Cistanche Deserticolast eraldatud fenüületanoidglükosiidi kogufraktsiooni kasulikud mõjud luu mikrostruktuurile rottidel, kellel on munasarjade eemaldamine Ⅰ

Käesoleva uuringu eesmärk oli hinnata fenüületanoidglükosiidide kogufraktsiooni osteoporoosivastast aktiivsust.C. deserticola(CDP) rottidel, mis on indutseeritud ovariektoomiaga (OVX), samuti sellega seotud mehhanismid. Pärast 3-kuulist suukaudset manustamist,vähenenud luu mineraalne tihedusOVX rottidel saadi seerumi Ca ja P ning trabekulaarne seisund halvenesluu mikroarhitektuurosaliselt paranes CDP (60, 120 ja 240 mg/kg) sekkumine, luu resorptsioonimarkerite aktiivsus vähenes ja luu moodustumise indeksi bioaktiivsus tõusis üles; vahepeal vähenes MDA sisaldus ja CDP-ravi suurendas GSH-d. Kompositsiooniliselt tuvastati 8 fenüületanoidglükosiidi ühenditÜhendused CDP-s koos kogusisu kvantiteedigaÜhendusHPLC meetodil saadi 50,3%. Mehhaaniliselt alandas CDP TRAF6, RANKL ja RANK taset, pärssides seega RANKL/RANK/TRAF6-indutseeritud allavoolu NF- aktivatsiooni.κB ja PI3K / AKT signaaliülekandeteed ja lõpuks NFAT2 ja c-Fos peamiste osteoklastogeensete valkude aktiivsuse vältimine. Kõik ülaltoodud andmed viitasid sellele, et CDP näitas kasuÜhendustsiaalne eFfmõjutavad luu mikrostruktuuri rottidel, kellel on eemaldatud munasarjad, ja need eFfektid võivad olla seotud NF-gaκB ja PI3K / AKT signaalirajad, mille käivitas RANKL, RANK ja TRAF6 sidumine.

LOODUSLIK ORGAANILINE CISTANŠE LUUKASVUKS

1. Sissejuhatus

Menopausijärgne osteoporoos, mille all kannatab iga kolmas üle 50-aastane naine, on muutumas peamiseks terviseriskiks, mis mõjutab enam kui 200 miljonit naist kogu maailmas [1]. Menopausi ajal põhjustab östrogeeni taseme järsk langus tavaliselt suurenenud osteoklastogeneesist põhjustatud luu resorptsiooni ületamist; seejärel tasakaal osteoblastide indutseeritud luu moodustumise ja osteoklastide poolt indutseeritud vahelluu resorptsioonon häiritud ja kiirenenud luu resorptsioon põhjustas lõpuks osteoporoosi ja isegi puusaluu või lülisamba murru [2]. Usuti, et osteoklastide diferentseerumine vallandas siis, kui tuumafaktori kappa B (RANK) retseptori aktivaator seondus RANKL-iga, RANK-i ligandiga. RANK-i ja RANKL-i kombinatsiooni ei saa aga aktiveerida, kui sellega pole ühendatud valgu kasvaja nekroosifaktori retseptoriga seotud faktor 6 (TRAF6) [3], millele järgneb allavoolu signaaliradade, sealhulgas PI3K/AKT ja NF-κB stimuleerimine. . Lõpuks reguleeriti aktiveeritud T-rakkude c2 (NFAT2) ja c-Fos tuumafaktori ekspressioone [4], et moduleerida osteoklastide diferentseerumist ja luu resorptsiooni. Seega arvati, et osteoklastide aktiveerimise ja diferentseerumisega otseselt või kaudselt seotud tegurid ja regulaatorid on luuhõrenemise vältimise olulised sihtmärgid.

On tõepoolest olemas mõned kliinilised ja sünteetilised hormoonasendusravi ravimid, nagu östradioolvaleraat, mis on menopausijärgse osteoporoosi ravis tõhusad. Kahjuks suurendasid mõned neist tõsiste vähivormide, sealhulgas rinna- ja endomeetriumivähi [5] riski, mis piiras nende kliinilist rakendust. Seetõttu on vaja valida teisi alternatiive, millel on nii tõhusus kui ka minimaalsed kõrvalmõjud. Traditsioonilised hiina ravimid (TCM), samuti isoleeritud bioaktiivsed ühendid ja fraktsioonid [6–9] osutusid tõhusaks mitmesuguste haiguste, sealhulgas menopausijärgse osteoporoosi korral. Nende bioaktiivsete komponentide ja fraktsioonide hulgas arvati, et potentsiaalse efektiivsusega fenüületanoidglükosiidi (PhG) ühendeid on paljulubavad ained osteoporoosi ravis [10–12]. PhG-de struktuurid koosnevad kaneelhappe aglükoonist, hüdroksüülfenüületüülrühmast, mis on glükosiidsideme kaudu ühendatud -glükopüranoosi, apioosi, galaktoosi, ramnoosi või ksüloosiga. Neid leidub laialdaselt perekonna Cistanche meditsiiniliikides [13]. Cistanche deserticola YC Ma on ametlik TCM, mis on registreeritud Hiina farmakopöas ja lisaks sellele, et C deserticola on oluline TCM [14], on see ka väheste kõrvaltoimetega vananemisvastane tooniktaim, millest on välja töötatud meditsiiniline liköör ja toitevedelik, mille on heaks kiitnud. riiklik toidu- ja ravimiamet. Hiina farmakopöa andmetel on põliselanikud traditsiooniliselt kasutanud C. deserticola't neeruessentsi puudulikkuse probleemide, nagu lihaste nõrkus ja nimmepiirkonna nõrkus, raviks ning fenüületanoidglükosiidühendid, sealhulgas ehhinakosiid ja atsetoniid, on selle ürdi peamised bioaktiivsed koostisosad. Vastavalt TCM-i teooriale "neer-valitseb luu" juhib luusüsteemi neeru olemus [15] ja luudega seotud probleeme, nagu osteoporoos, saab ravida ravimtaimede või ühenditega, millel on neeruessentsi toitmine. Seetõttu püstitasime hüpoteesi, et C. deserticolast eraldatud fenüületanoidglükosiidi kogufraktsioon oli vähemalt osaliselt kasulik osteoporoosi ravis. Seetõttu töötati käesolev katse välja meie hüpoteesi kinnitamiseks, kasutades munasarjade eemaldamise (OVX) rotimudelit; Lisaks luu resorptsiooni ja moodustumise markeritele, mida tuleb hinnata, kasutati osteoporoosivastase bioaktiivsuse peamiste mehhanismide uurimiseks ka antioksüdatsiooniindeksit ning RANKL/RANK/TRAF6- indutseeritud PI3K/AKT ja NF-κB signaaliülekandeteid. .

2. Materjalid ja meetod

2.1. Taimsed materjalid ja ettevalmistused.

2015. septembril koguti Yongningi maakonnast kokku 30 kg Cistanche deserticola YC Ma varsi koordinaatidega 106.026597 ja 38.262816, Ningxia provints, Hiina. Rohu tuvastas dr Lin Dong (Ningxia Meditsiiniülikooli farmakognoosia osakond) ja vastavat isendit (nr 20150901) säilitati osakonnas farmatseutilise analüüsi kohta. Esiteks ekstraheeriti 30,0 kg pulbrilist C. deserticola't püstjahutiga, kasutades lahustina 70% etanooli; materjali ja lahusti suhe määrati 1:10 ja tagasijooksuaeg oli 2 tundi 3 korda. Seejärel ühendati kõik filtraadid ja kondenseeriti alandatud rõhul temperatuuril 60 °C. Teiseks kasutati eeleraldamiseks makropoorset vaigukolonne AB-8 ja etanooli vees erinevas vahekorras (0%, 20%, Elueerimiseks kasutati 30%, 40%, 50% ja 60%, kumbki 60 l). Kolmandaks ühendati 40% ja 50% eluendid ja puhastati täiendavalt, kasutades korduvaid AB-8 makropoorseid vaigukolonne eluentide 0%, 20%, 30%, 40% ja 50% etanooliga vees ja iga eluent oli 12 l. Lõpuks koguti 40% fraktsioon ja kondenseeriti alandatud rõhul, saades 150 g C. deserticola kahvatukollase sette fenüületanoidglükosiidi fraktsiooni (CDP, saagis oli 0,5%). In vivo katsetes kasutati CDP lahustamiseks 0,5% CMC-Na lahustit; suukaudseks manustamiseks loomadele määrati 1 ml 100 g kehamassi kohta; in vitro Western blot analüüsi jaoks lahustati CDP DMSO-ga ja lahjendati seejärel DMEM-ga, et saada lõppkontsentratsioonid 0,1 mg/ml, 0,01 mg/ml ja 0,001 mg/ml.

2.2. Kemikaalid ja lahustid.

Östradioolvaleraat (EV) pärines Delpharm Lille SAS-ist Prantsusmaalt; aluseline fosfataas (ALP),luu gla-proteiin(BGP), tartraadiresistentse happelise fosfataasi (TRAP) ja desoksüpüridinoliini (DPD) ristsidemete ELISA komplektid firmalt Xinyu Biological Engineering Co. Ltd., Shanghai, Hiina, 201605; malondialdehüüdi (MDA, 20181221), superoksiiddismutaasi (SOD, 20121218) ja glutatiooni (GSH, 20181221) reaktiivide komplektid Nanjing Jianchengi bioloogilise tehnika instituudist, Nanjing, Hiina; lntact parathormoon (l-PTH, NEWASHE7UZ), kaltsitoniin (2L9ISN7AIU) ja östrogeeniga seotud retseptori alfa (ERR, Y3AY8QEWB3) ristsiduvad ELISA komplektid firmalt Elabscience Biotechnology Co. Ltd., Wuhan, Hiina; katepsiin K ELISA reaktiivikomplekt firmalt BioVision, Ameerika, 1l300141; RANKL (GR3193842-5), RANK (AA02113656), TRAF6 (2), c-Fos (AG12059411), NFAT2 (AO11015648), NF-κBp65 (AH04138226), PI3 alfa1AC6, PI3 alfa1AC09, PI3 alfa1AC09 primaarsed antikehad AKT 1 (AF05173234), -aktiin (17AV0411) ja mädarõika peroksidaasiga konjugeeritud kitse küülikuvastase IgG sekundaarsed antikehad firmalt ZSGB-BIO, Hiina, 136080; kogu BCA valgu analüüsikomplekt ja kaubanduslik komplekt luude oklastide moodustumise ja veise loote seerumi tuvastamiseks ning Dulbecco modifitseeritud Eagle'i sööde (DMEM) firmast HyClone, Logan, UT, USA; polüvinülideenfluoriidi (PVDF) membraan firmalt Millipore Life Sciences, Billerica, MA, USA; penitsilliini ja streptomütsiini firmalt Gibco, Rockville, MD, USA. Kõik muud kasutatud keemilised ained olid AR-klassi.

2.3. CDP HPLC kvantifitseerimine.

CDP koostise tuvastamiseks ja kvantifitseerimiseks kasutati Agilent 1220 HPLC seadet. Kromatograafia tingimused olid järgmised: C18 kolonn (TSK-GEL, 4 6 I d × 250 mm, 5 μm); gradientelueerimine sisaldas lahusteid A (atsetonitriil) ja B (0,5% äädikhapet sisaldav vesi) (0-10 min: 17-20% A; 10-30 min: 20-25% A; ja 30-40 min: 25-30% A); tuvastamise lainepikkus oli 333 nm; ümbritseva õhu temperatuur; voolukiirus oli 1,0 ml/min; proovi süstimise maht oli 5 μL. Tuvastati kaheksa PhG ühendit, nimelt tsistanosiid F, ehhinakosiid, 6'-atsetüüllakteosiid, tsistanosiid C, tsistanosiid A, akteosiid, 2'-atsetüüllakteosiid ja isoakteosiid; kasutades vastavaid võrdlusaineid ja välist standardmeetodit, kvantifitseeriti ülaltoodud 8 PhG sisaldus HPLC analüüsiga (joonis 1).

Joonis 1: CDP HPLC sõrmejälg. Sellest fraktsioonist leiti kaheksa fenüületanoidglükosiidi ühendit ja kogusisalduseks määrati 50,7%. Ühendid ja nende sisaldused olid järgmised: (1) akteosiid F (3,6%), (2) ehhinakosiid (8,8%), (3) tsistanosiid A (5,0%), (4) akteosiid (13,3%), (5) isoakteosiid (3,3%), (6) akteosiid C (3,6%), (7) 2'-atsetüüllakteosiid (9,9%) ja (8) 6'-atsetüüllakteosiid (3,2%).

2.4. Loomkatsete protokoll.

Ningxia Meditsiiniülikooli loomkatsete keskusest saadi kokku 6 0 emast täiskasvanud Sprague-Dawley rotti vanuses 3 kuud ja kelle keskmine esialgne kehakaal oli umbes 234 ± 25 g. Rotte hoiti standardses spetsiifilises patogeenivabas keskkonnas, mis pidi kohanema 1 nädala jooksul. Seejärel anesteseeriti kõik rotid (kloraalhüdraat, 100 mg/kg, ip) või tehti võlts munasarjade eemaldamine (SHAM) või eemaldati kaks munasarja ja jagati seejärel juhuslikult 5 alarühma: neile manustati suukaudselt vehiikulit (0,5% CMC- Na) määrati mudelrühmaks (OVX), östradioolvaleraat (1 mg/kg/päevas) positiivseks rühmaks (EV) ja 60, 120 ja 240 mg/kg/päevas CDP madalaks (CDPL), keskmise (CDPM) ja kõrge (CDPH) annuste rühmad. Kõikidele rottidele manustati suukaudselt iga päev ja manustati 3 kuud, kusjuures annust kohandati iga 2 nädala järel, mis sõltus kogu kehamassi muutusest. Loomkatse viimasel päeval saadi 24-tunnine uriin, kasutades metaboolseid puure; seerum koguti tuimestatud rottide reiearterist; parem reieluu, sääreluu ja kõik elundid lõigati lahti ning säilitati edasiseks analüüsiks temperatuuril -80 kraadi C. Meie läbiviidud loomkatsed kiitis heaks Ningxia meditsiiniülikooli institutsionaalne loomade hooldamise ja kasutamise komitee.

2.5. Luu mineraaltiheduse määramine ja mikro-CT analüüs.

Esiteks kasutati iga roti parema reieluu luu mineraalse kogutiheduse hindamiseks kahe energiaga röntgenikiirguse absorptiomeetria aparaati (Lunar, USA); teiseks kasutati sama reieluu trabekulaarse luu mikroarhitektuuri 3D-kujutise hindamiseks mikro-CT-skanneri abil (GE, Ameerika). Ideaalse 3D-pildi saamiseks määrati isotroopseks eraldusvõimeks 14 μm; huvipakkuv piirkond (ROI) valiti, määrates iga proovi reieluu kasvuplaadis samad koordinaadid; ja luu morfomeetrilised parameetrid, sealhulgas trabekulaarne eraldumine (Tb.Sp), trabekulaarne arv (Tb.N), trabekulaarne paksus (Tb. Th), luu mineraalide sisaldus (BMC), koe mineraalne tihedus (TMD) ja koe mineraalide sisaldus (TMC). ) saadi ROI analüüsimisel.

2.6. Seerumi ja uriini biokeemiline analüüs.

Seerumi katepsiin K, TRAP, SOD ja GSH aktiivsus, samuti seerumi PTH, kaltsitoniini, ERR , MDA, BGP ja uriini DPD sisaldus määrati vastavate reaktiivikomplektide abil vastavalt tootja juhistele ja Leeliselise fosfataasi (ALP) taset ning seerumi ja uriini kaltsiumi (Ca) ja fosfori (P) sisaldust hinnati automaatse masina (Ciba-Corning 550 Diag nostics Corp., Oberlin, OH, USA) abil.

2.7. Western blot analüüs.

Osteoklastid indutseeriti, kasutades RAW 264.7 rakke, millele oli lisatud makrofaagide kolooniaid stimuleerivat faktorit (MCSF) ja RANKL-i. Lühidalt, 1 × 107 RAW 264.7 rakku kultiveeriti 6-süvendiga plaadil 30 ng/mL MCSF ja 25 ng/ml RANKL juuresolekul. Pärast 6-päevast induktsiooni identifitseeriti küpsed osteoklastirakud TRAP-värvimise meetodil ja vastava komplektiga, seejärel töödeldi neid CDP-ga (0,1, 0,01 ja 0,001 mg/ml). vastavalt) 24 tundi; seejärel lüüsiti rakud lüüsipuhvriga, mis sisaldas 0,5 mmol fenüülmetüülsulfonüülfluoriidi, proteaasi ja fosfataasi inhibiitoreid. Lüsaat eraldati seejärel 10% SDS-PAGE abil ja kanti üle PVDF membraanile, mida sondeeriti AKT1, NF-κB-p65, RANKL, PI3K p85, RANK, NFAT2, TRAF6, c-Fos ja -aktiiniga ( 1 : 400) pärast blokeerimist 5% rasvavaba piimaga 2 tundi. Samad membraanid eemaldati ja sondeeriti uuesti vastavalt ülaltoodud 9 vastava antikehaga, seejärel tuvastati need lõpus Image Labi tarkvaraga. Katseid korrati kolm korda.

2.8. Statistiline analüüs.

Kõiki in vivo ja in vitro katsetest saadud andmeid, mida kirjeldati kui keskmine ± SD, analüüsiti ühesuunalise ANOVA abil, millele järgnes Dunnetti testi (SPSS 22.0 tarkvara, SPSS, USA); p < 0 05 oli statistiliselt oluline.

Wecistanche'i tugiteenus

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Lisateabe saamiseks ostke:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-pood