Tsistanosiidi A terapeutiline toime munasarjade eemaldatud hiirte luude ainevahetusele

1. Sissejuhatus

Osteoporoosist, süsteemsest luustiku "vaikivast tapjast", on viimastel aastatel saanud suur terviserisk, mis on viimastel aastatel vaevanud üle 2000 miljoni inimese kogu maailmas.. Seda iseloomustab madal luumassi tihedus (BMD) ja mikroarhitektuuri halvenemine, mis tuleneb luude liigsest resorptsioonist ja lõpuks luude moodustumisest ja lõpuks osteoporoosist tingitud luumurruni.. Tänapäeval on osteoklastide diferentseerumist ja resorptsiooni blokeerivate ainete tuvastamine levinud ja edukas strateegia osteoporoosi raviks kasutatavate ravimite väljatöötamiseks.ja on tõepoolest palju sünteetilisi aineid, sealhulgas östradioolvaleraat ja naatriumalendronaat, mis võivadennetada ja ravida osteoporoosi. Haiguste ravimid pole aga kaugeltki ideaalsed; mõned neist ravimitest võivad suurendada endomeetriumi ja rinnavähi riski ning neil on ka teatud kõrvaltoimed, nagu hüperkaltseemia, hüperkaltsiuuria jne., mis piiravad nende kliinilist rakendust. Seetõttu on traditsioonilisi hiina ravimeid (TCM), eriti isoleeritud bioaktiivsete ühendite ja fraktsioonidega söödavat TCM-i, kasutatud Aasia riikides ohutult ja tõhusalt juba enam kui aastatuhande vältel laialdaselt erinevate haiguste, sealhulgas osteoporoosi ennetamiseks ja raviks.. 

LOODUSLIK TUBULOOS OSTEOPROOSI HAIGUSE RAVIKS JA VÄLTIMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Osteoporoosi iseloomustatakse suurenenud osteoklastogeneesi tõttu suurenenud luu resorptsioonina ja see protsess hõlmab hematopoeetiliste monotsüütide sidumist osteoklastide prekursoriteks, mis sulanduvad, moodustades mitmetuumalisi osteoklaste, mis on suunatud ümberkujundatavatele luukohtadele [4]. Tuumafaktor-κB ligandi (RANKL) retseptori aktivaator, mis on osteoblastidest sekreteeritav võtmefaktor, stimuleerib monotsüütide diferentseerumist osteoklastideks [8, 9]. RANKL-i interaktsioon selle retseptoriga RANK põhjustab rakusiseste sündmuste kaskaadi, sealhulgas NF-κB, PI3K/Akt ja kaltsiumi/kalmoduliinist sõltuva kinaasi, kaasates adapteri signaalvalgu TNF-retseptoriga seotud faktori (TRAF6). Selle tulemusena on mitmed osteoklastidega seotud markergeenid, sealhulgas TRAP, katepsiin K ja DPD, ülesreguleeritud ning luu resorptsiooniprotsess kiireneb.

Fenüületanoidglükosiide iseloomustavad kaneelhappe ja hüdroksüülfenüületüülrühmad, mis on seotud glükosiidsideme kaudu glükopüranoosiga (apioos, galaktoos, ramnoos, ksüloos jne), mis on laialt levinud ravimtaimedes [10]. Tsistanosiid A (Cis A) on aktiivne ainefenüületanoidglükosiidCistanche deserticola YC Ma. Hiina farmakopöa andmetel kasutati C. deserticolat traditsiooniliselt neeru-yini puudulikkuse, lihasnõrkuse, nimmepiirkonna nõrkuse jne raviks ning fenüületanoidglükosiidid on selle ürdi peamised bioaktiivsed koostisosad [11]. Tuginedes TCM-i "neeru" teooriale, võib neer juhtida luusüsteemi, mis tähendab, et luude areng ja funktsioonid sõltuvad neeruessentsist ning see neeruessents võib muutuda luuüdiks, et luid toita, soodustab luustiku kasvu ja paranemist ning tugevdab seda [12]. Kuna C. deserticola võib neerusid tugevdada, eeldasime, et Cis A võib ennetada ja ravida osteoporoosi. Seetõttu oli käesolev uuring kavandatud selleks, et kinnitada potentsiaaliCis A osteoporoosi ennetamiselkasutades ovariektoomiaga hiirte mudelit ning luu moodustumise ja resorptsiooni markerid ning nendega seotud potentsiaalsed mehhanismid määrati selle aine osteoporoosivastase bioaktiivsuse hindamiseks.

2. Tulemused ja arutelu

2.1. Tulemused

2.1.1. Cis A mõju luu kolmepunktilise painde testimisele

Et analüüsida, kas ravi Cis A-ga muudab luu tugevamaks, teostasime reieluud kolmepunktilise painutustesti. Nagu on näidatud joonisel 1, oli maksimaalne koormus luumurdude korral 21,5% ja 220% suurem loomadel, keda raviti 20 mg/kg ja 80 mg/kg kg Cis A, võrreldes munasarjade eemaldamise (OVX) rühma loomadega (p < 0.05). Samal ajal suurendas ravi Cis A-ga ka luu jäikust; kõigil Cis A-ga ravitud hiirtel oli jäikus oluliselt suurenenud, vastavalt 121.0 ± 12,1 (p < 0,05), 124,1 ± 16,2 (p < 0,05) ja 127,7 ± 9,6 (p < 0,01), võrreldes 102,2 ± 10,7 OVX hiirtega. Tulemused näitavad, et Cis A-ga ravitud OVX hiirte luude tugevuse suurenemine oli tingitud suurenenud luu kogusest ja luu kvaliteedi paranemisest.

2.1.2. Cis A mõju luude mikroarhitektuurile

Mikro-CT-ga mõõdetud hiirte kolmemõõtmeline trabekulaarse luu mikroarhitektuur (joonis 2 ja tabel 1) näitab intuitiivselt, et OVX rühma hiirtel vähenes trabekulaarne ala ja trabekulaarne arv võltsrühmaga võrreldes, mis näitab, et munasarjade eemaldamine võib esile kutsuda luumassi tiheduse (BMD, -46%), luu mineraalainete sisalduse (BMC, -66%), koe mineraalainete sisalduse (TMC, -85%), luumahu fraktsiooni (BVF, -82%) märkimisväärse vähenemise, trabekulaarne arv (Tb. N, –76%) ja trabekulaarse eraldumise suurenemine (Tb. Sp, +80%), ilma et koe kogu mineraaltihedus (TMD) ja trabekulaarne paksus (Tb. Th) muutuks pärast tegevus 12 nädalat. Kuid Cis A-ga ravitud OVX hiirtel suurenes annusest sõltuvalt BMD (+43%~57%), BMC (+65%~73%) ja TMC (+83%~). 90%), BVF (+80%~88%), suurem Tb vähenemine. Sp (−79% ~ 88%) ja veelgi suurendatud Tb. N (+73%~82%) võrreldes OVX-rühmaga. Tundub, et munasarjaektoomia ei mõjutanud TMD-d, kuid ravi östradioolvaleraadiga (EV) suurendas seda oluliselt.

2.1.3. Cis A mõju nii luu moodustumise kui ka resorptsiooni markeritele

Cis A mõju luu resorptsioonimarkeritele, sealhulgas TRAP-le, DPD-le, katepsiin K luu moodustumise indeksile ALP ja luu Gla-valgule (BGP), on näidatud joonisel 3. Pärast 12-nädalast munasarjade eemaldamise operatsiooni on TRAP, DPD aktiivsus ja katepsiin K OVX rühmas suurenes oluliselt, eriti DPD, mis suurenes ligi 55,6%; TRAP ja katepsiin K suurenesid vastavalt 43, 5% ja 38, 1%, võrreldes võltsrühmaga. 12 nädala jooksul suukaudselt manustatud Cis A näitas märkimisväärset potentsiaali kõigi ülalmainitud luu resorptsioonimarkerite ärahoidmisel, eriti kui suur annus (80 mg/kg) avaldas olulist mõju DPD aktiivsuse pärssimisele. Võrreldes OVX rühm (joonis 3). Kuigi OVX rühmas ilmnes ALP ja BGP aktiivsuse suurenemise trend, ei täheldatud statistiliselt olulisi muutusi. Siiski täheldati ALP aktiivsuse olulist paranemist madala ja kõrge Cis A-ga ravitud rühmades võrreldes võltsrühmaga (p < 0,01).

LOODUSLIK TUBULOOS OSTEOPOROOSI HAIGUSTE VÄLTIMISEKS, 75% ECH 30% ACT 12%

2.1.4. Cis A mõju TRAF6, NF-κB PI3K, Akt, OPG ja RANKL-i valgu ekspressioonitasemetele

Western blot analüüs näitas, et võrreldes võltsrühmaga oli TRAF6, NF-κB ja RANKL valgu tase OVX rühmas oluliselt suurenenud (p < 0.05), samas kui OPG, PI3K ja Akt vähenesid oluliselt (joonis 4). Cis A (20 mg/kg või 80 mg/kg) vähendas oluliselt TRAF6 ekspressiooni (p < 0,05), millele järgnes RANKL-i ekspressiooni vähenemine ja OPG suurenemine, mis tähendab, et OPG/RANKL-i suhe oli ülesreguleeritud. Järelikult reguleeriti NF-κB signaaliülekandekaskaadid alla ja PI3K / Akt reguleeriti üles Cis A-raviga (p <0, 05).

2.2. Arutelu

Arvestades praeguste osteoporoosi ravivõimaluste piiranguid, on vaja alternatiive toidust või looduslikest söödavatest ravimtaimedest. Osana meie jätkuvatest püüdlustest leida TCM-ist tõhusaid osteoporoosivastaseid aineid, leidsime rea ekstrakte, fraktsioone ja ühendeid, millel on osteoporoosivastased omadused [13, 14]. Cistanche deserticola on oluline klassikaline TCM, millel leiti olevat soodne ohutusprofiil [15] ja laialdased meditsiinilised funktsioonid neerupuudulikkuse jne raviks [16]. TCM-i teooria kohaselt olid TCM-id, millel on neerude turgutav toime, tavaliseltkasutatakse osteoporoosi raviks; fenüületanoidglükosiidid on selle ürdi peamised bioaktiivsed koostisosad, mis tähendab, etfenüületanoidglükosiididC. deserticolas sisalduval bakteril võib olla osteoporoosivastane omadus. On tõestatud, et C. deserticola ekstrakt võib märkimisväärselt pärssida BMD vähenemist ja takistada OVX-i põhjustatud trabekulaarse mikroarhitektuuri halvenemist [17]. In vitro katses suurendas see oluliselt ka ALP-d, luu morfogeneetilist valku-2 ja osteopontiini mRNA-d, samuti kultiveeritud osteoblastide luu mineralisatsiooni [18]. Ehhinakosiidil, mis on Hiina farmakopöas ametlikult registreeritud C. deserticola peamine bioaktiivne komponent [11], ilmnes suures annuses 30–270 mg/kg kehakaalu kohta päevas [19] osteoporoosivastane toime [19] ja edasised in vitro tulemused näitasid, et see võib soodustada luu regeneratsiooni, suurendades OPG/RANKL-i ratsiooni MC3T3-E1 subklooni 14 rakkudes [20]. Cis A oli üks C. deserticolast eraldatud fenüületanoolglükosiididest ja mitmed aruanded näitasid, et sellel ühendil on antioksüdatiivne toime [21] ja põletikuvastased omadused [22,23]. Hiljuti avaldatud artikkel avastas, et Cis A avaldas hiirtel kaitsvat toimet nii CCl4 kui ka alkoholist põhjustatud hepatotoksilisuse suhtes ning samuti näitas see kaitsvat omadust etanoolist põhjustatud kahjustuste suhtes primaarselt kultiveeritud hiire hepatotsüütides in vitro [24]. Meie praeguses uuringus näitasid tulemused, et Cis A-l oli väikeses annuses (20–80 mg/kg kehakaalu kohta päevas) osteoporoosivastane toime, kasutades munasarjade eemaldatud hiirte mudelit, ja see bioaktiivsus saavutati TRAF6 taseme allareguleerimisega, pärssides RANKL ja NF-κB ekspressioon ning OPG, PI3K ja Akt stimuleerimine, mis tähendab, et Cis A terapeutiline toime OVX hiirtel toimus TRAF6-vahendatud NF-kappaB inaktiveerimise ja PI3K/Akt aktiveerimise mehhanismi kaudu.

On hästi teada, et munasarjade eemaldamine võib põhjustada osteoporoosi ilmse BMD, biomehaanilise tugevuse, luu kvaliteedi ja trabekulaarse luu mikroarhitektuuri langusega ning ülaltoodud muutused on osaliselt tingitud östrogeeni puudulikkusest [25]. Nüüd, käesolevas in vivo katses, näitab meie uuring, et munasarjade eemaldamisest põhjustatud osteoporoos vähendas oluliselt biomehaanilist tugevust ja trabekulaarseid struktuurseid parameetreid, sealhulgas BMD, BMC, TMC ja Tb. N ja Tb suurendamine. Sp; ja Cis A ravi parandas oluliselt luu mehaanilisi omadusi, sealhulgas maksimaalset koormust ja jäikust, suurendas BMD-d ja parandas enamikku luu trabekulaarse mikroarhitektuuri struktuuriparameetreid võrreldes OVX rühma hiirtega, mis näitab, et Cis A parandas luu kvaliteeti tõhusalt. ja trabekulaarne mikroarhitektuur OVX hiirtel.

Lisaks kogu BMD-le võis kolmepunktiline painutustest ja trabekulaarse luu mikroarhitektuuri mõõtmine otseselt diagnoosida osteoporoosi, samuti kasutati luu moodustumise markereid, sealhulgas ALP ja BGP, ning luu resorptsiooniindeksit, sealhulgas TRAP, DPD ja katepsiin K. selgitada välja Cis A seotud osteoporoosivastased mehhanismid. Meie uuringus näitas ALP aktiivsus OVX rühma hiirtel mitteolulist kasvutendentsi, mis viitas luude ainevahetuse kiirenemisele [26,27] menopausijärgse osteoporoosi korral; Cis A ravi kõrge (80 mg/kg kehakaalu kohta päevas) ja madal (20 mg/kg kehakaalu kohta päevas) annused näitasid ALP aktiivsuse olulist paranemist võrreldes võltsrühmaga, samas kui BGP aktiivsust ei mõjutanud munasarjade eemaldamine kõigis ravitud rühmades; TRAP, DPD ja katepsiin K suurenesid OVX rühmas märkimisväärselt ning Cis A manustamine vähendas märkimisväärselt kõiki kolme luu resorptsiooni markerit. Ülaltoodud andmed viitasid sellele, et Cis A-l oli potentsiaalne osteoporoosivastane toime ja seda toimet avaldas luu metabolismi reguleerimine, sealhulgas nii luu resorptsiooni pärssimine kui ka luu moodustumise suurendamine.

Osteoblastide ja osteoklastide vaheline koordineerimine on luustiku terviklikkuse säilitamisel kriitiline tegur. TRAP-i ekspresseerivad osteoklastid kinnituvad luu pinnale, moodustades aktiiniga seotud tihendustsoonid, mille sees vabanevad proteolüütilised ensüümid, nagu katepsiin K, mis viib resorptsioonisüvendite moodustumiseni. Osteoklastogeneesi moduleerimist osteoblastilise liini ebaküpsete rakkude poolt vahendavad RANKL ja OPG [28]. OPG on peibutusretseptor, mis inhibeerib osteoklastogeneesi RANKL-i aktivatsiooni, vähendades seeläbi luu resorptsiooni. RANKL, mis annab olulise signaali osteoklastide eellasrakkudele, on kasvaja nekroosifaktori ligandiperekonna membraaniga seotud molekul, mis soodustab osteoklastide moodustumist. Arvatakse, et OPG/RANKL-i ekspressiooni suhe on osteoklastogeense aktiivsuse põhiparameeter ja RANKL-i poolt aktiveeritud signaalikaskaadid hõlmavad NF-KB ja PI3K radu [29]. NF-κB raja tähtsust osteoklastogeneesile näitab tõsiasi, et NF-κB deletsioon hiirtel põhjustas küpsete osteoklastide puudumise [30]. TRAF6 osutus uute osteoporoosivastaste ravimite paljutõotavaks sihtmärgiks. TRAF6-puudulikud hiired, kellel esines defektne osteoklastogenees ja raske osteopetroos, näitasid seega TRAF6 tähtsust luu ainevahetuses. Uued tõendid viitavad TRAF6 kriitilisele regulatiivsele funktsioonile RANKL / RANK-vahendatud signalisatsioonikaskaadides [4, 31]. Käesoleva uuringu andmed näitasid, et Cis A ravi OVX hiirtel põhjustas TRAF6 valgu ekspressioonitasemete allareguleerimise, RANKL-i vähenemise ja OPG ekspressioonide suurenemise, takistades seeläbi allavoolu NF-κB RANKL-i aktiveerimist ja aktiveerides PI3K / Akt signaaliradu. mis viitab sellele, et Cis A inhibeerib osteoklastide diferentseerumist TRAF6-vahendatud NF-kappaB inaktiveerimise ja PI3K/Akt aktivatsiooni kaudu ning suurendab OPG/RANKL suhet, inhibeerides seejärel osteoklastogeneesi ja soodustades luu moodustumist.

LOODUSLIK CISTANCHE TUBULOSA FORANTIOSTEOPOROOTILINE AKTIIVSUSPHGS75% ECH 30% ACT 12%

3. Materjalid ja meetodid

3.1. Taimsed materjalid, ettevalmistamine ja määramine

Cistanche deserticola varredYC Ma, mille tuvastas prof Xue-yan Fu Ningxia meditsiiniülikooli farmaatsiaosakonnast, koguti 2. 015. septembril Hiinas Ningxia provintsis Yongningi maakonnas. Vautšeri näidis (nr 20150901) konserveeriti apteegiosakonna herbaariumis. Kokku 30,0 kg õhu käes kuivatatud C. deserticola varsi ekstraheeriti püstjahutiga 70% etanooliga (180 l, 3 x 2 h) 3 korda. Filtraadid ühendati ja viidi makropoorse vaigu (AB-8) kolonni koos astmelise gradiendiga lahustisüsteemiga, mis suurendas etanoolisisaldust vees (0%, 20% ja 60%, kumbki 60 l), et saada kolm fraktsiooni. 60% fraktsioonist puhastati täiendavalt Sephadex LH-20 (Pharmacia Biotech Co., Uppsala, Rootsi) ja poolpreparatiivse kõrgsurvevedelikkromatograafiaga (Agilent 1100, Agilent Technologies, Waldbronn, Saksamaa), et saada kahvatukollane värv. tsistanosiid A 4,5 g (Cis A; saagis oli 0,015%). Struktuuri selgitati peamiselt NMR (Bruker Avance, 400 MHz, Saksamaa) ja MS spektrite (Agilent 6540, Agilent Technologies) andmete analüüsiga, mis olid kooskõlas esitatud andmetega [19]. Selle puhtus määrati HPLC ala normaliseerimise meetodil (joonis 5). Loomkatsetes oli meie esialgse katse põhjal Cis A annus 20–80 mg / kg päevas.

3.2. Kemikaalid ja lahustid

Kasutati: kogu valgu ekstraheerimise komplekti ja BCA valgu kvantimise komplekte (Ken Gen Biotech. Co. Ltd, Nanjing, Hiina), TRAF6, NF-κB, PI3K, Akt, RANKL, OPG, -aktiini ja tubuliini primaarseid antikehi ( Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA), mädarõika peroksidaasiga konjugeeritud kitse küülikuvastase IgG sekundaarsed antikehad (ZSGB-BIO, Peking, Hiina), östradioolvaleraat (1 mg, Delpharm Lille SAS, Pariis, Prantsusmaa), luu Gla -valk ja desoksüpüridinoliini ristsiduvad ELISA komplektid (Xinyu Biological Engineering Co. Ltd., Shanghai, Hiina) ja katepsiin K ELISA komplekt (Biovision, Mountain View, CA, USA). Kõik muud kasutatud kemikaalid ja biokeemilised ained olid AR analüütilise puhtusega reaktiivid.

3.3. Loomkatsed

Kuuskümmend emast Kunmingi liini hiirt, vanuses 8 nädalat kehakaaluga 26.0 ± 1,62 g, osteti Ningxia Meditsiiniülikoolist ja 10 hiirt peeti ühes puuris standardse laboratoorse dieediga. ja kraanivett juhitava õhuga tingimustes (24.0 ± 0,5 ◦C, 45%–50% niiskus ja 12 h/12 ​​h hele-pimeda valgustuse tsüklid). Pärast 1-nädalast aklimatiseerumist tehti operatsioon aseptilistes tingimustes ja kõik hiired anesteseeriti kloraalhüdraadiga (100 mg/kg, ip); hiired, kellele tehti operatsioon ilma munasarju eemaldamata, olid võltsrühm (n=10); teistele tehti kahepoolne munasarjade eemaldamine OVX-rühmadena (n=50). Ülaltoodud loomkatsed viidi läbi vastavalt laboriloomade hooldamise ja kasutamise juhendile ning need kiitis heaks Ningxia meditsiiniülikooli bioeetika komitee.

Pärast järjekordset {{0}}nädalast taastumisperioodi jaotati ülaltoodud 50 OVX hiirt juhuslikult ja võrdselt 5 rühma: neile manustati suukaudselt östradioolvaleraati (1 mg/kg/päevas) positiivse kontrollina (EV); 20, 40 ja 80 mg/kg/päevas Cis A-d vastavalt madala, keskmise ja suure annuse rühmana; vehiikuliga (0,5% karboksümetüültselluloos()-Na) mudelirühmana (OVX). Kõikidele hiirtele manustati suukaudselt võrdses mahus 1 ml/100 g kehamassi vehiiklit, EV või Cis A, mis algas teisel nädalal pärast operatsiooni ja kestis 12 nädalat. Kehakaalu mõõdeti kaks korda nädalas, annust kohandati vastavalt. Pärast viimast suukaudset manustamist võeti anesteseeritud hiirte reiearterist vereproovid, lasti hüübida ja tsentrifuugiti 3000 × g juures 10 minutit, et saada seerum; lõigati lahti parem reieluu ja sääreluu. Luu mikroarhitektuuri ja osteoporoosiga seotud seerumi biokeemiliste parameetrite edasiseks hindamiseks säilitati kõiki proove temperatuuril –80 ◦C.

3.4. Kolmepunktilise painde testimine

Hiire parema reieluu biomehaaniline omadus määrati kolmepunktilise painutusseadme abil. Painutusrakisel on V-kujuline tugi, mis kinnitab reieluu distaalse ja proksimaalse otsa testimise ajal. Reieluu asetati horisontaalselt esiküljega ülespoole ja koormust rakendati allapoole reieluu keskosas. Tugede vahe oli 8 mm. Luud laaditi konstantse nihkekiirusega 0,02 mm/s kuni ebaõnnestumiseni, kasutades BOSE testimismasinat (3220) (Bose Corporation, Endura TEC Systems Group, Minnetonka, MN, USA). Koormus-nihke kõverad saadi ja neid kasutati konstruktsiooni- ja materjaliomaduste, sh maksimaalse koormuse, tippkoormuse, elastsusmooduli, paindetugevuse jms arvutamiseks.

3.5. Mikrokompuutertomograafia analüüs

Kõigi hiirte parempoolsed reieluud puhastati kleepuvatest pehmetest kudedest ja ülaltoodud parempoolse reieluu distaalse metafüüsika trabekulaarse luu mikroarhitektuur määrati mikro-CT-skanneriga (eXplore Locus SP, GE Healthcare, London, ON, Kanada). isotroopne eraldusvõime on seatud 8 µm kõigis kolmes ruumimõõtmes. Huvipakkuv piirkond (ROI) valiti samu koordinaate kasutades reieluu kasvuplaadil. Luu morfomeetrilised parameetrid, sealhulgas BMD, luu mineraalide sisaldus (BMC), koe mineraalide sisaldus (TMC), koe mineraaltihedus (TMD), luu mahu fraktsioon (BVF), trabekulaarne eraldumine (Tb. Sp), trabekulaarne arv (Tb. N ) ja trabekulaarset paksust (Tb. Th), hinnati ROI-d analüüsides, kasutades ABA luuanalüüsi tarkvara.

3.6. Biokeemiliste parameetrite analüüs

Seerumi aluselise fosfataasi (ALP) aktiivsust mõõdeti automaatanalüsaatoriga (Ciba-Corning 550 Diagnostics, Corp., Oberlin, OH, USA)); seerumi DPD, BGP ja katepsiin K tasemed määrati vastavate reaktiivikomplektidega ning tartraadiresistentset happelist fosfataasi (TRAP) analüüsiti vastava kirjanduse järgi [32].

3.7. Western blot analüüs

TRAF6, NF-κB PI3K, Akt, OPG ja RANKL valgu ekspressioonitasemed erinevates rühmades tuvastati Western blot analüüsiga. Lühidalt öeldes ekstraheeriti valk hiirte parempoolsest sääreluust, kasutades lüüsipuhvrit, mis sisaldas 0,5 mM fenüülmetüülsulfonüülfluoriidi, proteaasi ja fosfataasi inhibiitoreid. Lüsaate tsentrifuugiti 10 minutit kiirusel 12,000 × g, et saada supernatandid edasiseks analüüsiks. Lüsaatide valgu kontsentratsiooni mõõdeti bitsinhoniinhappe kvantifitseerimise testiga. Valgud (50–100 µg) eraldati 10% SDS-PAGE abil, kanti polüvinülideendifluoriidmembraanile ja inkubeeriti monoklonaalsete primaarsete antikehadega, mis olid suunatud TRAF6, NF-κB RANKL, PI3K, Akt, OPG ja -aktiini (1:500). Sama membraan eemaldati ja sondeeriti uuesti ning Image Lab tarkvara tuvastas kemoluminestsentssignaalid. -aktiin või tubuliin toimis sisekontrollina.

3.8. Statistiline analüüs

Kõiki loomkatsetest saadud andmeid analüüsiti ühesuunalise dispersioonanalüüsi abil, kasutades SPSS-i Dennetti testi (versioon 22.0, IBM SPSS Statistics, IBM Corp., Armonk, New York, NY, USA). ) tarkvara; väärtust p < 0,05 peeti statistiliselt oluliseks ja kõik tulemused esitati kui keskmine ± SD.

4. Järeldused

Kokkuvõttes, Cis A,aktiivsed fenüületanoidglükosiididisoleeritud C. deserticolast, avaldas OVX hiirtel märkimisväärset osteoporoosivastast toimet ja molekulaarne mehhanism võib olla seotud TRAF6-vahendatud NF-kappaB inaktiveerimise ja PI3K/Akt aktivatsiooniga, seega tõenäoliselt paljulubav aine osteoporoosi ravis haigus.

LOODUSLIK CISTANCHE TUBULOSA FORANTIOSTEOPOROOTILINE AKTIIVSUSPHGS75% ECH 30% ACT 12%