Cistanche Deserticolast eraldatud fenüületanoidglükosiidi kogufraktsiooni kasulikud mõjud luu mikrostruktuurile rottidel, kellel on munasarjade eemaldamine

1. Sissejuhatus

Menopausijärgne osteoporoos, mille all kannatab iga kolmas üle 50-aastane naine, on muutumas peamiseks terviseriskiks, mis mõjutab enam kui 200 miljonit naist kogu maailmas [1]. Menopausi ajal põhjustab östrogeeni taseme järsk langus tavaliselt suurenenud osteoklastogeneesist põhjustatud luu resorptsiooni ületamist; siis on tasakaal osteoblastide põhjustatud luu moodustumise ja osteoklastide poolt indutseeritud luu resorptsiooni vahel häiritud ja kiirenebluu resorptsioonlõpuks põhjustas osteoporoosi ja isegi puusaluu või lülisamba murru [2]. Usuti, et osteoklastide diferentseerumine vallandas siis, kui tuumafaktori kappa B (RANK) retseptori aktivaator seondus RANKL-iga, RANK-i ligandiga. RANK-i ja RANKL-i kombinatsiooni ei saa aga aktiveerida, välja arvatud juhul, kui sellega on ühendatud valgu kasvaja nekroosifaktori retseptoriga seotud faktor 6 (TRAF6) [3], millele järgneb allavoolu signaaliradade, sealhulgas PI3K/AKT ja NF-κB, stimuleerimine. Lõpuks reguleeriti aktiveeritud T-rakkude c2 (NFAT2) ja c-Fos tuumafaktori ekspressioone [4], et moduleerida osteoklastide diferentseerumist ja luu resorptsiooni. Seega arvati, et osteoklastide aktiveerimise ja diferentseerumisega otseselt või kaudselt seotud tegurid ja regulaatorid on luuhõrenemise vältimise olulised sihtmärgid. On tõepoolest olemas mõned kliinilised ja sünteetilised hormoonasendusravi ravimid, nagu östradioolvaleraat, mis on menopausijärgse osteoporoosi ravis tõhusad. Kahjuks suurendasid mõned neist tõsiste vähivormide, sealhulgas rinna- ja endomeetriumivähi [5] riski, mis piiras nende kliinilist rakendust. Seetõttu on vaja valida teisi alternatiive, millel on nii tõhusus kui ka minimaalsed kõrvalmõjud. Traditsioonilised hiina ravimid (TCM), samuti isoleeritud bioaktiivsed ühendid ja fraktsioonid [6–9] osutusid tõhusaks mitmesuguste haiguste, sealhulgas menopausijärgse osteoporoosi korral. Nende bioaktiivsete komponentide ja fraktsioonide hulgas arvati, et potentsiaalse efektiivsusega fenüületanoidglükosiidi (PhG) ühendeid on paljulubavad ained osteoporoosi ravis [10–12]. PhG-de struktuurid koosnevad kaneelhappe aglükoonist, hüdroksüülfenüületüülrühmast, mis on glükosiidsideme kaudu ühendatud -glükopüranoosi, apioosi, galaktoosi, ramnoosi või ksüloosiga. Neid leidub laialdaselt perekonna Cistanche meditsiiniliikides [13]. Cistanche deserticola YC Ma on ametlik TCM, mis on registreeritud Hiina farmakopöas ja lisaks sellele, et C.deserticola on oluline TCM [14], on see ka väheste kõrvalmõjudega vananemisvastane tooniktaim, millest on välja töötatud meditsiiniline liköör ja toitevedelik. riiklik toidu- ja ravimiamet. Hiina farmakopöa andmetel kasutasid põliselanikud C. deserticola't traditsiooniliselt neeruessentsi puudulikkusega seotud probleemide, nagu lihaste nõrkus ja nimmepiirkonna nõrkus, ning fenüületanoidglükosiidiühendeid, sealhulgasehhinakosiidja akteosiid on selle ürdi peamised bioaktiivsed koostisosad. Vastavalt TCM-i teooriale "neer-valitseb luu" juhib luusüsteemi neeru olemus [15] ja luudega seotud probleeme, nagu osteoporoos, saab ravida ravimtaimede või ühenditega, millel on neeruessentsi toitmine. Seetõttu püstitasime hüpoteesi, et C. deserticolast eraldatud fenüületanoidglükosiidi kogufraktsioon oli vähemalt osaliselt kasulik osteoporoosi ravis. Seetõttu töötati käesolev katse välja meie hüpoteesi kinnitamiseks, kasutades munasarjade eemaldamise (OVX) rotimudelit; Lisaks luu resorptsiooni ja moodustumise markeritele, mida tuleb hinnata, kasutati osteoporoosivastase bioaktiivsuse peamiste mehhanismide uurimiseks ka antioksüdatsiooniindeksit ning RANKL/RANK/TRAF6- indutseeritud PI3K/AKT ja NF-κB signaaliülekandeteid. .

2. Materjalid ja meetod

2.1. Taimsed materjalid ja ettevalmistused.

2015. septembril koguti Yongningi maakonnast kokku 30 kg Cistanche deserticola YC Ma varsi koordinaatidega 106.026597 ja 38.262816, Ningxia provints, Hiina. Rohu tuvastas dr Lin Dong (Ningxia Meditsiiniülikooli farmakognoosia osakond) ja vastavat isendit (nr 20150901) säilitati Ameerika Ühendriikide osakonnas. Farmatseutiline analüüs. Esiteks ekstraheeriti 30,0 kg pulbrilist C. deserticola't püstjahutiga, kasutades lahustina 70% etanooli; materjali ja lahusti suhe määrati 1:10 ja tagasijooksuaeg oli 2 tundi 3 korda. Seejärel ühendati kõik filtraadid ja kondenseeriti alandatud rõhul temperatuuril 60 °C. Teiseks kasutati eeleraldamiseks makropoorset vaigukolonne AB-8 ja etanooli vees erinevas vahekorras (0%, 20%, Elueerimiseks kasutati 30%, 40%, 50% ja 60%, kumbki 60 l). Kolmandaks ühendati 40% ja 50% eluendid ja puhastati täiendavalt, kasutades korduvaid AB-8 makropoorseid vaigukolonne eluentide 0%, 20%, 30%, 40% ja 50% etanooliga vees ja iga eluent oli 12 l. Lõpuks koguti 40% fraktsioon ja kondenseeriti alandatud rõhul, saades 150 g C. deserticola kahvatukollase sette fenüületanoidglükosiidi fraktsiooni (CDP, saagis oli 0,5%). In vivo katsetes kasutati CDP lahustamiseks 0,5% CMC-Na lahustit; suukaudseks manustamiseks loomadele määrati 1 ml 100 g kehamassi kohta; in vitro Western blot analüüsi jaoks lahustati CDP DMSO-ga ja lahjendati seejärel DMEM-ga, et saada lõppkontsentratsioonid 0,1 mg/ml, 0,01 mg/ml ja 0,001 mg/ml. 

LOODUSLIK CISTANŠE ekstrakt LUUDE KASVUKSFENÜÜLETANOIDGLYKOSIIDID 75% EHHINAKOSIID 30% AKTEOSIID 12%

2.2. Kemikaalid ja lahustid.

Östradioolvaleraat (EV) pärines Delpharm Lille SAS-ist Prantsusmaalt; aluselise fosfataasi (ALP), luu gla-valgu (BGP), tartraadiresistentse happelise fosfataasi (TRAP) ja desoksüpüridinoliini (DPD) ristsidemete ELISA komplektid ettevõttelt Xinyu Biological Engineering Co. Ltd., Shanghai, Hiina, 201605; malondialdehüüdi (MDA, 20181221), superoksiiddismutaasi (SOD, 20121218) ja glutatiooni (GSH, 20181221) reaktiivide komplektid Nanjing Jianchengi bioloogilise tehnika instituudist, Nanjing, Hiina; lntact parathormoon (l-PTH, NEWASHE7UZ), kaltsitoniin (2L9ISN7AIU) ja östrogeeniga seotud retseptori alfa (ERR, Y3AY8QEWB3) ristsiduvad ELISA komplektid firmalt Elabscience Biotechnology Co. Ltd., Wuhan, Hiina; katepsiin K ELISA reaktiivikomplekt firmalt BioVision, Ameerika, 1l300141; RANKL (GR3193842-5), RANK (AA02113656), TRAF6 (2), c-Fos (AG12059411), NFAT2 (AO11015648), NF-kB p65 (AH04138226), PI3 alfa1AC95 (p26638226), PI3 alfa1AC95 (p26AC085) primaarsed antikehad (AG12059411) , AKT 1 (AF05173234), -aktiini (17AV0411) ja mädarõika peroksidaasiga konjugeeritud kitse küülikuvastase IgG sekundaarsed antikehad firmalt ZSGB-BIO, Hiina, 136080; kogu BCA valgu analüüsikomplekt ja kaubanduslik komplekt luude oklastide moodustumise ja veise loote seerumi tuvastamiseks ning Dulbecco modifitseeritud Eagle'i sööde (DMEM) firmast HyClone, Logan, UT, USA; polüvinülideenfluoriidi (PVDF) membraan firmalt Millipore Life Sciences, Billerica, MA, USA; penitsilliini ja streptomütsiini firmalt Gibco, Rockville, MD, USA. Kõik muud kasutatud keemilised ained olid AR-klassi.

2.3. CDP HPLC kvantifitseerimine.

CDP koostise tuvastamiseks ja kvantifitseerimiseks kasutati Agilent 1220 HPLC seadet. Kromatograafia tingimused olid järgmised: C18 kolonn (TSK-GEL, 4.6.id × 250 mm, 5 μm); gradientelueerimine sisaldas lahusteid A (atsetonitriil) ja B (0,5% äädikhapet sisaldav vesi) (0-10 min: 17-20% A; 10-30 min: 20-25% A; ja 30-40 min: 25-30% A); tuvastamise lainepikkus oli 333 nm; ümbritseva õhu temperatuur; voolukiirus oli 1,0 ml/min; proovi süstimise maht oli 5 μL. Tuvastati kaheksa PhG ühendit, nimelt tsistanosiid F, ehhinakosiid, 6'-atsetüüllakteosiid, tsistanosiid C, tsistanosiid A, akteosiid, 2'-atsetüüllakteosiid ja isoakteosiid; kasutades vastavaid võrdlusaineid ja välist standardmeetodit, kvantifitseeriti ülaltoodud 8 PhG sisaldus HPLC analüüsiga (joonis 1).

Joonis 1: CDP HPLC sõrmejälg. Sellest fraktsioonist leiti kaheksa fenüületanoidglükosiidi ühendit ja kogusisalduseks määrati 50,7%. Ühendid ja nende sisaldused olid järgmised: (1) akteosiid F (3,6%), (2) ehhinakosiid (8,8%), (3) tsistanosiid A (5,0%), (4) akteosiid (13,3%), (5) isoakteosiid (3,3%), (6) akteosiid C (3,6%), (7) 2'-atsetüüllakteosiid (9,9%) ja (8) 6'-atsetüüllakteosiid (3,2%).

2.4. Loomkatsete protokoll.

Ningxia Meditsiiniülikooli loomkatsete keskusest saadi kokku 6 0 emast täiskasvanud Sprague-Dawley rotti vanuses 3 kuud ja kelle keskmine esialgne kehakaal oli umbes 234 ± 25 g. Rotte hoiti 1 nädala jooksul standardses spetsiifilises patogeenivabas keskkonnas, et kohaneda. Seejärel anesteseeriti kõik rotid (kloraalhüdraat, 100 mg/kg, ip) või tehti võlts munasarjade eemaldamine (SHAM) või eemaldati kaks munasarja ja jagati seejärel juhuslikult 5 alarühma: neile manustati suukaudselt vehiikulit (0,5% CMC- Na) määrati mudelrühmaks (OVX), östradioolvaleraat (1 mg/kg/päevas) positiivseks rühmaks (EV) ja 60, 120 ja 240 mg/kg/päevas CDP madalaks (CDPL), keskmise (CDPM) ja kõrge (CDPH) annuste rühmad. Kõikidele rottidele manustati suukaudselt iga päev ja manustati 3 kuud, kusjuures annust kohandati iga 2 nädala järel, mis sõltus kogu kehamassi muutusest. Loomkatse viimasel päeval saadi 24-tunnine uriin, kasutades metaboolseid puure; seerum koguti tuimestatud rottide reiearterist; parem reieluu, sääreluu ja kõik elundid lõigati lahti ning säilitati edasiseks analüüsiks temperatuuril -80 C kraadi. Meie läbiviidud loomkatsed kiitis heaks Ningxia meditsiiniülikooli institutsionaalne loomade hooldamise ja kasutamise komitee.

2.5. Luu mineraaltiheduse määramine ja mikro-CT analüüs.

Esiteks kasutati iga roti parema reieluu luu mineraalse kogutiheduse hindamiseks kahe energiaga röntgenikiirguse absorptiomeetria aparaati (Lunar, USA); teiseks kasutati sama reieluu trabekulaarse luu mikroarhitektuuri 3D-kujutise hindamiseks mikro-CT-skanneri abil (GE, Ameerika). Ideaalse 3D-pildi saamiseks määrati isotroopseks eraldusvõimeks 14 μm; huvipakkuv piirkond (ROI) valiti, määrates iga proovi reieluu kasvuplaadis samad koordinaadid; ja luu morfomeetrilised parameetrid, sealhulgas trabekulaarne eraldumine (Tb.Sp), trabekulaarne arv (Tb.N), trabekulaarne paksus (Tb.Th), luu mineraalide sisaldus (BMC), koe mineraaltihedus (TMD) ja koe mineraalide sisaldus (TMC). ) saadi ROI-d analüüsides.

Joonis 2: OVX ja 12-nädalase ravi CDP või EV-ga mõjud kogu luu mineraaltihedusele rottide paremas reieluus, mida hinnati kahe energiaga röntgenikiirguse absorptiomeetria abil (n=10/rühm). Andmed esitati kui keskmine ± SD; ∗p < 0 05, ∗∗p < 0 01 ja ∗∗∗p < 0 001 versus OVX rühm; ###p < 0 001 versus SHAM-rühm.

Joonis 3: CDP-ga töödeldud rottide parema reieluu mikroarhitektuuri mikro-CT-skaneeringud; näidatud fotod esindasid igas rühmas 4 erinevat rotti: (A) OVX rühm; (B) SHAM-rühm; (C) EV rühm; (D) CDPH rühm; (E) CDPM rühm; (F) CDPL rühm. Mõõdetud parameetrid hõlmavadluu mineraalainete sisaldus(BMC), koe mineraalide sisaldus (TMC), koe mineraalne tihedus (TMD), trabekulaarne eraldumine (Tb.Sp), trabekulaarne arv (Tb.N) ja trabekulaarne paksus (Tb.Th). OVX rotid väljendasid mikroarhitektuuri pindala ja trabekulaarse arvu märkimisväärset vähenemist. CDP-ga ravitud rotid ja EV-ga ravitud rotid muutsid pärast 12-nädalast ravi ülalnimetatud leiud osaliselt samal määral ümber. Kõik väärtused esitati kui keskmine ± SD. ∗p < 0 05, ∗∗p < 0 01 ja ∗∗∗p < 0 001 versus OVX rühm; ###p < 0 001 versus SHAM-rühm.

Joonis 4: OVX ja 12-nädalase ravi CDP või EV-ga mõjud uriini ja seerumi Ca ja P sisaldusele, samuti PTH-le ja kaltsitoniinile rottidel (n=10/rühm). Kõik andmed väljendati keskmisena ± SD. ∗p < 0 05, ∗∗p < 0 01 ja ∗∗∗p < 0 001 versus OVX rühm; # p < 0 05, ##p < 0 01 ja ###p < 0 001 versus SHAM-rühm.

2.6. Seerumi ja uriini biokeemiline analüüs.

Seerumi katepsiin K, TRAP, SOD ja GSH aktiivsus, samuti seerumi PTH, kaltsitoniini, ERR , MDA, BGP ja uriini DPD sisaldus määrati vastavate reaktiivikomplektide abil vastavalt tootja juhistele ja Leeliselise fosfataasi (ALP) taset ning seerumi ja uriini kaltsiumi (Ca) ja fosfori (P) sisaldust hinnati automaatse masina (Ciba-Corning 550 Diagnostics Corp., Oberlin, OH, USA) abil.

2.7. Western blot analüüs.

Osteoklastid indutseeriti, kasutades RAW 264.7 rakke, millele oli lisatud makrofaagide kolooniaid stimuleerivat faktorit (MCSF) ja RANKL-i. Lühidalt, 1 × 107 RAW 264.7 rakku kultiveeriti 6-süvendiga plaadil 30 ng/mL MCSF ja 25 ng/ml RANKL juuresolekul. Pärast 6-päevast induktsiooni identifitseeriti küpsed osteoklastirakud TRAP-värvimise meetodil ja vastava komplektiga, seejärel töödeldi neid CDP-ga (0,1, 0,01 ja 0,001 mg/ml). vastavalt) 24 tundi; seejärel lüüsiti rakud lüüsipuhvriga, mis sisaldas 0,5 mmol fenüülmetüülsulfonüülfluoriidi, proteaasi ja fosfataasi inhibiitoreid. Lüsaat eraldati seejärel 10% SDS-PAGE abil ja kanti üle PVDF membraanile, mida sondeeriti AKT1, NF-κB-p65, RANKL, PI3K p85, RANK, NFAT2, TRAF6, c-Fos ja -aktiiniga ( 1 : 400) pärast blokeerimist 5% rasvavaba piimaga 2 tundi. Samad membraanid eemaldati ja sondeeriti uuesti vastavalt ülaltoodud 9 vastava antikehaga ning seejärel tuvastati need lõpus Image Labi tarkvaraga. Katseid korrati kolm korda.

2.8. Statistiline analüüs.

Kõiki in vivo ja in vitro katsetest saadud andmeid, mida kirjeldati kui keskmine ± SD, analüüsiti ühesuunalise ANOVA abil, millele järgnes Dunnetti testi (SPSS 22.0 tarkvara, SPSS, USA); p < 0 05 oli statistiliselt oluline.

3. Tulemused

3.1. CDP keemiline koostis.

HPLC meetodit kasutades kaheksafenüületanoidglükosiidühendidleiti selles fraktsioonis, nagu näitab joonis 1. Standardviiteid ja välisstandardi meetodit kasutades identifitseeriti ja kvantifitseeriti ühendid ja nende sisaldused järgmiselt: (1) akteosiid F (3,6%), (2) ehhinakosiid (8,8%), (3)tsistanosiidA (50%), (4) akteosiid (13,3%), (5) isoakteosiid (3,3%), (6) akteosiid C (3,6%), (7) 2'-atsetüülakteosiid (9,9%) ) ja (8) 6'-atsetüüllakteosiid (3,2%). Nende kaheksa komponendi kogusisalduseks määrati 50,7%.

LOODUSLIK TUUB TASTANŠI EKSTRAKTLUUDE KASVUKSFENÜÜLETANOIDGLYKOSIIDID 75% EHHINAKOSIID 30% AKTEOSIID 12%

3.2. CDP mõju luu mineraalsele tihedusele ja trabekula mikroarhitektuurile.

Erinevate alarühmade rottide luude kogutihedus on näidatud joonisel 2. OVX-mudeli operatsiooni rottidel täheldati luu mineraalse tiheduse sisalduse vähenemist võrreldes SHAM-rühma rottidega (p < {{ 1}}). Kõigil CDP-ga ravitud rottidel suurenes luu mineraalne tihedus vastavalt 11,2%, 120% ja 10,7% (p < 0 01), võrreldes OVX mudelirühma rottidega. Lisaks näitasid mikro-CT rekonstrueerimine ja reieluu histomorfomeetriline määramine kooskõlas luude mineraaltiheduse andmetega, et OVX-rühma rottidel ilmnes trabekulaararhitektuuri ilmselge halvenemine, mida tõendab trabeekulite arvu ja pindala märkimisväärselt vähenemine. samuti märkimisväärselt suurenenud Tb.Sp võrreldes SHAM-rühma rottidega. Ravi CDP-ga hoidis ära OVX-i põhjustatud trabekulaarse arhitektuuri halvenemise; nagu jooniselt 3 on näha, suurenesid BMC, TMC ja Tb.N väärtused märkimisväärselt ning Tb.Sp pindala vähenes märkimisväärselt, samas kui OVX-operatsioon ja meie funktsioon tundus, et TMD ja Tb.Th väärtusi ei mõjutanud oluliselt CDP sekkumine.

Joonis 5: OVX ja 12-nädalase ravi CDP või EV-ga mõjud seerumi TRAP-i, katepsiin K, DPD, ALP ja BGP aktiivsusele OVX rottidel (n=10/rühm). Kõik väärtused esitati kui keskmine ± SD. ∗p < 0 05, ∗∗p < 0 01 ja ∗∗∗p < 0 001 versus OVX rühm; # p < 0 05, ##p < 0 01 ja ###p < 0 001 versus SHAM-rühm.

3.3. CDP mõju uriini ja seerumi biokeemilistele parameetritele.

Nagu jooniselt 4 on näha, tuvastati OVX-i mudelirühma rottidel uriini P taseme ja seerumi kaltsitoniinisisalduse olulise vähenemise trendid, mis olid peaaegu 30% ja 60% vähem kui SHAM-rottidel (p < 0 001 ), samas kui OVX-i ja SHAM-rühmade vahel ei täheldatud Ca ja seerumi Ca, samuti seerumi P ja seerumi PTH selgeid suurenevaid või vähenevaid suundumusi. CDP-ga töötlemine hoidis märkimisväärselt ära seerumi P ja Ca kaotuse OVX rottidel, mida tõendab seerumi P ja Ca märkimisväärselt ülesreguleeritud tase (p < 0 05) võrreldes OVX mudelrühma rottidega. Lisaks täheldati nii CDP madala kui ka suure annuse rühmas kaltsitoniini suurenenud, kuid mittestatistiliselt olulisi suundumusi võrreldes OVX mudelirühmaga.

Joonis 6: OVX ja 12-nädalase CDP või EV-ga ravi mõju ERR-i ekspressioonile, kehakaalule ning rottide emaka ja tupe massile (n=10/rühm). Andmed on esitatud kui keskmine ± SD. ∗p < 0 05, ∗∗p < 0 01 ja ∗∗∗p < 0 001 versus OVX rühm; ###p < 0 001 versus SHAM-rühm.

3.4. CDP mõju luude moodustumisele ja luu resorptsiooni markeritele.

CDP kasulik mõju luu moodustumise indeksile, samuti inhibeerimine mõjutabluu resorptsioonmarkereid on kirjeldatud joonisel 5. Mis puudutab luu moodustumise markereid, siis seerumi BGP taset munasarjade eemaldamise operatsioon peaaegu ei mõjutanud, mida tõendasid kõigis ravitud rühmades täheldatud ebaolulised muutused, samas kui seerumi ALP statistiliselt oluline paranemine saavutati nii madalatel (6) CDP sekkumisrühmade 0 mg/kg) ja mõõdukad (120 mg/kg) annused, võrreldes SHAM-rühma rottidega (p < 0 01). Mis puutub luu resorptsiooniindeksisse, siis seerumi katepsiin K ja DPD, samuti TRAP tasemed OVX-i mudelirühma rottidel suurenesid SHAM-rottidega võrreldes oluliselt vastavalt ligikaudu 75,0%, 41,4% ja 21,0%. ja kui raviti CDP-ga, eriti väikese annusega 60 mg/kg, inhibeeriti katepsiin K ja DPD ning TRAP-i omadused OVX mudelirühmas märkimisväärselt, vastavalt 67,3%, 41,4% ja 25,9%. võrreldes OVX mudelirühma rottidega.

LOODUSLIK TORU CISTANŠE LUUKASVUKSFENÜÜLETANOIDGLYKOSIIDID 75% EHHINAKOSIID 30% AKTEOSIID 12%

3.5. CDP mõju vagiinale ja emakale ning kogu kehamassile.

Kuues rühmas täheldati enne ravi mitteolulisi erinevusi rottide esialgses kogukeha massis (joonis 6). Munasarjade eemaldamise operatsioon tõi aga kaasa OVX-i mudelirühma rottide lõpliku kehamassi olulise suurenemise, mis on peaaegu 36.0%, samas kui emaka ja tupe märgkaal vähenes drastiliselt peaaegu 9{{4} }.0% ja 60,0% vastavalt, võrreldes SHAM-rottidega (p < 0 001). Kuigi ERR-i sisaldus ei näidanud olulist erinevust OVX-i ja SHAM-i rühmade vahel, suurendasid kõik ravirühmad, sealhulgas CDP ja EV, oluliselt ERR-i taset. Veelgi enam, EV-ga ravimisel suurenesid ülalnimetatud OVX rottide kogu kehamass, samuti tupe ja emaka kaalu kaotus osaliselt (p < 0 001), kuid CDP sekkumine ei mõjutanud neid.

3.6. CDP mõju seerumi MDA, SOD ja GSH tasemele.

Seerumi SOD ja GSH omadustes ei esinenud statistiliselt olulist erinevust SHAM ja OVX mudelirühmade vahel; nagu kirjeldab joonis 7, võib ülaltoodud kahe rühma vahel täheldada GSH kasvutendentsi. Lisaks oli OVX-i mudelirühma rottidel seerumi MDA tase järsult ülesreguleeritud peaaegu 50% võrra, võrreldes SHAM-rottidega. CDP-ravi SOD aktiivsust ei mõjutanud, samas kui CDP sekkumine parandas oluliselt GSH omadusi ning CDP vähendas märkimisväärselt MDA taset vastavalt 33,9% ja 42,4% vastavalt annustele 60 ja 240 mg/kg. p < 0 001).

3.7. CDP mõju valgu ekspressioonitasemetele.

Meie andmed, mis on näidatud joonisel 8, näitasid, et CDP-ravi vähendas oluliselt TRAF6, RANK ja RANKL valgu taset võrreldes kontrolliga. Allavoolu signaaliteed, sealhulgas NF-κB, suruti alla ja PI3K / AKT stimuleeriti CDP sekkumisega, mida tõendab NF-κB-p65 allareguleerimise ekspressioon, samas kui PI3K p85 ja AKT1 olid ülesreguleeritud. Järelikult vähenes NFAT2 ekspressioon oluliselt ja c Fos suurenes pärast töötlemist CDP-ga kontsentratsioonil 0.001-0,1 mg/ml. Soovitatud mehhanismi on kirjeldatud joonisel 9, kus CDP reguleeris RANKL-i ja RANK-i tasemeid alla, vähendades selle ligandi seondumiskoguseid selle retseptoriga. RANKL-i ühendust RANK-iga vähendas veelgi TRAF6 allareguleerimine, millele järgnes allavoolu radade, sealhulgas NF-κB raja allasurumine. Seevastu stimuleeriti PI3K / AKT signaali rada, mis lõpuks viis NFAT2 ekspressiooni vähenemiseni ja c-Fos taseme tõusuni.

4. Arutelu

Fenüületanoidglükosiididon looduslikult esinevad vees lahustuvad komponendid, mida leidub ravimtaimeriigis laialdaselt [11]. Siiani on fenüületanoidglükosiidide ühendid meelitanud üha rohkem teadlasi, kuna neil on ilmne roll mitmesuguste inimeste tervisehäirete ja kõrvalekallete ravis [13]. Kümnetest looduslikest ravimtaimedest tuvastati ja eraldati osteoporoosivastaste bioaktiivsete fraktsioonide ja ühendite arv, sealhulgas polüfenool- ja fenüületanoidglükosiidid [5, 10, 12, 16, 17].

Joonis 8: CDP erinevate kontsentratsioonide mõju TRAF6 (a), RANKL (b), RANK (c), PI3K (d), AKT (e), NF-κBIA (f), NFAT2 (g) valgu ekspressioonidele, ja c-Fos (h) (n=3/rühm); valgu ekspressioon normaliseeriti -aktiiniks ja iga signaalvalgu kvantitatiivsed andmed esitati protsentides kontrolli väärtusest. Andmeid kirjeldati kui keskmine ± SD. ∗p < 0 05, ∗∗p < 0 01 ja ∗∗∗p < 0 001 võrreldes kontrollrühmaga.

C. deserticola on hästi tuntud kui "kõrbe ženšenn", mis viitab selle söödava TCM-i ohutusprofiilile [18, 19]. Üldise toonilise ürdi ja loodusliku tervisetoiduna, mida on Aasia riikides pikka aega kasutatud, oli C. deserticola kasulik neerude tugevuse suurendamisel. Leiti, et TCM-i, mida traditsiooniliselt kasutatakse neeruessentsi turgutamiseks ja säilitamiseks, kasutati tavaliselt osteoporoosi raviks. Nii in vitro kui ka in vivo avaldatud andmed on tõestanud C. deserticola antiosteoporootilist toimet [20–23], ja fenüületanoidglükosiidkomponendid, sealhulgas ehhinakosiid ja akteosiid, on selle söödava ravimtaime peamised bioaktiivsed komponendid; kõik need viitasid sellele, et mitte ainult ehhinakosiidi ja akteosiidi ennast, vaid ka teisi C. deserticola's sisalduvaid fenüületanoidglükosiidi komponente peeti vastutavaks selle ürdi osteoporoosivastase omaduse eest. Meie käesolevas uuringus kasutati C. deserticola fenüületanoidglükosiidi fraktsiooni eraldamiseks ja rikastamiseks soodsat ohutust makropoorset vaiku ning HPLC meetodil kaheksa peamist fenüületanoidglükosiidi komponenti, nimelt akteosiid F, ehhinakosiid, tsistanosiid A, Isoleeritud fenüületanoidglükosiidi fraktsioonist leiti akteosiid, isoakteosiidi, akteosiid C, 2'-atsetüüllakteosiidi ja 6'-atsetüülakteosiidi ning nende sisaldus oli 3,6%, 8,8%, 5,0%, 13,3%, 3,3%, 3. vastavalt 9,9% ja 3,2%. On tõestatud, et ehhinakosiidil, mis on üks peamisi C. deserticola registreeritud toimeaineid [14], on osteoporoosivastane toime; 270 mg/kg annus oli aga nii suur, et piiras selle edasist kliinilist kasutamist [24]. Praegustes katsetes kasutati OVX rottidel fenüületanoidglükosiidi kogufraktsiooni väiksema annusega 60-240 mg/kg kehamassi kohta päevas ja tuvastatud koostisosade sisaldus oli selles fraktsioonis peaaegu 50% puhtus, kasutades HPLC meetod.

Oli hästi teada, et OVX võib põhjustada osteoporoosi, ja OVX rotti peeti klassikaliseks ja sobivaks mudeliks inimese postmenopausaalse osteoporoosi simuleerimiseks. Samal ajal täheldati pärast munasarjade eemaldamise operatsiooni olulist luu mineraalse tiheduse, trabekulaarse luu mikroarhitektuuri, emaka ja tupe märgkaalude ning östrogeeni taseme langust, samuti luu resorptsiooni ja kehakaalu ilmset paranemist, millest osa östrogeeni kadumisest [25]. Meie senised andmed on selgelt näidanud, et OVX kutsus esile menopausijärgse osteoporoosi ja sellega kaasneb alati luu kvaliteedi, luu mikroarhitektuuri ning emaka ja tupe märgkaalu järsk langus. Kuna EV on üldine hormoonasendusaine, mida on kasutatud kliinilises praktikas, kasutati seda meie in vivo katses positiivse kontrollina ning kaalutõus ja atroofeerunud emakakaal, samuti halvenenud luu mineraalne tihedus ja trabekulaarse luu mikroarhitektuur. eeldatavasti vastupidine EV lisamine. Erinevalt positiivsest kontrollist ei mõjutanud CDP-ravi OVX-i mudelirühma rottide vähenenud tupe ja emaka kaalu, aga ka kogu kehamassi suurenemist, mis viitas sellele, et CDP võib suurendada luu moodustumist ilma kõrvaltoimeid esile kutsumata. keha ja emaka orgaanilistes kudedes. Kuigi CDP-ravi reguleeris ERR-i taset oluliselt üles, oli see täpselt nagu fütoöstrogeeni toime, et emaka ja tupe orgaanilistele kudedele ei täheldatud kõrvaltoimeid. Lisaks tugevdas CDP ravi oluliselt OVX rottide luu kvaliteeti, mis oli munasarjade eemaldamise operatsiooni tõttu halvenenud.

Lisaks kasutati osteoporoosivastase toime kajastamiseks ka P ja Ca taset OVX rottide uriinis ja seerumis ning Ca ja anorgaanilise P kontsentratsioonid sõltusid tavaliselt kaltsitoniini ja PTH tasemest [26]. Kuigi käesolevas uuringus ei täheldatud Ca uriiniga eritumise taseme olulist langust ega suurenemist,

Joonis 9. Hüpoteesitud molekulaarne mehhanism: CDP võib RANKL/RANK/TRAF6-indutseeritud NF-κB inaktiveerimise ja PI3K/AKT radade aktiveerimise ning c-Fos stimulatsiooni ja NFAT2 supressiooni kaudu ära hoida OVX roti luukadu , mida tõendab TRAF6, RANKL, RANK, NF-κBIA ja NFAT2 ekspressioonitasemete allareguleerimine, samas kui c-Fos, AKT ja PI3K olid CDP-raviga võrreldes kontrollrühmaga oluliselt ülesreguleeritud.

saadi seerumi P, seerumi Ca ja PTH OVX mudelrühma rottidel ning täheldati märkimisväärset P ja kaltsitoniini taset uriinis (p < 0 001). Kooskõlas avaldatud andmetega, et munasarjade eemaldamise operatsioonist põhjustatud östrogeenipuudus põhjustas alati kaltsitoniini taseme langust veres, viis seerumi kaltsitoniini vähenemine lõpuks PTH taseme tõusuni, kus Ca peeti PTH sekretsiooni peamiseks regulaatoriks. Kuna PTH kontsentratsioon ei näidanud käesolevas uuringus olulist erinevust OVX ja SHAM rühmade vahel, ei näidanud Ca tase nii seerumis kui ka uriinis ilmseid muutusi kahe ülaltoodud rühma vahel. Siiski saavutati kaltsitoniini taseme märkimisväärselt vähenenud tendents OVX ja SHAM rühmade vahel ning sellest tulenevalt vähenes P sisaldus OVX uriinis tugevalt. Usume, et ülaltoodud andmed võivad seletada vastuolulist nähtust, miks OVX rottide Ca taseme eritumine uriiniga ei näidanud ilmset muutust võrreldes SHAM-rottidega ning see nähtus võib olla seotud ka luude ringluse suurenenud kiirusega [27] . Pärast ravi CDP-ga oli P ja Ca tase seerumis märkimisväärselt ülesreguleeritud ning P sisaldus uriinis vähenes OVX rottidel, mis näitas, et CDP ei suutnud mitte ainult takistada luu mineraalsete elementide eritumist, vaid ka suurendada nende seerumisisaldust. elemendid, pärssides seega kaudselt luuhõrenemist.

Lisaks kasutati CDP aluseks olevate osteoporoosivastaste mehhanismide selgitamiseks ka luu moodustumise ja resorptsiooni markereid ning antioksüdantseid ensüüme, sealhulgas SOD ja GSH. Sarnaselt avaldatud andmetega näitas ALP tase OVX-i mudelirühma rottidel statistiliselt mitteolulist tõusutrendi, mis näitab luude ainevahetuse kiirenemist menopausijärgse osteoporoosi korral [10]. Kuid pärast ravi CDP-ga (60, 120 ja 240 mg/kg/päevas) paranes ALP omadus oluliselt. Oli hästi teada, et OVX põhjustas östrogeenitaseme järsu languse, mis tavaliselt põhjustab ülemäärast luu resorptsiooni ja oksüdatiivset stressi [28], mida tõendavad TRAP, katepsiin K ja DPD ning MDA tasemed, mis on märkimisväärselt ülesreguleeritud rottidel. OVX mudeligrupp. Kuid CDP sekkumine parandas neid halvenemisi osaliselt. Lisaks näitas OVX rottide ravi CDP-ga (60 ja 240 mg/kg) GSH aktiivsuse olulist suurenemist (p < 0 05). Ülaltoodud tulemused viitasid sellele, et CDP-l oli terapeutiline toime OVX-indutseeritud osteoporoosile ja need mõjud olid nii luu moodustumise suurendamise ja luu resorptsiooni pärssimise kui ka luu antioksüdantide süsteemi parandamise kaudu.

RANK-i aktiveerimine selle ligandiga RANKL stimuleeris NFAT2 ja c-Fos ekspressiooni PI3K/AKT ja NF-κB signaaliülekande kaudu [29]. NF-κB osutus osteoklastogeneesi jaoks oluliseks, kuna NF-κB katkestamine võib põhjustada osteoporoosi fenotüübiga osteoklastide diferentseerumise halvenemist ning NF-κB reguleeris üles c-Fos ja vähendas NFAT2 ekspressiooni RANKL / RANK / TRAF-i indutseeritud osteoklastogeneesi ajal. CDP kasuliku mõju hindamiseks NFAT2 ja c-Fos-vahendatud osteoklastogeneesile analüüsiti RANKL-i ja RANK-i ekspressioonitasemeid. Eeldatavasti inhibeeris CDP oluliselt NFAT2 ja stimuleeris c-Fos taset, vähendades RANKL-i ja RANK-i ekspressioone. Vahepeal puudus RANK-il endal sisemine kinaasi omadus, välja arvatud juhul, kui TRAF6 on sellega ühendatud, et käivitada allavoolu signaalimine [3]. CDP reguleeris ka TRAF6 ekspressiooni, mis viis RANKL-i ja RANK-i seondumiskoguste märkimisväärselt vähenemiseni. CDP oletatav osteoporoosivastane mehhanism OVX rottidel kattis ülaltoodud signalisatsiooniteid ja regulaatoreid on kirjeldatud joonisel 9. Lühidalt öeldes alandas CDP TRAF6, RANKL ja RANK taset, pärssides seega allavoolu signalisatsiooniteid, sealhulgas PI3K/AKT ja NF-κB, mis RANKL / RANK käivitab ja lõpuks vähendas peamiste osteoklastogeensete valkude NFAT2 ja c-Fos ekspressiooni ja aktiivsust. Seetõttu viitasid mitmed vihjed andmetele CDP kasulikule mõjule OVX rottide luu metabolismile peamiselt RANKL/RANK/TRAF{25}}vahendatud PI3K/AKT ja NF-κB radade kaudu.

5. Järeldus

Kokkuvõttes avaldas C. deserticolast eraldatud fenüületanoidglükosiidide kogusumma OVX rottide menopausijärgsele osteoporoosile märkimisväärset kasulikku mõju ning luukoe hõrenemise pärssimise terapeutiline potentsiaal tulenes peamiselt luu moodustumise stimuleerimisest ja luu resorptsiooni pärssimisest ning luu antioksüdantide parandamisest. süsteem; mehhanismid võivad olla seotud RANKL/RANK/TRAF{0}}indutseeritud NF-κB aktivatsiooni ja PI3K/AKT inaktiveerimisega, samuti c-Fos stimulatsiooni ja NFAT2 supressiooniga ning lõpuks inhibeeriti osteoklastide diferentseerumine.

LOODUSLIK TORU CISTANŠE LUUKASVUKSFENÜÜLETANOIDGLYKOSIIDID 75% EHHINAKOSIID 30% AKTEOSIID 12%