Cistanche Deserticola glükosiidide koguhulk soodustab neuroloogiliste funktsioonide taastumist, indutseerides neurovaskulaarset regeneratsiooni nrf{0}}/Keap-1 raja kaudu MCAO/R rottidel

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Fujiang Wang, Ruiyan Li, Pengfei Tu, Jianping Chen, Kewu Zeng ja Yong Jiang

Taust:Traditsiooniline Hiina meditsiin Cistanche deserticola on teadaolevalt kehtiv südame- ja ajuveresoonkonna haiguste puhul. Selle isheemilise insuldi kaitseks mõeldud aktiivsed komponendid pole aga selged. Meie eesmärk oli uurida selle aktiivseid komponenteC. deserticolaisheemilise insuldi ja selle võimalike mehhanismide vastu.Meetodid:Uurisime ekstraktide aju kaitsvat toimetC. deserticola, koguglükosiidid (TG), polüsahhariidid (PS) ja oligosahhariidid (OS) keskmise ajuarteri oklusioon-reperfusiooni (MCAO/R) rotimudelis. 2, 3, 5-Trifenüültetrasooliumkloriidi (TTC) värvimist kasutati ajuinfarkti mahu hindamiseks ja hematoentsefaalbarjääri (BBB) ​​läbilaskvuse hindamiseks kasutati Evansi sinise analüüsi. Seejärel avaldised CD31, a-SMA, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, ZO-1, claudin-5, occludin, Keap-1 ja Nrf{{ 12}} analüüsiti Western blot analüüsi või immunofluorestsentsi abil ning MDA, SOD, CAT ja GSH-Px aktiivsusi analüüsiti komplektide abil.Tulemused:TG-ravi vähendas märkimisväärselt neuroloogilise puudujäägi skoori ja infarkti mahtu, soodustas angiogeneesi ja närvide remodelleerumist ning säilitas tõhusalt vere-aju barjääri terviklikkuse võrreldes mudelrühmaga. Lisaks vähendasid TG-d oluliselt MDA taset ja suurendasid antioksüdantide aktiivsust (SOD, CAT ja GSH-Px) ajus. Samal ajal vähendasid TG-d Keap-1 ekspressiooni märkimisväärselt alla ja hõlbustasid Nrf-2 tuuma translokatsiooni. Vastupidi, PS-i ja OS-i rühmade puhul ei täheldatud kaitsvat toimet.Järeldus:TG-d on peamised aktiivsed komponendidC. deserticolaMCAO/R-indutseeritud ajukahjustuse vastu ja kaitse toimub peamiselt Nrf{1}}/Keap-1 raja kaudu.

Märksõnad: Cistanche deserticola, ajukahjustus, glükosiidide summaarsed, polüsahhariidid, oligosahhariidid, Nrf{0}}/Keap- 1 rada

SISSEJUHATUS

Insulti peetakse maailmas peamiseks surma- ja puude põhjuseks (Donnan et al., 2008). Peaaegu 87 protsenti kõigist insuldijuhtudest on põhjustatud isheemilisest insuldist (Ovbiagele ja Nguyen-Huynh, 2011). Praegu on isheemilise insuldi raviks kasutatav kõige tõhusam aine ja ainus FDA poolt heaks kiidetud ravim rekombinantne koeplasminogeeni aktivaator. Kuid suur hulk insuldipatsiente ei reageeri sellele ravimile selle kitsa raviaja ja tõsise hemorraagiliste tüsistuste ohu tõttu (Lee et al., 2012; Schellinger ja Kohrmann, 2014). Trombolüütilise ravi peamiseks väljakutseks on isheemia/reperfusiooni (I/R) vigastus, mida peetakse ajukahjustuse ja funktsioonide hävimise peamiseks põhjuseks. Reperfusioon pärast ajuisheemiat suurendab aju hemorraagia riski, põhjustades samal ajal neurovaskulaarseid vigastusi ja tekitades liigseid reaktiivseid hapniku liike (ROS), mis kahjustavad hematoentsefaalbarjääri (Alluri et al., 2015). Mitmed uuringud on kinnitanud, et BBB katkemine on isheemilise insuldi patogeneesi peamine põhjus (Cao et al., 2016b).

BBB koosneb peamiselt endoteelirakkudest, peritsüütidest, astrotsüütidest, neuronitest ja basaalmembraanidest. BBB põhikomponendid on aju mikrovaskulaarsed endoteelirakud, mis on ühendatud tihedate ühendustega, piirates seega eksogeensete molekulide sattumist ajju. Tiheda ristmiku patoloogilised muutused – eriti okludiin, claudin-5 ja zonula occludens-1 (ZO-1) – mõjutavad märkimisväärselt BBB funktsiooni isheemilise insuldi ajal, eriti barjääri läbilaskvust (Liu et al., 2014; Hu jt, 2018; Liu jt, 2019). I/R perioodidel on liigne ROS üks peamisi tegureid, mis põhjustab aju neuronite otsest kahjustumist (Ding et al., 2014). ROS-i ületootmine viib teatud ristmike lagunemiseni ja BBB katkemiseni, mille tulemuseks on eksogeensete molekulide sisenemine BBB kaudu ajju, mis põhjustab ajukahjustuse süvenemist (Cheon et al., 2016; Zhang QY et al., 2017). Seetõttu on BBB kaitsmist antioksüdantidega peetud potentsiaalseks viisiks reperfusioonikahjustuste vältimiseks.

Lisaks BBB lagunemisele võib I/R põhjustada neurovaskulaarseid vigastusi ja neuronite surma (Jung et al., 2010). Insuldi ajal võib suurenenud neuronaalsete rakkude surm tuleneda oksüdatiivsest stressist (Chi et al., 2018) ning arvukad uuringud on näidanud, et ROS süvendab insuldi raskust ja neuroloogilisi kahjustusi (Kondo et al., 1997; Crack et al., 2001; Crack et al., 2006). Kuigi kliinilised uuringud ei ole andnud rahuldavaid tulemusi, on neuroprotektsioon endiselt paljulubav strateegia ägeda isheemilise insuldi raviks (Moretti et al., 2015). Seega on insuldi raviks tõhusate neuroprotektsiooni ravimite leidmine kasulik insuldihaigetele.

Traditsiooniline hiina meditsiin (TCM) võtab meetmeid, et sekkuda keha sisemise tasakaalustamatuse vastu (Gaire, 2018). Isheemiliste insultide keerulise patogeneesi tõttu mängib TCM-i ja selle aktiivsete koostisosade multifaktoriaalne toime insuldi ravis kriitilist rolli. Mongoolias ja Loode-Hiinas kuivades või poolkuivades piirkondades laialt levinud Cistanche deserticola YC Ma on olnud Hiinas enam kui 1,000 aastat laialdaselt kasutatav TCM-i rohi mitmesuguste haiguste, nagu unustamine ja depressioon, raviks. . Kaasaegnefarmakoloogilised uuringud näitasid, et toorekstraktidC. deserticolanäitasid mitmeid farmakoloogilisi toimeid, nagu õppimis- ja mälufunktsiooni parandamine, neuroprotektsioon, immuunsuse tugevdamine, antioksüdant, vananemisvastane ja väsimusevastane toime (Ko ja Leung, 2007; Wang et al., 2012; Li et al., 2015). C. deserticola keemiline analüüs näitas, et selle peamised koostisosad on fenüületanoidglükosiidid, iridoidglükosiidid, polüsahhariidid ja oligosahhariidid (Jiang ja Tu, 2009). C. deserticola aktiivsed komponendid ajukaitseks pole aga kuigi selged.C. deserticola neuroprotektiivne omadus viitab selle terapeutilisele potentsiaalile kognitiivsete funktsioonidega seotud haiguste, nagu insult ja depressioon, aga ka Alzheimeri tõve puhul (Wang et al., 2017). Kuid uuringud selle mõju kohtaC. deserticolainsuldi kohta, sealhulgas selle aktiivsed komponendid ja toimemehhanismid, on väga piiratud. Käesolevas töös uurisime kolme C. deserticola ekstrakti, üldglükosiidide (TG-d, fenüületanoidglükosiidid ja muud glükosiidid), polüsahhariidide (PS-d) ja oligosahhariidide (OS-de) kaitsvat toimet aju I/R vigastustele. Meie leiud võivad aidata kaasa selle täpsele kliinilisele kasutamiseleC. deserticolaja pakkuda kandidaatainet isheemilise insuldi raviks.

MATERJALID JA MEETODID

Kemikaalid ja reaktiivid

Cistanche deserticola varred osteti Sise-Mongooliast Alashanist ja need tuvastas üks autoritest (P.-F. Tu). TG-d, PS-id ja OS-id valmistati vastavalt meie varem teatatud meetodile (Gao et al., 2015). TG-de kvantitatiivne analüüs viidi läbi kõrgsurvevedelikkromatograafia (HPLC) abil, nagu eelnevalt kirjeldatud (Li et al, 2019), ja selle kromatogramm on näidatud joonisel 1. TG-de põhikomponendid on ehhinakosiid, tubulosiid A, akteosiid, iso- akteosiid ja 2'-atsetüüllakteosiid; nende sisaldus on vastavalt 163,05 mg/g, 4,125 mg/g, 41,66 mg/g, 22,655 mg/g ja 12,045 mg/g. PS-de ja OS-de sisaldus on vastavalt 69,42 protsenti ja 65,24 protsenti, mis on määratud vastavalt HPLC ja fenool-väävelhappe analüüsiga (Zhang A. et al., 2018; Shi et al., 2019).

Ehhinakosiidi (A0282), tubulosiidi A (A0942), akteosiidi (A0280), isoakteosiidi (A0281) ja 2'-atsetüüllakteosiidi (A0943) standardviited osteti ettevõttelt Chengdu Must Biotechnology (Sichuan, Hiina). Kõigi standardite puhtusaste on üle 98 protsendi. Nissli plekkide H&E komplektid osteti firmast Boster (Wuhan, Hiina). Edaravone (T0407-1) osteti ettevõttelt Target Mol (Shanghai, Hiina). Osteti küüliku rotivastane MAP-2 (ab32454), Nrf-2 (ab31163), PDGFRb (ab32570), Keap-1 (ab66620) ja hiire anti-roti CD31 (ab24590). firmalt Abcam Inc (Cambridge, MA, USA). Küüliku anti-roti Claudin5 (BS1069), ZO-1 (BS9802M) ja Occludin (BS72035) osteti ettevõttelt Bioworld Technology (Nanjing, Hiina). Cell Signaling Technology Inc. (Boston, MA, USA) oli küüliku rotivastase Synapsin-1 (SYN,5297T), PSD95 (3450T), a-Smooth Muscle Actin (a-SMA,19245T) allikas. GAPDH (HRP-60004) osteti ettevõttelt Proteintech Group, Inc. (Chicago, USA). Sekundaarsed antikehad tarnis Zhongshan Golden Bridge Biotechnology (Peking, Hiina). Hoechst 33258 saadi firmast Beyotime (Jiangsu, Hiina).

Loomad

Sprague-Dawley rotid (isased, kaaluga 250–300 g) saadi ettevõttest Vital River Laboratory Animal Technology (Peking, Hiina) ja neid hoiti konditsioneeritud ruumis, mida hoiti 12-tunnise valguse/pimeduse tsüklis. Kõik loomkatsed viidi läbi loomuuringute ARRIVE juhiste järgi (Kilkenny et al., 2010; McGrath et al., 2010) ja heaks kiidetud Pekingi ülikooli terviseteaduste keskuse institutsionaalse loomade hooldamise ja kasutamise komitee (LA2019123) poolt.

Loomkatsete protokollid

Rotid allutati MCAO/R-le, nagu eelnevalt kirjeldatud (Wang et al., 2018). Lühidalt paljastati vasak ühine unearter (CCA), väline unearter (ECA) ja sisemine unearter (ICA) ning 3-0 nailonist monofilamentõmblus sisestati ECA-st ICA-sse, kuni jõudis keskmesse. ajuarter (MCA). Pärast 1,5-tunnist MCA oklusiooni simuleeriti reperfusiooni, eemaldades hõõgniidi. Kirurgilise protseduuri ajal hoiti kõigi rottide kehatemperatuuri 37,0 kraadi juures.

Ravimiamet

Rotid jaotati juhuslikult kuueks rühmaks, kasutades SPSS-i tarkvara versiooni 22.0 nagu kirjeldatud (Jiang et al., 2014): normaalne rühm (NOR); mudelirühm (MOD); edaravooni rühm (positiivne ravim, 6 ml/kg, EDI); TG-de rühm (280 mg/kg, TG-d); PS-de rühm (280 mg/kg, PS-d) ja OS-de rühm (280 mg/kg, OS-d). TG-sid, PS-sid ja OS-sid manustati üks kord päevas pärast MCAO/R-i 14 päeva jooksul. NOR- ja MOD-rühmi töödeldi tavalise soolalahusega. Loomade arv on näidatud tabelis 1.

Kaalu ja modifitseeritud neuroloogilise defitsiidi skoori (mNSS) mõõtmine

Kehakaalu jälgiti 14. päeval, kasutades ADVENTURE™ digitaalset skaalat (OHAUS, New Jersey, USA). MNSS-i hinnati FJ Wangi kirjeldatud meetodil (Wang et al., 2018) väikeste muudatustega.

2, 3, 5-trifenüültetrasooliumkloriidi (TTC) värvimine

Infarkti mahtu mõõdeti nii, nagu eelnevalt kirjeldatud (Wang et al., 2015). Lühidalt öeldes jagati ajud seitsmeks võrdsete vahedega koronaalplokiks (2 mm). Neid sektsioone värviti 2% TTC-ga (Coolaber, Peking, Hiina) 37 kraadi juures 15 minutit. Infarkti maht ( protsenti )=(ipsilateraalne isheemilise poolkera maht − kontralateraalne isheemilise poolkera maht) / kontralateraalse isheemilise poolkera maht × 100.

Nissl ja H&E värvimine

Rotid anesteseeriti sügavalt ja kogu aju eemaldati seejärel kiiresti koljust ja fikseeriti 4% paraformaldehüüdiga ning sisestati parafiinvahasse ning lõigati 7 µm paksusteks viiludeks. Sektsioonid värviti Nissli ja H&E värvidega. Selles uuringus jäädvustati valgusmikroskoobiga igas koeproovis kuus juhuslikku 200 × 200 µm välja. Nissli surnukehade arv loendati IPP tarkvara versiooniga 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, USA).

Evansi sinine analüüs

Rottidele süstiti pärast MCAO/R-i 2 protsenti EB-d (Coolaber Science & Technology Co., LTD). Kaks tundi hiljem rotid tuimastati ja kogu aju eemaldati seejärel kiiresti ja homogeniseeriti atsetoonis. Supernatante analüüsiti 620 nm juures 800 TS neeldumislugejaga (BioTek, USA).

Katalaasi (CAT), superoksiiddismutaasi (SOD), malondialdehüüdi (MDA) ja glutatioonperoksidaasi (GSH-Px) aktiivsuse mõõtmine

Kõiki seerumiproove tsentrifuugiti kiirusel 4,000 × rpm 15 minutit 4 kraadi juures ja seejärel analüüsiti MDA, CAT, SOD ja GSH-Px aktiivsuse tuvastamiseks, järgides tootja juhiseid (Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd, Hiina).

Western blot analüüs

Igalt rotilt kogutud ajukoed (100 mg) homogeniseeriti ja lüüsiti RIPA lüüsipuhvris ning seejärel analüüsiti valgu kontsentratsiooni tuvastamiseks, kasutades BCA komplekti (Beijing TransGen Biotech Co., Ltd.). Koe üldvalgud kanti 10% SDS-PAGE geelidele ja kanti nitrotselluloosmembraanile. Membraan blokeeriti 5-protsendilise kooritud piimaga, seejärel inkubeeriti üleöö primaarsete antikehadega 4 kraadi juures. Seejärel inkubeeriti membraani sekundaarse antikehaga. Western blot analüüsi analüüsiti Kodak Digital Imaging Systemiga (5200 Multi, Tanon, Hiina).

Immunofluorestsentsanalüüs

Viidi läbi immunofluorestsentsvärvimine CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, okludiini, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, Nrf-2 ja Keap-1 jaoks. Primaarsed antikehad Nrf-2, CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, occludin, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2 ja Keap-1 vastu lahjendati 1:200 ja 1:100 vastavalt. Alexa Flur 488 hiire küülikuvastane IgG sekundaarne antikeha ja rodamiini (TRITC) kitse küülikuvastane IgG lahjendati mõlemad suhtega 1:200. Tuumad värviti Hoechst 33258-ga. Pildid jäädvustati Vectra® Polaris™ automatiseeritud kvantitatiivse patoloogia kujutise süsteemi abil (PerkinElmer, USA). Valgu ekspressiooni analüüsiti IPP tarkvara versiooni 6.0 abil.

Statistiline analüüs

Kõiki andmeid kirjeldati kui keskmisi ± SD. Statistilise analüüsi jaoks viidi läbi SPSS-i tarkvara versioon 22.{1}}. Erinevate rühmade võrdlemisel kasutati ühesuunalist ANOVA-d. Statistiliseks erinevuseks loeti P <>

TULEMUSED

TG-d suurendavad MCAO/R rottide kehakaalu ja vähendavad ajukahjustusi

Pärast 14-päevast ravi TG-de, PS-de, Oss-i ja EDI-ga hinnati I/R-rottide kehakaalu, neuroloogilisi puudujääke ja infarkti mahtusid. Tulemused näitasid, et MOD-rühma kehakaal vähenes oluliselt, samas kui vähenenud kaal TG-de, PS-de ja EDI-rühmades suurenes (joonis 2A). Neuroloogilise puudujäägi skoori alandasid oluliselt EDI ja TG-d (joonis 2B). NOR-rühma rottide ajulõigud olid sügavpunased ja infarkte ei esinenud, samas kui MOD rühma rottidel ilmnes suur ipsilateraalne ajuinfarkt. Pärast TG-ravi vähenesid infarkti mahud oluliselt (joonised 2C, D). PS-i ja OS-i ravi ei näidanud ülaltoodud indeksitele ilmset mõju. Ülaltoodud andmed näitasid, et TG-d võivad märkimisväärselt leevendada I / R-indutseeritud ajukahjustust, kuid PS-d ja OS-d ei suutnud.

TG-d leevendavad MCAO/R rottide histopatoloogilisi kahjustusi

TG-de, PS-de ja OS-de ravi mõjude kindlakstegemiseks histopatoloogilistele kahjustustele tehti patoloogiliste kahjustuste paljastamiseks H&E värvimine. NOR-rühma ajude histomorfoloogilised struktuurid korraldati regulaarselt. Morfoloogilised muutused TG-rühmades olid väiksemad kui MOD-rühmas. Kuid PS-i ja OS-i ravirühmad ei näidanud morfoloogiliste muutuste olulist paranemist (joonis 3).

TG-d nõrgendavad neuronaalseid vigastusi pärast I/R-indutseeritud rotte

Nissli värvimine näitas isheemilise piirkonna poolvarraste neuronite histopatoloogilisi muutusi. Nagu on näidatud joonisel 4, oli normaalsetel neuronitel selge tuum ja terve struktuur. MOD rühmas olid neuronitel rakkudevahelised ruumid laienenud. Nissl kehad olid kadunud, kokku tõmbunud ja sügavalt määrdunud. Neid muutusi täheldati aga harva EDI, TG-de ja PS-de rühmades. Need tulemused näitasid, et TG-d ja PS-d võivad oluliselt nõrgendada isheemiast / reperfusioonist põhjustatud neuronite kahjustusi.

TG-d nõrgendavad BBB häireid pärast I/R-ravi saanud rotte

Evansi sinine test on klassikaline meetod BBB läbilaskvuse muutuste uurimiseks. Katsetulemused näitasid, et MOD rühmas täheldati suurenenud Evansi sinist, samas kui TG-de ja EDI-ga töödeldud rottidel oli Evansi sinine märkimisväärselt vähenenud. Veelgi enam, PS-i ja OS-i ravirühmade vahel ei olnud olulist erinevust (joonis 5). Need tulemused näitasid, et TG-d võivad BBB häireid märkimisväärselt nõrgendada.

TG-d soodustavad angiogeneesi I/R-vigastatud rottidel

Hiljutised uuringud näitavad, et angiogenees mängib kriitilist rolli neuroloogilises funktsionaalses taastumises ja prognostilises tulemuses pärast ägedat isheemilist insuldi (Yuen et al., 2015). TG-de, PS-de ja OS-de mõju hindamiseks angiogeneesile kasutati kapillaaride arvu määramiseks CD31 ja a-SMA. Immunofluorestsentsvärvimine näitas, et MOD rühm põhjustas I/R rottide isheemiliste piirkondade poolvarras CD31 (joonised 6A, B) ja a-SMA (joonised 6C, D) ekspressioonide märkimisväärse vähenemise, võrreldes normaalsete rottidega. . See tulemus näitas, et I / R võib põhjustada isheemiliste poolkerade ajukoore penumbras veresoonte kahjustusi. Kuid TG-de ja EDI-ravi suurendas märkimisväärselt kapillaaride tihedust, angiogeneesi ja arteriogeneesi, mida näitavad CD31 ja a-SMA suurenenud ekspressioonid. Need tulemused viitavad sellele, et TG-d võivad soodustada angiogeneesi I / R rottide isheemilises penumbras, kuid PS-d ja OS-d ei saa seda teha.

TG-d suurendavad tihedate ühenduste valkude ekspressiooni I/R-vigastatud rottidel

BBB häire võib tõsta aju veesisaldust ja kudede turset, mis põhjustab ajukahjustusi. Tihedad ühendusvalgud on BBB olulised struktuurikomponendid (Tenreiro et al., 2016; Jiang et al., 2018). Et testida, kas TG-de, PS-de ja OS-de ravi pärast insulti võib mõjutada BBB terviklikkust, viidi ZO-1, claudin-5 ja okludiini ekspressioonid läbi immunofluorestsentsanalüüsiga. Tulemused näitasid, et claudin -5, ocludin ja ZO-1 ekspressioonid olid MOD rühmas nähtavalt vähenenud. Kuid need suurenesid oluliselt pärast 14-päevast TG-de manustamist. PS-i ja OS-i rühmad ei näidanud nendes valguekspressioonides olulisi muutusi (joonis 7). Need andmed näitasid, et TG-d võivad reguleerida tihedaid ristmikvalgu ekspressioone ja tõenäoliselt säilitada BBB terviklikkuse pärast I / R vigastust. TG-d suurendavad peritsüütide katvust kapillaaridel I/R-vigastatud rottidel Peritsüüdi katvus kapillaaridel mängib BBB terviklikkuse säilitamisel olulist rolli (Armulik et al., 2010; Daneman et al., 2010). Seega testisime, kas peritsüütide katvust saab suurendada TG-de, PS-de ja OS-de raviga. Immunofluorestsentsi intensiivsuse analüüsi tulemused näitasid, et nii PDGFRb kui ka CD31 ekspressioonid vähenesid MOD rühmas dramaatiliselt. TG-de manustamine I/R-rottidele taastas märkimisväärselt või isegi suurendas PDGFRb ja CD31 ekspressiooniintensiivsust, kuid PS-de ja OS-de ravirühmades erinevusi ei täheldatud (joonis 8). Seega võib TG-de ravi oluliselt suurendada peritsüütide katvust. Need leiud kinnitasid veelgi, et TG-d suudavad säilitada BBB terviklikkuse pärast I / R-i.

TG-d soodustavad I/R vigastatud rottide närvide ümberkujunemist

Paljude uuringute kohaselt võib neurogenees pärast insulti oluliselt parandada funktsionaalset taastumist (Grefkes ja Ward, 2014; Zhang et al., 2019). Sünaptofüsiini (SYN), postsünaptilise tiheduse 95 (PSD-95) valke ja mikrotuubulitega seotud valku 2 (MAP-2) kasutati markeritena, et uurida neuronaalset plastilisust ajukoore isheemilises penumbras. Et hinnata TG-de, PS-de ja OS-de ravi mõju neurogeneesile I/R vigastatud rottidel, viidi läbi immunofluorestsents ja Western blot SYN, PSD95 ja MAP{8}} ekspressioonide jaoks. Nagu on näidatud joonistel 9 ja 10, vähenesid SYN, PSD95 ja MAP{12}} ekspressioonitasemed I/R rottidel pärast 14-päevast reperfusiooni võrreldes NOR rottidega, samas kui TG-de ja PS-de paranemine võis oluliselt tõusta. reguleerida nende ekspressioonitaset. OS-i rühmal ei olnud MOD-rühmaga võrreldes olulisi muutusi. Andmed näitasid, et TG-de ja PS-de ravi suutis dramaatiliselt soodustada närvide remodelleerumist pärast I / R vigastust.

TG-d muudavad nrf{0}} ja Keap-1 väljendeid I/R-vigastatud rottides

Oksüdatiivne stress on I/R vigastuse peamine patogeenne mehhanism (Ya et al., 2018; Yu et al., 2018). Uuringud kinnitasid, et Nrf-2 on antioksüdatiivsete reaktsioonide peamine regulaator (Thompson et al., 2015). Et uurida Nrf-2 ja Keap-1 vahendatud oksüdatiivseid reaktsioone pärast I/R vigastust, hindasime Keap-1 tsütoplasmaatilist ekspressiooni ja tuuma translokatsiooni. Vahepeal analüüsiti ka Nrf{7}} ekspressiooni I/R vigastatud roti ajukoes (joonised 10 ja 11). Immunofluorestsentsanalüüsi kohaselt leiti, et Nrf{10}} paikneb peamiselt NOR-rühma tsütoplasmas. TG-de rühmas oli Nrf-2 ekspressioon tsütoplasmaatilises lokalisatsioonis alareguleeritud, kuid tuumas ülesreguleeritud ning samuti täheldati Keap-1 ekspressiooni vähenemist. Andmed näitasid, et TG-de ajukaitse võib olla seotud Nrf{13}} ja Keap{14}} modulatsiooniga

TG-d nõrgendavad ajukudede oksüdatiivset stressi I/R vigastatud rottidel

TG-de antioksüdatiivse toime kinnitamiseks hinnati SOD, CAT, GSH-Px ja MDA aktiivsust I/R vigastatud rottidel. Joonisel 12 oli MDA sisaldus märgatavalt suurenenud MOD rühmas ja samal ajal vähenesid SOD, CAT ja GSH-Px aktiivsused võrreldes normaalsete rottidega. Seevastu TG-ravi põhjustas MDA sisalduse olulise vähenemise ja SOD, CAT ja GSH-Px aktiivsuse suurenemise. Need tulemused kinnitasid veelgi TG-de antioksüdatsiooni aktiivsust.

ARUTELU

Paljud uuringud näitavad, et TCMC. deserticolaomab ulatuslikku bioloogilist tegevust, nt parandab õppimisvõimet, mälu ja immuunsust (Dong et al., 2007; Jiang ja Tu, 2009; Wang et al., 2017; Xia jt, 2018). C. deserticola aktiivsed komponendid neuroprotektsiooniks jäävad siiski ebaselgeks. Praeguse töö eesmärk on aktiivsete komponentide väljasõelumineC. deserticolaisheemilise insuldi vastu MCAO/R mudelil. Nende mõju MCAO/R rottidele ja ka võimalike mehhanismide hindamiseks kasutati kolme C. deserticola ekstrakti (TG-d, PS-id ja OS-id).

Insult on tavaline äge tserebrovaskulaarne haigus. Epidemioloogilised uuringud näitavad, et meestel esineb insult sagedamini kui naistel (Sealy-Jefferson et al., 2012; Guzik ja Bushnell, 2017). Seega võeti meie katses katseteks isased rotid. Meie tulemused näitasid, et I / R induktsioon kiirendas oksüdatiivset stressi ja infarkti mahtu, lõhkudes BBB ja põhjustades närvi- ja tserebrovaskulaarseid vigastusi. Pärast sõeluuringut leiti, et TG-d vähendavad infarkti mahtu ja soodustavad närvide remodelleerumist ja angiogeneesi. Lisaks täheldati, et TG-d säilitasid BBB terviklikkuse pärast I / R vigastust. Vastupidi, PS-d ja OS-d ei leevenda I/R-vigastusi märkimisväärselt. Seega peetakse TG-sid peamiseks aktiivseks fraktsiooniksC. deserticolaneuroprotektsiooniks, potentsiaalselt närvide remodelleerumise, angiogeneesi ja BBB terviklikkuse edendamise kaudu, aktiveerides raja Nrf{0}}/Keap-1.

Üha suurenevad tõendid näitavad, et tõhusa tagatisringluse loomine on infarkti ja isheemilise penumbra tekke vältimiseks märkimisväärselt oluline ning isheemilise insuldi varases staadiumis kriitiline ravi (ElAli, 2016; Iwasawa et al., 2016). Veresoonte endoteelirakkude ja silelihasrakkude proliferatsioon pärast isheemilist infarkti määrab kollateraalse tsirkulatsiooni tekkimise. Siiski on isheemiamudelitel tavaline nähtus - see tähendab, et aju mikroveresoonkonnas eksisteeris laialdaselt oksüdatiivne stress. Uuringuandmed on näidanud, et suur hulk antioksüdante võib häirida BBB funktsiooni ja angiogeneesi omadusi (Mentor ja Fisher, 2017). CD31 ja a-SMA on vastavalt vaskulaarsete endoteelirakkude ja silelihasrakkude markerid (Saboor et al., 2016). Et uurida ekstraktide mõju ülalmainitud rakkude proliferatsioonileC. deserticola, uurisime CD31 ja a-SMA ekspressioone aju isheemilises penumbra homogenaadis. Meie andmed näitasid, et TG-d suurendasid märkimisväärselt CD31 ja a-SMA ekspressioone. Siiski ei olnud PS-i ja OS-i rühmade puhul olulisi erinevusi. Seetõttu järeldasime, et TG-d võivad vähendada ajukahjustusi, soodustades angiogeneesi, suurendades CD31 ja a-SMA ekspressioone, samas kui PS-id ja OS-id ei taganud sellist kaitset ajukahjustuste eest. Need tulemused kinnitasid veelgi, et ainult TG-d võivad vältida aju I / R vigastusi.

Isheemilist insuldi võib pidada ajuisheemia tulemuseks, mis on põhjustatud neuronaalse plastilisuse kahjustusest või ajupiirkondade ümberkujundamisest. Enamikul insuldihaigetel on neuroloogiline defitsiit. Neurogeneesi aktiveerimine on insuldihaigete jaoks paljutõotav strateegia nende neuroloogiliste funktsioonide parandamiseks (Cramer ja Chopp, 2000). Neurogenees osaleb otseselt neuroloogilise funktsiooni taastumises pärast aju I/R vigastust (Zhang et al., 2019). Varasemad uuringud näitavad, et TG-d võivad parandada hipokampuse püramiidrakkude ellujäämise määra ja indutseerida neurogeneesi (Lian et al., 2017). Oksüdatiivne stress põhjustab neuronite kadu paljude haiguste, näiteks Parkinsoni tõve, insuldi jms ajal (Duan ja Si, 2019; Singh et al., 2019). Nrf-2 transkribeerib palju neuroprotektsiooniga seotud geene nende promootorpiirkonnas, sealhulgas peamiselt SOD, MDA, CAT ja g glutamüültsüsteiini ligaase jne (Satoh et al., 2006). SYN, PSD-95 ja MAP-2 valke, mis on tihedalt seotud sünaptilise moodustumise ja neurotransmissiooniga, võib pidada isheemilise penumbra piirkonna uuritava neuronaalse plastilisuse markeriteks. Pärast uurimist avastasime, et TG-dega ravimine võib märkimisväärselt suurendada PSD95, SYN-i ja MAP-i{10}} ekspressioone, mis näitab, et TG-de ajukaitse oli korrelatsioonis neuronite suurenenud plastilisusega I/R ajal. Kahju aga, et nii PS-de kui ka OS-ide gruppide puhul pole ilmset vahet. Need tulemused näitasid, et TG-d võivad pärast aju I / R vigastust suurendada neuroplastilisust.Insuldihaigete pildiuuringud näitasid, et BBB düsfunktsiooni võib pidada periisheemilise aju silmatorkavaks tunnuseks (Bang et al., 2007). TJ-d, mis koosnevad tsütoplasma valkudest, transmembraansetest valkudest ja kapillaaride endoteelirakkude vahelisest adhesioonimolekulidest, on BBB terviklikkuse säilitamisel väga olulised (Ye et al., 2019). Nende hulgas on TJ-de kõige olulisemad valgud ZO-1, claudin-5 ja okludiin. Suuremad tõendid näitavad, et isheemiast põhjustatud BBB suurenenud läbilaskvus on üldiselt korrelatsioonis ZO-1, claudiini-5 ja okludiini muutustega (Cao et al., 2016a; Page et al., 2016; Yu jt, 2017; Liu et al., 2018). Selle töö tulemused näitasid, et kuigi TG-d võivad oluliselt suurendada ZO-1, claudin-5 ja okludiini valkude ekspressiooni MCAO-indutseeritud ajukoes, ei teinud seda ei PS-d ega OS-d. BBB koosneb aju endoteelirakkudest ja on tihedalt seotud peritsüütidega (Nyul-Toth et al., 2016). Peritsüüdid on BBB terviklikkuse jaoks üliolulised (Bell et al., 2010). Isheemiline insult põhjustab ägedas faasis peritsüütide surma ja eraldumise aju endoteelirakkudest, destabiliseerides seega mikroveresoonkonna ja muutes BBB omadusi (Zechariah et al., 2013). Meie andmed näitasid, et TG-d võivad suurendada peritsüütide katvust kapillaaridel ja suurendada ZO-1, claudiini-5 ja okludiini ekspressioonitaset. Need nähtused tõestasid, et TG-d võivad pärast aju I / R vigastust tõhusalt kaitsta BBB terviklikkust. Kokkuvõttes võivad TG-d ajukahjustusi nõrgendada mitmel viisil, näiteks soodustades angiogeneesi, parandades neuronite plastilisust ja säilitades BBB terviklikkust.

Seejärel uurisime signaaliülekande rada, et uurida TG-de ajukaitse aluseks olevat mehhanismi. I/R vigastuse protsess on multifaktoriaalne ja seega on patogeneesis palju mehhanisme. Oksüdatiivne stress on põhiline riskitegur, mis soodustab I/R-indutseeritud ajukahjustusi (Suda et al., 2013), nagu BBB struktuuri kahjustused, veresoonte endoteeli düsfunktsioon ja isheemilise närvikahjustuse süvenemine (Xiong et al., 2015; Caglayan). et al., 2019; Priestley jt, 2019). Seega on oksüdatiivne stress muutunud atraktiivseks terapeutiliseks sihtmärgiks I / R-indutseeritud ajukahjustuse korral. 2. faasi ensüüme, mida vahendab tuumafaktor E2-seotud faktor-2 (Nrf-2), on peetud oluliseks vahendiks, mille abil neuronid end oksüdatiivse stressi eest kaitsevad (Suzuki ja Yamamoto, 2015; Ya et al., 2018). Tõendid näitavad, et Nrf-2 aktiveerimine I/R ajal on neuroprotektsiooni potentsiaalne terapeutiline sihtmärk (Ding et al., 2015; Zhang R. et al., 2017). Nrf-2, mis on endogeense antioksüdantse kaitse oluline regulaator, vahendab heemi oksügenaas 1 (HO-1) ja teiste antioksüdantsete ensüümide, nagu NAD(P)H kinoonoksidoreduktaas 1 (NQO1), taset. SOD, CAT, GSH ja MDA (Siow et al., 2007; Ding et al., 2014). Lisaks mängib Nrf{22}} angiogeneesis olulist regulaatori rolli. Käesolev uuring näitab, et Nrf-2 saab veresoonte arengu protsessis oluliselt suurendada ja aktiveerida (Wei et al., 2013).

Nagu eelnevalt kirjeldatud (Jiang ja Tu, 2009), sisaldavad TG-d palju bioaktiivseid ühendeid, näiteks ehhinakosiidi, tubulosiid A, akteosiidi, isoakteosiidi ja 2'-atsetüüllakteosiidi ning mõned neist näitasid pärast aju I/R neuroprotektiivset funktsiooni. vigastus (Peng et al., 2016). Ehhinakosiidil on palju farmakoloogilisi toimeid, nagu antioksüdatsioon, vananemisvastane toime, neuroprotektsioon, põletikuvastane toime, kihistumise soodustamine, hepatoprotektsioon, luukoe moodustumise soodustamine ja kasvajavastased toimed (Yu et al., 2016; Li et al., 2018; Zhang Y. jt, 2018; Ji jt, 2019; Xu et al., 2019). Hiljuti on ehhinakosiid tuvastatud kui tugev kesknärvisüsteemi antioksüdant (Lu et al., 2016). Ehhinakosiid võib vähendada MDA sisaldust ning parandada SOD ja GSH Px aktiivsust isheemia ajukahjustuse korral ning molekulaarne dokkimisanalüüs näitas, et ehhinakosiid võib seostuda Keapiga-1, mis viib Nrf-2 tuuma translokatsioonini (Li jt, 2018). Xia uuring näitas, et akteosiid võib vähendada infarkti mahtu ja aju veesisaldust, et parandada MCAO/R rottide neuroloogilisi puudujääke oksüdatiivse stressi leevendamise kaudu (Xia et al., 2018). Teised uuringud on näidanud, et isoakteosiid võib suurendada raku antioksüdantsete ensüümide, SOD ja CAT aktiivsust H2O2-töödeldud V79-4 rakkudes (Chae et al., 2005). Tuginedes ülaltoodud aruannetele TG-des sisalduvate aktiivsete ühendite kohta, on võimalik järeldada, et TG-d võivad antioksüdatsiooniradade kaudu kaitsta isheemilise insuldi eest.

Li teatas fenüületanoidglükosiidide (PhG) neuroprotektiivsest mõjust H2O2-indutseeritud apoptoosile PC12 rakkudel Nrf2/ARE raja kaudu (Li et al., 2018). Need PhG-d pärssisid märkimisväärselt, käivitades Nrf2 tuuma translokatsiooni ja suurendades HO-1, NQO1, glutamaat-tsüsteiini ligaasi katalüütilise subühiku (GCLC) ja glutamaat-tsüsteiini ligaasi modifikaatori subühiku (GCLM) ekspressiooni (Li et al., 2018). Gong et al., 2019). Seetõttu viitavad need leiud sellele, et Nrf-2/ARE rada mängib ülitähtsat rolli PhG-de vahendatud kaitsvates mõjudes neuronaalsetele rakkudele. Sarnaselt leidsime selles uuringus, et TG-d võivad vähendada MDA taset ja suurendada SOD, CAT ja GSH-Px taset I / R rottidel. Samal ajal võivad TG-d ülesreguleerida Nrf2 ekspressiooni tuumas, vähendada vastavat ekspressiooni tsütoplasmas ja oluliselt vähendada Keap{16}} ekspressiooni. Seetõttu võib rada Nrf-2/Keap-1 olla seotud TG-de vahendatud neuroprotektiivse toimega. Selle raja edasine valideerimine viiakse tulevikus läbi in vitro rakukultuuris hapniku-glükoosi puuduse / reoksüdatsiooni vigastuste mudelitega. Enamgi veel,C. deserticolaekstrakte manustati meie uuringus pidevalt 14 päeva. Kuna täiskasvanute neurogenees mõjutaks neuroprotektiivsete mõjude tõlgendamist 14-päevase reperfusiooni ajal, ei saa meie praeguses katseplaanis CT-de neuroprotektiivse toime uurimisel neurogeneesi välistada. See on meie uurimistöö piirang.

Kokkuvõtteks võib öelda, et see on pärit TG-destC. deserticolamis võivad tugevdada angiogeneesi ja neurogeneesi ning säilitada BBB terviklikkust I/R vigastusrottidel, kuid mitte PS-de ja OS-de puhul. Mõju võib vahendada raja Nrf-2/Keap-1 aktiveerimine.