16 või MC38 kasvajarakke (5 × 104) kultiveeriti ja töödeldi vastavalt NAC-ga (10 mM) või DC661-ga (1 μM või 3 μM) 24 tundi. Calri geneetiliseks inhibeerimiseks töödeldi MC38 rakke 48 tundi Calr siRNA või mittesihtmärgiga siRNA-ga (siNT), millele järgnes töötlemine 24 tunni jooksul kas DMSO või 3 μM DC661-ga. Seejärel kultiveeriti splenotsüüte DC661-ga koos B16 või MC38 rakkudega või ilma IL{102}} (5 IU/mL) juuresolekul ja kultiveeriti koos 72 tundi. Praimimist kinnitati supernatandi IFN-ELISA-ga (Biolegend, 430815). Seejärel kultiveeriti praimitud splenotsüüte koos värskelt kultiveeritud B16 või MC38 rakkudega sihtmärgi ja efektori (B16 või MC38 ja splenotsüütide) suhtega vastavalt 1:20 ja 1:50 B16 ja MC38 rakkude puhul. B16 või MC38 rakusurmaga seotud LDH vabanemist ja seejärel tsütotoksilisuse protsenti mõõdeti vastavalt tootja protokollile (MilliporeSigma, 4744926001) (31). Kasvajavastased vaktsineerimistestid ja keemiaravi uuringud väljakujunenud vähimudelitega. Kuue kuni kaheksa nädala vanused emased WT C57BL/6 hiired, NOD/SCID ja BALB/c hiired saadi firmast The Jackson Laboratory. Kasvajavastaste vaktsineerimiskatsete jaoks töödeldi WT B16F10, MC38 ja CT26 rakke DC661-ga (3 μM) 36 tundi 175 cm2 kolbides. Seejärel koguti supernatandid ja eraldatud rakud 50 ml falconi torusse. Rakud tsentrifuugiti ja pesti jääkülma PBS-ga. Vaktsineerimiseks süstiti 150 µl rakususpensiooni subkutaanselt immunokompetentsete C57BL/6 hiirte, immuunpuudulikkusega NOD/SCID hiirte (1,8 × 104 B16F10 rakku, 1,5 × 106 MC38 rakku hiire kohta (BALB3/0c) vasakusse külge × 106 CT26 rakku hiire kohta). Negatiivse kontrollina süstiti PBS-is resuspendeeritud külmutatud-sulatatud rakud. Nädal hiljem süstiti paremasse äärde sama tüüpi elusaid vähirakke (3 × 104 B16F10 rakku, 2 × 105 MC38 rakku või 5 × 105 CT26 rakku hiire kohta) samaväärse mahuga Matrigeli (Corning, 354248). vaktsineeritud hiirtest. Kasvajaid mõõdeti elektrooniliste nihikute abil ja maht arvutati L × W2 × 0, 5. Kasvaja kasvu jälgiti regulaarselt järgmistel päevadel ja kasvajate puudumist peeti tõhusa kasvajavastase vaktsineerimise näitajaks. DC661-MC38 vaktsineerimise uuringuid korrati NOD/SCID hiirtel. Statistika. Statistiline olulisus määrati kahe rühma võrdlemisel Studenti paaritu 2-sabaga t-testi abil. ANOVA testi 1-kasutati enam kui kahe rühma võrdlemisel. Nullhüpotees lükati märkimisväärselt tagasi, kui P väärtus oli väiksem kui 0, 05. Andmed on näidatud kui keskmine ± SEM. Uuringu heakskiit. Kõik loomkatsed viidi läbi vastavalt Pennsylvania ülikooli institutsionaalse loomade hooldamise ja kasutamise komitee poolt heaks kiidetud protokollidele.

Hiina herb tsitanche taim-kasvajavastane

Viited

1. Zeh HJ et al. Randomiseeritud II faasi preoperatiivne uuring autofagia inhibeerimise kohta hüdroksüklorokiini ja gemtsitabiini / Nab-paklitakseeli suurte annustega kõhunäärmevähiga patsientidel. Clin Cancer Res. 2020;26(13):3126–3134.

2. Rebecca VW et al. PPT1 soodustab kasvaja kasvu ja on vähi korral klorokiini derivaatide molekulaarne sihtmärk. Cancer Discov. 2019;9(2):220–229.

3. Brun S et al. GNS561, uus autofagia inhibiitor, mis on aktiivne vähi tüvirakkude vastu hepatotsellulaarse kartsinoomi ja kolorektaalse vähi maksa metastaaside vastu. J Vähk. 2021;12(18):5432–5438.

4. Brun S et al. GNS561, kliinilise staadiumi PPT1 inhibiitor, on lüsosomaalsete funktsioonide moduleerimise kaudu tõhus hepatotsellulaarse kartsinoomi vastu. Autofagia. 2022;18(3):678–694.

5. Oberle C, et al. Lüsosomaalse membraani permeabiliseerimine ja katepsiini vabanemine on Bax / Bak-sõltuv, võimendav apoptoosi sündmus fibroblastides ja monotsüütides. Rakkude surma erinevus. 2010;17(7):1167–1178.

6. Boya P, Kroemer G. Lüsosomaalse membraani permeabilisatsioon rakusurmas. Onkogeen. 2008;27(50):6434–6451.

7. Rebecca VW et al. Ühtne lähenemine lüsosoomi degradatiivsete ja kasvu signaalide rollide sihtimiseks. Cancer Discov. 2017;7(11):1266–1283.

8. Tang R et al. Ferroptoos, nekroptoos ja püroptoos vähivastases immuunsuses. J Hematol Oncol. 2020;13(1):110.

9. Yamamoto K et al. Autofagia soodustab pankreasevähi immuunsüsteemi vältimist, lagundades MHCI. Loodus. 2020;581(7806):100–105.

10. Deng J et al. ULK1 inhibeerimine ületab kahjustatud antigeeni esitluse ja taastab kasvajavastase immuunsuse LKB1 mutantse kopsuvähi korral. Nat Vähk. 2021;2(5):503–514.

11. Lazarou M, et al. Ubikvitiini kinaas PINK1 värbab mitofagia esilekutsumiseks autofagia retseptoreid. Loodus. 2015;524(7565):309–314.

12. Choi YB et al. TAX1BP1 piirab viiruse poolt indutseeritud apoptoosi, hõlbustades mitokondriaalse adapteri MAVSi sügeluse poolt vahendatud lagunemist. Mol Cell Biol. 2017;37(1):e00422-16.

13. Rikka S jt. Bnip3 kahjustab mitokondriaalset bioenergeetikat ja stimuleerib mitokondriaalset käivet. Rakkude surma erinevus. 2011;18(4):721–731.

14. Leu JI et al. Kahjustatud ferroptoosi mehaaniline alus rakkudes, mis ekspresseerivad p53 Aafrika-keskset S47 varianti. Proc Natl Acad Sci US A. 2019;116(17):8390–8396.

15. Erkes DA, et al. Mutantsed BRAF-i ja MEK-i inhibiitorid reguleerivad tuumori immuunmikrokeskkonda püroptoosi kaudu. Cancer Discov. 2020;10(2):254–269.

16. Serrano-Puebla A, Boya P. Lüsosomaalse membraani läbilaskvus rakusurmas: uued tõendid ja mõju tervisele ja haigustele. Ann NY Acad Sci. 2016;1371(1):30–44.

17. Thirusangu P et al. Kinakriini poolt indutseeritud autofagia munasarjavähi korral käivitab katepsiin-L vahendatud lüsosomaalse / mitokondriaalse membraani läbilaskvuse ja rakusurma. Vähid (Basel). 2021;13(9):2004.

18. Michallet MC et al. Katepsiinist sõltuv apoptoos, mille käivitab T-lümfotsüütide supraoptimaalne aktiveerimine: võimalik suure annuse taluvuse mehhanism. J Immunol. 2004;172(9):5405–5414.

19. Mondal A et al. Ppt1-puudus häirib lüsosomaalse Ca++ homöostaasi, aidates kaasa patogeneesile CLN1 haiguse hiiremudelis. J Inherit Metab Dis. 2022;45(3):635–656. 20. Engel KM et al. Fosfolipaasid ja reaktiivsed hapniku liigid tuletasid lipiidide biomarkerid tervetel ja haigetel inimestel ja loomadel – keskendudes lüsofosfatidüülkoliinile. Esifüsiool. 2021;12:732319.

21. Fu R, et al. N-atsetüültsüsteiini efektiivsus Niemann-Picki tõve C1 tüübi hiiremudelite fenotüübilises supressioonis. Hum Mol Genet. 2013;22(17):3508–3523.

22. Boz Z et al. N-atsetüültsüsteiin hoiab ära olansapiini poolt indutseeritud oksüdatiivse stressi mHypoA-59 hüpotalamuse neuronites. Sci Rep. 2020;10(1):19185.

23. Khare S et al. ASS1 ja ASL pärsivad muutunud lämmastiku metabolismi kaudu selgerakulise neerurakulise kartsinoomi kasvu. Vähk Metab. 2021;9(1):40.

24. Gęgotek A et al. Askorbiinhappe kaitsva toime võrdlus redoks- ja endokannabinoidsüsteemide interaktsioonidele in vitro kultiveeritud inimese naha fibroblastidel, mis puutuvad kokku UV-kiirguse ja vesinikperoksiidiga. Arch Dermatol Res. 2017;309(4):285–303.

25. De Raedt T et al. Vähirakkude haavatavuste ärakasutamine ras-test põhjustatud kasvajate kombineeritud ravi väljatöötamiseks. Vähirakk. 2011;20(3):400–413.

26. Zhang X et al. Lipiidide peroksüdatsiooni jälgimine vahtrakkudes lüsosoomile suunatud ja ratiomeetrilise sondi abil. Anal Chem. 2015;87(16):8292–8300.

27. Wei CY et al. Bioinformaatikapõhine analüüs näitab kõrgenenud MFSD12 kui rakkude proliferatsiooni peamist promootorit ja potentsiaalset terapeutilist sihtmärki melanoomi korral. Onkogeen. 2019;38(11):1876–1891.

28. Aldini G et al. N-atsetüültsüsteiin kui antioksüdant ja disulfiidi purustav aine: põhjused. Vaba Radic Res. 2018;52(7):751–762. 29. Abu-Remaileh M et al. Lüsosomaalne metaboloomika näitab V-ATPaasist ja mTOR-st sõltuvat aminohapete väljavoolu reguleerimist lüsosoomidest. Teadus. 2017;358(6364):807–813.

30. Zhou J et al. Immunogeenne rakusurm vähiravis: praegused ja esilekerkivad indutseerijad. J Cell Mol Med. 2019;23(8):4854–4865. 31. Sharma G et al. PPT1 inhibeerimine suurendab PD-1-vastase antikeha kasvajavastast toimet melanoomi korral. JCI Insight. 2020;5(17):e133225.

32. Mehnert JM et al. BAMM (BRAF autofagia ja MEK inhibeerimine melanoomi korral): I/II faasi uuring dabrafeniibi, trametiniibi ja hüdroksüklorokviiniga kaugelearenenud BRAFV600-mutantse melanoomi korral. Clin Cancer Res. 2022;28(6):1098–1106. 33. Loi M et al. Makroautofagia valgud kontrollivad MHC I klassi taset dendriitrakkudel ja kujundavad viirusevastaseid CD8 (+) T-raku vastuseid. Cell Rep. 2016;15(5):1076–1087.

34. Jouandin P, et al. Lüsosomaalne tsüsteiini mobilisatsioon kujundab TORC1 reaktsiooni ja koe kasvu tühja kõhuga. Teadus. 2022;375(6582):eabc4203.

35. Schwalfenberg GK. N-atsetüültsüsteiin: ülevaade kliinilisest kasulikkusest (vana ravim uute nippidega). J Nutr Metab. 2021; 2021: 9949453.

36. Beer LA jt. Emakavälise raseduse seerumi biomarkerite süstemaatiline avastamine, kasutades 3-D-valgu profileerimist koos märgistuseta kvantifitseerimisega. J Proteome Res. 2011;10(3):1126–1138. 37. Goldman AR, et al. ARID1A-mutatsiooniga munasarja selge raku kartsinoomi peamine mõju proteoomile on mevalonaadi raja allareguleerimine transkriptsioonijärgsel tasemel. Moli rakkude proteoomika. 2016;15(11):3348–3360.

38. Cox J, Mann M. MaxQuant võimaldab kõrgeid peptiidide identifitseerimismäärasid, individuaalset ppb-vahemiku massitäpsust ja proteoomi hõlmavat valkude kvantifitseerimist. Nat Biotechnol. 2008;26(12):1367–1372.

39. Cox J et al. Andromeda: MaxQuant keskkonda integreeritud peptiidiotsingumootor. J Proteome Res. 2011;10(4):1794–1805.

40. Cox J et al. Täpne kogu proteoomi hõlmav sildivaba kvantifitseerimine viivitatud normaliseerimise ja maksimaalse peptiidi suhte ekstraheerimise teel, mida nimetatakse MaxLFQ-ks. Moli rakkude proteoomika. 2014;13(9):2513–2526.

41. Tyanova S et al. Perseuse arvutusplatvorm (prote)oomika andmete igakülgseks analüüsiks. Nat meetodid. 2016;13(9):731–740.

42. Tyanova S, Cox J. Perseus: bioinformaatika platvorm proteoomikaandmete integreerivaks analüüsiks vähiuuringutes. Meetodid Mol Biol. 2018;1711:133–148.

43. Alicea GM et al. Vananenud fibroblastide lipiidide metabolismi muutused kutsuvad esile vanusest sõltuva melanoomirakkude resistentsuse sihipärase ravi suhtes rasvhapete transporteri FATP2 kaudu. Cancer Discov. 2020;10(9):1282–1295.

44. Ran FA et al. Geenitehnoloogia CRISPR-Cas9 süsteemi abil. Nat Protoc. 2013;8(11):2281–2308.

45. Liu P, et al. Immunogeense rakusurmaga seotud kalretikuliini kokkupuute kvantifitseerimine. Meetodid Enzymol. 2020;632:1–13.