Tsüklooksügenaasi (COX-2) ja hüpoksiast põhjustatud haiguse vaheline seos

lisateabe saamiseks:ali.ma@wecistanche.com

Intratsellulaarne prostaglandiin E2 aitab kaasa hüpoksiast põhjustatud proksimaalse torukujulise rakusurma

Coral Garcia-Pastorl, Selma Benito-Martinez, Ricardo J. Bosch1, Ana B. Fernandez-Martinez, Francisco J. Lucio-Cazana

Proksimaalsed tubulaarsed rakud (PTC) on eriti tundlikud hüpoksiast põhjustatud apoptoosi suhtes, mis on oluline tegurneeruhaigus. Esitasime siin hüpoteesi, et hüpoksia korral PTC surma vahendab tsüklooksügenaasist (COX{1}}) sõltuv prostaglandiin E (PGE,) tootmine, mis leidis kinnitust inimese proksimaalsetes tubulaarsetes HK-2rakkudes, kuna hüpoksia (1% O,)-indutseeritud apoptoosi (i) takistas COX-2(cyclo)-oksügenaasi) inhibiitor ja prostaglandiini (EP) retseptorite antagonistid ning (ii) seostati intratsellulaarse PGE (iPGE) suurenemisega hüpoksiast indutseeritavast faktorist{1}}sõltuvast COX-i transkriptsioonilisest ülesreguleerimisest }}(cyclo-oksügenaas). Apoptoosi takistasid ka prostaglandiinide omastamise transporteri PGT inhibiitorid, mis näitasid, et iPGE aitab kaasa hüpoksiast põhjustatud apoptoosile (vastupidi, hüpoksiast / reoksügeenimisest põhjustatud PTC surm oli eranditult tingitud ekstratsellulaarsest PGE-st). Seega on iPGE hüpoksiast põhjustatud tubulaarse vigastuse patogeneesis uus osaleja ja PGT võib olla uus terapeutiline sihtmärk hüpoksiast sõltuvate kahjustuste ennetamiseks neeruhaiguste korral.

On hästi teada, et tubulaarne hüpoksia on oluline tegur nii ägeda kui ka kroonilise korralneeruhaigus"2 Proksimaalsed tubulaarsed rakud (PTC) on hapnikutarbimise seisukohalt väga aktiivsed, kuna neil on energianõudlik reabsorptsioonitegevus ja seetõttu on nad haavatavad hüpoksia suhtes. On näidatud, et apoptoos mängib olulist rolli hüpoksiaga kokkupuutunud kultiveeritud PTC-s, kuid apoptootilise masina aktiveerimise eest vastutavaid signalisatsiooniteid ei ole uuritud. Meie ja teised oleme leidnud, et prostaglandiin E (PGE), mis on paljude füsioloogiliste ja patoloogiliste protsesside oluline lipiidide vahendaja.neerud, mängib olulist rolli signaaliülekandes, mis viib PTC apoptoosini tsisplatiini7, albumiin8 või leptiini ja gentamütsiiniga töötlemisel. Kõigil juhtudel leiti, et PGE suurenemine sõltub tsüklooksügenaasi -2(COX-2) suurenenud ekspressioonist.(tsüklooksügenaas), indutseeritav ensüüm, mis koos COX{0}}l-ga on prostaglandiinide sünteesi kiirust piirav etapp. Inimesesneerud, basaal-COX-2(tsüklooksügenaas)väljendus on vähem intensiivne kui COX{0}}. COX-2(tsüklooksügenaas)on füsioloogilistes tingimustes tuvastatud podotsüütides ja Henle ahela osades ning neeruveresoonkonnas10. Patoloogiliste seisundite korral võib COX-2 immunoreaktiivsust siiski leida paljudes teistes rakutüüpides.neerudkaasa arvatud PTC, ja võib-olla aitab kaasa neerukahjustusele. Huvitaval kombel suurendab hüpoksia COX-i ekspressiooni-2(tsüklooksügenaas)ja/või PGE,{0}}i7 tootmine paljudes rakutüüpides. Tegelikult oleme varem leidnud, et hüpoksia suurendab PGE rakusisest sisaldust, samuti selle vabanemist rakuvälisesse söötmesse8. Seetõttu on teoreetiliselt võimalik, et PGE vahendab hüpoksia apoptootilist toimet PTC-le.

Enamik PGE-sõltuva apoptoosi uuringuid on põhiliselt keskendunud mehhanismidele, mis hõlmavad rakuvälist PGE-d, kuna on laialdaselt tunnustatud, et PGE avaldab oma bioloogilist mõju plasmamembraani hõlmavate G-valguga seotud PGE retseptorite (E-seeria prostaglandiini retseptorite) aktiveerimise kaudu. EP1-4)1. Sellegipoolest on mõne mudeli puhul intratsellulaarne PGE (iPGE) oluline apoptootilise rakusurma korral720-22. See tähendab, et apoptoosi esilekutsumiseks peab PGE uuesti jõudma rakusisesesse söötmesse ja aktiveerima EP retseptorite alamhulka, mis asuvad rakus (iEP retseptorid). Kuna PGE hõivamise ülesannet täidab peamiselt prostaglandiinide omastamise transporter (PGT)23-26, väldib PGT inhibeerimine iPGE-vahendatud apoptootilise rakusurma7.

Seda tausta arvesse võttes uurisime käesolevas töös, kas COX{0}}(tsüklooksügenaas)-sõltuv iPGE tõus, vahendab tase hüpoksiast põhjustatud apoptoosi PTC-s.

Klõpsake orgaanilise Cistanche neeruhaiguse jaoks

meetodid

Reaktiivid.

AG1478, Bromocresolgreen (BG), PGE, AH6809, GW627368X, kristallviolett, trüpaansinise lahused, bromosulfoftaleiin (BRS), 3-(5'-hüdroksümetüül2'-furüül)-1-bensüülindasool (YC1), ja aktinomütsiin D osteti firmalt Sigma (St. Louis, MO, USA). Z-VAD-FMK ja tselekoksiib pärinesid vastavalt ettevõttest Calbiochem (Darmstadt, Saksamaa) ja Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, USA). TriReagent osteti ettevõttest Vitro (Madrid, Hispaania) ning PVDF membraanid ja Western blot luminoolreaktiiv osteti ettevõttest Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). }}fenüülindool (DAPI), anneksiin-V-FITC (fluorestseiini isotiotsüanaat)/propiidiumjodiidi (PI) apoptoosi tuvastamise komplekt ja 2',7'-diklorofluorestseiindiatsetaadi (DCFH-DA) sond osteti ettevõttest Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) ja Molecular Probes (Oregon, USA) vastavalt. Antikehad saadi järgmistest allikatest: anti-PGE ja anti-COX-2(tsüklooksügenaas)antikehad olid firmalt Abcam (Cambridge, UK); anti-Bax ja anti-Bcl-2 olid ettevõttest Santa Cruz Technologies (Santa Cruz, CA.USA); anti-HIF-la antikeha ja -rabbit-Alexa-Fluor 488 pärinesid vastavalt ettevõttest BD Biosciences (Palo Alto, CA, USA) ja Invitrogen (Carlsbad, CA, USA); anti- -aktiini ja küüliku anti-hiire IgG peroksidaasi konjugaat osteti firmalt Sigma (St. Louis, MO, USA).

Rakukultuur ja katsetingimused.

Inimese proksimaalsed torukujulised HK-2 rakud osteti Ameerika tüübikultuuride kollektsioonist (ATCC) (Rockville, MD, USA). Rakke hoiti 5% CO juures 37 kraadi Cin juures DMEM/F12, millele oli lisatud 10% veise loote. seerum (FBS), 1% penitsilliini/streptomütsiini/amfoteritsiin B ja 1% glutamiini (Invitrogen. Carlsbad, CA, USA) ja 1% insuliini-transferriin-seleeni (ThermoFisher. Grand Island, NY, USA). Kõikides katsetes kasutasid rakud plaaditi 70-90 protsendilise liitumiskohaga ja pärast täielikku kinnitumist kultiveeriti neid hüpoksilistes (1% hapnikku) või normoksilistes tingimustes (21% hapnikku).Hüpoksiakatsed viidi läbi seadmes In vivo200hüpoksiatööjaam (Ruskin Technology, Lääne-Yorkshire, Ühendkuningriik). Sesthüpoksia/reoksüdeerimise katsed, allutati rakudhüpoksia24 tundi ja seejärel inkubeeriti rakke normoksilistes tingimustes kuni 3 tundi (taasoksügeenimisperiood).

iPGE immunofluorestsentsanalüüs ja COX-i Western blot analüüs-2(tsüklooksügenaas)ja HIF-1 .

Immunofluorestsentsanalüüsi ja Western blot analüüsi jaoks mõeldud rakud jaotati vastavalt klaasist katteklaasidele (4 × 104 rakku/klaasist katteklaas) või kuue süvendiga plaatidele (15 × 104 rakku süvendi kohta) ja inkubeeriti, nagu on kirjeldatud jaotises "Tulemused". Seejärel viidi läbi immunofluorestsents- ja immunoblotanalüüs, nagu eelnevalt kirjeldatud. Antikehade töölahjendused olid: 1/50 PGE jaoks, 1/1000 COX jaoks{10}}(tsüklooksügenaas)/HIF-1a/a-rabbit-Alexa-Fluor 568 ja 1/5000 -aktiini jaoks. Immunofluorestsentsi tuvastamine viidi läbi Leica SP5 konfokaalse mikroskoobiga (Leica Microsystems, Wetzlar, Saksamaa) biotehnoloogia, biomaterjalide ja nanomeditsiini biomeditsiiniuuringute võrgukeskuse (CIBER-BBN) konfokaalse mikroskoopia teenuse (ICTS 'NANBIOSIS'U17) kaudu. Alcali ülikool, Madrid, Hispaania)

Mööduv transfektsioon.

Mööduv transfektsioon siRNA PGT-ga (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), imetaja ekspressioonivektoriga pcDNA3, mis sisaldab inimese metsiktüüpi 15-hüdroksüprostaglandiini dehüdrogenaasi (p15-PGDH) cDNA-d või lutsiferaasi reporterplasmiidi konstruktid inimese COX jaoks-2(tsüklooksügenaas)phPES2-Luc, inimenehüpoksiavastuseelement (HRE) p9HIF1-Luc ja R. reniformis pRL-CMV (Promega, Madison, WI) ja lutsiferaasi aktiivsuse määramine viidi läbi nii, nagu on kirjeldatud mujal27,28.

Rakkude arv ja raku/tuuma morfoloogia.

Kleepuvate rakkude arv määrati spektrofotomeetriliselt modifitseeritud kristallvioletse värvimismeetodiga2. Apoptoosi tõendite tuvastamiseks jälgiti raku morfoloogiat faasikontrastmikroskoopia abil. Rakkude tuumad visualiseeriti pärast DNA värvimist DAPI-ga, nagu eelnevalt kirjeldatud 0. Tüüpiline apoptootiline morfoloogia, mida uuriti, hõlmas rakkude kokkutõmbumist, tuuma kondenseerumist ja fragmenteerumist ning apoptootiliste kehade moodustumist. Kvantifitseerimiseks uuriti igas katseseisundis pimedal viisil kuut välja, et hinnata apoptoosilaadse välimusega tuumade protsenti.

Voolutsütomeetria apoptoosi test ja rakkude elujõulisuse test trüpaansinise värvaine välistamise testiga.

Plaadile kleepunud rakud eraldati trüpsiniseerimisega ja neid kasutati analüüsis koos eelnevalt söötmest eraldatud eraldunud rakkudega.

Anneksiin-V-FITC/PI apoptoosi tuvastamise komplekt võimaldas apoptootiliste ja nekrootiliste HK-2 rakkude voolutsütomeetria tuvastamist, nagu eelnevalt kirjeldatud7. Varajased ja hilised apoptootilised rakud olid vastavalt positiivsed anneksiin V värvimise ja mõlema ja anneksiin V suhtes. värvimine. Nekrootilised rakud olid positiivsed ainult PI suhtes ja elusad HK-2 rakud ei värvunud.

Rakkude elujõulisuse hindamiseks kasutati trüpaansinise värvaine välistamise testi. Elujõulised rakud (valged) ja surnud rakud (sinised) loendati valgusmikroskoobi ja hemotsütomeetriga.

Statistiline analüüs.

Iga katset korrati vähemalt kolm korda. Tulemused on väljendatud keskmisena ± SEM. Neile viidi läbi ühesuunaline dispersioonanalüüs (ANOVA), millele järgnes Bonferroni test mitme võrdluse jaoks. Olulisuse tasemeks määrati P Väiksem kui 0,05 või sellega võrdne.

Tulemused

Hüpoksia kutsub esile proksimaalse tubulaarse HK-2 rakusurma.

Hüpoksiavähendas HK-2 rakkude arvu, mida hinnati kristallvioletse testiga (joonis la), ning indutseeris ka rakkude ümardumist ja plaadilt eraldumist (joonis lb, ülemine paneel). Ootuspäraselt,hüpoksiakäivitas rakusurma mudeli, millel on selged apoptoosi morfoloogilised omadused (vt tuuma värvimine DAPI-ga joonisel lb, alumine paneel, vasakul), nagu rakkude kokkutõmbumine koos olulise tuuma kondenseerumisega, killustumine ja apoptootiliste kehade moodustumine.Hüpoksia-indutseeritud apoptoosi kinnitas veelgi anneksiin V-FITC värvumise suurenemine, mida hinnati voolutsütomeetriaga, ja selle vältimine pan-kaspaasi inhibiitoriga Z-VAD-FMK (joonis lc).Hüpoksiamääras ka elujõuliste rakkude arvu vähenemise, kuid ei kutsunud esile statistiliselt olulisi muutusi nekrootiliste rakkude arvus (joonis lc, sisestus).

Joonis 1. Hüpoksia kutsub esile proksimaalse tubulaarse HK-2 rakusurma.a) Vähenenud rakkude arv (kristallviolettanalüüs). (b) Apoptoosi morfoloogilised omadused. Tüüpilised faasikontrastsed mikrofotod (ülemine paneel, originaalsuurendus, 10 ×) DAPI värvimisfotod (alumine paneel, originaalsuurendus, 40 ×). c) Apoptoosi suurenemine (voolutsütomeetria uuringud). Anneksiin V pluss rakud sisaldavad anneksiin V pluss/propiidiumjodiidi rakke (st varajased apoptootilised rakud, millel on säilinud plasmamembraani terviklikkus) ja anneksiin V pluss/propiidiumjodiid pluss rakud (st hilised apoptootilised rakud). Sisend: rakupopulatsioonide tüübid (anneksiin V-/propiidiumjodiid pluss rakud on nekrootilised rakud ja anneksiin V-/propiidiumjodiid-rakud on elus). Tulemused on väljendatud protsentides sündmuste koguarvust. Üldteave:(1) Rakke inkubeeriti 24 tundi normoksilistes (21% O2) või hüpoksilistes (1% O2) tingimustes, nagu on näidatud jaotises "Meetodid?". Pan-kaspaasi inhibiitor Z-VAD-FMK (25 μM) oli lisati 1 h enne kokkupuute alustamisthüpoksia. (2) Mikrofotod on kolme sõltumatu katse tüüpilised näited. Tulbad ja vearibad graafikutel: iga riba tähistab 3 erineva katse keskmist ± SEM *P<0.01 vs.=""><0.01 vs="">hüpoksia;**P<0.01 vs.="" normoxia="" and="">hüpoksiapluss ZVAD.

COX-2(tsüklooksügenaas)/iPGE,/EP retseptori rada vahendab hüpoksiast põhjustatud proksimaalset tubulaarset HK-2 rakusurma.

COX-i rolli hindamiseks-2(tsüklooksügenaas)/iPGE2/EP retseptori rada sissehüpoksia-indutseeritud HK-2 rakusurma, eelinkubeerisime rakke esmalt tselekoksiibiga, COX-2(tsüklooksügenaas)inhibiitor1; AH6809, EP1, EP2 ja EP3 retseptorite antagonist või GW627368X, EP4 retseptori antagonist33; või bromokresoolrohelise või bromosul-foftaaliga mõlemas PGT435 inhibiitorid. PGT langetati samuti siRNA-ga transfektsiooni kaudu.

Joonis 2. COX-2(tsüklooksügenaas)/iPGE,/EP retseptori rada vahendab hüpoksiast põhjustatud proksimaalse tubulaarse HK-2 rakusurma.(a) Rakusurma ennetamine raja inhibiitorite poolt. ülemine paneel; Tulbad näitavad kogu rakusurma protsenti (vasakul) või apoptootiliste anneksiin V pluss rakkude protsenti (paremal). Enne kokkupuudethüpoksia, rakke eelinkubeeriti 1 tund 3 μM tselekoksiibiga (COX-2(tsüklooksügenaas)inhibiitor）; 10 μuM AH6809, (EP1-3 retseptorite antagonist), 10 μM GW627368X (EP4 retseptori antagonist); või 50 μM bromokresoolrohelise (BG) või 25 μM bromosulfoftaleiiniga (BrS), kaks PGT inhibiitorit. Alumine paneel: vasakpoolne: rakusurma ennetamine siRNA-ga transfektsiooni (trüpaansinise sukeldumise välistamise test) kaudu PGT mahalöömise teel. Sisetükk: PGT (Western blot analüüs) pärssimise tõhusus Paremal: bromokresoolrohelise (BG) ennetava toime sõltuvus kontsentratsioonist. (b) Rakusurma ennetamine transfektsiooni teel imetaja ekspressioonivektoriga, mis sisaldab prostaglandiinide inaktiveerivat ensüümi 15-hüdroksüprostaglandiini dehüdrogenaasi (15-PGDH) cDNA (trüpaansinise värvaine välistamise test). 11}}PGDH (Western blot analüüs) transfekteeritud rakkudes. (c)Hüpoksiaindutseerib iPGE PGT-tundliku suurenemise, vasakul: kuvatakse PGE-st sõltuv immunofluorestsents üksi või kombineerituna tuumavärvimisega DAPI-ga (algne suurendus, 40 ×) Paremal: Kvantitatiivne lähenemine vasakpoolsel paneelil esitatud piltidele, kasutades Image J tarkvara. (d) EGFR-i aktiveerimise inhibiitor AG1478 ei takista HK-2-rakusurma EGFR-i. Rakke eelinkubeeriti 1 tund 1 µM AG1478-ga, enne kui neile allutatihüpoksia. (e) PGT inhibiitor BG ei muuda Baxi ja Bcl-2 ekspressiooni HK-2 rakkudeshüpoksia(Western blot analüüs). f) ennetaminehüpoksia/reoksügeenimisest põhjustatud rakusurm raja inhibiitorite poolt (trüpaansinise värvaine välistamise test). Rakke eelinkubeeriti raja inhibiitoritega ja allutatihüpoksianagu punktis a. Seejärel eksponeeriti rakke 3 tunniks normoksiaga. Üldine teave: (1) Rakke inkubeeriti 24 tundi normoksilistes (21% O) või hüpoksilistes (1% O,) tingimustes, nagu on näidatud jaotises "Meetodid". (2) Mikrofotod on kolme sõltumatu katse tüüpilised näited. (3) Inhibiitorite lahustid (luL/mL sööde) ei muutnud nende toimethüpoksiarakusurma kohta (tulemusi ei näidata). (4) Western blot analüüs: võrdne valk kinnitati sondeerimisega anti- -aktiini või anti-GAPDH antikehaga. (5) Tulbad ja veariba graafikutel: iga riba tähistab 3 erineva katse keskmist ± SEM.*P<0.01><0.01>hüpoksiavõihüpoksia/reoksüdeerimine.

Nagu on näidatud joonisel 2a,hüpoksia- indutseeritud proksimaalse tubulaarrakkude surm hoiti ära kõigil juhtudel. Apoptoosi inhibeerimine tselekoksiibi poolt näitas, et COX-2(tsüklooksügenaas)mängib olulist rollihüpoksia-indutseeritud apoptootiline rakusurm (joonis 2a, ülemine paneel paremal). Täpsemalt, fakt, et apoptoosi takistas EP retseptorite antagonism, viitab sellele, et apoptoosi vahendab COX-2(tsüklooksügenaas)-sõltuv PGE tootmine.Teisest küljest on kõige tõenäolisem, et iPGE aitab kaasahüpoksia-indutseeris HK-2 rakusurma, kuna seda takistas;(i) PGT inhibeerimine(joonis 2a) või(i) 15-PGDH üleekspressioon(joonis 2b), mis inaktiveerib iPGE2 läbi selle oksüdatsioon25 (pange tähele, et transfektsiooniprotseduur ise suurendas HK-2 rakkude tundlikkusthüpoksia: rakusurm oli kontrolltingimustes transfektsiooni puhul 45-55 protsenti võrreldes 15-20 protsendiga transfekteerimata rakkudes). Täiendav toetus iPGE panuselehüpoksia-indutseeritud HK-2 rakusurma, on meie varasemad leiudhüpoksiamäärab iPGE,1 rakkude sisalduse suurenemise ja selle tõusu takistasid PGT inhibiitorid (joonis 2c).

MAPK signaalirajad võivad indutseerida apoptoosi. Kuna iEP retseptorid transaktiveerivad epidermaalse kasvufaktori retseptori (EGFR)36, mis viib MAP kinaaside ERK1/2 ja p38 aktiveerumiseni HK-2 rakkudes0, küsisime, kas - HK-2 rakkude inkubeerimine EGFR-i aktiveerimise inhibiitoriga AG1478 on takistatudhüpoksia-indutseeritud rakusurm. Leidsime negatiivsed tulemused (joonis 2d) ja seetõttu on ebatõenäoline, et EGFR-i transaktiveerimine vahendab HK-2 rakusurmahüpoksia.

Mitmetes eksperimentaalsetes mudelites vähendati mitokondriaalset ATP-d ajalhüpoksiapõhjustab pro-apoptootilise valgu Bax ja anti-apoptootilise valgu Bcl-2 ekspressioonisuhte suurenemist, mis viib tsütokroom C vabanemiseni tsütosooli, kaspaas 9 aktiveerumiseni ning järgneva lõhustumise ja allavoolu efektori aktiveerumiseni. kaspaasid37,38. Kuid eelinkubeerimine PGT inhibiitoriga BG HK-2 rakkudes allhüpoksiaei toonud kaasa muutusi, mis on kooskõlas anti-apoptootilise nihkega Bc-2 ja Baxi ekspressiooni vahel (joonis 2e), mis ei toeta nende valkude rolli HK-2 rakus. surm allhüpoksia.

Pärast hüpoksilist kokkupuudet võivad reoksüdatsiooni episoodid (isheemia/reperfusioonikahjustus) esile kutsuda täiendavaid rakukahjustusi. Taasoksüdatsioonikahjustuse "paradoksi" saab mõista, võttes arvesse, et rakkudes toimuvad vastusena spetsiifilised muutused ensüümi aktiivsuses, mitokondriaalses funktsioonis, tsütoskeleti struktuuris, membraanitranspordis ja antioksüdantide kaitsevõimes.hüpoksia, mis siis ühiselt soodustavad hapniku taastamise kahjustust39. Reoksügeenimine aitab kaasa ägedale neerukahjustusele isheemilise insuldi, neerusiirdamise, vereringepuudulikkuse või neeru- ja südame-veresoonkonna operatsioonide ajal. Selles kontekstis pärssimise potentsiaalne terapeutiline väärtushüpoksia/reoksügeenimisest põhjustatud proksimaalne tubulaarraku surm COX-i sekkumise tõttu-2(tsüklooksügenaas)/iPGE,/iEP retseptori rada on ilmne. Seetõttu küsisime, kas iPGE vahendab konkreetselthüpoksia-indutseeritud rakusurma või ka vahendabhüpoksia/reoksügeenimisest põhjustatud rakusurm (in vitro mudel, mis jäljendab in vivo neeruisheemiat/reperfusioonikahjustust). Nagu on näidatud joonisel 2f, hoidis COX ära rakusurma (hinnatud trüpaansinise sukeldumise välistamise testiga)-2(tsüklooksügenaas)inhibiitor tselekoksiib, samuti EP retseptori antagonistid AH6809 või GW627368X. Nagu joonisel 2a, näitavad need tulemused, et COX-2 mängib olulist rollihüpoksia/reoksügeenimisest põhjustatud rakusurm ja täpsemalt seda, et rakusurma vahendab COX-2(tsüklooksügenaas)-sõltuv PGE tootmine, kuna seda takistas EP retseptorite antagonism. Kuna aga PGT inhibiitorid bromokresoolroheline ega bromosulfoftaleiin (joonis 2f ja täiendav joonis 2d) ei takistanud rakusurma, on tõenäolisem, ethüpoksia/reoksüdatsioonist põhjustatud HK-2 rakusurma vahendab eranditult rakuväline PGE.

HIF{0}}sõltuv COX-i transkriptsiooniregulatsioon-2(tsüklooksügenaas)geeniekspressioon aitab kaasa ahüpoksia-indutseeritud iPGE suurenemine proksimaalsetes tubulaarsetes HK-2 rakkudes. PGE, biosüntees hõlmab arahhidoonhappe vabanemist membraani glütserofosfolipiididest fosfolipaas A toimel, millele järgneb arahhidoonhappe COX isoensüümide muundamine prostaglandiiniks H ja lõpuks prosta näärme isomerisatsioon H-s PGE-ks prostaglandiini E sünteesi abil. nagu mikrosomaalne PGE süntaas-1 (mPGES-1)19. Oleme selle leidnudhüpoksia-indutseeritud apoptoosi HK-2 rakkudes vahendab tõenäoliselt COX-2(tsüklooksügenaas)-sõltuv PGE tootmise suurenemine (joonis 2). Arvestades, et COX-2(tsüklooksügenaas)on ensüüm, mille ekspressiooni võib indutseeridahüpoksia, püstitasime hüpoteesi, et ahüpoksia-indutseeritud PGE suurenemine, HK-2 rakkude tootmine võib olla COX-2 ekspressiooni suurenemise tagajärg.(tsüklooksügenaas). Oma hüpoteesi kinnitamiseks uurisime (i) mõjuhüpoksiaCOX-i väljenduse kohta-2(tsüklooksügenaas)valk ja mRNA ning (ii) COX-i mõju-2(tsüklooksügenaas)tselekoksiibi inhibiitorhüpoksia-indutseeritud iPGE suurenemine, meie tulemused näitasid sedahüpoksiamääratakse mööduval viisil COX-i transkriptsiooni ülesreguleerimine-2(tsüklooksügenaas)avaldis(joonis 3a,b)ja see COX-2(tsüklooksügenaas)pärssimine vähendas iPGE tõusu HK-2 rakkudeshüpoksia(Joonis 3c). Huvitaval kombelhüpoksiamääras ka mPGES-1 valgu ekspressiooni mööduva ülesreguleerimise (joonis 3a, sisestus), kuid ei mõjutanud mPGES-1 mRNA ekspressiooni (joonis 3b, sisestus). Need tulemused näitasid, et suurenenud COX-i ekspressioon-2(tsüklooksügenaas)ja mPGES-1 vastutab selle eesthüpoksia-indutseeritud iPGE tõus.

Joonis 3. COX-i HIF-la-sõltuv transkriptsiooniregulatsioon-2(tsüklooksügenaas)geeniekspressioon aitab kaasa hüpoksiast põhjustatud iPGE suurenemisele proksimaalsetes tubulaarsetes HK-2 rakkudes.(a)COXi väljendus-2(tsüklooksügenaas)valk suureneb ajutiselthüpoksia(Western blot analüüs). Inset: ekspressiooni mPGES{0}} valk on samuti ajutiselt ülesreguleeritudhüpoksia. (b) Väljend COX-2(tsüklooksügenaas)mRNA-d suureneb ajutiselthüpoksia. Inset: mPGES-1 mRNA ekspressiooni ei mõjutahüpoksia. (c) Ennetamine tselekoksiibiga, COX{0}}(tsüklooksügenaas)poolt indutseeritud iPGE tõusu inhibiitorhüpoksia. Rakke eelinkubeeriti 1 tund 3 μM tselekoksiibiga. Kuvatakse vasakpoolne ∶PGE-sõltuv immunofluorestsents üksi või ühendatud tuumavärvimisega DAPI-ga (algne suurendus, 40 ×). Paremal: kvantitatiivne lähenemine vasakpoolsel paneelil esitatud piltidele, kasutades Image J tarkvara. d) transkriptsioonimehhanismide panus. Vasakul: transkriptsiooni inhibiitor aktinomütsiin D (akt. D) takistab ahüpoksia-indutseeritud COX-i tõus-2(tsüklooksügenaas)valgu ekspressioon (Western blot analüüs). Rakke töödeldi lh 1 ug/ml Act-iga. D enne kokkupuudethüpoksia3 tundi. Paremal: COX-i aktiivsuse suurenemine-2(tsüklooksügenaas)reporteri konstruktsioon. (e) HIF-la YC-1 inhibiitor takistabhüpoksia-indutseeritud transkriptsiooniline COX-2(tsüklooksügenaas)ülesreguleerimine. Rakke eelinkubeeriti 1 tund 0,5 uM YC-1-ga. Vasakul: COX-i ennetamine-2(tsüklooksügenaas)ülesreguleerimine. Rakud puutusid kokkuhüpoksia8 tunniks. Keskus: COX-i aktiivsuse suurenemise ennetamine-2(tsüklooksügenaas)reporteri konstruktsioon. Paremal: HRE-põhise reporterikonstruktsiooni aktiivsuse pärssimine. Rakud puutusid kokkuhüpoksia8 tunniks. (f) HIF-la inhibiitor YC-1 suurendab apoptootilist rakusurma (voolutsütomeetria uuringud). Enne kokkupuudethüpoksia, rakke eelinkubeeriti 1 tund 0,5 μM YC-1-ga. Inset∶ YC-1 pärsibhüpoksia-indutseeritud HIF-1a ekspressiooni suurenemine (Western blot analüüs). Üldine teave: (1) Rakke inkubeeriti 24 tundi normoksilistes (21 protsenti O,) või hüpoksilistes (1 protsenti O,) tingimustes, nagu on näidatud jaotises "Meetodid". (2) Mikrofotod on kolme sõltumatu katse tüüpilised näited. (3) Western blot analüüs: võrdne valk kinnitati sondeerimisega anti- -aktiini antikehaga. (4) Tulbad ja veatulbad graafikutel: iga tulp tähistab 3 erineva katse keskmist ± SEM. *P<0.01 vs.="" other="">

Et täiendavalt uurida transkriptsioonimehhanismide panust COX-i suurenemisse{0}}(tsüklooksügenaas)valgu ekspressioon allhüpoksia, COX-i väljend-2(tsüklooksügenaas)hinnati HK-2 rakkudes, mida inkubeeriti enne transkriptsiooni inhibiitori aktinomütsiin D-ga.hüpoksia5 tunniks. Nagu on näidatud joonisel 3d,hüpoksia-indutseeritud COX-i tõus-2(tsüklooksügenaas)valgu ekspressiooni takistas aktinomütsiin D. Lisakshüpoksiamääras kindlaks ka COX-i aktiivsuse suurenemise-2(tsüklooksügenaas)eelnevalt HK-2 rakkudesse transfekteeritud promootori konstruktsioon (joonis 3d paremal). Kokkuvõttes näitavad joonisel 3d näidatud tulemused, et transkriptsioonimehhanismid aitavad kaasa ahüpoksia-indutseeritud COX-i tõus-2(tsüklooksügenaas)valgu ekspressioon. Sellegipoolest esines lahknevus COX-2 promootori aktiveerimise aja ja maksimaalse COX-2 ajastuse vahel.(tsüklooksügenaas)mRNA ekspressioon: samal ajal kui COX-i ajutine suurenemine{0}}(tsüklooksügenaas)mRNA ekspressioon oli maksimaalne 2 tunni pärast (joonis 3b), COX-2 promootor aktiveerus 3 tunni pärast (joonis 3d), mis ilmselt peegeldab transkriptsioonijärgsete mehhanismide panust COX{{6 suurenemisse. }}(tsüklooksügenaas)väljendus4. Sellest tulenevalt oletame, et COX-2(tsüklooksügenaas)mRNA on stabiliseeritud allhüpoksia, mis tooks kaasa COX taseme tõusu-2(tsüklooksügenaas)mRNA ekspressioon ilma (sel hetkel) COX-i aktiivsuse suurenemiseta-2(tsüklooksügenaas)promootor. Siiski on ka võimalik, et promootori aktiveerimise ja mõõdetava substraadi akumuleerumise vaheline viivitus võib samuti kaasa aidata lahknevusele COX-2 promootori aktiveerimise aja ja maksimaalse COX{{1 ajastuse vahel. }}(tsüklooksügenaas)mRNA ekspressioon.

HIF-1 on heterodimeerne transkriptsioonifaktor, mis koosneb hapnikust sõltuvast -subühikust ja konstitutiivselt ekspresseeritud -subühikust. Underhüpoksia, HIF-l akumuleerub ja siseneb tuuma, kus genereerib transkriptsioonifaktori HIF-1 pärast dimeriseerimist HIF-1-ga. HIF-1 soodustab seejärel oma sihtgeenide ekspressiooni, seondudeshüpoksia- reageerivad elemendid (HRE-d), mis esinevad nende reguleerivas piirkonnas ja korraldavad seejärel raku adaptiivseid reaktsioone, et võideldahüpoksia 3. Arvestades sedahüpoksiavõib aktiveerida COX-i-2(tsüklooksügenaas)ekspressiooni HIF{0}}sõltuval viisil COX-2 promootorjärjestuses2 esineva funktsionaalse HRE kaudu, uurisime HIF-l rollihüpoksia-indutseeritud COX-i tõus-2(tsüklooksügenaas)väljendus. Vaatasime ka HK-2 rakkudesse transfekteeritud COX-2 promootori konstrukti aktiivsust. Nagu on näidatud joonisel 3e, eelinkubeerimine HIF-1inhibiitori YC-1-ga, mis nüristashüpoksia-indutseeritud HIF-la ekspressiooni ja HRE reporterkonstrukti aktiivsuse suurenemine, mille tulemusena välditi mõlema COX ekspressiooni suurenemist-2(tsüklooksügenaas)ja COX-i tegevus-2(tsüklooksügenaas)promootori konstruktsiooni HK-2 allutataksehüpoksia. Kokkuvõtteks võib öelda, et joonistel 3a-e näidatud tulemused toetavad arvamust, et HIF-1 -sõltuv COX-2 transkriptsiooniline ülesreguleerimine(tsüklooksügenaas)vastutab selle eesthüpoksia-indutseeritud iPGE2 suurenemine.

Although the consequences of the activation of HIF-1a on hüpoksia-indutseeritud apoptoosid on vastuolulised (tõenäoliselt seetõttu, et need võivad olla kontekstist sõltuvad), analüüsisime (esialgselt) HIF-1a rolli meie katsesüsteemis. Kuna oleme varem avastanud, et sekkumine COX-i-2(tsüklooksügenaas)/iPGE, EP retseptori rada inhibeerib HIF-la ekspressiooni suurenemist, mille käivitabhüpoksia8,56 küsisime, kas HIF-la inhibeerimine aitab ära hoidahüpoksia-indutseeritud HK-2 rakkude apoptoos. Nagu on näidatud joonisel 3f, suurenes eelinkubatsioon HIF-l inhibiitoriga YC-1hüpoksia-indutseeritud apoptoos. Seetõttu on ebatõenäoline, et HlF-la

Arutelu

PabertaskurätikhüpoksiaArvatakse, et see on kriitilise tähtsusega nii kroonilise neeruhaiguse kui ka ägeda neerukahjustuse patofüsioloogias, kuna PTC on neerutuubulite suhtes kõige vastuvõtlikum osa.hüpoksia. Siin uurisime PGE rolli tekitatud kahjushüpoksiainimese PTC-le ja leidis, et iPGE suurenenud tootmine tulenes HIF-la-st sõltuvast COX-i ülesreguleerimisest-2(tsüklooksügenaas)geeniekspressioon ja mPGES{0}} suurenenud ekspressioon aitavad kaasahüpoksia-indutseeritud apoptootiline rakusurm HK-2 rakkudes. Arvestades, et tubulaarne hüpoksia on oluline tegur nii ägeda kui ka kroonilise neeruhaiguse korral-2, osutavad need tulemused prostaglandiini transporteri PGT-le kui uuele terapeutilisele sihtmärgile neeruhaiguste korral.

Hüpoksiamitte ainult ei suurenda iPGE-d, vaid ka selle vabanemist rakuvälisesse keskkonda,8 nii et sekreteeritud (rakuväline) PGE võib samuti mängida rollihüpoksia-indutseeritud apoptoos (näiteks apoptootiliste kaskaadide käivitamine rakumembraanil paiknevate EP retseptorite kanoonilise aktiveerimise kaudu). Kaks varasemat uuringut on näidanud, et rakusurm allhüpoksiaoli samuti tingitud COX-ist-2(tsüklooksügenaas)-sõltuv PGE,1345 tootmine. Teisest küljest vahendab PGE-indutseeritud apoptoosi teatud rakutüüpides (fibroblastid, mikrogliia, neuronid ja ägeda lümfoblastse leukeemia rakuliinid) PGE-st sõltuv EP-retseptorite aktiveerimine{5}}. Oleme siin selle leidnudhüpoksia-indutseeritud HK-2 rakkude apoptoosi hoidis ära ka EP retseptorite antagonism (joonis 2a, ülemine paneel paremal). Kuid kuna EP retseptoreid on klassikaliselt kirjeldatud kui plasmamembraani retseptoreid – nii et need on iPGE2- jaoks kättesaamatud, oletame, et EP retseptorid, mis vahendavad iPGE apoptootilist toimet, on hüpoksilistes HK-2 rakkudes alamhulk, mis paikneb intratsellulaarselt (st iEP retseptorid).

Erinevalt iPGE2 rollist inhüpoksia-indutseeritud apoptoosi HK-2 rakkudes, leidsime, et ainult rakuväline PGE vahendabhüpoksia/reoksügeenimisest põhjustatud HK-2 rakusurm, kuna PGT inhibiitorid seda ei takistanud (joonis 2f). Kuigi rakukahjustuse patoloogilised mehhanismid pärasthüpoksia/reoksügeenimine ei ole täielikult mõistetav, on aktsepteeritud, et rakusurm toimub suures osas ülemääraste reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) tootmise kaudu. See kehtib eriti HK-2 rakkude 49,50 kohta. Siiski, kuigihüpoksiavõib ka suurendada ROS-i tootmist, meie teadmiste kohaselt ei ole tõendeid selle kohta, et ROS mängiks olulist rollihüpoksia-indutseeritud HK-2 rakkude surm. See viitab sellele, et hüpoksia ja hüpoksia/reoksügenatsiooni surmavat mõju HK-2 rakkudes vahendavad erinevad mehhanismid, mis võib selgitada, miks BG ja BS kaitsevadhüpoksiaaga mitte vastuhüpoksia/reoksüdeerimine. Järelikult võib PGT inhibeerimine pakkuda PTC-s terapeutilist kasu hüpoksiast põhjustatud rakukahjustuse vastu, kuid mitte rakkude kahjuliku mõju vastu.hüpoksia/reoksüdeerimine.

HIF-1 -sõltuv COX-i ülesreguleerimine-2(tsüklooksügenaas)jaoks oli kriitiline sündmushüpoksia-indutseeritud HK-2 raku apoptoos (joonis 3e). Kuid meie tähelepanek, et HIF-i inhibiitor YC-1 suurendas apoptootilist rakusurma (joonis 3f), on mõistatuslik, kuigi varasemad aruanded on juba näidanud sarnaseid tulemusi1. Üks võimalik seletus on hüpoteetiline stsenaarium, milles HIF-la mitte ainult ei vahenda COX-i proapoptootilist ülesreguleerimist{10}}(tsüklooksügenaas)vaid ka kaitsvate molekulide ülesreguleerimine. Tõepoolest, HIF{1}}reguleeris kaitsvate molekulide ekspressioonihüpoksianagu pikk mittekodeeriv RNA DARS-AS1'ja mikroRNA-2103 on spetsiifiliselt leitud HK-2 rakkudest. Kuigi need tõendid toetavad meie hüpoteetilist stsenaariumi, tuleks selle kinnitamiseks läbi viia konkreetsed katsed.

Neerurakkude vastuse uuriminehüpoksiavõib parandada meie arusaamist neerupatoloogiast. Oleme uurinud, kuigi esialgsel viisil, pro-apoptootilise valgu Bax ja anti-apoptootilise valgu Bcl{2}} ekspressioonisuhte suurenemise rollihüpoksia-indutseeritud apoptoos HK-2 rakkudes. Meie tulemused näitasid, et PGL inhibeerimine ei toonud kaasa muutusi, mis on kooskõlas anti-apoptootilise nihkega Bcl-2 ja Baxi ekspressiooni vahel (joonis 2e), mis ei toeta nende valkude rolli iPGE-sõltuv HK-2 rakusurm allhüpoksia. Meie teadmiste kohaselt on ainult kaks uuringut Bcl{{0}}/Bax telje mõju kohta hüpoksiast põhjustatud apoptoosile PTC-s ja mõlemad uuringud hõlmasid anoksilist" või peaaegu anoksilist O kontsentratsiooni5 Kui PTC-d eksponeeriti 0,2 protsendilise O.-ga, jäi Baxi ekspressioon muutumatuks ja apoptoos oli seotud Bcl-2 ekspressiooniastme vähenemisega. Siiski ei mõjutanud Bcl-2 ekspressiooni 1 protsent O, hoolimata apoptoosi olemasolu, mis langeb kokku meie tulemustega. Seetõttu tuleks kaaluda muid mehhanisme, mis ei pruugi tingimata hõlmata kvantitatiivseid muutusi Bcl-2 või Baxi ekspressioonis: näiteks apoptoosi esilekutsumine kultiveeritud glioomirakkudes iPGE2 abil nõuab ainult selle füüsiline seos Baxiga, mis käivitab Baxi translokatsiooni mitokondritesse202. Seega väärib edasist uurimist mehhanism, mille kaudu iPGE aitab kaasa HK-2 rakkude apoptoosile.

Meie rühm on leidnud, et COX-2(tsüklooksügenaas)-sõltuv iPGE suurenemine, vahendab apoptootilist surma HK-2 rakkudes, mis puutuvad kokku tsisplatiiniga, apoptootiliste kehadega7" jahüpoksia(meie praegused tulemused). Kuna PGE vabaneb pärast suuruse määramist2 kiiresti rakust väljapoole, mängib selle sissepoole transport PGl poolt kriitilist rolli iPGE-indutseeritud apoptoosis HK-2 rakkudes. Seega, kui PTC kahjustust vahendab iPGE, võib ravi PGT inhibiitoritega olla kasulik terapeutiline lähenemine potentsiaalsetele rakendustele, nagu tsisplatiinist põhjustatud PTC kahjustuste ennetamine, torukujulise vigastuse leviku pärssimine apoptootiliste kehade kaudu või kahjulikku mõjuhüpoksiaPTC-s.