Normaalse ja tsüstilise neeru nefronite kolmemõõtmeline arhitektuur
Mar 17, 2022
lisateabe saamiseks:ali.ma@wecistanche.com
Thomas Blanc1,2,7, Nicolas Goudin3,7, Mohamad Zaidan1,4,7, Meriem Garfa Traore3, Frank Bienaime1,5,Lisa Turinsky1, Serge Garbay1, Clement Nguyen1, Martine Burtin1, Gerard Friedlander1,6, Fabiola Terzi1,8ja Marco Pontoglio1,8
1Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale U1151, National de la Recherche Scientifique UMR8253, Université de Paris, Institut Necker Enfants Malades, Departemang «Croissance et Signalisation», Pariis, Prantsusmaa;2Service de Chirurgie Viscérale etUrologie Pédiatrique, AP-HP, Hôpital Necker Enfants Malades, Pariis, Prantsusmaa;3Struktuur Fédérative de Recherche Necker, USA{0}}UMS3633, Pariis, Prantsusmaa; 4Service de Néphrologie-Transplantation, AP-HP, Hôpital Bicêtre, Le Kremlin-Bicêtre, Prantsusmaa;5Service d'ExplorationsFonctionnelles, AP-HP, Hôpital Necker Enfants Malades, Pariis, Prantsusmaa; ja6Service d'Explorations Fonctionnelles, AP-HP, HôpitalEuropéen Georges Pompidou, Pariis, Prantsusmaa
MÄRKSÕNAD: tsüstneerudhaigus;neerud; nefron; nefronoftiis; kudede puhastamine
Tõlkeavaldus
Puhastusmeetodid pakuvad ainulaadset vahendit, et mõista, kuidas morfoloogilised muutused põhjustavad patoloogilisi tagajärgi.Neerudon kriitilised elundid, mis säilitavad keha homöostaasi vee, metaboliitide ja elektrolüütide käitlemise kaudu, mis sõltuvad olulisel määral komplekssest 3-mõõtmelisest struktuurist.nefroonid.Kui seda struktuurilist korraldust muudetakse, tekib neerupatofüsioloogia. Käesolevas uuringus oleme välja töötanud võimsa meetodi, mis põhineb optilisel puhastamisel, mitmefotonimikroskoopial ja digitaalsel jälgimisel.neerudühe nefroni tasemel füsioloogilistes ja patoloogilistes tingimustes. Eelkõige pakume polütsüstiidi esimese 3-mõõtmelise rekonstrueerimise ühe skaalalnefroonid. Seda meetodit saab rakendada mitmes patoloogilises kontekstis, mis võimaldab paremini mõista neerude halvenemise keerulist protsessi ja sellest tulenevalt töötada välja sihipärasemaid ravistrateegiaid.
Neer säilitab oma kompleksi kaudu keha homöostaasi3-mõõtmeline(3D) nefroni struktuur. Kui seda struktuurilist korraldust muudetakse, tekib neerupatofüsioloogia. Kroonilineneerudhaigusi iseloomustab neerukahjustuste teke. Huvitaval kombel on patoloogid teatanud krooniliste neeruhaiguste korral esinevate kahjustuste jaotumise laialdasest heterogeensusest.1,2 Kas see peegeldab tõsiasja, et konkreetsed nefronisegmendid võivad olla erinevalt kahjustatud, või alternatiivina, et mõnel nefronil on erinev vastuvõtlikkus tervikuna vigastada, pole teada. Selle probleemi lahendamiseks on kohustuslik rekonstrueerida 3D (Kolmemõõtmeline) kujunefroonidpatoloogilistes kontekstides.
Meie teada,nefroonidon täielikult rekonstrueeritud ainult 2D jadalõike kasutades.3–5 Kuigi standardne histoloogiline jaotus tagab kõrge eraldusvõime, on 3D-rekonstruktsioonid töömahukad ja raskesti saavutatavad. Selle põhjuseks on peamiselt mehaanilised moonutused, mis on viilutamisprotseduuri vältimatu mõju. Lisaks ei võimalda 3D (rekonstrueerimine 2D-kujutistest) 3D-struktuuride otsest kujutist tervelt kinnitatud kudedes.
Multifotoonmikroskoopia on parandanud meie võimet tuvastada morfoloogilisi muutusi paksudes lõikudes. Oluliseks piiranguks on aga valguse hajumise tõttu madal ligipääsetav sügavus. Murdumisnäitaja erinevusi minimeerides on puhastusained dramaatiliselt parandanud sügavuste kujutise võimet.6,7 Hoolimata asjaolust, et esimene puhastusaine võeti kasutusele sajand tagasi,8 on alles hiljuti välja töötatud mitu puhastusprotokolli, peamiselt aju jaoks.9 –17 Hiljutised uuringud on näidanud nende potentsiaali teiste tahkete elundite, nagu maks, kõhunääre võineerud.18–26
Polütsüstilineneerudhaigus, geneetiliselt heterogeenne haigus, mis hõlmab mutatsioone mitmes tsiliaarses geenis, on kõige levinum pärilik neeruhaigus.27,28 Polütsüstilineneerudhaigust iseloomustab tsüstide teke, mis viib neeru täieliku hävimiseni.28 Mikrodissektsiooniuuringud näitasid, et tsüstid võivad areneda kas nefronisegmendi "väljasurumisena", nagu autosomaalse domineeriva polütsüstilise neeruhaiguse korral; nagu kogumiskanalite (CD-de) ekstaatiline laienemine, nagu autosoom-retsessiivne polütsüstilineneerudhaigus; või eranditult medullaarsetes tuubulites, nagu nefronoftiis (NPHP).27,29 Kuid kuidas tsüstid arenevad 3D-s (Kolmemõõtmeline) ja korraldavad omavahel ja normaalne naabertuubulees veel teadmata.
Siin ühendasime optilise puhastamise multifotonmikroskoopiaga, et anda uusi teadmisi selle kohta, kuidasnefroonidon kujundatud ja organiseeritud füsioloogilistes tingimustes ning kuidas need muutuvad haiguse, näiteks tsüstogeneesi ajal. Meie tulemused näitavad, et on 3 tüüpinefroonidja et veresooned võivad mõjutada nefroni ruumilist korraldust. Huvitaval kombel täheldasime, et nefronid kipuvad asetsema kindlatel tasapindadel. Kui me seda tehnikat jckhiirtele rakendasime, märkasime ootamatult, et tsüstid arenesid ainult spetsiifilistes nefroni segmentides, kus fusiformsed tsüstid segunesid normaalsete tuubulitega.
Klõpsake selleksCistanchekõrvalmõjudneeruhaiguste korral
TULEMUSED
Eksperimentaalne seadistus
Terviku kuju uurimiseksnefroonidseoses nende keskkonnaga võtsime kasutusele meetodi, mis põhineb optilisel puhastamisel ja multifotoni mikroskoopial (täiendav joonis S1A). Erinevate optiliste puhastusprotokollide võrdlemisel tegime kindlaks, etneerud, bensüülalkohol / bensüülbensoaat (BABB) oli efektiivsuse osas kõige sobivam (täiendav joonis S1B ja C ning täiendav tabel S1).
3D (Kolmemõõtmeline) rekonstrueerimine ja digitaalne jälgimine nõuavad kvaliteetseid kõrge eraldusvõimega ja kõrge signaali-tausta suhtega pilte. Täheldasime, et natiivse fluorestsentsi pakutav optiline signaal ei olnud neerulõikudel ühtlane. Eelkõige olid medulla kujutised halvasti kontrastsed madala signaali-tausta suhtega (täiendav joonis S2). Signaali-tausta suhte parandamiseks värviti lõigud perioodilise happe-Schiffiga (täiendav joonis S1D), sest empiiriliselt märkisime, et see värvimine suurendas 2-fotonfluorestsentsi ajal õhukestes osades suurt kontrasti. Kuid signaal ei olnud ühtlaselt kogu paksu perioodilise happega – Schiffiga värvitudneerudsektsioonid (täiendav joonis S1E). Seetõttu värvisime neerulõike fluorokroomiga seotud lektiinidega: maapähkli aglutiniini ja nisuidu aglutiniiniga, mis värvivad glomeruleid ja torukesi, ning Griffonia simplicity I folia aglutiniiniga, mis märgib veresooni. suurenes järsult tervetes neeruosades, märkimisväärselt paranedes nii XY tasapinnal kui ka z-teljel (täiendav joonis S1E ja lisafilm S1).
3D nefronisegmendi visualiseerimine
Terviku kuju visualiseerimiseksnefroonid, jälgisime nende radu, alustades glomeruluse kuseteede poolusest ja lõpetades CD ristmikuga (täiendav film S2). Hoolimata asjaolust, et kasutatavad lektiinid seovad globaalselt kõiki nefronsegmente, märkasime, et hoolikalt kontrollides iseloomustas neid lektiine erinevates nefronsegmentides basaal- või luminaalmembraanide värvimisel spetsiifiline muster. Teisisõnu kasutasime erinevate nefroni segmentide tuvastamiseks ära lektiini värvimise stereotüüpset mustrit. Sel viisil saaksime hõlpsasti tuvastada 6 olemit: proksimaalne tuubul (PT), Henleloopi (HL) õhuke jäse (TL), HL-i paks tõusev jäse (TAL), distaalne keerdtuubul (DCT), ühendustoru (CNT), ja CD. PT ja TL vahelist üleminekut iseloomustas tüüpilise PT harja piirisignaali järsk kadumine ja luumeni laiuse vähenemine, mis TL-is peaaegu puudus (joonis 1a). Vastupidi, üleminekut TL ja TAL vahel iseloomustas toru välisläbimõõdu märkimisväärne suurenemine ja suhteliselt konstantne valendiku laius (joonis 1b). Kõigis nefronites leiti TAL-i üleminek DCT-le süstemaatiliselt glomeruli vaskulaarses pooluses. Seda üleminekut iseloomustas torukujulise välisläbimõõdu järsk suurenemine, mis oli peamiselt tingitud valendiku läbimõõdu olulisest suurenemisest (joonis 1c). DCT ja CNT vahelist üleminekut iseloomustas nii torukujulise läbimõõdu kui ka valendiku areduktsioon (joonis 1d). Lõpuks iseloomustas CNT ja kortikaalse CD vahelist ühendust nii torukujulise läbimõõdu kui ka valendiku järsk suurenemine (joonis 1e). Nende morfoloogiliste üleminekute kvantifitseerimine oli statistiliselt oluline (joonis 1f) ja selle asjakohasust kontrolliti spetsiifiliste torukujuliste markeritega värvimisega (täiendavad joonised S3–S5 ja lisafilm S3–S5).
PT-de kuju ja suurus erinevad sõltuvalt nende sügavusest
Värvimine paksneerudlõigud võimaldasid meil jälgida tervete PT segmentide ruumilise evolutsiooni koordinaate. Huvitaval kombel avastasime, et nende kuju oli äärmiselt muutlik ja selle määras nende glomerulite asukoht ajukoores. Ülemaailmselt tuvastasime 3 mustrit. Esimene vastas kõige pealiskaudsemalenefroonid(SN-id) (joonis 2a; lisafilm S6), mis hõivas ajukoore kõige välise osa (kõige välisem 30 protsenti neerukapsli lähedal). Nende keerdunud osad moodustasid kompaktsed struktuurid, millel oli ainult 6–7 keerdu ümber oma glomeruli, mis hõivasid väga väikesed ja tihedalt pakitud ruumid. Nende SN-de keerdumine lõppes pikkade ja sirgete pars recta-ga, mis laskus medullasse. Selle spektri teises otsas täheldasime teist nefronite mustrit, mis paiknesid ajukoore sügavaimas osas (40 protsenti rohkem sisemist sügavust), medulla kõrval (juxtamedullaarsed nefronid [JN-id]) (joonis 2a; täiendav joonis S6 ja täiendav film S6). Nende PT-sid iseloomustas esialgne lühike silmus, mis laskus süstemaatiliselt papilla poole ja seejärel pöördus U, et tõusta neerukapsli poole. Vastupidiselt SN-dele iseloomustasid JN proksimaalseid keerdunud tuubuleid suured mähised, mis arenesid ümber nende enda glomeruluse ja hõivasid suuri, lõdvalt pakitud domeene juxtamedullarycortexis. JN-ide PT keerdunud osal oli 10 kuni 15 konvolutsiooni, moodustades suuri domeene. Lõpuks hõlmas kolmas muster nefroneid, mis paiknesid ajukoore keskmises osas (keskmised nefronid [MN-id]) (joonis 2a; täiendav film S6). Huvitav on see, et neil tuubulitel oli kuju ja ruumiline orientatsioon, mis esindasid üleminekut SN-de ja JN-ide vahel. Tegelikult sisaldasid need 8–9 keerdumist mähistega, mis olid suuremad kui SN-id, kuid väiksemad kui JN-id. Lisaks oli MN-idel pikem pars recta kui JN-idel. Huvitaval kombel näitas PT-de kujude globaalne võrdlus, et SN-de ja MN-ide muster oli homogeenne, samas kui JN-id olid äärmiselt heterogeensed (täiendav joonis S6). Lisaks mitme ruumiline rekonstrueeriminenefroonid näitas, et PT-d ei segune kunagi (täiendav film S6), mis näitab, et iga nefron hõivab ajukoores oma individuaalse ruumi.
Morfomeetrilised analüüsid kinnitasid suuri erinevusi SN-de ja JN-ide suuruses ja kujus, MN-ide vahepealne aspekt. JN-ide PT oli rohkem kui 2-kordik pikem kui SN-de PT (joonis 2b); sirgus oli aga SN-des suurem kui JN-ides (joonis 2c), mis on kooskõlas tähelepanekuga, et JN-tuubulid olid palju käänulisemad (joonis 2a; täiendav joonis S6).
Joonis 1|Morfoloogilised kriteeriumid, mida kasutatakse nefroni segmentide tuvastamiseks. ( a – e ) Nefroni kontrolli all olevate hiirte erinevate segmentide morfoloogia.Nefronidjälgiti glomeruluse kusepoolusest kogumiskanalini (proksimaalne tuubul [PT]: türkiis; Henle ahela õhuke haru [TL]: helehall; Henle ahela paks tõusev haru [TAL]: tumehall; distaalne keerdunud tuubul [DCT]: roosa; ühendustuubul [CNT]: kollane; kortikaalne kogumiskanal [CCD]: oranž). Nooled näitavad erinevate nefroni segmentide läbimõõtu. (jätkub)
Joonis 1|(Järgneb) (f) Erinevate nefronisegmentide torukujulise välisläbimõõdu kvantifitseerimine. Andmed on väljendatud keskmisena±SEM. Dispersioonanalüüs, millele järgneb Tukey-Krameri test: **P < 0.01, ***P < 0,001.
Joonis 2 |Kolmemõõtmeline(3D) proksimaalse tuubuli rekonstrueerimine paljastab 3 erinevat kuju ja organisatsiooni. (a) Tüüpilised 3D-rekonstrueerimiskujutised proksimaalsetest tuubulitest läbi kogu neerukoore, mis on jagatud kolmeks tasemeks (valged jooned) vastavalt proksimaalsete tuubulite (PT) kujule: pindmine (sinine), keskmine (roheline) ja juxtamedullaarne (punane) ajukoor, mis vastab vastavalt ajukoore välimisele 30 protsendile, keskmisele 30 protsendile ja sisemisele 40 protsendile. Pöörake tähelepanu kolme tüübi erineva kujuganefroonidja eriti kõrvuti paiknevate tuubulite pikkus ja käänulisus. Riba{{0}} mm. (b, c) Kolme tüüpi proksimaalsete tuubulite (b) pikkuse ja (c) sirguse kvantifitseerimine. (d) Glomerulite mahu kvantifitseerimine igast ajukoore piirkonnast. Andmed on väljendatud keskmise SEM-ina. Dispersioonanalüüs, millele järgneb Tukey-Krameri test: kõrvutine PT versus pindmine PT: ###P < 0.001;="" kõrvutine="" pt="" versus="" keskmine="" pt:="" ***p="">< 0,001;="" pindmine="" pt="" versus="" keskmine="" pt:="" $$$p=""><>
Joonis 3 |Kolmemõõtmeline(3D) nefroni rekonstrueerimine paljastab 3 erinevat tüüpi nefronit. (a) Tüüpilised 3D-kujutised tervest nefroonist (vasakpoolsed paneelid) glomerulitest kuni kogumiskanalini kontrollhiirtel pindmises ajukoores (sinine), keskmises ajukoores (roheline) ja juxtamedullaarses piirkonnas (punane). Nefroni segmenteerimine (parempoolsed paneelid) 3 erinevat tüüpi nefroni jaoks. Riba =150 mm. (b) Henle ahela kahe haru vahelise sisemise kauguse kvantifitseerimine kolme tüüpi nefronite puhul. c) Nefroni pikkuse kvantifitseerimine (jätkub)
Joonis 3|(jätkub) 3 tüüpinefroonid. d) nefroni erinevate segmentide pikkuse kvantifitseerimine vastavalt nefroni tüübile. Andmed on väljendatud keskmisena±SEM. Dispersioonanalüüs, millele järgneb Tukey-Krameri test: juxtamedullaarne nefron (JN) versus pindmine nefron (SN): ###P < 0.001;="" jn="" versus="" keskmine="" nefron="" (mn):="" *p="">< 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001.="" cnt,="" ühendustoru;="" dct,="" distaalne="" keerdtuubul;="" pt,="" proksimaalne="" tuubul;="" tal,="" henle="" silmuse="" paks="" tõusev="" haru;="" tl,="" henle="" silmuse="" peenike="">
Glomerulaarne suurus varieerub sõltuvalt sügavusest
Seejärel analüüsisime igast kolmest tsoonist juhuslikult valitud glomerulite sügavust ja läbimõõtu. Morfomeetrilised analüüsid näitasid, et glomerulid paiknesid JN-ides ja SN-des keskmiselt vastavalt 783 ja 355 mm kaugusel neerukapslist. Nagu varem teatatud, täheldasime, et glomerulite suurus varieerus vastavalt nende sügavusele. Eelkõige oli JN-de glomerulaarmaht 3 korda suurem kui SN-de ja MN-ide maht (joonis 2d).
3D nefroni rekonstrueerimine
Seejärel jälgisime kogu ruumilist arengutnefroonidPT-st CNT-le. Nende 3D globaalne vaade (Kolmemõõtmeline) rekonstrueerimine kinnitas, et nefroni kuju erines SN-de, MN-ide ja JN-ide vahel (joonis 3a; täiendav film S7). See erinevus tulenes peamiselt PT struktuurist. Lisaks täheldasime, et HL-il oli erinev 3D-ruumiline korraldus. Eelkõige olid TL ja TAL JNsthanis SN-ides ja MN-ides kaugemal eraldatud (joonis 3b). Morfomeetrilised analüüsid näitasid, et JN-id olid globaalselt 2-korda pikemad kui SN-id (joonis 3c). Suurenenud pikkus jaotati proportsionaalselt kõigis segmentides, välja arvatud TAL ja DCT, millel oli kõigis nefronitüüpides sarnane absoluutpikkus (joonis 3d). See viitas sellele, et nefroni pikenemine on üllatavalt homogeense mustriga protsess.
Kaarjad veresooned mõjutavad kõrvuti PT konvolutsiooni
Et saada terviklikum perspektiivneerudstruktuuri, kasutasime ära Griffonia simplicifoliaagglutiniini värvimist, mis võimaldas meil jälgida kaarekujulisi veresooni ja nende harusid kortikaalsetesse kiirgussoontesse (joonis 4a; täiendav film S8). Huvitav on see, et samaaegne 3D (Kolmemõõtmeline) nefronite ja veresoonte rekonstrueerimine näitas, et kaarekujulised veresooned kipuvad olema üllatavas paralleelses ruumilises korralduses lähedal asuvate tuubulitega. Eelkõige täheldasime, et konkreetsete JN-ide (piiratud JN-ide) järgitav tee kipub järgima lähedal asuva laeva teed (joonis 4b; täiendav film S9). Märkimisväärne on see, et seda eelarvamust (täheldatud ainult JN-i alamhulga puhulnefroonid) põhjustas PT kujude suurt heterogeensust (täiendav joonis S6). Morfomeetrilised analüüsid näitasid, et "piiratud" PT-d olid oluliselt pikemad ja käänulisemad (vähendatud sirgus) kui "kinnitamata" (joonis 4c ja d). Väärib märkimist, et nii SN-de kui ka MN-ide keerdunud osad paiknesid kaarekujuliste soonte kohal ega olnud piiratud.
Cistanche-krooniline neeruhaigus
Torukesed kipuvad lebama tasapinnaliselt
Huvitav on see, et 3D (Kolmemõõtmeline) kujundeidnefroonidnäitas, et nad kipuvad lamama tasapindadel (joonis 5a; täiendav film S10). Selle parameetri kvantifitseerimiseks ja selle konformatsiooni võimaliku statistilise nihke hindamiseks mõõtsime tuubulite üldist kalduvust painduda välja nende silmustega määratletud tasapinnast. Meie mõõtmised näitasid, et võrreldes juhusliku kõndimise simuleeritud mudeliga, mis genereeriti sama järjestikuste mõõdetud nurkade ja järjestikuste punktide vahelise pikkusega (joonis 5b), kaldusid tuubulid arenema tasapinnast väiksema kõrvalekaldega (joonis 5c). See näitas, et torukesed piirasid nende teed mööda tasapinda. Täheldatud erinevused olid statistiliselt väga olulised (P <>
3D-nefroni rekonstrueerimine näitab tsüstide arengu spetsiifilist mustrit
Et teha kindlaks, kas meie protokoll võimaldab tuvastada nefroneid korrastamata patoloogilistes kudedes, iseloomustasime tsüstide kujusid ja ruumilist jaotumist jackhiirtel, mis on laialdaselt kasutatav NPHP ja tsüstilise haiguse mudel.31–33 3D-kujutised näitasid, et vaatamata silmapaistvate tsüstide ilmumine, üldine 3D (Kolmemõõtmeline) nefronite kulg ei erinenud oluliselt kontrollhiirte omast (täiendav film S11). Samamoodi kinnitasid morfomeetrilised analüüsid, etnefroonid, glomerulaarmaht ja iga nefroni segmendi pikkus olid võrreldavad kontrollhiirte omadega (täiendav joonis S7). Pange tähele, et tsüstide arengu tõttu ei suutnud me HL-is TL-i TAL-st eristada. Kõigil nefronitel tekkisid fusiformsed tsüstid (täiendavad filmid S11 ja S12). Üks silmatorkavamaid tunnuseid oli tähelepanek, et fusiformsed tsüstilised laienemised toimusid sama nefronisegmendi juures mitmes kohas (täiendavad filmid S12 ja S13). Huvitaval kombel täheldasime, et PT-des ja HL-i laskuvates jäsemetes ei tekkinud kunagi tsüstid (joonis 6a; täiendav film S12). Vastupidiselt tuvastati need peamiselt HL-i tõusvates jäsemetes, DCT-des, CNT-des ja CD-de ülemises osas koos CNT-ga (joonis 6a; täiendav film S12). Eelkõige täheldasime, et DCT-l ja ka CNT-segmentidel oli omapäraselt suurenenud tõenäosus tsüstide tekkeks vastavates kaugemates osades (joonis 6b). 3D-rekonstruktsiooni kujutiste kvantitatiivsed morfomeetrilised analüüsid näitasid, et tsüsti kogumaht nefroni kohta oli eriti kõrge CNT-s (joonis 7a). Lisaks täheldasime, et tsüstide suurenemine HL-is ja DCT-s oli JN-ides suurem kui SN-i ja MN-i puhul (joonis 7a; täiendav film S12). Veelgi enam, tsüstide esinemissagedus oli JN-de puhul oluliselt kõrgem kui teistel tüüpidelnefroonid(Joonis 7b). Samuti täheldasime, et keskmine glomerulaarne vaheline kaugus (arvutatud lähima 5 glomeruli järgi) oli eriti suurenenud intsüstilistel hiirtel, eriti pindmisemas ajukoores (täiendav joonis S8).
Joonis 4|Laevad määravad nefroni kuju. (a)Kolmemõõtmelineveresoone arhitektuuri rekonstrueerimine kaarekujulistest veresoontest kortikaalsete kiirgussoonteni. Varras ¼ 200 mm. (b) "mittekinnitatud" (ülemine paneel) ja "piiratud" (alumine paneel) kõrvutatud proksimaalsete tuubulite tüüpilised kujutised. Varras ¼ 100 mm. (c, d) "mittekinnitatud" ja "piiratud" kõrvuti proksimaalsete tuubulite (c) pikkuse ja (d) sirguse kvantifitseerimine. Andmed on väljendatud keskmisena±SEM. Mann-Whitney test: "piiratud" versus "mittepiiratud":*P < 0.05,="" ***p=""><>
3D (Kolmemõõtmeline) arvukate tsüstide rekonstrueerimine näitas, et nende kuju ja maht olid äärmiselt erinevad (joonis 6c; täiendavad filmid S11 ja S13). HL-i tõusvas jäsemes olid tsüstid väikese läbimõõduga fusiformse kujuga. DCT-s olid tsüstid üsna sfäärilise ja suurema kujuga ning paiknesid laienemata tuubulite vahel. Huvitav on see, et üleminekut DCT ja CNT vahel iseloomustas süstemaatiliselt normaalne mittedilateeritud struktuur. Seevastu CNT-s täheldasime süstemaatiliselt külgnevat laienenud tsüstilist struktuuri, mis oli vahetult kokkupuutes CD-ga. Huvitav on see, et CD-s kahanes see struktuur järk-järgult normaalse tuubuli suuruseni. Veelgi enam, CD külgnevas osas ei tuvastatud täiendavaid tsüste. Veel üks järjekindel tunnus oli tsüstide omapärane ruumiline korraldus HL-i tõusvas jäsemes. Tegelikult, kuigi tsüstid olid SN-des sügavamal ja ahelale lähemal, olid nad JN-ides pealiskaudsemad ja DCT-le lähemal (joonis 6c). Jällegi hõivasid tsüstid MN-ides vahepealse positsiooni (joonis 6c).
Joonis 5|Nefronituubulid kipuvad arenema tasase struktuurina. (a) Nefroni proksimaalse tuubuli tüüpiline tee. See tee illustreerib selle kalduvust asuda tasapinnal. Teekonna arengu tasapinnalisust saab paremini näha, kui seda õigesti pöörata ja vaatleja vaatepunktiga joondada (vt sama torukujulise segmendi parempoolset kujutist, mis vasakpoolsel küljel on kujutatud erineva nurga all) . (b) 4 segmendist koosneva torukujulise tee skemaatiline esitus (5 punkti vahel, mis määratlevad näitena näidatud torukujulise tee). Astet, mil teed kipuvad "oma tasapinnast välja" minema, saab esitada nurgaga, mis on siin näidatud kui "beeta". (jätkub)
Joonis 5|(Järgneb) Seda nurka mõõdetakse lõigu p3-p4 vahel tasapinna suhtes (määratletud vahetult eelnevate punktidega p3, p2 ja p1) ja skeemis kujutatud tumehalli ristkülikuga. Seejärel arvutati beetanurkade arvutamine rekursiivselt koos torukujulise tee punktide komplektiga. Nende beetanurkade nihke ulatuse hindamiseks simuleerisime juhuslikku kõndimist (Monte Carlosimulation [MCs]), kasutades iga torukujulise tee sama järjestikuste alfanurkade komplekti (mõõdetuna kõigi järjestikuste segmentide vahel). See juhuslik kõndimine tekitas tee, millel on identne alfanurkade komplekt ja juhuslikud beetanurgad. (c) Viiuli graafikud beetanurkade globaalse jaotuse ja MC-de tulemuse kohta proksimaalses tuubulis (PT), Henle ahela õhukeses harus (TL), Henle ahela paksus tõusvas jäsemes (TAL), distaalses keerdtorustikus (DCT) ) ja sidetoru (CNT). MCs, P <>
ARUTELU
Traditsioonilised histoloogilised meetodid on piiratud nende võimega tuvastada patoloogilisi muutusi, mis mõjutavad globaalset kujunefroonid. Siin tutvustame võimsat kudede puhastamisel põhinevat lähenemisviisi, mis võib lahendada olulisi küsimusineerudenneolematu ruumilise detailiga arhitektuur normaalsetes ja patoloogilistes tingimustes. Meie tulemused kinnitasid kolme tüüpi nefronite olemasolu, mis erinevad oma asukohast, kujust ja suurusest vastavalt nende funktsionaalsetele eripäradele. Lisaks näitasime, et nefronstent lebab tasapindadel ja kohaneb laeva ruumilise korraldusega. Huvitaval kombel täheldasime seda tehnikat tsüstilise neeruhaiguse mudeli puhul, et tsüstid arenevad kõigis nefronites, kuid ainult teatud segmentides. Huvitaval kombel näitasime, et tsüsti kuju varieerub vastavalt nefronsegmendile ja et piki sama nefroni interkaleeruvad tsüstid tavaliste mittedilateeritud tuubulitega. Kokkuvõttes annavad need tulemused esimese 3D-pildi (Kolmemõõtmeline) ruumilise paigutuse iseloomustusnefroonidja veresooned ning annab aluse patoloogilise protsessi, näiteks astsüstogeneesi mõistmiseks.
Neerude optiline puhastamine on kõrge autofluorestsentsi ja rakutiheduse tõttu keeruline. Erinevate kliirimisprotokollide võrdlemisel tuvastasime BABB-s võimsa tehnika, mis võimaldab visualiseerida ja rekonstrueerida struktuure, mis asuvad kõige sügavamas osas.neerud, see tähendab medulla. Lisaks on BABB kiire ja skaleeritav ning pärast tühjendamist saab proove säilitada mitu kuud enne pildistamist. Selle tehnika teine peamine eelis on selle madal hind. Puhastusained võivad põhjustada struktuuride kahanemist või suurenemist.9–17 Kuna need neerude suuruse muutused on aga isotroopsed, ei mõjuta need suhtelised mõõtmised ega moonuta nende tõlgendust. Üks olulisemaid piiranguid on struktuuride annoteerimine, mis on väga aeganõudev. Sellegipoolest on üha rohkem süvaõppel põhinevaid tehnikaid, mis peaksid selle piirangu kiiresti ületama.
Kooskõlas klassikaliste tehnikatega saadud tulemustega näitas meie uuring, et nefronid erinevad oma kuju ja pikkuse poolest vastavalt nende asukohale. Eelkõige täheldasime, et JN-idel on rohkem arenenud keerdunud PT-d ja suuremad glomerulid ning need on 2 korda pikemad kui SN-d. Pikkuse suurenemine on harmoonilise protsessi tulemus, kuna pikenemine mõjutab proportsionaalselt kõiki nefroni segmente. Samuti täheldasime, et JN-idel on suurem HL. Kokkuvõttes näitavad need andmed selgelt, et SN-de ja JN-ide mikroanatoomia on märkimisväärselt erinev ja et MN-idel on vahepealsed omadused. Huvitaval kombel on seda näidanud füsioloogilised uuringudnefroonidon ka funktsionaalselt erinevad.2 Nende erinevuste aluseks olevad morfogeneetilised sündmused pole veel teada. Seega on ahvatlev oletada, et JN-ide konkreetne struktuur võib olla tingitud nende funktsioonide spetsiifilisusest.
Huvitav on see, et pakkudes esmakordselt 3D-d (Kolmemõõtmeline) rekonstrueeriminenefroonidja neid ümbritsevad veresooned, avastasime ruumilise piirangu kaarekujuliste veresoonte ja nefronite alarühma vahel. Seega on mõeldav arvata, et veresooned võivad dikteerida seda, kuidas nefronid arengu ajal pikenevad.34,35 Nefronite 3D-kujude kontrollimine koos arvutuslike simulatsioonidega näitas ka, et nefronid ei segune kunagi ja iga nefron kaldub asetsema tasapinnal. Selle tähelepaneku funktsionaalne tähtsus tuleb veel välja selgitada.
Tsüstide areng polütsüstilise haiguse ajalneerudhaigus on endiselt intrigeeriv protsess. NPHP, patoloogiline seisund, mida iseloomustab tsüstide areng, on kõige levinum geneetiline haigus, mis põhjustab lõppstaadiumis neeruhaigust lastel ja noorukitel. Seni on tuvastatud kakskümmend NPHP geeni.36Nende hulgas kodeerib NEK8 mitte kunagi inmitoosiga A-ga seotud kinaasi perekonna liiget, mis mängib rolli ripsmete funktsioonis ja rakutsükli progresseerumises.37 Nek8 iseloomustati algselt jck hiirtel muteerunud geenina.32 Eelkõige on näidatud, et amutatsioon samas valgudomeenis põhjustab inimestel NPHP9.{8}}D-uuringud näitasid, et tsüstide areng erineb polütsüstilise neeruhaiguse erinevate vormide puhul dramaatiliselt. eranditult CD-st ja DCT-st.31 Kuigi need immunohistokeemilised uuringud on informatiivsed, ei saa need vastu vaielda võimalusele, et spetsiifiliste torukujuliste markerite39 kadumine on selle tähelepaneku põhjuseks kunstlikult. Seega meie 3D (Kolmemõõtmeline) uuring annab esimesed selged tõendid selle kohta, et tsüstide areng on protsess, mis võib hõlmata ainult spetsiifilisi nefronisegmente. Huvitav on see, et kuigi NIMA (mitosageen A mitte kunagi) – seotud kinaas 8 (NEK8) ekspresseerub kõigi nefroni segmentide tsütoplasmas, on selle ekspressioon ripsmetes piiratud DCT ja CD-ga. Kuna ainult need segmendid on altid tsüstide tekkele,31 võime oletada, et NEK8 tsiliaarse funktsiooni rikkumine on tsüstide moodustumise otsustav sündmus. Huvitaval kombel oleme ka täheldanud, et fusiformne tsüst on pidevas normaalsete mittedilateeritud tuubulitega. Asjaolu, et retsessiivne idutee mutatsioon põhjustab patoloogilise fenotüübi ainult rakkude alamrühmas, viitab sellele, et teine sündmus võib vallandada nendes rakkudes tsüstide arengu, nagu soovitatakse autosomaalse domineeriva polütsüstilise haiguse korral.neerudhaigus.40,41
Joonis 6 |Kolmemõõtmeline(3D) nefroni rekonstrueerimine näitab, et tsüstid arenevad ainult spetsiifilistes nefroni segmentides. (a) Tüüpilised 3D-kujutised terve nefroni (vasakpoolsed paneelid) tsüstimahu renderdamisega glomerulitest kuni kogumiskanalini pindmises ajukoores (sinine), keskmises ajukoores (roheline) ja jackhiirtel kõrvutipiirkonnas (punane). Nefroni segmenteerimine (parempoolsed paneelid) kolme erineva tüübi jaoksnefroonid. Riba =150 mm. ( b ) Tsüstide tekke tõenäosus erinevates nefroni segmentides tungraua hiirtel. (jätkub)
Joonis 6|(Jätkub) Horisontaalne telg on nefronite normaliseeritud pikkus, mis vastab 50 mahutile (proksimaalne tuubul [PT], türkiis; Henleloop [HL], valge; distaalne keerdunud tuubul [DCT], roosa; ühendustuubul [CNT], kollane). (c) Tüüpilised 3D-tsüstide rekonstrueerimiskujutised HL-i (vasakpoolsed paneelid), DCT-de (keskmised paneelid) ja CNT-de ning kortikaalsete kogumiskanalite (CCD) (parempoolsed paneelid) tsüstide mahu renderdamisega pindmistes (ülemised paneelid), keskmises (keskmised) paneelid) ja kõrvuti (alumised paneelid) nefronid tungraua hiirtel. Riba=50 mm.
Joonis 7|Tsüsti jaotumise ja mahu iseloomustus kogu nefronis. (a) Tsüstide kogumahu kvantifitseerimine (tsüstide summa nefroni kohta) iga nefronisegmendi kohta (Henle silmus [HL], valge; distaalne keerdunud tuubul [DCT], roosa; ühendustuubul [CNT], kollane) ja (b) tuubuli pikkus, mille hõivavad tsüstid igat tüüpi nefroni puhul (pindmine: sinine; keskmine: roheline; kõrvutine: punane) jakkhiirtel. Andmed on väljendatud keskmisena±SEM. Dispersioonanalüüs, millele järgneb Tukey-Krameri test: juxtamedullaarne nefron [JN] versus pindmine nefron [SN]: #P < 0.05;="" jn="" versus="" keskmine="" nefron="" [mn]:="" *p="">< 0,05,="" **p=""><>
Samuti täheldasime, et tsüstide suurenemine on JN-de puhul domineerivam kui SN-des, vähemalt arvestades PT ja CNT vahel paiknevaid tsüste. Järjekindlalt on teatatud, et glomeruloskleroosi kontekstis leitakse glomerulaarseid kahjustusi JN-idel sagedamini kui SN-idel.1,21,42 Kas ühe nefroni suurenenud glomerulaarfiltratsiooni kiirusest ja transpordi-/ensümaatilisest aktiivsusest tulenev ületöötamine põhjustab JN-ide suurenenud tundlikkust. halvenemine on huvitav hüpotees, mis väärib edasist uurimist.
Kokkuvõttes kirjeldame uut pildistamise tehnikatneerud3D-s (Kolmemõõtmeline) piisava molekulaarse spetsiifilisuse ja eraldusvõimega spetsiaalselt märgistatud sisestruktuuride ruumilise ja kvantitatiivse jaotuse otse registreerimiseks (nefroonid, veresooned ja tsüstid). Arvestades mugavust, kiirust ja otsese kvantifitseerimise võimalust, eeldame, et sellest tehnikast saab võimas tööriist neerupatofüsioloogia mõistmisel.
MEETODID
Loomad
Kõik loomadega tehtavad protseduurid on heaks kiidetud "Services Vétérinairesde la Préfecture de Police de Paris" ja University Paris Descartes'i eetikakomitee poolt. Kahe kuu vanuseid FVB/N hiiri (n=20) kasutati katsetingimuste seadistamiseksneerudSeejärel viidi uuring läbi 2-nädala vanuste isasloomade hiirtega (n=4) ja kontroll-pesakonnakaaslastega (n=3).
Neerukudede ettevalmistamine
Enne tapmist perfuseeriti hiiri intrakardiaalse kateteriseerimisega 25 ml hepariniseeritud soolalahusega (1000 IU/l), millele järgnes 75 ml 4% paraformaldehüüdi fosfaatpuhverdatud soolalahuses (PBS). Katsed viidi läbi ksülasiini (Rompun 2 protsenti, Bayer, Leverkusen, Saksamaa, 6 mg/g kehamassi kohta) ja ketamiini (Clorketam 1000, Vetoquinol SA, Lure, Prantsusmaa, 120 mg/g kehakaalu kohta) anesteesia all.
Arveldusuuringute jaoksneerudfikseeriti 4-protsendilises paraformaldehüüdis 4 tundi ning sisestati 4-protsendilisesse agaroosi ja 15-mm paksused lõigud, mis ümbritsevad neerupaunat, lõigati ja säilitati PBS-is 4 °C juures.kraadi. Neerulõigud värviti esmalt ja seejärel puhastati.
Õhukeste lõikude immunohistokeemiliste uuringute jaoks fikseeriti neerud üleöö 4-protsendilises paraformaldehüüdis ning lõigati parafiiniga ja 4-mm lõigud.
Värvimine
Perioodiline happe-Schiffi värvimine. 1.{1}}mmneerudsektsioone inkubeeriti enne puhastamist puhtas või 1:100 PBS-ga lahjendatud perioodilises happes-Schiffis 5 minutit toatemperatuuril.
Immunohistokeemia õhukestel parafiiniga kaetud lõikudel. Parafiiniga manustatud neerude nelja mikromeetriseid sektsioone kuumutati antigeeni leidmiseks ja inkubeeriti üleöö temperatuuril 4 °C.4 kraadikoos flfluorokroomiga seotud lektiinidega tuubulite jälgimiseks (rodamiini maapähkli aglutiniin [RL-1072-5] ja rodamiini nisuidu aglutiniin [RL-1022-5], Vector Laboratories, Burlingame, CA, lahjendatud 1:200) ja segment- spetsiifiline primaarne antikeha, mis kujutab erinevaid torukujulisi segmente (biotinüülitud Lotus tetragonolobus lektiin [B-1325], Vector Laboratories, lahjendatud 1:100; hiire anti-Calbindin D28K[D-4], Santa Cruz, Heidelberg, Saksamaa, lahjendatud vahekorras 1:200; kitse anti-AQP2 [C-17], Santa Cruz, lahjendatud vahekorras 1:200). Järgmisel päeval inkubeeriti sektsioone sekundaarse antikehaga 1 tund toatemperatuuril (Alexa Fluor 488 konjugaat [S32354], Invitrogen; kitsevastane Alexa Fluor 488 [A-11055], Invitrogen; hiirevastane AlexaFluor 488 [A-21202], Invitrogen, Carlsbad, CA; kõik lahjendatud vahekorras 1:500)enne värvimist 40,6-diamidino-2-fenüülindooliga. Kõik kujutised saadi Nikon Eclipse E800 mikroskoobiga (Champignysur Marne, Prantsusmaa) ja valmistati Fidži tarkvaraga (versioon 1.50). Paksudel lõikudel värviti lektiini. 1.{37}}mm paksuneneerudsektsioone inkubeeriti 44 kraadi1 kuu Texas Red või flfluorestseiini isotiotsüanaadiga seotud lektiinides: maapähkli aglutiniin (RL-1072-5) ja nisuidu aglutiniin (RL-1022-5), lahjendatud vahekorras 1:100 0,1% PBS-asiidis ja 0,1% Triton-X-s. Seejärel pesti sektsioone enne puhastamist iga päev 2 nädala jooksul PBS-iga.
Cistanche-neeru funktsioon
Optiline puhastus
Skaala puhastamiseks 1.5-mmneerudsektsioone inkubeeriti ScaleA2-s (4 M karbamiidi, 0,1 protsenti Triton X-100, 10 protsenti glütserooli) või ScaleB4-s (8 Murea, 0,1 protsenti Triton X{10}} ) 2 nädalat, kuni 1 aasta, kell 4kraadi.
BABB puhastamiseks dehüdreeriti 15- mm suurused neerulõigud toatemperatuuril järjestikuste etanooliloputustega. Seejärel inkubeeriti proove BABB-s (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO) vahekorras 1:2 vähemalt 2 päeva temperatuuril 4 °C.
Kahe fotoni mikroskoopia kujutise saamine
Kuded pildistati vesigeeliga ümberpööratud multifotonmikroskoobiga (LaVision BioTec), mis oli varustatud Mai Tai HP Titanium-Sapphire Laseriga (Spectra-Physics, Santa Clara, CA) (täiendav joonis S1A). Ergastuse lainepikkus oli 815 nm 8% võimsusest. Kasutasime 20Xvees sukeldusobjektiiv (XLUMPLFL20XW, Olympus [Tokyo, Jaapan]; numbriline ava, 0,95; töökaugus, 2,0 mm). Fluorestsentsi omandamiseks kasutasime 80-protsendilist skaneerimata detektorit ribapääsfiltriga 593/40 nm.
Esimene samm koosnes 2D-mosaiikkujutise hankimisest keskmises z-virnas, kasutades suboptimaalseid pildistamisparameetreid (400 mm x 400 mm ja 1011 x 1011 pikslit, 10-protsendiline kattuvus ja lineaarkeskndamine 2-s), et juhtida kõige asjakohasemate keskväljade valimist (täiendav joonis S9A). ). Kui XY ruudustik ja z huviväljad olid määratletud, kohandati parameetreid kvaliteetsete piltide saamiseks. Selline lähenemine vähendas huvipakkuvat piirkonda 5-niX12 välja z-virna kohta. Seejärel hankisime 850 z virna/optilised viilud (1- mm sammu suurus), mis ümbritsesid neeru keskosa.neerudosa.
Piltide õmblemine, töötlemine ja jälgimine Iga virn kanti plaaditud vastavalt Preibischet al.43 väljatöötatud meetodile, mis võimaldab Fidži tarkvara pistikprogrammi "Grid/Collection Stitching" (HTTP://Fiji. sc/Fidži). Kuna pärast õmblemist täheldasime olulist nihet kahe külgneva pildi vahel, kirjutasime Pythonis kohandatud sobitusprogrammi. See programm kompenseerib kujutise nihke, võimaldades pilte õigesti joondada (täiendav joonis S9B). Õmmeldud korrigeeritud pilte analüüsiti Imarise versiooniga 8.4.2 (Bitplane, Zürich, Šveits). Torukesed ja veresooned jälgisid Imarise hõõgniidijälgijate paketi manuaalset režiimi ning nendega liitus Imaris Xtension, mille arendasime koos MATLABiga (https://www.dropbox.com/s/sm9u5em3orjrpmc/Standalone_Liitu{12}} Filament_Tool.zip?dl=0) (täiendav joonis S9C). Glomeruliandi tsüstid rekonstrueeriti 3D-s, kasutades Imarise pinnapaketi käsitsi režiimi. 3D (Kolmemõõtmeline) glomerulite ruumiline korraldus kuvati Imarise täppide paketi käsitsi režiimis.
Morfomeetria
Torukujulise segmendi pikkus, nefroni pikkus ja sirgus määrati Imarise hõõgniidi märgistuspaketi abil. Imarise tarkvara järgi kvantifitseeriti sirgus kahe punkti vahelise kauguse ja nefroni segmendi tee pikkuse suhtena. Kolmkümmend üks PT ja 12 tervetnefroonidrekonstrueeriti ja mõõdeti 3 metsiktüüpi hiirel, samas kui 37 PT-d ja 17 täisnefroni rekonstrueeriti ja mõõdeti 4 jack-hiirel. Tsüstide ja glomerulaaride mahud määrati Imarise "pinnapaketi" abil. Metsikut tüüpi hiirtel ja jack-hiirtel mõõdeti vastavalt 31 ja 34 glomeruli. Kokku mõõdeti seitsekümmend neli tsüsti.
Torukujuliste pöörete "tasapinnast väljas" nurki (tähistatud kui "beeta") mõõdeti tasapinna (määratletud 3 järjestikuse punktiga) ja järgmise järjestikuse neljanda punktiga ruumis oleva suuna vahel (joonis 5b). Täheldatud kallutatuse statistilise olulisuse hindamiseks simuleerisime beetanurkade jaotust beetanurkade juhusliku pööramisega (Monte Carlo simulatsioon) struktuurides, mis koosnesid samadest segmentidest samade alfanurkade komplektiga.
Tsüstilise kahjustuse tekke tõenäosuse arvutamiseks koos nefroni segmentidega esindasime iga nefroni ruumipunktide komplektiga. Iga punkt märgiti tsüsti olemasolu ja normaalse struktuuri ja segmendi tüübi kohta. Tõenäosus igal standardsel pikkusel (määratud 50 salve) arvutati suhtena tsüstilise annotatsiooniga punktide arvu ja prügikasti punktide koguarvu vahel.
Keskmise glomerulaaridevahelise kauguse arvutamiseks võtsime iga glomeruli puhul arvesse keskmist glomerulaarsete vahekaugust, mis arvutati lähima 5 glomeruli kohta.
Andmete analüüsid ja statistika
Andmed on väljendatud keskmisena ± SEM. Erinevusi katserühmade vahel hinnati dispersioonanalüüsi abil, millele järgnes, kui see oli oluline (P < {0}}.05),="" tukey-krameri="" testiga.="" kui="" võrreldi="" ainult="" 2="" rühma,="" kasutati="" mann-whitney="" testi.="" statistilised="" analüüsid="" viidi="" läbi="" graph="" prism="" tarkvaraga="" (sandiego,="" ca,="" versioon="">
AVALIKUSTAMINE
Kõik autorid ei deklareerinud konkureerivaid huve.
TUNNUSTUS
Täname tehnilise abi eest Laboratoire Experimentation Animale et Transgenese (LEAT), histoloogia- ja pildistamisplatvorme Federative deRecherche Necker. Täname Pierre Isnardit, Marie-Claire Gublerit ja Nicolas Kuperwasserit käsikirja kriitilise lugemise eest. Seda tööd toetasid Institut National de laSanté et de la Recherche Médicale, Université Paris Descartes, Assistance Publique – Hôpitaux de Paris, Agence Nationale de laRecherche, Whoami Laboratoire d'Excellence Kes ma olen, RochePharma Research and Early Development (Basel, Šveits) ja Institut Roche de Recherche et de Médecine Translationnelle (Pariis, Prantsusmaa).
AUTORI KAASALAD
TB, NG ja MZ kavandasid ja viisid läbi katsed ning analüüsisid andmeid. FB, LT, MGT ja SG viisid läbi ka mõned katsed ja analüüsisid andmeid. MB ja CN viisid läbi hiirekatsed. TB ja MZ aitasid kaasa ka käsikirja kirjutamisele.GF vaatas käsikirja üle. FT ja MP andsid kontseptuaalse raamistiku ja kavandasid uuringu, juhendasid projekti ja kirjutasid paberi.
Cistanche - Nefronite neeru kolmemõõtmeline arhitektuur
LISAMATERJAL
Täiendav fail (PDF)
Joonis S1. Eksperimentaalne seadistamine, hankimisprotseduur ja pilditöötlus.
Joonis S2. Autofluorestsentssignaali piirid resolutsioonides XY ja z.
Joonis S3. Kahemõõtmeline pilt üleminekust PT ja TL vahel 4- mm parafiiniga manustatudneerudlõigud.
Joonis S4. Kahemõõtmeline pilt üleminekust TAL ja DCT vahel 4- mm parafiiniga manustatud neerulõikudel.
Joonis S5. Kahemõõtmeline pilt üleminekust DCT ja CNT vahel 4- mm parafiiniga manustatud neeruosadel.
Joonis S6. Kolmemõõtmeline rekonstrueerimine paljastab 3 erinevat proksimaalsete tuubulite kuju.
Joonis S7.Kolmemõõtmelinerekonstrueerimine näitab, et pikkus ja segmenteeriminenefroonidtsüstid neid ei mõjuta.
Joonis S8. Glomerulite tihedus kontrolli all ja tsüstilineneerud.
Joonis S9. Omandamisprotseduur ja töötlusjärgne pilditöötlus. Tabel S1. Arveldusmeetodite võrdlus. Täiendav fail (filmid)
Film S1. Lektiini värvimine parandab märkimisväärselt eraldusvõimet ja signaali-tausta suhet.
Film S2. Torukese teekonna jälgimine.
Film S3. Puhastatud neeru kolmemõõtmeline rekonstrueerimine, mis näitab proksimaalse tuubuli ja Henle ahela õhukese lüli vahelist ristmikku.
Film S4. Puhastatud neeru kolmemõõtmeline rekonstrueerimine, mis näitab Henleloopi paksu tõusva jäseme ja distaalse keerdunud tuubuli ühenduskohta.
Film S5.Kolmemõõtmelinepuhastatud rekonstrueerimineneerudnäitab ristmikku distaalse keerdunud tuubuli ja ühendava tuubuli vahel.
Film S6. Proksimaalsete tuubulite kuju ja suurus erinevad sõltuvalt nende sügavusest.
Film S7. Kolmemõõtmeline nefroni rekonstrueerimine kontrollhiirtel.
Film S8. Soone teekonna jälgimine kaarekujulisest veresoonest akortikaalse kiirgussooneni.
Film S9. Kaarjad veresooned modelleerivad külgnevate proksimaalsete tuubulite kuju.
Film S10.Nefronidkipuvad lennukis lamama.
Film S11. Kolmemõõtmeline nefroni rekonstrueerimine näitab tsüstide arengu ebaspetsiifilist mustrit.
Film S12.Kolmemõõtmelinenefroni segmenteerimine näitab, et tsüstid arenevad spetsiifilistes nefroni segmentides.
Film S13. Ruumiline paigutus ja vastastikune seosnefroonidja veresooned polütsüstilisesneerud.
VIITED
1. Rikas AR. Juxtamedullaarsete glomerulite seni kirjeldamata haavatavus lipoidse nefroosi korral. Bull Johns Hopkins Hosp. 1957;100:173–186.
2. Bankir L, Bouby N, Trinh-Trang-Tan MM. Nefronatoomia heterogeensus. Kidney Int Suppl. 1987;20:S25–S39.
3. Christensen EI, Grann B, Kristoffersen IB jt.Kolmemõõtmelineroti nefroni rekonstrueerimine. Am J Physiol Physiol. 2014;306:F664–F671.
4. Zhai XY, Birn H, Jensen KB, et al. Hiire proksimaalse tuubuli digitaalne kolmemõõtmeline rekonstrueerimine ja ultrastruktuur. J Am Soc Nephrol.2003;14:611–619.
5. Zhai XY, Thomsen JS, Birn H, et al. Hiire nefroni kolmemõõtmeline rekonstrueerimine. J Am Soc Nephrol. 2006;17:77–88.
6. Puelles VG, Moeller MJ, Bertram JF. Nüüd näeme selgelt: optiline puhastamine janeerudmorfomeetria. Curr Opin Nephrol Hypertens.2017;26:179–186.
7. Seo J, Choe M, Kim SY. Suuremahuliste bioloogiliste kudede puhastamise ja märgistamise tehnikad. Moli rakud. 2016;39:439–446.
8. Spalteholz W. Über das Durchsichtigmachen von menschlichen undtierischen Präparaten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang:Über Knochenfärbung. Leipzig, Saksamaa: S. Hierzel; 1914. aasta.
9. Hama H, Kurokawa H, Kawano H jt. Skaala: keemiline lähenemine fluorestsentspildistamiseks ja läbipaistva hiireaju rekonstrueerimiseks. Nat Neurosci. 2011;14:1481–1488.
10. Ertürk A, Becker K, Jährling N jt.Kolmemõõtmelinelahustiga puhastatud elundite pildistamine 3DISCO abil. Nat Protoc. 2012; 7:1983–1995.
11. Kuwajima T, Sitko AA, Bhansali P jt. ClearT: detergentide- ja lahustivaba puhastusmeetod neuronaalsetele ja mitteneuronaalsetele kudedele.Areng. 2013;140:1364–1368.
12. Ke MT, Imai T. Fikseeritud ajuproovide optiline puhastamine SeeDB abil. CurrProtoc Neurosci. 2014;66:2.22.1–2.22.19.
13. Chung K, Deisseroth K. CLARITY närvisüsteemi kaardistamiseks. NatMethods. 2013;10:508–513.
14. Tomer R, Ye L, Hsueh B, Deisseroth K. Advanced CLARITY intaktsete kudede kiireks ja kõrge eraldusvõimega pildistamiseks. Nat Protoc. 2014; 9:1682–1697.
15. Yang B, Treweek JB, Kulkarni RP jt. Üherakuline fenotüüpimine läbipaistvas puutumatus koes kogu keha puhastamise kaudu. Kamber. 2014;158:945–958.
16. Susaki EA, Tainaka K, Perrin D jt. Kogu aju pildistamine üherakulise eraldusvõimega, kasutades keemilisi kokteile ja arvutusanalüüsi. Cell.2014;157:726–739.
17. Alanentalo T, Asayesh A, Morrison H jt. Tomograafiline molekulaarne kujutis ja 3D kvantifitseerimine täiskasvanud hiire elundites. Nat Methods.2007;4:31–33.
18. Parra SG, Chia TH, Zinter JP jt. Puhastatud hiire elundite multifotonmikroskoopia. J Biomed Opt. 2010;15:036017.
19. Renier N, Wu Z, Simon DJ jt. iDISCO: lihtne ja kiire meetod suurte koeproovide immunomärgistamiseks mahu kuvamiseks. Kamber. 2014;159:896–910.
20. Lee H, Park JH, Seo I jt. Elektroforeetilise kudede puhastamise tehnoloogia CLARITY täiustatud rakendamine tervetele tahketele organitele, sealhulgas ajule, kõhunäärmele, maksale,neerud, kopsud ja sooled. BMC Dev Biol. 2014;14:1–7.
21. Iversen BM, Amann K, Kvam FI jt. Suurenenud glomerulaarne kapillaarrõhk ja suurus vahendavad glomeruloskleroosi SHR juxtamedullarycortexis. Am J Physiol Physiol. 1998;274:F365–F373.
22. Angelotti ML, Antonelli G, Conte C, Romagnani P. Neeru pildistamine: valgusest ülilahutusega mikroskoopiani. Nephrol Dial Transplant.2021;36:19–28.
23. Puelles VG, van der Wolde JW, Schulze KE jt. Kolmemõõtmelise meetodi valideerimine podotsüütide loendamiseks ja suuruse määramiseks tervetes glomerulites. J Am Soc Nephrol. 2016;27:3093–3104.
24. Pannabecker TL, Dantzler WH, Layton HE, Layton AT. Rollkolmemõõtmelineneerude sisemise medulla uriini kontsentreerimise mehhanismi arhitektuur. Am J Physiol Physiol. 2008;295:F1271–F1285.
25. Saritas T, Puelles VG, Su XT jt. Optiline puhastus neerus näitab kaaliumi vahendatud tuubulite ümberkujunemist. Cell Rep. 2018;25:2668–2675.e3.
26. Schuh CD, Polesel M, Platonova E jt. Neerude kombineeritud struktuurne ja funktsionaalne pildistamine näitab suuri aksiaalseid erinevusi tuubulite endotsütoosi proksimaalses piirkonnas. J Am Soc Nephrol. 2018;29:2696–2712.
27. Braun DA, Hildebrandt F. Ciliopathies. Cold Spring Harb Perspect Biol.2017;9:a028191.
28. Bergmann C, Guay-Woodford LM, Harris PC jt. Polütsüstilineneerudhaigus. Nat Rev Dis Prim. 2018;4:50.
29. Wilson PD. Polütsüstiline neeruhaigus. N Engl J Med. 2004;350:151–164.
30. Laitinen L, Virtanen I, Saxén L. Muutused glükosüülimise mustris hiire neeru embrüonaalses arengus, mis ilmnes lektiinikonjugaatide puhul. J Histochem Cytochem. 1987;35:55–65.
31. Smith LA, Bukanov NO, Husson H jt. Polütsüstiidse haiguse areng juveniilsetel tsüstilistel neeruhiirtel: ülevaated patogeneesist, tsiliaarsetest kõrvalekalletest ja inimese haiguse ühistest tunnustest. J AmSoc Nephrol. 2006;17:2821–2831.
32. Liu S, Lu W, Obara T jt. Uue Nek-perekonna kinaasi defekt põhjustab hiirtel ja sebrakaladel tsüstilise neeruhaiguse. Areng.2002;129:5839–5846.
33. Franke M, Baeßler B, Bechtel J jt. Magnetresonantsi T2 kaardistamine ja difusiooniga kaalutud pildistamine tsüstogeneesi ja ravivastuse varaseks avastamiseks polütsüstilise neeruhaiguse hiiremudelis.NeerInt. 2017;92:1544–1554.
34. Barry DM, McMillan EA, Kunar B jt. Nefroni veresoonte spetsialiseerumise molekulaarsed determinandidneerud. Nat Commun. 2019;10:5705.
35. Perretta-Tejedor N, Jafree DJ, Long DA. Endoteeli-epiteeli kommunikatsioon polütsüstiliste haiguste korralneerudhaigus: veresoonte endoteeli kasvufaktori signaaliülekande roll. Kärjesignaal. 2020;72:109624.
36. Srivastava S, Molinari E, Raman S, Sayer JA. Paljud geenid-üks haigus?Nefronoftoosi (NPHP) ja NPHP-ga seotud häirete geneetika.Front Pediatr. 2017;5:287.
37. Fry AM, O'Regan L, Sabir SR, Bayliss R. Rakutsükli reguleerimine proteiinkinaaside NEK-perekonna poolt. J Cell Sci. 2012;125:4423–4433.
38. Otto EA, Trapp ML, Schultheiss TÜ jt. NEK8 mutatsioonid mõjutavad tsiliaarset ja tsentrosomaalset lokaliseerimist ning võivad põhjustada nefronoftoosi. J Am SocNephrol. 2008;19:587–592.
39. Wilson PD. Apico-basaalne polaarsus polütsüstilise neeruhaiguse epiteeli korral.Biochim Biophys Acta. 2011;1812:1239–1248.
40. Happé H, Leonhard WN, van der Wal A jt. Pkd1-deletsioonihiirte toksiline tubulaarne vigastus neerudes kiirendab tsüstogeneesi, millega kaasneb tasapinnaliste rakkude ebaregulaarne polaarsus ja kanoonilised Wnt signaalirajad. Hum Mol Genet. 2009;18:2532–2542.
41. Piontek K, Menezes LF, Garcia-Gonzalez MA jt. Kriitiline arengulüliti määratleb neerutsüstide moodustumise kineetika pärast Pkd1 kadumist. Nat Med. 2007;13:1490–1495.
42. Ikoma M, Yoshioka T, Ichikawa I, Fogo A. Sügavate kortikaalsete glomerulite küpsemise ainulaadse tundlikkuse mehhanismneerudraske fokaalse glomerulaarskleroosi korral. Pediatr Res. 1990;28:270–276.
43. Preibisch S, Saalfeld S, Tomancak P. Globaalselt optimaalne 3D õmblus (Kolmemõõtmeline) mikroskoopiliste kujutiste saamine. Bioinformaatika. 2009;25:1463–1465.
