Tubulosiidi B kaitsev toime TNF-indutseeritud apoptoosile neuronaalsetes rakkudes

ABSTRAKTNE

EESMÄRK: uurida tubulosiidi B neuroprotektiivset toimet, mis on üks fenüületanoididest, mis on eraldatud tubulosiidi vartest.Cistanche salsa, kasvaja nekroosifaktor-alfa (TNF) poolt indutseeritud apoptoosi kohta SH-SY5Y neuronaalsetes rakkudes.MEETODID: Rakkude elujõulisust analüüsiti MTT testiga. Apoptootilised rakud tuvastati Hoechst33342 värvimise abil ja kinnitati DNA fragmentatsiooni ja voolutsütomeetrilise analüüsiga. Kaspaasi-3 aktiivsust mõõdeti spetsiaalse testikomplektiga. Vaba rakusisese kaltsiumi kontsentratsioon määrati probeIndo-1 abil spektromeetriga. Intratsellulaarsete reaktiivsete hapnikuliikide tase ja mitokondriaalse membraani potentsiaal määrati laserskaneeriva konfokaalse mikroskoopia (LSCM) abil koos fluorestsentssondiga H2DCFDA või JC-1. TULEMUSED: SH-SY5Y rakkudel, mida töödeldi TNF-ga 100 µg/l 36 tundi, ilmnesid tüüpilised apoptoosi morfoloogilised muutused. DNA redelit võis jälgida agaroosgeelelektroforeesiga. Suurim apoptootiliste rakkude protsent kogunes 37,5 protsendini. Pärast 36-tunnist ravi TNF-ga täheldati rakusisese ROS-i ja [Ca2 pluss] I akumuleerumist ja mitokondriaalse membraanipotentsiaali vähenemist ning kaspaasi-3aktiivsus suurenes kontrollrühmaga võrreldes ligikaudu viis korda. Kuid eeltöötlus tubulosiidi B-ga (1, 10 või 100 mg/l) 2 tunni jooksul nõrgendas TNF-vahendatud apoptoosi. Tubulosiidi B antiapoptootiline toimeosaliselt sõltus antioksüdatiivse stressi mõjust, mitokondrite funktsiooni säilitamisest, vaba rakusisese kaltsiumi kontsentratsiooni vähenemisest ja kaspaasi -3 aktiivsuse pärssimisest. JÄRELDUS: Tubulosiidil B on neuroprotektiivne võime antagoniseerida TNF-indutseeritud apoptoosi SH-SY5Y rakkudes ja see võib olla kasulik mõnede neurodegeneratiivsete haiguste ravis.

SISSEJUHATUS

Apoptoos mängib olulist homöostaatilist rolli mitmetes rakuprotsessides ja ka närvisüsteemide arengus[1]. Programmeeritud rakusurm võib kaasa aidata ka mitmesugustele patoloogilistele seisunditele, nagu ajuisheemia[2,3], neurodegeneratiivsed häired, nagu Alzheimeri tõbi, Parkinsoni tõbi, Hunting Toni tõbi ja amüotroofiline lateraalskleroos[4-7]; samuti hiline entsefalopaatia pärast ägedat süsinikmonooksiidi mürgitust[8]. Mitmed tõendid on kindlalt viidanud sellele, et oksüdatiivne stress, rakkude tasakaalustamatus reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) tootmise ja elimineerimise vahel, põhjustas neuronaalse apoptoosi ja nekroosi[9-11]. Seetõttu on väärtuslik tuvastada ühendeid, mis võivad antagoniseerida ROS-i kahjulikku toimet ja toimida antioksüdandina, et kaitsta neuroneid apoptoosi eest.

Tubulosiid B on üks fenüületanoididest, mis on eraldatud selle vartestCistanche salsa, Hiina taimne ravim, mis on oluline toorravim, mida kasutatakse nii seleeni- kui ka väsimusevastase ainena[12]. On näidatud, et mitmetel fenüületanoididel on vabu radikaale püüdvad omadused ja need kaitsevad oksüdatiivse stressi põhjustatud toksiliste vigastuste eest[13-15]. Kasvajanekroosifaktor-alfa (TNF) on toksiline segav aine, kuna tal on oluline roll neurodegeneratiivsetes haigustes. Vastuseks TNF-ile on täheldatud surma kas nekroosi või apoptoosi tõttu [16]. Paljud uuringud näitavad, et oksüdatiivne stress mängib kriitilist rolli TNF-vahendatud raku apoptoosi mehhanismis. Pärast TNF-ga töötlemist on rakkudes dokumenteeritud ROS-i taseme tõusu [17,18] ja vabade radikaalide püüdjad võivad pärssida TNF-vahendatud surma [19]. Seega uurisime, kas tubulosiid B suudab kaitsta kultiveeritud SH-SY5Y neuronaalsetes rakkudes TNF-indutseeritud apoptoosi ja oksüdatiivse stressi vastu.

MATERJALID JA MEETODID

Reaktiivid

Modifitseeritud Eagle'i sööde (MEM) ja veise loote seerum (FBS) osteti ettevõttelt GIBCO/BRL. Kromatiinvärv bisbensimiid (Hoechst 33342), polü-L-lüsiin, 3-(4,5-dimetüültiasaal-z-üül)-2, 5-difenüültetrasoolium (MTT), TNF ja 2,7-diklorodihüdrofluorestseiindiatsetaati (H2DCFDA) saadi firmalt Sigma Chemical Company (St Louis, MO, USA). Anneksiin-V fluorestseiini isotiotsüanaadi (FITC) apoptoosi tuvastamise komplekt osteti firmalt Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN, Saksamaa). 5,5',6,6'-tetrakloraal-1,1',3,3'-tetraetüülbensimidasoolkarbotsüaniinjodiid (JC-1) ja Indo-1/AM osteti ettevõttest Molecular Sondid (Leiden, Holland). Kaspaas-3 analüüsi ja DNA ekstraheerimise komplektid saadi ettevõttelt Promega (USA). Tubulosiid B alatesCistanche salsapakkus lahkelt dr Peng-fei TU (Pekingi ülikooli traditsioonilise hiina meditsiini kaasaegne uurimiskeskus). Ühendite puhtus oli kõrgsurvevedelikkromatograafias (HPLC) üle 98 protsendi. Kõik muud reaktiivid või ravimid olid analüütilise puhtusega.

Rakukultuur ja ravi

ATCC-st saadud neuronaalseid SH-SY5Y rakke hoiti MEM-is, millele oli lisatud 10% FBS-i, 100 KU/L bensüülpenitsilliini ja 100 mg/l streptomütsiine, polü-L-lüsiiniga kaetud kultiveerimiskolvis niisutatud inkubaatoris 5% CO2-ga temperatuuril 37 °C. Kultuurikeskkonda uuendati iga 2 kuni 3 päeva järel. Rakke töödeldi 2 tundi erinevate tubulosiidi B kontsentratsioonidega (1, 10 või 100 mg/l) ja seejärel töödeldi enne analüüsimist 100 µg/l TNF-iga 36 tundi. Normaalseid rakke peeti kontrolliks.

Rakkude elujõulisuse analüüs

Rakkude elujõulisus määrati MTT-testi[20] abil. Rakud külvati 96-süvendiplaatidele tihedusega 1 × 104 rakku süvendi kohta ja kasvatati söötmes 70% konfluentsuseni. Sööde asendati söötmega, mis sisaldas erinevates kontsentratsioonides tubulosiidi B 2 tundi ja seejärel TNF-iga 36 tundi. Igasse süvendisse lisati 36 tunni pärast kokku 5 g/l MTT-d ja kultuuri inkubeeriti veel 4 tundi temperatuuril 37 ºC. Pärast söötme eemaldamist lahustati rakud ja värvikristallid 200 µL dimetüülsulfoksiidiga (Me2SO) ja neeldumist mõõdeti lainepikkusel 570 nm, kasutades mudeli ELX-800 mikroplaadi analüüsilugejat (One Lambda Inc).

Hoechst 33342 värvimine

Pärast töötlemist tubulosiidi B ja/või TNF-ga koguti rakud ja fikseeriti 4% paraformaldehüüdiga 30 minutit temperatuuril 25 ºC, seejärel pesti kolm korda eeljahutatud fosfaatpuhversoolaga (PBS) ja eksponeeriti toas 10 mg/l Hoechst33342-ga. temperatuuril pimedas 10 minutit. Proove vaadeldi fluorestsentsmikroskoopiaga (Olympus RX 400)[21].

DNA fragmentatsiooni analüüs

DNA ekstraheeriti DNA ekstraheerimiskomplekti (Promega) abil vastavalt tootja juhistele. Lühidalt, 10 µl DNA proov laaditi 1,5% horisontaalsetele agaroosgeelidele, mis sisaldasid etiidiumbromiidi. Geele töödeldi 60 V juures 1 tund ja DNA fragmendid visualiseeriti UV-valgustusega[22].

Anneksiin-V sidumiskatse

Anneksiin-V sidumiseks kasutati AnnexinV-FITC apoptoosi tuvastamise komplekti, millel on tugev afiinsus fosfatidüülseriini suhtes ja mis suudab tuvastada apoptoosi [23]. Lühidalt, rakud koguti ja suspendeeriti sidumispuhvris raku lõpliku kontsentratsiooniga 1 × 106 rakku/ml. Ligikaudu 1 × 105 rakku inkubeeriti pimedas anneksiin-V ja propiidiumjodiidiga 15 minutit. Seejärel analüüsiti suspensiooni FACS-i skaneerimisvoolutsütomeetriga (Becton Dickinson, Heidelberg, Saksamaa). Anneksiin-VFITC ja propiidiumjodiidiga seotud fluorestsents registreeriti vastavalt FL1-H (525 nm) ja FL2-H (575 nm) filtritel.

Kaspaasi-3 aktiivsuse test

Kaspaasi{0}} aktiivsus tuvastati Apo-ONETM HomogenousCaspase-3 analüüsikomplekti (Promega) abil. Lühidalt, rakud külvati 96-süvendiplaatidele tihedusega 1 × 104 rakku süvendi kohta. Pärast kokkupuudet tubulosiidB ja/või TNF erinevate kontsentratsioonidega pesti rakke jääkülma PBS-ga. Seejärel segati 1 µL Z-DEVD-R110 ja 99 µL kaspaaspuhvrit, et saada homogeenne kaspaas{12}}reaktiiv. Igasse süvendisse lisati kokku 100 µL homogeenset kaspaas{14}} reaktiivi. Sisu segati õrnalt ja inkubeeriti 4 tundi toatemperatuuril pimedas. Z-DEVD-R110 substraadi fluorestsentsi intensiivsust mõõdeti ergastuslainepikkusel 498 nm ja emissioonilainepikkusel 521 nm, kasutades mikroplaadi spektrofluoromeetrit (Wallac Victor2TM 1420 Multilabel Counter, USA).

Intratsellulaarse ROS taseme määramine rakusisene

ROS-i tasemeid mõõdeti fluorestsentsvärvi H2DCFDA värvimismeetodiga[24]. H2DCFDA on mittepolaarne ühend, mis muundatakse raku esteraaside toimel pärast rakkudesse inkorporeerimist mittefluorestseeruvaks polaarseks derivaadiks (H2DCF). H2DCF on membraani mitteläbilaskev ja oksüdeerub intratsellulaarse ROS juuresolekul kiiresti tugevalt fluorestseeruvaks 2,7-diklorofluorestseiiniks (DCF)[25]. Klaasist katteklaasidel kasvatatud rakke inkubeeriti igas rühmas 30 minutit temperatuuril 37 ºC H2DCFDA 20 µmo/L lahusega PBS-is. Seejärel pesti katteklaase kolm korda PBS-ga ja analüüsiti konfokaalse lasermikroskoopia abil (Leica, Saksamaa). DCF ergutati 488 nm juures ja emissioonifilter oli 510 nm barjäärfilter. Fluorestsentsi intensiivsust ja konfokaalseid lasermikroskoopilisi kujutisi hoiti konstantsena, et võimaldada kontroll- ja katserakkude suhtelise fluorestsentsi intensiivsuse võrdlemist.

Mitokondriaalse membraani potentsiaali test

Rakkude mitokondriaalse membraani potentsiaal oli mulle sondi JC-1[26] kasutamisel kindel. JC-1 võib mitokondritesse siseneda selektiivselt, mis on madala kontsentratsiooni või madala membraanipotentsiaali korral roheline monomeerina. Kuid kõrgel kontsentratsioonil ilmnevad mitokondrid punaste fluorestseeruvate agregaatidena. JC -1 on tundlik mitokondriaalse membraani potentsiaali suhtes ning muutused rohelise ja punase fluorestsentsi vahekorras võivad anda teavet mitokondriaalse membraani potentsiaali kohta. Pärast töödeldud rakkude laadimist JC-1 1 µmol/L-ga 10 minutiks temperatuuril 37 ºC, ergastati fluorestseeruv värv 490 nm juures ja nii monomeeri kui ka agregeerunud molekulide fluorestsentsi intensiivsus registreeriti 590 nm juures konfokaalses valguses. skaneeriv lasermikroskoopia.

[Ca2 pluss ]i mõõtmised

SHSYY rakkude vaba rakusisene kaltsiumi kontsentratsioon ([Ca2 pluss ]i) määrati sondiga Indo-1, järgides Rego et al[27] kirjeldatud meetodit. Pärast TNF-ga töötlemist (tubulosiidi B juuresolekul või puudumisel) laaditi SHSYY rakud 3 µmol Indo-1/AM-ga MEM-is 45 minutiks temperatuuril 37 ºC ja inkubeeriti veel 15 minutit MEM-is, et võimaldada raku hüdrolüüsi. sondi atsetoksümetüülestri prekursor. Pärast loputamist naatriumsoola lahusega (1,5 mmol/L CaCl2-ga) mõõdeti rakkude fluorestsentsi 37 ºC juures luminestsentsspektromeetris, ergastus 335 nm juures ja emissioon 410 nm juures. [Ca2 pluss ] I arvutati võrrandi järgi:

[Ca2 pluss ]i=250 nmol/L × [(F-Fmin)/(Fmax-F)] (nmol/L),

kus 250 nmol/L vastab kompleksi Indo-1-Ca2 plus dissotsiatsioonikonstandile, Fmax on maksimaalne fluorestsents, mis saadakse 3 ¦Ìmol/lionomütsiini lisamisel, ja Fmin on minimaalne fluorestsents, mis on määratud järgmise võrrandiga: Fmin =AF pluss 1/12(Fmax-AF), kus AF on autofluorestsents, mis saadakse 3 mmol/l MnCl2 lisamisel.

Statistiline analüüs

Tulemused väljendati iga katse puhul kolmekordsete väärtuste keskmisena ± SD. Statistilised võrdlused hõlmasid Student-S-testi kasutamist. P<0.05 was="" considered="" to="" be="" statistically="">

TULEMUSED

Tubulosiid B mõju raku tuuma morfoloogiale

Tubulosiid B- ja TNF-ravi järgsete tuumamorfoloogia muutuste hindamiseks kasutati DNA suhtes tundlikku Hoechst 33342 värvimist. Normaalsete rakkude tuumad olid normaalsed ja neil oli kromatiini hajutatud värvumine (joonis 1A). Kuid pärast 36-tunnist kokkupuudet TNF-iga 100 µg/l, toimusid SH-SY5Y rakkudes tüüpilised apoptoosi morfoloogilised muutused, nagu kondenseerunud kromatiin ja kahanenud tuum (joonis 1B). Tubulosiidi B-ga eeltöödeldud rakkudes täheldati märgatavat langust (joonis 1C-1E).

Tubulosiidi B neuroprotektiivne toime rakkude elujõulisusele

Pärast inkubeerimist TNF-ga suri umbes 45,6 protsenti rakkudest apoptoosi tõttu. Eeltöötlemine tubulosiidiga B (1, 10 või 100 mg/l) vähendas rakusurma määra annusest sõltuval viisil (rakusurm oli vastavalt 30%, 19,5% ja 6,2%; joonis 2), kuid tubulosiid B üksi ei põhjustanud nähtavat tsütotoksilisust (andmeid pole näidatud).

Tubulosiid B mõju DNA fragmentatsioonile

Pärast SH-SY5Y rakkude kokkupuudet TNF-iga 36 tundi täheldati tavaliselt väljendunud DNA redelit. Tubulosiidi B-ga eeltöötletud rakud inhibeerisid aga TNF-vahendatud DNA redelit, eriti kontsentratsioonil 100 mg/l, mis pärsib täielikult DNA fragmentatsiooni (joonis 3).

Tubulosiid B mõju fosfolipiidide fosfatidüülseriini ekspositsioonile

Tubulosiidi B antiapoptootilist toimet kinnitati ka fosfatidüülseriini olemasolu mõõtmisega raku välismembraanil. Kontrollrühmas on umbes 96,3 protsenti rakkudest terved. Joonisel fig 4 on näidatud anneksiin-V seondumiskatsete tulemused, et mõõta fosfatidüülseriini esinemist raku välismembraanil. Apoptoosi protsent oli pärast TNF-ravi 37,5 protsenti (joonis 4B), kuid see osa vähenes 28,2 protsendini, 19,29 protsendini ja 7,9 protsendini tubulosiidB eeltöötlemisel vastavalt 1, 10 või 100 mg/l (joonis 4C-4 E).

Tubulosiidi B inhibeeriv toime ROS-i moodustumisele

Käesolevas uuringus saadi SH-SY5Y rakkudest tüüpilised konfokaalsed lasermikrograafid 36 tunni jooksul TNF ja tubulosiidiB puudumisel või juuresolekul. TNF-indutseeritud rakkudes tekkinud ROS-i tase tõusis märkimisväärselt võrreldes kontrollidega (joonis 5B). Siiski vähenes fluorestsentsi intensiivsus tubulosiid B-ga töödeldud rakkudes vastavalt 16,2%, 56,4% ja 89,7% 1,10 või 100 mg/l tubulosiid B-ga töötlemisel võrreldes TNF-ga töödeldud rakkudega (joonis 5C-5 E).

Tubulosiidi B mõju mitokondriaalse membraani potentsiaalile

Töötlemata kontrollrakkudel esines arvukalt eredalt värvuvaid mitokondreid, mis kiirgasid punakasoranži fluorestsentsi ja punase/rohelise suhe oli 5,97±0,21, mis viitas normaalsele kõrgele membraanipotentsiaalile (joonis 5A). TNF-ravi põhjustas mitokondrite läbilaskvuse ülemineku ja membraanipotentsiaali olulise kaotuse (punase/rohelise suhe oli 0,35±0,02) (joonis 5B). Ravi TubulosideB-ga pärssis TNF-i poolt indutseeritud mitokondriaalse membraani potentsiaali kokkuvarisemist SH-SY5Y rakkudes suureneva annusega. Tubulosiid B taastas järk-järgult mitokondriaalse membraani potentsiaali suurenevate kontsentratsioonidega, nagu näitas mitokondri punase värvumise taasilmumine (joonis 6C-6E).Tubulosiid B mõju kaspaasi{0}} aktiivsusele

Kaspaas-3 aktiivsus suurenes pärast TNF-ga kokkupuudet umbes viis korda võrreldes kontrollidega (joonis 7). Seevastu SH-SY5Y rakkudel, mida töödeldi samaaegselt tubulosiidiga B 1, 10 või 100 mg/l, ilmnes kaspaasi -3 aktiivsuse märkimisväärne vähenemine võrreldes TNF-i loodud rakkudega samal ajahetkel (joonis 7).

Tubulosiidi B mõju [Ca2 pluss]i tasemele

[Ca2 pluss] I tase TNF-indutseeritud rakkudes tõusis märkimisväärselt võrreldes kontrollrühmaga (kontroll: 105,5±11,2 nmol/L; 100 µg/L TNF: 238,4±18,9 nmol/L), mida tubulosiidiga eeltöötlemine osaliselt vähendas. B(10 või 100 mg/L) (joonis 8).

ARUTELU

Cistanchessalsa(CA Mey) G Beck, üks liikCistanchesOrobanchaceae perekonda kuuluv parasiitaim, mis pärineb Loode-Hiinast. Selle taime vars on oluline traditsiooniline hiina meditsiin ja seda kasutatakse neerupuudulikkuse, naiste viljatuse, haigusliku leukorröa, neurasteenia ja jämesoole inertsist tingitud seniilse kõhukinnisuse korral. Selle ürdi peamised aktiivsed komponendid on fenüületanoidglükosiid[28]. Viimastel aastatel on mitmete uuringute tulemused toonud esile tubulosiid B funktsiooni mitmesuguste farmakoloogiliste ja bioloogiliste tegevuste edendamisel[13-15]. Kuid toimingute aluseks olevad rakulised ja molekulaarsed mehhanismid ei ole täielikult teada. Käesolev uuring näitas, et tubulosiid B-l on märkimisväärne neuroprotektiivne toime TNF-indutseeritud apoptoosile SH-SY5Y-neuronaalsetes rakkudes, säilitades mitokondriaalse funktsiooni, vähendades ROS-i teket, vähendades rakusisese kaltsiumi taset ja inhibeerides kaspaasi{5}} aktiivsust. antioksüdatsiooni mehhanism. Need mehhanismid võivad tuleneda tubulosiid B individuaalsest neuroprotektiivsest toimest või selle interaktsioonist teiste teguritega ja seejärel viia apoptoosi suhte vähenemiseni rakkudes.

Varasemad uuringud on näidanud, et oksüdandid või prooksüdandid on olulised apoptoosi regulaatorid ja võivad indutseerida apoptoosi [29,30]. Oksüdatiivne stress on apoptoosi tavaline element, mis on põhjustatud mitmesugustest stiimulitest, nagu TNF ja keskkonna toksiinidega kokkupuude, mis tavaliselt ei avalda otsest oksüdeerivat toimet. Oksüdatiivse stressi keskset rolli apoptoosis toetab tugevalt erinevate rakuliste antioksüdantide võime blokeerida erinevate ainete poolt indutseeritud apoptoosi [31]. Antioksüdantsete omadustega ühenditel võib vabade radikaalide eemaldamise kaudu olla kaitsev toime erinevates rakufunktsiooni häirete korral[32]. Lisaks teatati, et mitmel fenüülpropanoidglükosiidil on vabu radikaale püüdvad omadused ja need kaitsevad oksüdatiivse stressi põhjustatud toksiliste vigastuste eest. Kooskõlas selle ideega leidsime, et tubulosiid B vähendas TNF-i poolt indutseeritud ROS-i taset, see võib kaitsta neuroneid apoptoosi eest, püüdes otseselt rakusiseseid reaktiivseid hapniku liike.

Paljud tõendid viitavad sellele, et mitokondriaalse funktsiooni suured muutused olid kriitiliselt seotud apoptootilise protsessiga [33]. Leiti, et kaltsiumi homöostaasi häired ja mitokondriaalse membraani potentsiaali muutused soodustavad mitokondriaalse läbilaskvuse üleminekupoori (MPTP) avanemist või indutseerivad tsütokroom c vabanemist MPTP-st sõltumatute mehhanismide kaudu, mis on otseselt vastutavad apoptootilise kaskaadi aktiveerimise eest ja võivad eelneda tuumale. apoptoosi tunnused[34]. Need biokeemilised muutused võivad tuleneda mitokondrite funktsioonide muutumisest[35]. Faktid, et tubulosiid B pärssis mitokondriaalse membraani potentsiaali vähenemist ja vähendas TNF-i poolt indutseeritud intratsellulaarse kaltsiumi tõusu, viitavad sellele, et tubulosiid B võib olla võimeline neutraliseerima TNF-i toksilisust, pärssides MPTP avanemist ja pärssides mitokondrite düsfunktsiooni.

Välised stiimulid võivad ülaltoodud mehhanismide kaudu algatada apoptoosi ja koonduda kaspaaside rajale, et viia läbi apoptootilise protsessi viimane faas [36]. Proteaaside kaspaaside perekond koosneb vähemalt 14 imetajaliikmest, mida ekspresseeritakse konstitutiivselt peaaegu kõigis rakutüüpides inaktiivsete proensüümidena (sümogeenidena), mida töödeldakse ja aktiveeritakse vastusena mitmesugustele proapoptootilistele stiimulitele[37]. Kaspaas{{4 }} on kaspaasi kaskaadi allavoolu liige ja toimib täitmisfaasis keskse efektorina. Kui kaspaas-3 prekursorvalk CPP32 aktiveeritakse ülesvoolu signaalide, näiteks mitokondriaalse tsütokroom c vabanemisega, lõhustab aktiivne kaspaas-3 spetsiifilisi aspartaadijääke valkudes, millel on erinevad struktuursed, majapidamis- ja regulatsioonifunktsioonid[{{ 8}}]. Need proteolüütilised sündmused võivad põhjustada raku apoptoosi ja aidata kaasa DNA fragmenteerumisele ja tuuma morfoloogilistele muutustele. Seega võivad ained, mis võivad inhibeerida kaspaasi-3 aktiivsust, kaitsta rakke apoptoosi eest[2,31]. Kuna tubulosiid B inhibeeris märkimisväärselt kaspaasi{12}} aktiivsust TNF-ga töödeldud rakkudes, on sellel neuroprotektiivne võime.

Kokkuvõtteks võib öelda, et tubulosiid B-l oli kahjustatud neuronitele multifunktsionaalne kaitsev toime. Oma võimsa anti-apoptoosi ja antioksüdatiivse stressi tõttu võib see olla kliiniliseks kasutamiseks neurodegeneratiivsete ja neuroloogiliste puude korral, mis hõlmab neuronite apoptoosi.