Toidu kõrvalproduktide antioksüdantide tõhusus indutseeritud CYP geenide ekspressioonile ja histoloogilistele muutustele põrsaste maksa ja neerude puhul, keda toidetakse aflatoksiin B1 ja ohratoksiin A-ga
Feb 26, 2022
Abstraktne:Selle uuringu eesmärk oli uurida viinamarjaseemne- ja astelpajuõlitööstusest saadud kõrvalsaaduste segu potentsiaali leevendada ohratoksiin A ja aflatoksiin B1 põhjustatud kahjulikke kahjustusi maksa- janeeru-tase põrsastel pärast võõrutamist. Nelikümmend ristanditega TOPIGS-40 hübriidpõrsast määrati pärast võõrutamist kolme katserühma (E1, E2, E3) ja ühte kontrollrühma (C) ning neid toideti 30 päeva jooksul katsetoiduga. Põhisööt oli kontrollainena ja see sisaldas tavalist segasööta starterpõrsastele ilma mükotoksiinideta. Katserühmi toideti järgmiselt: E1 – põhitoit pluss kahe kõrvalsaaduse segu (1:1) (viinamarjaseemned ja astelpajujahu); E2 – põhitoit, mis on eksperimentaalselt saastunud mükotoksiinidega (479 ppb OTA ja 62 ppb AFB1); ja E3 – põhitoit, mis sisaldab 5 protsenti viinamarjaseemne- ja astelpajujahu segu (1:1) ning on saastunud OTA ja AFB1 seguga. 4 nädala pärast loomad tapeti ning koeproovid võeti maksast ja neerud geeniekspressiooni ja histoloogilise analüüsi läbiviimiseks. Geeniekspressiooni analüüs näitas, et kui võõrutatud põrsaid toideti saastunud toiduga, oli enamiku analüüsitud geenide ekspressioon alareguleeritud. CYP450 perekonna hulgas oli CYP1A2 geen, mille allareguleerimine oli suurim. Nende tulemuste kohaselt avastasime maksas, et mükotoksiinid kutsusid esile histomorfoloogilisi muutusi maksas janeerudja avaldas mõju CYP1A2, CYP2A19, CYP2E1 ja CYP3A29 ekspressioonitasemele, kuid me ei tuvastanud olulisi muutusi CY4A24, MRP2 ja GSTA1 geenide ekspressioonitasemes.
Märksõnad: põrsad; antioksüdantne toime; söödalisandid; mükotoksiinid; CYPs geeniekspressioon;neer; neeru-
Sissejuhatus
Mükotoksiinid on sekundaarsed toksilised metaboliidid, mida toodavad teatud niitjate seente tüved. Need madala molekulmassiga ühendid (kuni 500 Da) võivad saastada mitmesuguseid tooraineid ja põhjustada suurenenud riski inimeste ja loomade tervisele [1]. Iseloomustatud ja hästituntud toimega mükotoksiinide arv on seente tekitatud toksilise potentsiaaliga metaboliitide arvukuse tõttu suhteliselt väike [2–4]. Need liigitatakse viide rühma, mille spetsiifilised keemilised struktuurid esinevad sageli söödas ja toidus: trikotetseenid, zearalenoon, ohratoksiinid, fumonisiinid ja aflatoksiinid. Toidus ja söödas leiduvad mükotoksiine tootvad seened jagunevad kahte rühma: need, mis tungivad sisse enne teravilja koristamist, mida nimetatakse põldseenteks, ja need, mis kasvavad alles pärast koristamist, mida nimetatakse ladustamisseenteks [5]. Euroopa tasandil kehtivad määrused ja soovitused seasöödas tavaliselt leiduvate kuut tüüpi mükotoksiinide maksimaalse lubatud taseme kohta: aflatoksiinid, fumonisiinid, ohratoksiinid, desoksünivalenool, T2 toksiin ja zearalenoon [6–8]. Põllumajandusloomaliikidest on sead mükotoksiinide suhtes väga tundlikud, kuna nad puutuvad kokku teraviljapõhiste söötadega [9]. Sigade ainevahetus ei ole efektiivne mükotoksiinide detoksifitseerimisel ja väljutamisel, mis suurendab mükotoksikoosi riski. See vastuvõtlikkus sõltub ka vanusest, mükotoksiinide kontsentratsioonist söödas ja kokkupuute kestusest. Maks on organ, mida nende toksiinide allaneelamine mõjutab kõige enam [10]. Lisaks suurendavad need toksiinid sigade ja kodulindude sooleepiteeli barjääri läbilaskvust, mis võib tekitada eelsoodumuse nekrootilise enteriidi tekkeks [11] ja kaasasündinud immuunsuse vähenemisele.
CISTANCHE PARANDAB NEERU/NEERU FUKTSIOONI
Aflatoksiinid esindavad enim leiduvaid mükotoksiine toiduainetes, õliseemnetes, teraviljades, piimas, pinnases, loomades ja inimestes. Kõik aflatoksiinide tüübid pärinevad perekonda Aspergillus kuuluvatest seeneliikidest ja neid peetakse loomadele ja inimestele kõige kahjulikumate mükotoksiinide hulka [4, 10–17]. Nagu eespool mainitud, on aflatoksiinide peamised bioloogilised mõjud imetavatel põrsastel ning kasvavatel, viimistletud ja aretussigadel kantserogeensus, immunosupressioon, mutageensus, teratogeensus, vähenenud söödatõhusus ja vähene kaalutõus, maksakahjustus ja muutunud seerumi biokeemilised parameetrid [18, 19]. . Tõsised tagajärjed sigadel võivad põhjustada ägedat hepatiiti, süsteemseid hemorraagiaid, nefroosi ja surma [20], samuti vähenenud vastupanuvõimet stressile [21]. Mõned autorid on ka näidanud, et madala aflatoksiinisisaldusega toidetud sigadel ilmnesid kopsuturse nähud, vähenes söödatarbimine ja kehakaalu tõus ning oksüdatiivse dekarboksüülimisega seotud ensümaatilised aktiivsused, samuti seerumi üldvalgusisaldus, vererõhk ja leukotsüütide üldarv [18, 22-24]. Sellega seoses on vastavalt Euroopa Komisjoni direktiivile 2003/100/EÜ seatud aflatoksiin B1 (AFB1) lubatud piirnorm sigadele 0,02 mg/kg. Ohratoksiinid on sekundaarsed metaboliidid, mida toodavad perekondadesse Aspergillus ja Penicillium kuuluvad seened. Ohratoksiinide toksilisuse genotoksiliste või mittegenotoksiliste mehhanismide kohta on avaldatud lahknevaid arvamusi [25, 26]. In vitro ja in vivo uuringud näitasid, et guaniin-OTA-spetsiifilised DNA aduktid püsisid kauem kui 16 päevaneeru-tasemel, samas kui maksas ja põrnas eemaldati need 5 päeva pärast [27]. Tänu sellele avaldati nende peamine toksiline ja kantserogeenne toimeneerud[28].
Enamikul I ja II faasi detoksifitseerimisel saadud ohratoksiinide metaboliitidest on madal toksilisus. Maos hüdrolüüsitakse proteolüütiliste ensüümide toimel osa ohratoksiinidest ohratoksiiniks. Teine võimalus nende hüdrolüüsiks on laktoonitsükli avamine soolestiku leeliselistes tingimustes, mille tulemuseks on kõrge toksilisusega ühend. Tugeva albumiiniga seondumise tõttu on ohratoksiinide eliminatsioon glomerulaarfiltratsiooni teel tühine, eritumine toimub peamiselt tubulaarsekretsiooni kaudu. Tubulaarset resorptsiooni peetakse osaliselt vastutavaks ohratoksiinide rakusisese akumuleerumise eest [29,30]. Üldjuhul imenduvad ohratoksiinid põllumajandusloomadel pärast allaneelamist kiiresti läbi seedetrakti (mao ja tühisoole proksimaalne osa) passiivsel viisil, mida soodustab ohratoksiinide kõrge seondumisafiinsus plasmavalkudega, ja ioniseerimata kujul. , mis seletab nende püsivust organismis. Sigade seerumis seonduvad ohratoksiinid spetsiifilisemalt valkudega, mille molekulmass on alla 20 kDa, võimaldades neil läbida glomerulaarset basaalmembraani ja avaldada nefrotoksilist toimet. Ohratoksiinid kogunevad ka maksa ja lihastesse. Kuid,neerudon ohratoksiinide peamine ladustamiskoht, kus nende reabsorptsioon proksimaalsetes ja distaalsetes tuubulites aitab kaasa keha püsivusele ja suurenenud nefrotoksilisusele [27, 31]. Teisest küljest, kui AFB1 imendub soolestiku tasemel, jõuab see maksa, kus see muundatakse I faasi metaboliseerivate ensüümide poolt hüdroksüülimise, hüdratsiooni, demetüleerimise ja epoksüdatsiooni teel. Esimesed kolm reaktsiooni tekitavad mittetoksilisi metaboliite, neljas aga AFB1-8,9 epoksiidi, mis moodustab guaniini N7 saidis DNA-ga adukte [32]. Samuti saab AFB1 konjugeerida redutseeritud glutatiooniga reaktsioonis, mida katalüüsivad glutatioon-S-transferaasid [33] ja glükuroonhape [34]. AFB1 eritumine toimub peamiselt sapiteede kaudu, millele järgneb kuseteede kaudu [35].
Üks peamisi raskusi mükotoksiinide kontrolli all hoidmisel on see, et sööda- või teraviljapartiis on korraga rohkem kui ühte tüüpi mükotoksiine. Seega võib põrsaste ja sigade söötmine saastunud söödaga mitut tüüpi mükotoksiinidega, isegi kui need on minimaalsetes kontsentratsioonides, oma sünergilise toime tõttu põhjustada arvukalt negatiivseid tagajärgi [36–40]. Selles kontekstis võib sigade söödas leiduvate mükotoksiinide negatiivsete mõjude vähendamine ja kõrvaldamine vähendada tootmiskulusid ja seakasvatuse kahjumit. Praeguseks on välja töötatud arvukalt strateegiaid loomasöödast pärineva mükotoksiinidega saastumise ennetamiseks, vähendamiseks või isegi kõrvaldamiseks bioloogiliste, keemiliste ja füüsikaliste detoksikatsioonimeetoditega. Need meetodid võimaldavad mükotoksiinide ja nende vastavate metaboliitide lagundada ning säilitada toidu toiteväärtust, ilma et see viiks bioloogilistesse süsteemidesse muid toksilise potentsiaaliga aineid [6,14,41]. Hea lahendus on mükotoksiinide bioloogiline dekontaminatsioon, kasutades konkureerivat inhibeerimist teiste seenetüvede poolt või antioksüdantsete ühendite lisamist loomasöödale, et vähendada mükotoksiinide toksilist mõju ja/või pärssida mükotoksiine tootvate seeneliikide kasvu. Enimkasutatav meetod mükotoksiinide negatiivse mõju vastu põllumajandusloomadele on "mükotoksiinide sidujate" või "mükotoksiini modifikaatorite" lisamine, mis on poorse struktuuriga alumiiniumsilikaadid, mis on võimelised mükotoksiine adsorbeerima ja kinni püüdma [42–44]. Need on aflatoksiinide suhtes väga tõhusad ja neil on piiratud aktiivsus muud tüüpi mükotoksiinide suhtes. Kuid kuna nad on mittespetsiifilised, seovad nad ka vitamiine ja mikroelemente, tekitades puudusi [45–47]. Mõnede taimse päritoluga antioksüdantide lisamine söödale võib olla parem lahendus [48], et vähendada mükotoksiinide kahjulikku mõju loomade tervisele.
P450 tsütokroomi ensüümid, mis esinevad peamiselt maksas, sooletraktis janeerud,mängivad olulist rolli ksenobiootikumide, eriti perekondadesse 1 ja 3 kuuluvate I faasi biotransformatsioonis [49]. Mükotoksiinid võivad olla nende metaboliseerivate ensüümide substraadid, inhibiitorid või indutseerijad. Tsütokroomide P450 spetsiifilise aktiivsuse ja indutseeritavuse muutused määravad lõpuks kindlaks suhtelise muutuse ksenobiootikumi metabolismis. Mükotoksiinid võivad muuta nende valkude geeniekspressiooni, põhjustades toitainete ja muude söödast saadavate substraatravimite imendumise ja biotransformatsiooni. Sellest tulenevalt oli käesoleva töö eesmärgiks uurida Vitis vinifera (viinamarjaseemned) ja Hippophae rhamnoides (astelpaju) õlitööstusest saadud kõrvalsaaduste segu potentsiaali leevendada ohratoksiin A (OTA) kaasnevat kahjulikku kahju. ja aflatoksiin B1 (AFB1) söödas maksa- janeeru-tase põrsastel pärast võõrutamist.
Tulemused
Dieedi koostisKõrvalsaaduste jahu keemiline koostis näitas, et astelpaju jahu sisaldab rohkem valku (pluss 38,4 protsenti), rasva (pluss 66,6 protsenti) ja süsivesikuid ning vähem tuhka kui viinamarjaseemnejahu (tabel 1).
Keemiline analüüs näitas ka kahe rasvhapete, flavonoidide, fenoolhapete ja mineraalide kõrvalproduktide erinevat profiili. Seega on astelpaju jahu küllastunud rasvhapete (palmitiin- ja palmitoleiinhape), oomega{0}}-hapete (cis-oleiinhape) ja oomega-3-hapete (-linoleenhape) sisaldus suurem kui viinamarjaseemnejahus. . Seevastu viinamarjaseemnejahus on väga kõrge oomega-6-hapete (linoolhape) sisaldus (67,35 protsenti võrreldes 18,59 protsendiga astelpajujahus) (tabel 2).
Mõlemad kõrvalsaadused sisaldavad flavonoide ja fenoolhappeid, bioaktiivseid ühendeid, mis on tuntud oma antioksüdantsete, põletikuvastaste ja immunomoduleerivate omaduste poolest [50, 51]. Seega oli polüfenoolide üldkontsentratsioon viinamarjaseemnejahus (133,84 mg GAE/L) 74,8 protsenti kõrgem kui astelpajus (76,57 mg GAE/L). Erinevate polüfenoolide klasside osas sisaldab viinamarjaseemnejahu katehhiini ja vanilliinhapet rohkem kui astelpaju, samas kui astelpaju sisaldab rohkem rutiini, kvertsitriini, luteoliini, p-kumaarhapet ja ferulhapet (tabel 3). Mineraalkoostise poolest on astelpaju jahu K, Mg, Fe, Mn ja Zn sisaldus kõrgem kui viinamarjaseemnejahu. Seevastu viinamarjaseemnejahu sisaldas kaks korda rohkem vaske kui astelpajujahu. Märkimisväärne on astelpaju jahu kõrge rauasisaldus (tabel 4).
Loomade jõudlus
E2 rühma põrsaste kokkupuude ohratoksiini ja aflatoksiin B1 seguga ei avaldanud negatiivset mõju kehakaalule, kaalutõusule ja söödatarbimisele, kuna erinevused ei olnud kontrolliga võrreldes olulised. Seevastu ainult kõrvalsaaduste segu (E1) sisaldava dieedi manustamine suurendas oluliselt selle dieediga söödetud põrsaste kehakaalu võrreldes kontrollrühmaga (32,14 ± 1,63 vs. 27,09 ± 1,31) ja rühmaga E2, kellele toideti saastunud põrsaid. dieet (32,14 ± 1,63 vs 28,72 ± 1,07). Tuleb märkida, et saastunud sööta ja kõrvalsaaduste segu saanud põrsaste rühmal oli kalduvus kaalus juurde võtta võrreldes mükotoksiinijoobes põrsaste rühmaga, kuigi erinevus ei olnud oluline. Biokeemiliste parameetrite analüüs, mis iseloomustab loomade üldist tervislikku seisundit ning maksa- janeerud, registreeritud normaalväärtused võõrutatud põrsaste vanuse- ja kaalukategooria kohta. Enamiku neist rühmade vahel olulisi erinevusi ei tuvastatud (tabel 5). Siiski suurendas mükotoksiinide segu ALP ja gamma GT aktiivsust võrreldes kontrolliga ja vähendas aktiivsust kontrolltasemel kõrvalproduktide segu saanud rühmas E3.
Maksa ja neeru histoloogiaE2 rühma maksade valgusmikroskoopiline analüüs, mida toideti OTA ja AFB1 seguga saastunud põhitoiduga, näitas nekroosi fookuspiirkondi, sinusoidi laienemist ja põletikulist parenhüümi infiltratsiooni. Portaalialadel ilmnes mononukleaarne rakuline infiltratsioon ja periportaalne fibroos. Täheldati ka fibrootilisi perilobulaarseid fibrootilisi vaheseinu (joonis 1)
Mükotoksiini manustamine põhjustas struktuurimuutusineerudmis mõjutasid nii ajukoore kui medulla. Täheldati glomerulaarsete kimpude atroofiat ja Bowmanni kapsli muutust (joonis 2). Torukesed näitasid vooderdavate epiteelirakkude nekroosi, mille vahel oli põletikuliste rakkude infiltratsioon. Põletikuliste rakkude fokaalseid agregaate täheldati glomerulite ja tuubulite vahel seoses veresoonte ummistuse fookusaladega, eriti medullaarses piirkonnas. Ilmselt täheldati kollageeni proliferatsiooni peamiselt torukujulise vigastusega piirkondades. LisaksneerudE3 rühmade lõikudes, viinamarjaseemnete ja astelpaju segu sisaldava põhitoiduga ning OTA ja AFB1 seguga saastunud rühmas, ilmnesid väikesed patomorfoloogilised muutused, mis olid peaaegu sarnased kontrolliga.
Maksas vähenes CYP1A2 geeniekspressioon E2 puhul 18 protsenti ja E3 puhul 44 protsenti võrreldes E1 rühmaga. CYP2A19 geeniekspressioon oli rühmades E1 ja E2 muutmata, samas kui rühmas E3 vähenes see peaaegu 62 protsenti. Täheldati CYP2E1 geeniekspressiooni olulist tõusu 29 protsenti E1 rühmas, keda toideti põhitoiduga, millele oli lisatud viinamarjaseemne- ja astelpajujahu segu, võrreldes E2 rühmaga. Seevastu viinamarjaseemne ja astelpaju jahu (E1 rühm) seguga rikastatud põhidieedi manustamine vähendas CYP3A29 geeniekspressiooni 24 protsenti võrreldes E2 rühma tasemega. Teine kontrast täheldati CYP4A24 geeniekspressioonis: E1 rühmas vähenes 33 protsenti ja E3 rühmas 24 protsenti ning E2 rühmas, keda toideti AFB1 ja AFB1 ja AFB1 seguga täiendatud põhitoiduga, suurenes oluliselt 41 protsenti. OTA, võrreldes kontrolltasemega. MRP2 puhul oli geeniekspressiooni muster sarnane CYP4A24 geeni omaga – E1 rühmas vähenes 35 protsenti ja E3 rühmas 24 protsenti ning E2 rühmas oli geeniekspressiooni muster märkimisväärne 28 protsenti. kontrolltasemele. Sarnaselt CYP4A24 geeniekspressiooniga näitas GSTA1 geeniekspressioon olulist 14-protsendilist tõusu E2-rühmas, 9-protsendilist suurenemist E1-rühmas ja 30-protsendilist vähenemist E3-rühmas. Ilmselgelt põhjustas viinamarjaseemne ja astelpaju segu ning OTA ja AFB1 samaaegne manustamine kõigi analüüsitud geenide ekspressioonide vähenemise maksas võrreldes kontrolliga. Nende geenide ekspressioonitaseme osasneerud,võrreldes maksaproovidega ei täheldatud statistiliselt olulisi muutusi (joonis 4). Siiski võib täheldada muutusi geeniekspressiooni taseme regulatsioonis.
Joonist 4 analüüsides võis märgata, et viinamarjaseemne ja astelpaju jahu segu reguleeris CYP1A2 geeni ekspressiooni alla ja suurendas CYP2A19, CYP2E1, CYP3A29 ja CYP4A24 geeniekspressiooni ebaolulisel viisil, samas kui MRP2 ja GSTA1 geeniekspressioon jäi muutmata. . Samuti vähendas OTA ja AFB1 olemasolu põrsaste söödas CYP1A2 ja CYP2A19 geeniekspressiooni ebaolulisel viisil, samas kui MRP2 ja GSTA1 olid muutmata. Viinamarjaseemne ja astelpaju jahu ning OTA ja AFB1 segu samaaegne manustamine määras kõigi geenide ekspressioonitasemete naasmise kontrolltasemetele, välja arvatud GSTA1, mis näitas olulist tõusu võrreldes E1 rühmaga.
Arutelu
Mükotoksiinid nagu AFB1 ja OTA on looduslikud toksiinid, mis saastavad paljusid taimseid saadusi. Selle tulemusena esinevad AFB1, OTA ja nende metaboliidid toidus ja söödas, samuti loomsetes toodetes [52]. Enamikus mükotoksiinide mõju käsitlevates toksikoloogilistes uuringutes on käsitletud kokkupuudet ühte tüüpi mükotoksiinidega, arvestamata nende kombinatsiooni ja vastastikmõju, vastavalt looduses sageli esinevaid sünergistlikke või antagonistlikke mõjusid. Andmed mükotoksiinide kombinatsioonide toksiliste mõjude kohta on piiratud, seega pole mitut tüüpi toksiinidega kokkupuutumise oht endiselt teada. Mükotoksiinide, nagu AFB1, DON, ZEA, OTA, FB1 ja FB2 esinemine teraviljas, teraviljatoodetes ning sigade täiend- ja täissöödas [16] on seotud geograafilise asukoha ja kliimamuutustega, mis suurendab kaasnevat riski mükotoksiiniga saastumisega sigade söödatoodete ladustamise ja töötlemise ajal [53]. Teravilja ja muude toorainete kaassaastumine toimub tegelikus elus sagedamini kui üksiku mükotoksiiniga saastumine [7]. Näiteks on leitud aflatoksiin B1 ja ohratoksiin A koosesinemist erinevates toidu või sööda koostisosades, nagu nisu [54], oder [55], teraviljajahud [56], vürtsid [57] jne. AFB1 ja OTA vahel söödas leiti olevat umbes 1 kuni 6 [37]. Samuti jäi globaalne söödasisaldus AFB1-s ja OTA-s vastavalt määramata ja 100 ppb ning määramata ja 211 ppb [58]. Selles kontekstis uurisime välitingimuste jäljendamiseks koos nende mükotoksiinide mõjusid ja hindasime kõrvalsaaduste segu tõhusust mükotoksiinide mõju vastu võitlemisel. Looduslikud lisandid (viinamarjaseemned ja astelpaju kõrvalsaadused) valiti nende võime järgi leevendada mükotoksikoosi toidulisandite kasutamisel [59, 60].
Käesolevas uuringus ei mõjutanud põrsaste (E2 rühm) kokkupuude mükotoksiinide seguga loomade jõudlust (27,83 ± 1,1 vs. 27.09 ± 1,3 kehamassi puhul ja 1,48 ± 0 0,9 vs. 1,40 ± 0,8 sööda tarbimisel) ja biokeemilised parameetrid võrreldes kontrollrühmaga. Samamoodi on Balogh et al. [61] teatasid, et põrsad, keda toideti starteri (0–28 päeva) ja kasvataja (29–49 päeva) perioodil ligikaudu 0,4 mg/kg OTA-ga, ei registreerinud olulisi muutusi kasvataja tootmisomadustes ja toksilisuse kliinilistes tunnustes. faas. Seevastu täheldati kehakaalu suurenemise olulist vähenemist algusperioodil, mil loomad olid tundlikumad. Selles uuringus avaldas kõrvalsaaduste segu lisamine toidule märkimisväärselt loomade jõudlust (rühm E1) ja suurendas põrsaste kaalu, kui segu seostati saastunud toiduga (rühm E3).
Toksikoloogilisest vaatepunktist on IARC (Rahvusvaheline Vähiuuringute Agentuur) klassifitseerinud OTA samasse rühma (2B) inimeste jaoks mõeldud kantserogeensete ainete hulka, millel on AFB1-ga sarnane toksilisus [62]. Nende mükotoksiinide imendumise, jaotumise ja eliminatsiooni toksikokineetilised mustrid on enamasti täielikult välja selgitatud. Seevastu vaatamata hiljutistele edusammudele ei ole meie teadmisi toksikokineetiliste biotransformatsiooni etappide kohta üksikasjalikult selgitatud. Mitmed uuringud on näidanud, et AFB1 ja OTA metaboliseeritakse inimeste, sigade ja rottide maksa mikrosoomide kaudu mitmeks epimeeriks [63]. Tsütokroomide P450 spetsiifilise aktiivsuse ja indutseeritavuse muutused määravad lõppkokkuvõttes suhtelise muutuse mis tahes ksenobiootikumi metabolismis.
On leitud, et kokkupuude AFB1 ja OTA-ga vähendas CYP1A2, CYP2E1, CYP3A29 ja MRP2 geenide ekspressiooni sea maksas ning põhjustas mitmeid muutusi maksa histoloogias ja ultrastruktuuris, sealhulgas nekroosi fookuspiirkonnad, sinusoidi laienemine, põletikuline parenhüüm. infiltratsioon ja periportaalne fibroos. Seoses CYP450 isovormide geeniekspressiooni tasemega sigadelneerud,teaduskirjanduses andmed puuduvad. Selle uuringu jaoks valiti geenid CYP1A2, CYP2A19, CYP2E1, CYP3A29, CYP4A24, MRP2 ja GSTA1, kuna need kodeerivad ensümaatilise aktiivsusega või transporterifunktsiooniga valke, mis osalevad ksenobiootikumide biotransformatsiooni ja detoksifitseerimise I ja II faasis, moodustades elektrofiilse reaktiivi. metaboliidid [64]. Nende tulemuste kohaselt näib, et kõrvalsaaduse manustamine määras CYP1A2 geeniekspressiooni vähenemise ja GSTA1 geeniekspressiooni suurenemise. Sarnaseid tulemusi täheldati inimese käärsoolevähi HT-29 rakkudes, mida raviti Salicornia freitagii ekstraktiga, mis on tuntud oma antioksüdantse ja põletikuvastase toime poolest. Sel juhul toimus selle sisalduse tõttu bioaktiivsetes fenoolides CYP1A2 mRNA allareguleerimine ja GSTA1 mRNA ülesreguleerimine [65]. Erinevalt meie tulemustest suurenes CYP1A2 mRNA ja valgu ekspressioon siguriga toidetud sigade maksas [66]. Need erinevad tulemused olid tõenäoliselt põhjustatud erinevatest looduslikest ühenditest siguris, võrreldes käesolevas uuringus kasutatud kõrvalsaadustega, peamiselt klorogeen-, kohv- ja p-kumaarhapetega [67].
Teisest küljest suhtlesid OTA ja AFB1 tõenäoliselt aromaatse süsivesiniku retseptoriga ja aktiveerisid selle, mis viis selle tuuma translokatsioonini. Pärast heterodimerisatsiooni interakteerusid OTA ja AFB1 tõenäoliselt süsivesinike retseptori tuumatranslokaatoriga, heterodimeeriga, seostus ksenobiootikumidele reageerivate elementidega ja transaktiveeritud geenidega, nagu CYP1A1, CYP1A2 ja GST [68]. See ksenobiootikumidele reageeriv element on jagatud CYP1A1 ja CYP1A2 geenide vahel [69] ning nende poolt kodeeritud kahe ensüümi substraadi spetsiifilisus kattub [70]. Seamaksas on ainult CYP1A2 aktiivsus ja selle kogu tuvastatud CYP450 suhteline kogus on 4 protsenti [71]. Inimese maksas on AFB1 ja OTA CYP1A1, 1A2, 2B6, 2C9, 3A4 ja 3A5 indutseerijad [72]. AFB1, nagu ka OTA kokkupuude, tekitavad mitokondriaalset düsfunktsiooni, mida iseloomustab ROS-i tootmise suurenemine [14], mis võib suurendada TGF- 1 ekspressiooni või aktiveerida latentse TGF- 1 [73]. Võttes arvesse varasemaid tõendeid selle kohta, et TGF- 1 vähendas CYP1 ekspressiooni inimestel ja rottidel, on võimalik, et meie tingimustes toimis sama mehhanism [74]. Nii mükotoksiinide kui ka viinamarjaseemnete ja astelpaju kõrvalsaaduste samaaegse kokkupuute mõjud olid tõenäoliselt sünergistlikud ning CYP1A2 ekspressioon oli E3-s madalam kui E1, E2 ja kontrollrühmas. CYP1A2 ekspresseeritakse madalamal tasemel ekstrahepaatilistes kudedes [75].
CISTANCHE PARANDAB neeru-/NEerupuudulikkust
Theneerudon organ, mis võtab vastu umbes 25 protsenti südame võimsusest ja puhastab vereringesüsteemist ainevahetusjääke ja ksenobiootikume. Selle tühjendusprotsessi käigus koonduvad mürgised ainedneerud[76]. Põrsasneerud, oli CYP1A2 geeniekspressiooni varieeruvus sarnane E1 ja E2 ekspressioonitasemetega maksas. Huvitav on see, et E3 rühmas oli selle geeni ekspressioon kõrgem kui kontrollrühmas. See võib olla tingitud mittekanoonilise signaaliraja aktiveerimisest AhR transkriptsiooni jaoksneerudrakud [77]. Seamaksas moodustavad CYP2A19 ja CYP2E1 suhtelised kogused vastavalt 31 protsenti 13 protsenti kogu CYP450-st [71]. Sigade CYP2A19 ja CYP2E1 geenid vastutavad nii endogeensete ühendite (skatool, suguhormoonid) kui ka eksogeensete ühendite (toidukomponendid) biotransformatsiooni eest. Mõlemat tüüpi ühendeid ekspresseeritakse kõrgelt maksas ja vähemneerudja rasvkude. CYP2A19 transkriptsiooni kontrollib CAR transkriptsioonifaktor [78]. Selle inimese ortoloogi CYP2A6 kontrollivad CAR, PXR, glükokortikoidi retseptor (GR), östrogeeni retseptor, HNF 4 ja PGC-1 [79]. Samuti reguleerib CYP2A6 konstitutiivset maksaekspressiooni hiirtel HNF 4, CCAAT-kasti/võimendajat siduva valgu (C/EBP, C/EBP) ja oktameeri transkriptsioonifaktori -1 (okt{13}) koosmõju. }) [ 80 ]. Varem täheldati positiivset korrelatsiooni CYP2A19 geeni mRNA ja valgu taseme vahel [81]. Erinevalt teistest CYP 450 geenidest mängib CYP2A19 ksenobiootikumide metabolismis vähem olulist rolli, kuid osaleb rakkude reaktsioonis stressile, Nrf-2, osaledes ka CYP2A19 transkriptsioonis [82]. CYP2A19 geen on CYP2A6 geeniga võrreldes tõenäoliselt väga polümorfne [83] ja selle tootes võib esineda ulatuslik indiviididevaheline variatsioon. Varasemad uuringud näitasid, et imetajate CYP2A6 ja CYP3A4 pardi P450 ortoloogid on seotud AFB1 bioaktiveerimisega selle epoksiidiks [84]. Erinevalt nendest tulemustest ei täheldatud käesolevas uuringus olulisi muutusi CYP2A19 geeniekspressioonis E1 ja E2 rühmades, tõenäoliselt selle geeni kõrge ekspressioonitaseme tõttu põrsaste maksas. Praegu on raske seletada, miks nii mükotoksiinide kui ka viinamarjaseemne ja astelpaju segu koosmõju vähendas CYP2A19 ekspressiooni. See ekspressiooni vähenemine vähendas aga toksiliste metaboliitide tekke riski.
Sigasneerud,CYP2A19 ekspressioon on madalam kui maksas [79]. Tõenäoliselt selle madalama ekspressiooni tõttu põhjustas loomade kokkupuude viinamarjaseemne ja astelpajujahu seguga Nrf-2 indutseeritud CYP2A19 geeni ekspressiooni ülesreguleerimise luteoliini [85] ja feruulhappe [86] sisalduse tõttu. . Teisest küljest on tõendeid selle kohta, et sigade CYP2E1 transkriptsiooni reguleerimises osalevad ainult kaks transkriptsioonifaktorit, st tibu ovalbumiini ülesvoolu promootori transkriptsioonifaktor (COUP-TF1) ja hepatotsüütide tuumafaktor (HNF-1). [87]. CYP2E1, nagu ka teised ksenobiootikume metaboliseerivad P450-d, paikneb peamiselt endoplasmaatilise retikulumi (ER) membraanis ja seda saab indutseerida mitmesugustes metaboolsetes või toitumistingimustes. ER-stressi võib esile kutsuda metaboolne stress, mis on põhjustatud valgu/lipiidide biosünteesi ülekoormusest, ja oksüdatiivne stress, mis võib vallandada evolutsiooniliselt konserveerunud kompleksse homöostaatilise signaaliraja, mida tuntakse voltimata valgu vastusena (UPR) [88].
On tõenäoline, et CYP2E1 mRNA tase oli E1- ja kontrollrühmades ligikaudu sama tänu palmitiinhappe [89], linool- ja linoleenhapete [90] antagonistlikule toimele, mis suurendas seda geeni transkriptsiooni ning vanilje- ja p-kumaarhapped, mis seda vähendasid [65]. Hiljuti tõestati, et OTA-d sisaldav sööt muutis partide soolestiku mikrobiootat, mõjutades nii pimesoole mikrobiota mitmekesisust ja koostist kui ka soolebarjääri. Selle tulemusena sisenesid gramnegatiivsed bakterite päritolu lipopolüsahhariidid verre ja maksa, põhjustades maksapõletikku [91]. Immuunvahendatud maksakahjustuse korral vähenes CYP2E1 ekspressioon [92]. Selline olukord võib tekkida E2 rühmas. On tõenäoline, et kahe mükotoksiini ja toidust saadavate kõrvalsaaduste kumulatiivne toime vähendas CYP2E1 ekspressiooni E3 rühma maksas. Aastalneerud,vabu rasvhappeid, nagu palmitaat, oleaat ja linoleaat, talletatakse nefronis [93] ning need happed suurendasid tõenäoliselt CYP2E1 geeni ekspressioonineerudE1 rühmast võrreldes kontrolltasemega. Pfohl-Leszkowiczi ja Manderville'i [25] järgi moodustab OTA DNA-ga adukti, tekitadesneeru-genotoksilisus ja kantserogenees. On tõenäoline, et OTA kõrge tase stimuleeris CYP2E1 geeni ekspressioonineerudE2 rühmast võrreldes kontrolltasemega. E3 rühmas näib, et kahe mükotoksiini ja toidu kõrvalsaaduste koosmanustamisel oli antagonistlik toime, kusjuures CYP2E1 geeni ekspressioon naasis kontrolltasemele. Lisaks näitas E3 rühma histoloogiline hindamine, et viinamarjaseemne- ja astelpajuõlist saadud kõrvalsaaduste segu leevendas aflatoksiin B1 ja ohratoksiin A põhjustatud kahjulikke kahjustusi maksas janeeru-tase põrsastel pärast võõrutamist. CYP2E1, nagu ka teised ksenobiootikume metaboliseerivad P450-d, paikneb peamiselt ER membraanis ja seda saab indutseerida mitmesugustes metaboolsetes või toitumistingimustes [89]. CYP2E1 geeni reguleerimine rühmas E1 oli tõenäoliselt tingitud kumariinist pärinevate ühendite hüdroksüülimisest, mida katalüüsivad CYP2A ensüümid, mida peetakse CYP2 ensüümide esinemise spetsiifilisteks indikaatoriteks [94], koos p-kumaariga. hapet leidub viinamarjaseemnete ja astelpaju kõrvalsaadustes.
Sigade puhul on CYP3As ensüümide olemasolu kohta väga vähe teadaneerukude,ja nende indutseeritavuse kohta pole midagi teada [95]. Imetajate CYP3A alamperekonnas on tuvastatud mitu geeni (näiteks viis rottidel ja neli inimestel), kuid nende geenide ekspressioonneerukudedon vähe uuritud [96]. Mis puudutab geeniekspressiooni, siis Ayed-Boussema et al. (2012) [63] ja Gonzalez-Arias jt. [97] kirjeldasid ekspressioonitasemete tõusu kõigis testitud tsütokroomides (CYP3A4, 2B6, 3A5 ja 2C9) inimese primaarses hepatotsüütide kultuuris. Varasemad uuringud on teatanud erinevatest tulemustest AFB1 ja OTA mõju kohta primaarselt kultiveeritud inimese hepatotsüütidele, kus nende mükotoksiinide suurenev kontsentratsioon indutseeris selgelt CYP3A4 ja CYP2B6 mRNA tasemeid annusest sõltuval viisil [63]. Seevastu on leitud, et OTA ja AFB1 olemasolul maksas (joonis 3, rühm E2) väheneb CYP3A29 ekspressioonitase võrreldes kontrolltasemega, võib-olla AhR aktiveerimise tõttu [98]. Need andmed erinevad Zepniku jt andmetest. [99], kes teatasid OTA hüdrolüüsi suurenemisest roti maksa mikrosomaalsete ensüümide poolt, eriti P450 3A1/2 ja 3A4 puhul, mis viitab sellele, et seda geeniekspressiooni moduleeritakse liigist sõltuval viisil. Mõnel juhul võib P450 ensüümide inhibeerimine polüfenoolide poolt avaldada kemopreventiivset toimet, kuna P450 ensüümid võivad kantserogeene nende loomuliku metaboolse aktiivsuse käigus aktiveerida. Ksenobiootiliselt metaboliseerivate I faasi ensüümide inhibeerimine võib olla üks looduslikult esinevate tsükliliste polüfenoolide kemopreventiivse toime sihtmärk. Maksas täheldatud CYP4A24 suurenemine võib olla füsioloogiline reaktsioon ebatavalises lipiidide akumulatsiooni ja CYP2E1 aktiivsuse puudumise kontekstis, kuna CYP2E1 ja CYP4A on indutseeritavad maksa mikrosomaalsed tsütokroomid P-450, mis osalevad rasvhapete hüdroksüülimises. happed ja mõlemad võivad käivitada lipiidide peroksüdatsiooni automaatse paljunemise protsessi. Need võivad olla üksteist täiendavad, põhjustades koostoimeid üksikute ensüümide regulatsioonis [100]. Seetõttu on selge, et CYP4A valgud on maksa lipiidide metabolismi häiretele reageerimisel võtmetähtsusega vahendajad [101]. CYP4A24 taseme langus veresneerudtõenäoliselt põhjustab mükotoksiinidega saastunud dieedi tõttu maksa toksilisi mõjusid, mis tähendab, et CYP4A24 reguleerib maksa ER stressi [102, 103].
CISTANCHE PARANDAB NEERU/NEERU VALU
Käesolevas uuringus suurendas viinamarjaseemnete ja astelpaju jahu kõrvalsaaduste segu lisamine ekspressioonitasetneerud,mis eeldatavasti soodustaks eliminatsiooniprotsesse ja rakusiseste ainete tasakaalu säilitamist [104]. Veelgi enam, OTA imendus soolestikus, kus mängib olulist rolli mitme ravimiresistentsuse valk 2 (MRP2 geen), mis toimib ksenobiootilise väljapoole transporterina, et vähendada suukaudset biosaadavust ja toksiinide koormust elunditesse ning seeläbi OTA toksilisust. Kui OTA jõuab vereringesse, võib see jõuda ka teistesse organitesse, näiteks maksa, ja MRP2 transporter on taas peamine esmane aktiivne transporter, mis osaleb anioonsete konjugaatide ja ksenobiootilise ekstrusiooniga rakuvälisesse ruumi, mis aitab kaasa sapi moodustumisele ja sellele järgnevale toksiini eliminatsioonile. 97, 105]. MRP2 transporter esineb ka enterotsüütide apikaalsetes membraanides,neerud-proksimaalsed tuubulid ja muud rakud [105]. OTA toksilisus on omistatud selle isokumariiniosale ja on hästi teada, et OTA inaktiveeritakse või bioaktiveeritakse tsütokroom P450 ensüümide poolt [29]. Varem seostati OTA esinemist söödas nefrotoksilisuse tekkega, mida rottidel on seostatudneeru-adenoomid janeerudkasvajad [97]. Käesolevas uuringus leiti MRP2 ekspressiooni vähenemine maksas, mis viitab mükotoksiinide sekretsiooni kahjustusele E2 rühmas.
Rottidel eritus OTA proksimaalsetes tuubulites 15 protsenti vähem.neerud,samas kui aminohapete proksimaalne tubulaarne transport ei olnud kahjustatud [97, 106]. Seetõttu võib selles uuringus leitud MRP2 vähenemine maksas olla mehhanism, mille kaudu mükotoksiinid saavutavad in vivo kõrge biosaadavuse protsendi. Sel viisil suurendataks põrsaste AFB1 ja OTA kokkupuudet, mis aitaks kaasa hepatotoksilisusele. Arvestades OTA ja AFB1 nefrotoksilist potentsiaali, võib MRP2 geeniprodukti vähenemine oluliselt mõjutada ka proksimaalset tuubulit, mis viib OTA eliminatsioonivõime vähenemiseni [97]. Selle hüpoteesi toetamiseks on aga vaja täiendavaid uuringuid AFB1 ja OTA transporteri mehhanismi kohta. Metaboolse detoksikatsiooni II faasis konjugeeritakse algne ksenobiootiline ühend või I faasi käigus modifitseeritud vahemetaboliidid, et need sobiksid eritumiseks. Glutatioon S transferaasid (GST) ja UDP glükosüültransferaasid (UGT) aitavad kaasa II faasi töötlemisele [107].
Viinamarjaseemnete ja astelpaju kõrvalsaaduste segu olemasolul seasöödas suureneb GSTA1 ekspressioonitase maksas märkimisväärselt, tõenäoliselt antioksüdantidele reageeriva elemendi (ARE) ja -NF-le reageeriva elemendi (-NF-RE) tõttu. vastavalt, mis fenoolsete antioksüdantide juuresolekul aktiveerivad GST isovormid, ilma et oleks vaja arüülsüsivesiniku (Ah) retseptoreid [108]. Üllataval kombel Ghadiri et al. (2019) [109], täheldati AFB1--vahendatud GSTA1 mRNA allareguleerimist lehma maksas antioksüdandi juuresolekul. Varasemad uuringud [110] näitasid, et OTA ja AFB1 konkureerivad samade CYP450 ensüümide pärast, mis esindavad AFB1 bioaktivatsiooni teed, kusjuures AFB1-DNA adukte toodetakse vähem. Selle konkurentsi tõttu võib AFB1 tõenäoliselt konjugeerida redutseeritud glutatiooniga reaktsioonis, mida katalüüsivad GST ensüümid, kusjuures nende kodeerivad geenid on ülesreguleeritud. AFB1 võib osaleda teist tüüpi II faasi reaktsioonides, st glükuroniseerimises ja sulfaadimises, samas kui OTA on peamiselt konjugeeritud redutseeritud glutatiooniga [72]. Lisaks suurendas kahe mükotoksiini (AFB1 ja OTA) sööt vastusena samaaegsele manustamisele sigadele oksüdatiivse stressi biomarkerite teket. Seetõttu aktiveerusid kaitsemehhanismid, mis soodustasid kohanemist ja ellujäämist vastusena oksüdatiivsele stressile [111]. Näiteks võivad ROS ja oksüdandid aktiveerida GST isovormide transkriptsiooni ARE kaudu [108], mida on täheldatud nii maksas kui kaneerudGSTA1 geeni ekspressioonitaseme tõusu kaudu.
Järeldused
Meie andmed näitasid põrsaste vahel erinevusineerudja maksa reaktsiooni kohta nii mükotoksiinide kui ka selles uuringus kasutatud kõrvalsaaduste suhtes. Üldiselt vähendasid antioksüdantse toimega kõrvalsaadused analüüsitud CYP mRNA ekspressiooni maksas ja suurendasid sedaneerud. Mõlemas elundis põhjustas põrsaste samaaegne kokkupuude OTA ja AFB1-ga geeniekspressiooni suurenemise või vähenemise sõltuvalt geenitüübist. Viinamarjaseemne- ja astelpajujahu lisamine OTA- ja AFB1-joobes sigade toitumisse vähendas CYP P450 geeniekspressiooni, mis viitab nende mükotoksiinide bioaktivatsiooni vähenemisele, mille tulemuseks on tõenäoliselt mõlema organi toksilisuse vähenemine, kuna histoloogilised uuringud on näidanud. Need leiud viitavad sellele, et viinamarjaseemne- ja astelpajujahu jäätmed on paljulubav allikas ohratoksiin A ja aflatoksiin B1 kahjuliku mõju vastu võitlemisel. Kuigi on vaja täiendavat tööd, et selgitada välja mehhanismid, mille abil viinamarjaseemne ja astelpaju kõrvalsaadused mõjutavad AFB1 ja OTA biotransformatsiooni ning seega toksiliste metaboliitide teket, näib, et kaitsvat toimet vahendab vähemalt osaliselt maksa antioksüdantide kaitse tugevnemine. janeerudtasemel.
Materjalid ja meetodid
Eksperimentaalne disain ja näidiste koguNelikümmend ristand TOPIGS-40 hübriid (♀ Large White × Hybrid (Large White × Pietrain) ×♂ Talent, peamiselt Duroc) põrsast pärast võõrutamist keskmise kehamassiga 9,11 ± 0.{{16 }}3 kg määrati kolmele katserühmale (E1, E2, E3) ja ühele kontrollrühmale (C), mida hoiti aedikutes (kaks kordust viiest siga aediku kohta ühe ravi kohta) ja neid toideti katsetoiduga 3{{19} } päeva. Katse ajal pakuti sööta ja vett ad libitum. Põhitoitu serveeriti kontrollina ja see sisaldas tavalist segasööta starterpõrsastele ilma mükotoksiinita (mais 68,46 protsenti, sojajahu 19 protsenti, maisigluteen 4 protsenti, piimaasendaja 5 protsenti, L-lüsiin 0,3 protsenti, DL-metioniin 0,1 protsenti, lubjakivi 1,57 protsenti, monokaltsiumfosfaat 0,35 protsenti, sool 0,1 protsenti, koliini eelsegud 0,1 protsenti ja 1 protsenti vitamiini-mineraalide eelsegusid). Katserühmi toideti järgmiselt: E1 – põhitoit pluss kahe kõrvalsaaduse (viinamarjaseemne- ja astelpajujahu) segu (1:1) 5 protsendi ulatuses, asendades maisi- ja sojajahu; E2 – põhitoit, mis on kunstlikult saastunud mükotoksiinidega (segu 62 ppb aflatoksiin B1- AFB1 ja 479 ppb ohratoksiin A-OTA); ja E3 – põhitoit, mis sisaldab 5 protsenti (1:1) viinamarjaseemne- ja astelpajujahu segu ning on saastunud AFB1 ja OTA seguga. OTA ja AFB1 mükotoksiinide segu pakkusid lahkelt dr. Boudra ja dr. Morgavi INR A-st, Clermont Ferrandi keskusest, ning see saadi Aspergillus flavus'e ja Aspergillus ochraceous'e kasvatamisel nisul, nagu on juba kirjeldanud Boudra et al. [112]. Saadud saastunud materjal lisati E2 ja E3 rühmade dieeti, mille tulemuseks oli lõppkontsentratsiooniks 479 ppb OTA ja 62 ppb AFB1. Kõigi katserühmade loomadel oli katseperioodi igal päeval (30 päeva) vaba juurdepääs ravisöödale ja veele. Viinamarjaseemnejahu ja astelpajujahu pakkusid kaks kohalikku reklaami, SC OLEOMET-SRL ja BIOCATINA, Bukarest, Rumeenia. 4 nädala pärast tapeti loomad riikliku loomade toitumise ja bioloogia uurimis- ja arendusinstituudi eetikakomitee heakskiidul Balote s , ti, Rumeenia (eetikakomitee nr 118/02.12.2019) ja kooskõlas Rumeenia seadus 206/2004 ja EL nõukogu direktiiv 98/58/EÜ katsetel kasutatavate loomade käitlemise ja kaitse kohta. Selle uuringu katseperioodi lõpus mõõdeti tootlikud parameetrid, kaal ja söödakulu. Maksa janeerudproovid koguti neljalt loomalt rühma kohta ja perfundeeriti vere eemaldamiseks jääkülma soolalahusega. Fragmendid ~50 mg paremast maksasagarast janeeru-ajukoor (igast kolm) koguti RNAlateri stabiliseerimisreagendisse (Qiagen, Germantown, Maryland) ja säilitati seejärel temperatuuril –80 ◦ C kuni RNA eraldamisetapini. Eetilistel põhjustel, iga looma maksimaalse kasutamise, loomade kadumise minimeerimise ja statistilise analüüsi tõttu vähendati isendite arvu nii palju kui teaduslikult võimalik. Hea teadus ja hea katsekujundus aitavad vähendada kõigis uurimisuuringutes kasutatavate loomade arvu, võimaldades teadlastel koguda andmeid minimaalse nõutava loomade arvuga [113].
Voo iseloomustusSöödasöötade baaskeemilist koostist (kuivained, toorproteiin, toorrasv, toorkiud ja tuhk) analüüsiti vastavalt Rahvusvahelise Standardiorganisatsiooni meetoditele (SR ISO 6496/2001, Standardised Bulletin (2010). http://www. asro.ro (kasutatud 13. veebruaril 2021)). Toidu kõrvalsaaduste bioaktiivsed ühendid, nagu polüfenoolid, polüküllastumata rasvhapped (PUFA) ja mineraalid, määrati Folin-Ciocalteu reaktsiooni, HPLC-UV-Vis ja gaasikromatograafia abil, nagu on kirjeldanud [113, 114] autorid. Antioksüdantne aktiivsus määrati DPPH meetodil, nagu on eelnevalt kirjeldanud [115] autorid.
Plasma biomarkerite analüüs30. päeval võeti tühja kõhuga põrsastelt aseptiliselt vereproovid. Maksa funktsionaalsust kajastavad markerid (aspartaattransaminaas-AST, alaniin-transaminaas-ALT, gamma-glutamüültransferaas-GGT, üldvalk, aluseline fosfataas-AKL) ja neerud (albumiin, kreatiniin) määrati pärast vere tsentrifuugimist Clinical Chemistry töölauaga. analüsaator Horiba Medical—ABX Pentra 400, (Irvine, CA, USA).
Valgusmikroskoopia uuringMaksa janeerudbiopsiad fikseeriti 4-protsendilises fosfaatpuhverdatud formaldehüüdi lahuses, dehüdreeriti, selgitati ja lisati parafiiniplokkidesse. 5 µm lõike töödeldi vastavalt Leica protokollile rutiinselt vastavalt hematoksüliin-eosiini ja Gomori trikroomiga (Leica Biosystems, 38016SS1, Nussloch, Saksamaa) värvimiseks. Mikroskoopilisi lõike analüüsiti Olympus BX43 mikroskoobiga, mis oli varustatud digitaalkaameraga Olympus XC30. Maksa ja maksa histopatoloogilised muutusedneerudliigitati kahjustuste raskusastme järgi 1.–4. astmesse kuuluvateks, nagu eelnevalt kirjeldatud [116]. Maksa puhul, 1. aste: normaalne näitaja; 2. aste: normaalsed hepatotsüüdid, veidi laienenud sinusoidid ja ummikud; 3. aste: vakuoleeritud hepatotsüüdid, laienenud sinusoidid ja ummikud; mõõdukas kollageeni proliferatsioon; aste 4: nekroos, põletikulised infiltraadid, kollageeni proliferatsioon. Neerude puhul, 1. aste: normaalne aspekt; aste 2: kerged torukujulised/glomerulaarsed vigastused, põletik ja kollageeni proliferatsioon; 3. aste: kerged tubulaarsed/glomerulaarsed vigastused, põletik ja kollageeni vohamine; aste 4: märgatavad tubulaarsed/glomerulaarsed vigastused, põletik ja kollageeni proliferatsioon. "Keskmine hindamisväärtus" (MAV) arvutati kõigi andmete keskmisena katserühma kohta.
RNA eraldamineKogu RNA eraldamine viidi läbi 10 mg koest, kasutades RNeasy Plus Universal Mini Kit (Qiagen) järgides tootja protokolli. Veelgi enam, see sisaldas veerus oleva DNaasi lagundamisetappi. Pärast RNA eraldamist tehti alikvoodid, et vältida külmumis-sulatustsüklite põhjustatud lagunemist. Kogu RNA kontsentratsioon ja puhtus määrati spektrofotomeetriga NanoDrop 8000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA).
RNA terviklikkuse number (RIN)RNA proovide RIN väärtused määrati, kasutades Agilent RNA 6000 NanoKit (Agilent, Santa Clara, CA, USA) ja Agilent 2100 Bioanalyzerit, kasutades tootja protokolli. Proove, mille RIN väärtused olid alla 8, edasisesse analüüsi ei kaasatud ja isoleerimisetappe korrati.
PöördtranskriptsiooncDNA sünteesiks allutati 1000 ng kogu RNA-st pöördtranskriptsioon, kasutades iScript cDNA sünteesikomplekti (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). 4 µl reaktsioonisegu ja 1 µl pöördtranskriptaasi segati 1 µl RNA proovidega ja lisati RNaasi vaba veega kogumahuni 20 µl. RNA lõppkontsentratsioon oli 1000 ng reaktsiooni kohta. Reaktsioon viidi läbi Veriti 96-kaevu termotsükleri abil (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) järgmise programmiga: üks tsükkel 25 °C 5 minutit, üks tsükkel 42 °C 30 minutit ja üks tsükkel 85 ◦ C 5 minutit. cDNA proovide kontsentratsioon ja puhtus määrati spektrofotomeetriga NanoDrop 8000 (Thermo Scientific).
Krundi disainKuna puuduvad andmed geenide kohta, mis on seotud hepato-nefrotoksilisusega võõrutatud sigade mükotoksiinidega kokkupuutel, kavandati praimerijärjestused (tabel 7) in silico, kasutades Primer3Plusi [59] ja kontrolliti programmiga BLAST [117]. Need, mis on sihtjärjestuse suhtes kõige spetsiifilisemad, valiti selleks, et amplifitseerida CYP1A2, CYP2A19, CYP2E1, CYP3A29, CYP4A24, MRP2 ja GSTA1 geene ning kolme võrdlusgeeni, mis kodeerivad TATA-boksi siduvat valku, ribosomaalset valku L4 ja beeta {19}}mikroglobuliin Sus scrofas. Praimerite anniilimistemperatuurid määrati temperatuurigradient-PCR abil.
Reaalajas PCRReaalajas PCR-reaktsioon viidi läbi iCycler iQ Real-Time PCR-tuvastussüsteemis (Bio-Rad), kasutades iQ SYBR Green SuperMixi (Bio-Rad). 96-süvendiga plaadil 1 µl 1{{10}}0 ng/µL cDNA-d, 12,5 µL iQ SYBR Green SuperMix (Bio-Rad), 0,5 Lisati ui 20 pmol/uL päripraimerit, 0,5 uL 20 pmol/uL pöördpraimerit ja 10,5 uL MilliQ vett. Kogumaht oli 25 µl. Võimendusprogramm koosnes 1 tsüklist 95 ◦ C 5 minutit, 45 tsüklit 95 ◦ C 30 s 55/56 ◦ C 30 s, 72 ◦ C 45 s ja 85 tsüklit 55 ◦ C, seadepunkti temperatuuri tõstmisega 0,5 ◦ C võrra tsükli kohta 10 sekundi jooksul. Proovid käitati ja lävitsüklite (Ct) väärtused registreeriti. Tehti ka sulamiskõverad.
Andmete analüüsCt väärtusi töödeldi vastavalt jaotisele "The MIQE Guidelines: Minimal Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments" [118], kasutades OpenOffice Calci vastavalt 2- ∆∆ Ct meetodile, mida on kirjeldanud Livak ja Schmittgen (2001). ) [119]. Võrdlusgeenid (TBP, RPL4 ja B2M) valiti selleks, et neid saaks stabiilselt ekspresseerida erinevates koetüüpides ja sigade proovide töötlemisel [120, 121]. Suhteline ekspressiooniväärtus (2 − ∆∆Ct ) saadi normaliseerimise teel, lahutades igast huvipakkuvast geenist võrdlusgeenide aritmeetilise keskmise. Tehnilised kordused keskmistati enne statistilist analüüsi. Andmed on illustreeritud rühmade keskmiste väärtustena (n=4) ± keskmise standardvea hälve (STDEV). Kõiki andmeid analüüsiti statistiliselt, kasutades ühesuunalist ANOVA meetodit, mis viidi läbi GraphPad Prism 3.03 tarkvaraga (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Kõigi rühmade post-hoc võrdlused viidi läbi, kasutades Bonferroni testi. Statistiline olulisus (p väärtus) esitati kõigi rühmade jaoks erinevalt kontrollrühmast (C).
