Epigeneetiline regulaator BRD4 on seotud kaadmiumi poolt põhjustatud põletikulise reaktsiooniga roti neerudes

lisateabe saamiseks:ali.ma@wecistanche.com

Zhongguo Gong jt

Cistanche tubulosa hoiab ära neeruhaiguse, selle saamiseks klõpsake siintooted ja Cistanche DHT

ABSTRAKTNE

Kaadmiumi (Cd) on kirjeldatud kui potentsiaalset põletiku indutseerijat, samas kui üha rohkem tõendeid näitab, et sobimatu põletik on soodustavaks teguriksneerukahjustus. Seega on Cd-indutseeritud nefrotoksilisuse mehhanismi selgitamisel Cd-indutseeritud põletikulise vastuse uurimine väga oluline. Bromodomeeni sisaldav 4(BRD4) on oluline epigeneetiline regulaator, mis on seotud paljude põletikuliste haiguste tekkega, kuid selle regulatiivsed rollid Cd-käivitatud.põletikulinevastus tuleb veel täpsustada. Siin leidsime, et ravi Cd-ga Sprague-Dawley rottidel (2 mg/kg kehamassi kohta, ip, 5 järjestikust päeva) ja rottidelneerurakkliin (NRK{{0}}E, 0–10 μM, 12 h) kutsus esile põletikuliste tsütokiinide transkriptsiooni, mida saab vähendada JQ1 (BRD4 inhibiitor, 25 mg/kg kehamassi kohta, ip , 3 järjestikust päeva in vivo; 0, 5 μM, 12 tundi in vitro) või BRD4 väikest segavat RNA-d (siRNA, in vitro), mis viitab sellele, et BRD4 osaleb Cd-käivitatud põletikulises vastuses. Järgmisena selgitas meie uuring BRD4 rolli Cd-käivitatud põletikulises vastuses. BRD4 inhibeerimine vähendas Cd-promoteeritud NF-KB tuuma translokatsiooni ja aktivatsiooni in vivo ja in vitro. Cd suurendas RelA K310 atsetüülimise taset ja suurendas BRD4 seondumist atsetüülitud NF-KB RelA-ga in vivo ja in vitro, mis tühistati BRD4 inhibeerimisega. Kokkuvõtlikult võib öelda, et meie uuring viitab sellele, et BRD4 osaleb põletikuliste tsütokiinide Cd-käivitatud transkriptsioonis, vahendades NF-κB signaaliraja aktiveerimist ja suurendades enda seondumist atsetüülitud NF-κB RelA-ga rottidel.neerud,seetõttu võib BRD4 olla potentsiaalne terapeutiline sihtmärk Cd-indutseeritud neeruhaiguste korral.

Märksõnad: BRD4KaadmiumNeerupõletiktsütokiinid NF-κB JQ1

1. Sissejuhatus

Kaadmium (Cd) on raskemetallide saasteaine, millel on kõrge toksilisus ja pikk poolestusaeg. Tööstusliku tootmise arenedes on Cd-saaste suurenenud oht keskkonnaohutusele ja inimeste tervisele tekitanud muret (Wang et al., 2020; Horiguchi ja Oguma, 2016). Pärast kehas imendumist põhjustab Cd mitme organi kahjustusi janeerudon peamine sihtorgan (Fernando et al., 2020; Zhao et al., 2021). Varem kontrollisime süstemaatiliselt, et autofagia inhibeerimine, oksüdatiivne stress ja apoptoos aitavad sünergistlikult kaasa Cd põhjustatud nefrotoksilisusele rottidel (Liu et al., 2017; Wang et al., 2017). Põletik on füsioloogiline reaktsioon, mis toimib kaitsereaktsioonina infektsiooni või vigastuse vastu, kuid Cd-indutseeritud kontrollimatud ja sobimatud põletikulised reaktsioonid võivad põhjustada kahju, näiteks kahjustada kõrvalseisja normaalset kudet ja soodustada autoimmuunhaigusi (Hossein-Khannazer et al., 2020; Zhang et al. al., 2020). Cd poolt põhjustatud põletikuline reaktsioon süvendas südame-veresoonkonna haigusi ja maksakahjustusi, mis viitab sellele, et põletik võib mängida olulist rolli Cd-vahendatudneerudpatoloogilised protsessid (Fagerberg et al., 2017; Almeer et al., 2019).

Epigeneetika viitab mitte-DNA järjestuse muutustel põhinevatele pärilikele modifikatsioonidele geeniekspressioonis ning nende modifikatsioonide pöörduvus võimaldab avastada uusi terapeutilisi sihtmärke (Vendetti ja Rudin, 2013). Bromodomeeni ja ekstra-terminaalse domeeni (BET) perekonda kuuluvad bromodomeeni sisaldavad 2 (BRD2), BRD3, BRD4 ja bromodomeeni munandispetsiifilised (BRDT), mida iseloomustavad kaks bromodomeeni ja seondumine histoonide ja mittehistooni atsetüülitud lüsiinidega ( Lochrin et al., 2014; Chatterjee ja Bohmann, 2018). BET-valgud toimivad paljude geenide transkriptsioonilise kaasaktivaatorina, reguleerides seega rakutsüklit, põletikulist vastust, oksüdatiivset stressi ja muid füsioloogilisi protsesse erinevates patoloogilistes mudelites (Jiao et al., 2020; Wang et al., 2019b). BRD4 on eriti hästi uuritud BET-valgu perekonna liige ja kuhjuvad uuringud on näidanud, et see on uudne epigeneetiline sihtmärk mitmekesise reguleerimisel.neeruhaigused, sealhulgas krooniline nefriit, diabeetiline nefropaatia ja eksperimentaalne neerukahjustus (Zeng ja Zhou, 2002; Morgado-Pascual et al., 2019). On kinnitatud, et BRD4 osaleb tuumafaktorist κB (NF-κB) sõltuvas transkriptsiooniprotsessis, et reguleerida paljude haiguste põletikulisi reaktsioone (Xu ja Vakoc, 2014; Suarez-Alvarez et al., 2017). BRD4 saab värvata atsetüülitud RelA (NF-κB subühik, valku kodeeriv geen) lüsiin 310 (RelA-K310ac) abil selle bromodomeenide kaudu, aktiveerides seega tsükliinist sõltuva kinaasi 9 (CDK9) ja fosforüülides RNA polümeraasi II. NF-κB sihtgeenide transkriptsioon (Hajmirza et al., 2018). Hiljutised uuringud näitavad, et BRD4 inhibiitorid võivad olla põletikuliste haiguste potentsiaalne ravivõimalus. Rottide seljaaju vigastuse mudelites nõrgendas BRD4 inhibeerimine põletikulist vastust ja soodustas mikrogliia funktsionaalset taastumist (Dey et al., 2019). Samuti tühistas BRD4 inhibeerimine eksperimentaalse neerupõletiku ühepoolse kusejuha obstruktsiooni, membraanivastase basaalse GN-i ja angiotensiin II infusiooni hiiremudelites (Suarez-Alvarez et al., 2017).

Pidades silmas Cd potentsiaalset põletikuvastast toimet ja BRD4 regulatiivset mõju põletikule, oletasime, et BRD4 osaleb Cd poolt käivitatud põletikulises vastuses. Nagu oodatud, vahendab BRD4 põletikuliste tsütokiinide transkriptsiooniprotsessi Cd eksponeeritud roti neerumudelites. Meie uuring paljastab potentsiaalse mehhanismi Cd-ga vallandatud põletikulises vastuses ja annab uue ülevaate Cd-indutseeritud nefrotoksilisuse ravist.

2. Materjalid ja meetodid

2.1. Kemikaalid ja antikehad

Kaadmiumkloriid (CdCl2, veevaba, 439800) osteti firmalt Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, USA). (pluss )-JQ1 (HY-13030) saadi ettevõttest MedChemExpress (Monmouth Junction, NJ, USA). Tuumavalgu ekstraheerimise komplekt osteti ettevõttest Beyotime Institute of Biotechnology (Shanghai, Hiina, P0027). Tõhus kemoluminestsentsi komplekt (ECL, 32209) ja bitsinhoniinhappe valguanalüüsi reaktiiv (BCA, 23225) saadi firmast Thermo Fisher Scientific (Madison, WI, USA). Kasutati primaarseid antikehi järgmiste valkude vastu: NF-κB p65 (10745-1- AP), IL-1 (26048-1-AP), TNF- (17590-1-AP) osteti ettevõttest Proteintech Group (Wuhan, Hiina); -aktiin (3700 s), histoon H3 (His3, 4499), Sirtuin 1 (Sirt1, 8469), normaalne küüliku IgG (IgG, 4394) osteti ettevõttest Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA); BRD4 (ab128874), K (lüsiin) atsetüültransferaas 3 (KAT3B/Ep300, ab14984), NF-κB RelA (atsetüül K310) (RelA-K310ac, ab19870), Alexa Fluor® 488 488 anti-konjugeeritud, Alexa Fluor® 488 – anti-5bbit7 donkey3 (anti-5bbit) firmast Abcam (Cambridge, Ühendkuningriik). Teised antikehad: Goat Anti-Mouse IgG (H plus L) (115-035-003) ja Goat Anti-Rabbit IgG (H plus L) (111-035-003) osteti ettevõttest Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA) ).

2.2. Loomad ja katsed

Kakskümmend neli Sprague-Dawley rotti (isased, 6 nädala vanused, 110–120 g) osteti ettevõttelt Pengyue Experimental Animal Breeding Co., Ltd (Jinan, Shandong, Hiina). Rottidele võimaldati vaba juurdepääs toidule ja veele keskkonnasäästlikus ruumis (24 ± 5 ​​kraadi, 12 h valguse/pimeduse tsükkel). Katseprotseduurid olid kohaldatavad Euroopa Ühenduste Nõukogu loomkatsete direktiivi 2010/63/EL alusel ning kõik protseduurid kiitis heaks Yangzhou ülikooli loomade hooldamise ja kasutamise komitee. Pärast ühenädalast aklimatiseerumist jagati rotid juhuslikult nelja rühma: (1) Kontrollrühm: süstiti intraperitoneaalselt vastavat lahustit (füsioloogiline soolalahus või 2-hüdroksüpropüül- -tsüklodekstriini lahus). (2) Cd rühm: CdCl2 (2 mg/kg kehamassi kohta, lahustatuna füsioloogilises soolalahuses), mida süstiti intraperitoneaalselt 5 järjestikuse päeva jooksul, et luua Cd mürgistuse mudel. (3) Cd pluss JQ1 rühm: CdCl2 (2 mg/kg kehamassi kohta), mida süstiti intraperitoneaalselt 5 järjestikuse päeva jooksul, et luua Cd mürgistusmudel, ja JQ1 (25 mg/kg kehamassi kohta, lahustatud 2-hüdroksüpropüül{{) 25}}tsüklodekstriini lahus) süstiti intraperitoneaalselt 6.–8. päeval. (4) JQ1 rühm: JQ1 (25 mg/kg kehamassi kohta) süstiti intraperitoneaalselt päevadel 6–8. Cd sisalduse statistika roti seerumites ja neerukudedes on loetletud tabelis S1, mis peegeldab Cd-ga eksponeeritud rotimudelite edukat loomist.

Pärast 8-päevast ravi tapeti rotid emakakaela dislokatsiooniga sügava anesteesia all pärast 12-tunnist tühja kõhuga. Neerukuded lõigati lahti ja 1 g kudet igast neerust säilitati kiiresti -80 °C juures, et järgida Western blot analüüsi ja kvantitatiivset PCR (qPCR) analüüsi. Ülejäänud koe kogus fikseeriti kiiresti 4-protsendilises paraformaldehüüdis (PFA) immunohistokeemilise (IHC) värvimise jaoks.

2.3. Rakukultuur ja ravi

Roti neeru rakuliin (NRK{{0}}E) saadi Hiina Teaduste Akadeemiast Shanghai Cell Bank. NRK-52E-rakke kasvatati Dulbecco modifitseeritud Eagle'i söötmes (DMEM, Gibco, 12800-017), mis sisaldas 5 protsenti veise loote seerumit (FBS, Gibco, 10437-028), penitsilliini ja streptomütsiini (1 00 U/mL) niisutatud tingimustes, kus on 5 protsenti CO2 ja 95 protsenti õhku 37 kraadi juures. CdCl2 (ultrapuhas vees lahustatud) ja JQ1 (dimetüülsulfoksiidis lahustatud) säilitati eraldi temperatuuril 4 kraadi ja -20 kraadi ning lahjendati enne kasutamist töölahusteks. Katse ülesehitus oli järgmine: (1) Järgmiste analüüside tegemiseks töödeldi rakke 0, 2,5, 5, 10 µM Cd-ga 12 tundi või 5 µM Cd-ga 0, 6, 12, 24 tundi. (2) Järgmiste analüüside tegemiseks töödeldi rakke 12 tundi 5 μM Cd ja/või 0,5 μM JQ1-ga. (3) Rakud transfekteeriti siBRD4-ga ja/või töödeldi 5 μM Cd-ga veel 12 tundi, et teha järgmised analüüsid.

2.4. Väike segav RNA transfektsioon

Transfekteerisime 20 nM BRD4 väikest segavat RNA-d (siBRD4, Invitrogen, CA, USA) NRK-52E rakkudesse Lipofectamine RNAiMAX transfektsioonireagendiga (Thermo Fisher Scientific, Cat# 13778150) 24 tunni jooksul vastavalt toote juhenditele. Kasutati järgmisi sensoorseid siRNA-sid:

siBRD4, sihtjärjestusega 5′-CCGTCAAGCTGAACCTCCCTGATTA-3′;

siCt (siRNA negatiivne kontroll), sihtjärjestusega 5′- UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′.

2.5. Western blotting

Neerukoe proovid ja NRK{0}}E rakud lüüsiti proteaasi inhibiitoreid sisaldavas RIPA puhvris, et ekstraheerida kogu valk. Tuumavalk valmistati eelnevalt värsketest kudedest ja rakkudest ning säilitati -80 kraadi juures. Valguproovid (20–30 ug proovi kohta) eraldati SDS-PAGE elektroforeesiga ja kanti seejärel polüvinülideenfluoriidmembraanidele (Millipore, ISEQ00010). Membraanid blokeeriti 90 minutit 5-protsendilise kooritud piimaga ja inkubeeriti 12 tundi 4 kraadi juures järgmiste primaarsete antikehadega: -aktiin (1:5000), NF-κB p65 (1:1000), IL-1 ( 1:600), TNF- (1:600), BRD4 (1:1000), Ep300 (1:1000), Sirt1 (1:1000), His3 (1:1000), RelA-K310ac (1:1000). Seejärel pesti membraane TBST-ga ja inkubeeriti vastavate sekundaarsete antikehadega (1:10000) 90 minutit toatemperatuuril (RT). Membraanid inkubeeriti elektrokemoluminestsentsiga (ECL, ThermoFisher Scientific) ja määrati Chemidoc XRS-iga (Bio-Rad, Marnes-La Coquette, Prantsusmaa) ning optilist tihedust analüüsiti ImageJ abil (NIH, Bethesda, MD, USA).

2.6. Immunofluorestsents (IF) värvimine

NRK{{0}}E-rakud, mis olid külvatud 24-süvendite plaadile, kasvatati umbes 60 protsendini. Rakke töödeldi 5 μM Cd ja/või 0,5 μM JQ1-ga 12 tundi, seejärel fikseeriti PFA-ga (4 protsenti , 10 min), permeabiliseeriti Triton X{10}}-ga (0,1 protsenti, 15 min), blokeeriti BSA-ga. (2 protsenti, 90 min) toatemperatuuril ja inkubeeriti primaarse antikehaga (NF-κB p65, lahjendus 1:50) üle öö temperatuuril 4 °C. Pärast kolm korda PBS-iga pesemist inkubeeriti rakke sekundaarse antikehaga (lahjendus 1:500) 90 minutit ja DAPI-ga 5 minutit toatemperatuuril, seejärel vaadeldi rakke konfokaalse mikroskoobi all. NF-κB tuuma translokatsiooni analüüsiti kolmes sõltumatus uuringus.

2.7. qPCR

Neerukudede kogu-RNA ja NRK{0}}E-rakud ekstraheeriti komplektiga RNAiso Plus (Takara Bio, Shiga, Jaapan). 1 ug kogu RNA-d kasutati 1. ahela cDNA sünteesimiseks vastavalt tootja juhendile (Roche, Basel, Šveits). Iga süvendi kohta võeti 2 µl komplementaarset DNA-d (cDNA), et tuvastada suhteline mRNA tase, kasutades LightCycler® 96 reaalajas PCR süsteemi (Roche). Arvutage suhtelised mRNA tasemed võrrandi 2-△△CT järgi. Praimerid on loetletud tabelis S2. -aktiin oli roti võrdlusgeen.

2.8. Kaasimmunosadestamine (Co-IP)

Neerukuded ja NRK{0}}E rakud lüüsiti värskelt valmistatud rakulüüsipuhvris (20 mM HEPES-KOH pH 7,5, 150 mmol/L NaCl, 2 mmol/L EDTA, 1% Triton X{{8}). }), mis sisaldab PMSF-i. Proteiin G helmed (100 µl proovi kohta, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) segati 2 ug BRD4, RelA-K310ac või IgG antikehaga proovi kohta ja pöörati 10 minutit toatemperatuuril. Seejärel inkubeeriti kogu valgulüsaate helmeste-antikehade kompleksiga üleöö 4 kraadi juures. Pärast kolm korda rakkude lüüsipuhvriga pesemist resuspendeeriti immunosademed proovide konfigureerimiseks 1 × SDS PAGE proovipuhvriga. Sihtvalgud tuvastati Western blot analüüsi abil anti-BRD4 ja anti-RelA K310ac primaarsete antikehadega.

2.9. Statistiline analüüs

Kõik andmed saadi vähemalt kolmest sõltumatust katsest ja väljendati keskmisena ± SEM, kui pole märgitud teisiti. Katserühmi võrreldi paaritu kahepoolse Studenti t-testi või ühesuunalise dispersioonanalüüsi (ANOVA) abil, kasutades SPSS 22.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Olulisuseks määrati p <>

3. Tulemused

3.1. Cd indutseerib põletikuliste tsütokiinide ekspressiooni in vivo ja in vitro

Keskkonnasaasteainena on tõestatud, et Cd põhjustab neerukahjustusi, reguleerides mitmeid bioloogilisi protsesse (Wang et al., 2019c). Selles uuringus uuriti põletikuliste tsütokiinide transkriptsioonitasemete muutusi pärast Cd-ga kokkupuudet, et uurida, kas põletik on seotud Cd-indutseeritud nefrotoksilisusega. Andmed näitasid, et Cd kokkupuude suurendas oluliselt interleukiini (IL)-1 ja tuumori nekroosifaktori (TNF) valgu taset NRK-52E rakkudes (joonis 1A–B) ja roti neerukudedes (joonis 1C). -D). Samal ajal, nagu on näidatud joonistel 1E–F, suurendas Cd kokkupuude põletikuliste tsütokiinide (IL-1, IL-6, TNF- ja (monotsüütide kemoatraktantvalk-1) MCP transkriptsioonitasemeid. -1) in vivo ja in vitro. Need leiud viitavad sellele, et Cd indutseerib põletikuliste tsütokiinide ekspressiooni roti neerudes.

3.2. BRD4 osaleb põletikuliste tsütokiinide Cd-indutseeritud transkriptsiooniprotsessis

BRD4 on äsja kirjeldatud epigeneetiline regulaator, mis seondub atsetüülitud histoonidega või mittehistooniga, et reguleerida paljude haiguste põletikulisi protsesse. Siin kasutati BRD4 inhibiitorit JQ1 ja BRD4-siRNA-d, et uurida BRD4 rolli Cd-käivitatud põletikulises vastuses. Andmed näitasid, et Cd-kõrgenenud IL-1 ja TNF-valgu taset vähendasid JQ1-ravi in ​​vivo ja in vitro (joonis 2A-D) ning BRD4-ga in vitro (joonis S1A-B). Samal ajal pärssis JQ1-ravi oluliselt IL-1, IL-6, TNF- ja MCP-1 Cd-võimendatud transkriptsioonitasemeid NRK-52E-rakkudes (joonis 2E) ja roti neerukuded (joonis 2F). Samuti vähendas BRD4 knockdown oluliselt põletikuliste tsütokiinide Cd-ga suurenenud transkriptsioonitaset NRK-52E rakkudes (joonis S1C). Need leiud viitavad ühiselt sellele, et BRD4 on Cd-käivitatud põletikulise vastuse kriitiline regulaator roti neerudes.

3.3. BRD4 ekspressioonitasemed jäävad pärast Cd kokkupuudet muutumatuks

Järgmisena tuvastati pärast Cd kokkupuudet muutused BRD4 ekspressioonitasemetes. NRK-52E-rakke töödeldi Cd-ga kontsentratsioonigradienti all ja rottidele süstiti intraperitoneaalselt Cd-d 5 päeva jooksul, et selgitada välja Cd mõju BRD4 ekspressioonile neerudes in vivo ja in vitro. Tulemused näitasid, et BRD4 valgu tase ei muutunud nii Cd-ga eksponeeritud NRK-52E rakkudes (joonis 3A-B) kui ka roti neerukudedes (joonis 3C-D). Samuti ei muutunud BRD4 mRNA tasemed pärast Cd eksponeerimist (joonis 3E-F). Need tulemused näitavad, et BRD4 vahendab Cd-käivitatud põletikulist vastust, mis ei sõltu ekspressioonitaseme muutustest.

3.4. BRD4 reguleerib Cd-promoteeritud NF-κB tuuma translokatsiooni

Meie uuringus uuriti BRD4 rolli Cd-käivitatud põletikulises vastuses. NF-κB signaaliraja muutus on tihedalt seotud põletikuliste tsütokiinide transkriptsiooniga (Chi et al., 2021). Meie uuring näitas, et BRD4 osaleb Cd-reguleeritud tuuma translokatsioonis ja NF-κB aktiveerimises. Esiteks määrati NF-κB subtsellulaarne lokaliseerimine IF-värvimise ja IHC-värvimisega. Andmed joonistel 4A ja D näitasid, et JQ1 inhibeerib Cd-promoteeritud NF-κB tuuma translokatsiooni NRK-52E rakkudes ja roti neerukudedes. Vahepeal näitasid Western blot tulemused, et JQ1 vähendas oluliselt NF-KB Cd-ga suurenenud tuumavalgu taset in vivo (joonis 4B-C) ja in vitro (joonis 4E-F). Samamoodi pärssis BRD4 knockdown oluliselt ka Cd-promoteeritud NF-κB tuuma translokatsiooni (joonis S2A) ja vähendas NRK-52E-rakkudes Cd-suurenenud NF-kB tuumavalgu taset (joonis S2B-C). Kokkuvõttes võib BRD4 inhibeerimine vähendada Cd poolt soodustatud NF-KB tuuma translokatsiooni, mis viitab sellele, et BRD4 vahendab NF-KB signaaliraja aktiveerimist neerus pärast Cd kokkupuudet.

3.5. Cd suurendab RelA K310 atsetüülimise taset

Uuringud on kinnitanud, et BRD4 seondub broomidomeenide kaudu atsetüülitud RelA K310-ga, et reguleerida NF-κB-sõltuvat transkriptsiooni (Morgado-Pascual et al., 2019; Zhong jt, 2018). Seega tuvastati RelA K310 atsetüülimise tase ja kahe ensüümi ekspressioon. Andmed näitasid, et RelA-K310ac ja atsetülaasi Ep300 valgu tase langes pidevalt koos Cd kontsentratsiooni suurenemisega, samas kui deatsetülaasi Sirt1 valgu tase tõusis järk-järgult NRK-52E rakkudes (joonis 5A-B) ja roti neerukudedes (joonis fig. 5C-D). Ka Ep300 ja Sirt1 mRNA tasemed näitasid samu suundumusi (joonis 5E-F). Need tulemused viitavad sellele, et Cd soodustab RelA K310 atsetüülimise taset, seega võib BRD4 olla seotud Cd-käivitatud põletikuliste tsütokiinide transkriptsiooniga neerudes.

3.6. Cd suurendab BRD4 seondumist RelA-K310ac-ga, et parandada selle transkriptsioonifunktsiooni

Seondumine atsetüülimissaitidega on BRD4 transkriptsiooniregulatsiooni aluseks (Huang et al., 2009). Et kontrollida, kas Cd reguleerib BRD4 funktsiooni, suurendades BRD4 seondumist RelA-K310ac-ga, tuvastati Co-IP kaudu RelA-K310ac ja BRD4 vaheline interaktsioon. Andmed joonisel 6A näitasid, et Cd suurendas oluliselt RelA-K310ac ja BRD4 vahelist interaktsiooni NRK-52E rakkudes, mida leevendas ravi JQ1 või BRD4 knockdown. Sama suundumust täheldati ka roti neerukudedes (joonis 6B). Need tulemused näitavad, et Cd suurendab BRD4 seondumist RelA-K310ac-ga, mis soodustab NF-KB-sõltuvat transkriptsiooni ja aitab seejärel kaasa Cd-käivitatud põletikulisele vastusele.

4. Arutelu

CD-d on teatatud potentsiaalse põletiku vallandajana selle kõrge toksilisuse tõttu, samas kui täpne mehhanism pole veel täielikult teada (Arab-Nozari et al., 2020; Ghosh, 2018). Meie uuring kinnitas, et Cd indutseerib põletikuliste tsütokiinide ekspressiooni roti neerurakkudes, ja leidis, et BRD4, epigeneetiline sihtmärk, millel on kriitilised funktsioonid paljudes rakuprotsessides, sealhulgas põletikus, aitab kaasa Cd poolt käivitatud põletikulisele vastusele. Täiendavad katsed näitasid, et BRD4 osaleb Cd-promoteeritud NF-KB signaaliraja aktiveerimises. Samuti suurendas Cd RelA K310 atsetüülimise taset, suurendades seeläbi BRD4 seondumist atsetüülitud NF-κB RelA-ga, et soodustada NF-κB-sõltuvat põletikuliste tsütokiinide transkriptsiooni.

Põletik on üks loomulikke kaitsemehhanisme eksogeensete kemikaalide vastu, samas kui kontrollimatu ja sobimatu põletikuline reaktsioon võib kahjustada normaalseid kudesid ja kutsuda esile autoimmuunhaigusi (Jian et al., 2018). Cd-ga suurenenud põletiku bioloogilisi markereid seostati sageli erinevate haigustega. Uuringud on näidanud, et Cd-indutseeritud põletik on seotud aterogeneesiga (Tinkov et al., 2018). Lisaks soodustas Cd põletikuliste tsütokiinide ekspressiooni, mis aitas kaasa kopsu- ja munandikoe kahjustustele ning indutseerib hepatotoksilisust (Koopsamy Naidoo et al., 2019; Arafa et al., 2014). Need kahjulikud mõjud on kooskõlas meie tulemustega, et põletikuline reaktsioon on seotud Cd-indutseeritud neerukahjustusega. Üha rohkem uuringuid on keskendunud Cd-indutseeritud põletiku esinemismehhanismidele. Hästi uuritud BET-valgu perekonnaliikmena mängib BRD4 olulist rolli paljudes bioloogilistes protsessides, sealhulgas põletikus. Siin kasutati JQ1 (BRD4 inhibiitor) ja siRNA-d BRD4 funktsionaalse aktiivsuse dereguleerimiseks ning leiti, et BRD4 inhibeerimine vähendas Cd-indutseeritud põletikuliste tsütokiinide transkriptsiooni roti neerudes, mis viitab sellele, et BRD4 osaleb Cd-käivitatud põletikulises vastuses. . Üldiselt arvatakse, et BRD4 ekspressiooni düsregulatsioon on põletikulise vastuse tekkimisel otsustava tähtsusega sündmus. Seljaaju vigastuse, südame patoloogilise hüpertroofia ja muude põletikuga seotud haiguste korral aitas häiritud BRD4 ekspressioon kaasa põletikuliste tsütokiinide ekspressioonile (Zhu et al., 2020; Marazzi et al., 2018; Ren jt, 2019). Kuid Cd ei mõjutanud praegustes katsetingimustes BRD4 ekspressioonitasemeid, mis pani meid mõtlema, kas BRD4 vahendab Cd-käivitatud põletikulist vastust teiste radade kaudu.

NF-κB on põletikuliste protsesside oluline reguleeriv tegur ja vastutab paljude põletikuliste vahendajate ekspressiooni kontrollimise eest (Lawrence, 2009). On teatatud uuringutest, et BRD4 osaleb NF-κB signaaliraja reguleerimises. Huang et al. (2017) soovitas, et BRD4 reguleeris IKK-vahendatud NF-κB aktivatsiooni p38 ja JNK-MAPK radade kaudu. Wang et al. (2019a) leidsid, et BRD4 knockdown või JQ1-ravi blokeeris lipopolüsahhariidi (LPS) aktiveeritud NF-KB signaaliraja mikroglias. Meng et al. (2014) näitas, et JQ1-ravi blokeeris põletikuliste tsütokiinide ekspressiooni, inhibeerides NF-κB aktivatsiooni LPS-ga töödeldud RAW 264.7 rakkudes. Need aruanded näitasid, et BRD4 vahendab NF-κB aktiveerimist paljudes põletikumudelites, samas kui BRD4 inhibeerimine on tõhus terapeutiline lähenemine põletikuvastasele toimele. Käesolevas uuringus blokeeris BRD4 inhibeerimine NF-κB tuuma translokatsiooni Cd-ga eksponeeritud roti neerukudedes ja NRK-52E-rakkudes, mis viitab sellele, et BRD4 vahendab Cd-aktiveeritud NF-κB signaalirada.

Tavaliselt pärast NF-κB aktiveerimist erinevate stiimulite toimel ja ümberpaiknemist tuuma, seondub BRD4 atsetüülitud NF-κB RelA-ga K310 saidil, mis suurendab selle stabiilsust ja transkriptsioonilist aktiivsust tuumas (Hajmirza et al., 2018). Seega mõjutab RelA K310 atsetüülimistase BRD4 regulatiivset funktsiooni põletikulise reaktsiooni suhtes. Hippokampuse neuronites vahendas deatsetülaas Sirt1 RelA K310 deatsetüülimist, et reguleerida BACE1 ekspressiooni, mis aitas kaasa neuronaalse amüloidi tootmisele (Flores-Leon et al., 2019). Glioblastoomirakkudes reguleeris fotodünaamilise teraapia stress deatsetülaasi Sirt1 ja aktiveeris atsetülaasi Ep300, mis suurendas RelA-K310ac taset ja viis ellujäämist soodustava lämmastikoksiidi suurenenud tootmiseni (Fahey et al., 2019). Meie uuring näitas, et Cd soodustab RelA K310 atsetüülimise taset, suurendades Ep300 ekspressiooni ja vähendades Sirt1 ekspressiooni, mis näitab, et Cd mõjutab regulatiivset funktsiooni BRD4, suurendades RelA K310 atsetüülimise taset.

Eelkõige näitasid meie tulemused, et JQ1-ravi oli Cd-käivitatud põletikureaktsiooni leevendamisel tõhusam kui BRD4-d. JQ1-l on kõrge seondumisafiinsus BRD4-ga ja see võib peaaegu täielikult blokeerida BRD4 seondumise kromosoomiga, samas kui siBRD4 võib BRD4 valgu ekspressiooni häirida ainult selleks, et vähendada BRD4 seondumist sihtkohaga, mis viitab sellele, et BRD4 vahendab Cd-käivitatud põletikulist vastust, mis võib sõltuda seondumine atsetüülitud NF-κB RelA-ga. Hiljutised uuringud on näidanud sarnast regulatiivset mehhanismi: pärast NF-κB tuuma translokatsiooni ja aktiveerimist suhtles BRD4 seejärel atsetüülitud RelA-ga, et aktiveerida NF-κB transkriptsiooniline aktiveerimine (Huang et al., 2009). RelA-BRD4 värvati NF-κB sihtmärkpromootoritesse erinevates põletikulistes stimulatsioonitingimustes, samas kui JQ1-ravi takistas BRD4 seondumist atsetüülitud NF-κB RelA-ga, vähendades seega NF-κB transkriptsioonilist aktiivsust (Zou et al., 2014). Meie tulemused näitasid, et BRD4 inhibeerimine blokeerib Cd-võimendatud interaktsiooni BRD4 ja RelA-K310ac vahel roti neerudes, toetades meie ülaltoodud tulemusi, et BRD4 inhibeerimine pärsib NF-κB Cd-indutseeritud transkriptsioonilist aktiivsust, mis näitab, et Cd suurendab BRD4 seondumist atsetüülitud rakkudega. NF-κB RelA põletikuliste tsütokiinide transkriptsiooni suurendamiseks.

Kokkuvõttes näitas meie uuring BRD4 regulatiivseid mehhanisme Cd-käivitatud põletikulises vastuses roti neerudes: (1) BRD4 vahendab Cd-indutseeritud NF-κB tuuma translokatsiooni ja aktiveerimist. (2) Cd suurendab RelA K310 atsetüülimise taset ja suurendab BRD4 seondumist atsetüülitud NF-κB RelA-ga, mis soodustab NF-κB-sõltuvate põletikuliste tsütokiinide transkriptsiooni. Lisaks leevendas BRD4 inhibeerimine märkimisväärselt Cd kõrgenenud põletikuliste tsütokiinide taset, mis viitab sellele, et sihitud BRD4 võib välja töötada tõhusa vahendina põletikuliste haiguste, sealhulgas Cd-indutseeritud nefriidi raviks.

CRediT autorluse panuse avaldus

Zhongguo Gong: kontseptualiseerimine, metoodika, visualiseerimine, formaalne analüüs, valideerimine, uurimine, formaalne analüüs, andmete kureerimine, kirjutamine – algne mustand. Gang Liu: kontseptualiseerimine, metoodika, visualiseerimine, andmete kureerimine, kirjutamine – algne mustand, projekti haldamine, rahastamise hankimine. Wenjing Liu: Tarkvara, ressursid, metoodika, formaalne analüüs. Hui Zou: projekti haldamine, järelevalve. Ruilongi laul: tarkvara, formaalne analüüs, järelevalve. Hongyan Zhao: tarkvara, formaalne analüüs, järelevalve. Yan Yuan: Järelevalve. Jianhong Gu: järelevalve. Jianchun Bian: rahastamise omandamine, järelevalve. Jiaqiao Zhu: kirjutamine – ülevaade ja toimetamine, järelevalve. Zongping Liu: kirjutamine – arvustus ja toimetamine, juhendamine,

Projekti haldamine, rahastamise hankimine, kontseptualiseerimine.

Konkureerivate huvide deklaratsioon

Autorid kinnitavad, et neil ei ole teadaolevaid konkureerivaid finantshuve ega isiklikke suhteid, mis oleksid võinud mõjutada käesolevas artiklis käsitletud tööd.

Tunnustus

Seda tööd toetasid Hiina riiklik loodusteaduste sihtasutus (nr 31872533, 31902329, 32072933), Hiina riiklik võtmetähtsusega teadus- ja arendusprogramm (nr 2016YFD0501208) ja Jiangsu kõrghariduse prioriteetse akadeemilise programmi arendamise projekt. Asutus (PADP). Käsikirja redigeeris õige inglise keele, grammatika, kirjavahemärkide, õigekirja ja üldise stiili jaoks üks või mitu ELIXIGENi kõrgelt kvalifitseeritud inglise keelt emakeelena kõnelevat toimetajat.

Viited

Almeer, RS, AlBasher, GI, Alarifi, S., Alkahtani, S., Ali, D., Abdel Moneim, AE, 2019. Mesilaspiim nõrgendab isastel hiirtel kaadmiumist põhjustatud nefrotoksilisust. Sci. Rep. 9 (1), 5825.

Arab-Nozari, M., Mohammadi, E., Shokrzadeh, M., Ahangar, N., Amiri, FT, Shaki, F., 2020. Kaasaegne kokkupuude mittetoksilise kaadmiumi ja fluoriidi tasemega põhjustab rottidel hepatotoksilisust käivitades mitokondriaalse oksüdatiivse kahjustuse, apoptoosi ja NF-KB radu. Keskkond. Sci. Saasta. Res. Int. 27 (19), 24048–24058.

Arafa, MH, Mohammad, NS, Atteia, HH, 2014. Fenugreek seemnepulber leevendab kaadmiumist põhjustatud munandikahjustusi ja hepatotoksilisust isastel rottidel. Exp. Toksikool. Pathol. 66 (7), 293–300.

Chatterjee, N., Bohmann, D., 2018. BET-ting on Nrf2: kuidas Nrf2 signaalimine võib mõjutada BET-valgu inhibiitorite terapeutilist toimet. Bioesseys 40 (5), 1800007.

Chi, Q., Zhang, Q., Lu, Y., Zhang, Y., Xu, S., Li, S., 2021. Selenoproteiin S rollid reaktiivse hapniku liigist sõltuvas neutrofiilide ekstratsellulaarses lõksu moodustumises, mis on põhjustatud seleeni- puudulik arteriit. Redox Biol. 44, 102003 Dey, A., Yang, W., Gegonne, A., Nishiyama, A., Pan, R., Yagi, R., Grinberg, A., Finkelman, FD, Pfeifer, K., Zhu, J ., Singer, D., Zhu, J., Ozato, K., 2019. BRD4 suunab vereloome tüvirakkude arengut ja moduleerib makrofaagide põletikulisi reaktsioone. EMBO J. 38 (7)

Fagerberg, B., sünd, Y., Barregard, L., Sallsten, G., Forsgard, N., Hedblad, B., Persson, M., Engstrm, G., 2017. Kaadmiumiga kokkupuude on seotud lahustuva urokinaasi plasminogeeni aktivaatori retseptoriga, mis on põletiku ja tulevaste südame-veresoonkonna haiguste ringlev marker. Keskkond. Res. 152, 185–191.

Fahey, JM, Korytowski, W., Girotti, AW, 2019. Ülesvoolu signaalisündmused põhjustavad fotodünaamiliselt mõjutatud glioblastoomirakkudes ellujäämist soodustava lämmastikoksiidi suurenenud tootmist. Vaba Radik. Biol. Med. 137, 37–45.

Fernando, TD, Jayawardena, BM, Mathota Arachchige, YLN, 2020. Oryza sativa L. erinevate metaboliitide ja raskmetallide varieerumine, mis on seotud tundmatu etioloogiaga kroonilise neeruhaigusega Sri Lankal. Chemosphere 247, 125836.

Flores-Leon, M., Perez-Dominguez, M., Gonzalez-Barrios, R., Arias, C., 2019. Palmitiinhappest põhjustatud NAD(pluss) vähenemine on seotud SIRT1 funktsiooni vähenemise ja BACE1 suurenenud ekspressiooniga hipokampuse neuronites. Neurochem. Res. 44 (7), 1745–1754.

Ghosh, KNI, 2018. Kaadmiumiga töötlemine kutsub esile ehhinokokoosi, DNA kahjustuse, põletiku ja apoptoosi albiino Wistari rottide südamekoes. Keskkond. Toksikool. Pharmacol. 59, 43–52. põletik ja vähk. Biomeditsiin 6 (1), 16.

Horiguchi, H., Oguma, E., 2016. Äge kokkupuude kaadmiumiga kutsub esile pikaajalise neutrofiilia koos granulotsüütide kolooniaid stimuleeriva faktori hilinenud indutseerimisega hiirte maksas. Arch. Toksikool. 90 (12), 3005–3015.

Hossein-Khannazer, N., Azizi, G., Eslami, S., Alhassan Mohammed, H., Fayyaz, F., Hosseinzadeh, R., Usman, AB, Kamali, AN, Mohammadi, H., Jadidi-Niaragh, F., Dehghanifard, E., Noorisepehr, M., 2020. Kaadmiumiga kokkupuute mõju põletiku esilekutsumisel. Immunopharmacol. Immunotoksikool. 42 (1), 1–8.