TRPM6 olulised rollid vererõhu ööpäevases reguleerimises
Mar 19, 2022
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Neeru ioonikanali TRPM6 tähtsus reniini ööpäevases sekretsioonis vererõhu tõstmisel
Yosuke Funato, Daisuke Yamazaki, Daisuke Okuzaki, Nobuhiko Yamamoto ja Hiroaki Miki
Vererõhkon igapäevase mustriga, aktiivsel perioodil kõrgemad väärtused. Selle tõus aktiivse perioodi alguses suurendab oluliselt surmaga lõppevate kardiovaskulaarsete sündmuste riski. Neeru sümpaatiliste neuronite poolt stimuleeritud reniini sekretsiooni peetakse selle protsessi jaoks oluliseks; selle regulatiivne mehhanism jääb aga suures osas teadmata. Siin näitame selle tähtsustmööduv retseptori potentsiaal melastatiiniga seotud 6 (TRPM6), Mg2 pluss-läbilaskev katioonikanal, mis suurendab reniini sekretsiooni aktiivsel perioodil.TRPM6ekspressioon on märkimisväärselt vähenenud hüpotensiivsete Cnnm{0}}puudulike hiirte distaalses keerdunud tuubulis. Loome neeruspetsiifilisedTRPM6-puudulikud hiired ja jälgige nende vähenemistvererõhkja selle ööpäevase variatsiooni kadumine. Järjekindlalt ei suurene reniini sekretsioon aktiivsel perioodil. Lisaks tühistatakse reniini sekretsioon pärast neuronaalse stimulatsiooni sihtmärgiks oleva -adrenoretseptori farmakoloogilist aktiveerimist ja retseptori ekspressioon väheneb reniini sekreteerivates rakkudes. Need tulemused näitavad nende olulist rolliTRPM6 aasta ööpäevases regulatsioonisvererõhk.
Arvatakse, et maailmas on ligikaudu miljardil inimesel hüpertensioon, mis suurendab märkimisväärselt erinevate haiguste, sealhulgas potentsiaalselt surmaga lõppevate haiguste, nagu südame isheemiatõbi ja insult, riski. Need hüpertensiooniga seotud surmaga lõppevad juhtumid esinevad teadaolevalt sageli varahommikul, aktiivse perioodi alguses, kuiverisurvettõuseb järsult. Arvatakse, et neerude sümpaatiliste neuronite käivitatud reniini sekretsioon mängib selles otsustavat rolli.vererõhkkõrgust, kuid selle regulatsioonimehhanismi ei mõisteta hästi².
On üldtunnustatud, et mõned toidust saadavad mineraalid, eriti naatrium ja kaalium, mängivad olulist rolliverisurvet. Magneesium on oluline element, mis osaleb mitmesugustes bioloogilistes tegevustes. Epidemioloogilised uuringud on näidanud olulist pöördvõrdelist seost toidu magneesiumisisalduse ja hüpertensiooniriski vahel3-6. Veelgi enam, magneesiumi eritumine uriiniga, mis eeldatakse olevat ligikaudu tasakaalus magneesiumi imendumisega soolestikus, on pöördvõrdelises korrelatsioonis hüpertensiooni riskiga. Need leiud viitavad tihedale seosele organismi magneesiumi homöostaasi javererõhkregulatsioon, tuues esile Mg2 pluss kanalite ja/või transporterite tähtsuse reguleerimiselvererõhk.
Suur kogus magneesiumi imendub neerudes pidevalt tagasi. Suurem osa glomerulaarfiltraadis sisalduvast magneesiumist imendub tagasi Henle ahela paksus tõusvas harus, kuid reabsorptsiooni viimane etapp toimub distaalses keerdunud tuubulis (DCT)8. Viimane protsess on rangelt reguleeritud, et reguleerida reabsorptsiooni kogust magneesiumi homöostaasi säilitamiseks sobivale tasemele. Hüpomagneseemia sümptomitega kaasasündinud haiguste genoomianalüüsid on avastanud mitmeid selles protsessis osalevaid võtmemolekuleTRPM6, kodeeringmööduv retseptori potentsiaal melastatiiniga seotud 6(TRPM6), mis on muteerunud retsessiivse hüpomagneseemiaga ja sekundaarse hüpokaltseemiaga patsientidel2,10.TRPM6moodustab Mg2 pluss läbilaskva ioonikanali, mis paikneb DCT rakkude apikaalsel membraanil ja vahendab Mg2 pluss sissevõttu torukujulisest luumenist1. Teine võtmemolekul on tsükliin M2 (CNNM2) ja Mg2 pluss transporter, mis paiknevad DCT rakkude basolateraalsel membraanil 12, 13. Cnnm2 mutatsioonid põhjustavad perekondlikku domineerivat hüpomagneseemiat, mida iseloomustavad magneesiumi reabsorptsiooni defektid neerudes2. Cnmm2-puudulikel hiirtel on sarnased hüpomagneseemia sümptomid koos magneesiumi kadumisega neerudes4. CNNM2 täpne molekulaarne roll on endiselt vastuoluline, kuid mitmed tõendid viitavad sellele, et see vahendab Mg2 pluss väljavoolu DCT rakkudest läbi basolateraalse membraani5, aidates sellega kaasa magneesiumi reabsorptsioonile. Cnnm{16}puudulike hiirte edasised analüüsid on näidanud, et nendel hiirtel on ka oluliselt madalamverisurvetkui kontrollhiired4. Küll aga mehhaanilised detailid ja teiste Mg2 pluss kanalite/transporterite kaasamine sellesseverisurvetregulatsioon jääb teadmata.
Samuti on teada, et neerude DCT mängib olulist rolliverisurvetreguleerimine, sest see absorbeerib oluliselt naatriumi ja reguleerib kehavedeliku mahtu6. DCT apikaalsel membraanil ekspresseeritakse mitmeid katioonkanaleid/transportereid, nagu Na-Cl kaastransporter (NCC), epiteeli naatriumikanal (ENaC) ja Na plus /H pluss soojusvaheti 2 (NHE2). need valgud vahendavad Na pluss sissevõttu DCT rakkudesse torukujulisest luumenist. Seejärel ekstrudeeritakse intratsellulaarne Na plus rakkudest läbi basolateraalse membraani Na plus /K plus -ATPaasi abil, et saavutada selle reabsorptsioon. Lisaks otsesele osalemisele kehavedeliku mahu reguleerimises, asub DCT kõrvuti makula densaga, mis kontrollib reniini sekretsiooni – hormooni, millel on peamine roll orkestreerimisel.vererõhkmäärus17,18. Tundes uriini Cl-taset, stimuleerivad makula densa rakud läheduses asuvaid juxta-glomerulaarseid (JG) rakke reniini sekreteerima.
Selles töös teostame hüpotensiivsete Cnnm{0}}puudulike hiirte neerudega transkriptsioonianalüüse. Leiame märkimisväärse languseTrpm6, mis sunnib meid looma neeruspetsiifilisiTrpm6- puudulikud hiired. Ootamatult avastasid selle hiiretüve analüüsid fenotüübi, mis erineb kvalitatiivselt Cnnm2-puuduliku fenotüübi omast: tsirkadiaani variatsiooni kadu.verisurvet. Samuti leiame, et see fenotüüp on põhjustatud reniini, avererõhk- tõstev hormoon, mille tase veres on aktiivse faasi ajal tavaliselt kõrgenenud.
cistanche kulturism
Tulemused
alareguleerimineTRPM6 (mööduv retseptori potentsiaal melastatiiniga seotud 6)väljendus Cnnm{0}}puudulike hiirte puhul. Et uurida selle molekulaarset mehhanismivererõhkCnnm{0}}puudulike hiirte arvu vähenemist, teostasime DNA mikrokiibi analüüse, et uurida geeniekspressiooni muutusi Cnnm2f/il neerudes; Kuus2-Cre hiirt, kellel puuduvad neerus mõlemad Cnnm2 alleelid4. Erinevalt ekspresseeritud geenide hulgast (tabel 1) otsustasime analüüsida Pvalb jaTrpm6, mis mõlemad on väljendatud DCT919-s. Kvantitatiivsed PCR (qPCR) analüüsid näitasid sedaTrpm6ekspressioon vähenes sarnaselt mõlema Cnnm2fi neerudes; Kuus2-Cre ja Cnnm2 plus / hiirt. Kuna nii Cnnm2 pluss /A kui ka Cnnm2fi/; Kuus2-Cre-hiirt olid hüpotensiivsed4, analüüsisimeTRPM6 väljendus üksikasjalikumalt. Neerulüsaatide immunoblotanalüüsid kinnitasid olulist vähenemistTRPM6valgu tasemel Cnnm2-defitsiit, kuigi NCC ja fosforüülitud NCC (aktiivne vorm) taset märkimisväärselt ei mõjutanud, kinnitati CNNM2 ekspressioon järjestikuste immunosadestamise ja immunoblotanalüüsidega). VähenemineTRPM6Cnnm2f/i neerudes; Kuus2-Cre hiirt kinnitasid ka immunofluorestsentsanalüüsid.
Uurisime kaTRPM6ekspressioon hiirtel, kellel puudub CNNM4, millel on samuti hüpomagneseemia sümptomid,20 kuid need on suurenenudvererõhk4. Immunoblotanalüüs ja immunofluorestsentsanalüüsid näitasid, etTRPM6ekspressioon suureneb Cnnm{0}}puudulike hiirte DCT rakkudes, mis viitab sellele, etTRPM6väljendus on tihedalt seotudvererõhkväärtused, kuid see ei ole otseselt seotud vere magneesiumitasemega.
aasta määrusTRPM6ekspressioon rakusisese Mg2 plussiga DCT rakkudes. Molekulaarse mehhanismi iseloomustamiseksTRPM6 Cnnm{0}}puudulike hiirte alareguleerimisel kasutasime DCT-st tuletatud rakuliini MDCT21, mis ekspresseerib Cnnm perekonna geenide hulgas valdavalt Cnnm2 ja mõõdukalt Cnnm3 ja Cnnm4. Kuna CNNM2 ja CNNM4 omavad tugevat Mg2 ja CNNM4 väljavoolu aktiivsust, samas kui CNNM3-l puudub Mg2 pluss väljavoolu aktiivsus15, teostasime kas Cnnm2, Cnnm4 või mõlema väikese segava RNA (siRNA) vahendatud knockdowni. Cnnm2 mahajätmine suurendas intratsellulaarset Mg pluss taset ([Mg pluss ]) ja samaaegne Cnnm4 katkestamine viis keskmise [Mg2] vähese tõusuni; väärtus, mis ei olnud statistiliselt oluline. Järgmisena uurisimeTrpm6ekspressiooni qPCR abil ja leidis märkimisväärse languse pärast Cnnm2 koputamist ja palju suuremat langust pärast Cnnm2 ja Cnnm4 kahekordset koputamist. SeetõttuTrpm6ekspressiooni näib olevat negatiivselt reguleeritud intratsellulaarse Mg2 pluss tasemega, mis on kooskõlas eelmiste aruannetega . Mg2 plusi olulisuse otseseks uurimiseks kultiveerisime MDCT rakke erineva kontsentratsiooniga Mg2 pluss 0,1 h söötmes, mis viis ekstratsellulaarse Mg2 pluss kontsentratsiooni vähenemiseni intratsellulaarse Mg2 pluss tasemeni ja suurenemiseni.Trpm6ekspressiooni, mis viitab Mg2 pluss supresseerivale rollile. Topeltknockdowni (Cnnm2/Cnnm4) MDCT rakkude korralTrpm6ekspressioon suruti alla Mg2 plussi vähenemisega
pluss kontsentratsioonid kuni 0,2 mm, kuid edasine vähendamine tühistas pärssiva efekti; nii rakusisene Mg2 pluss kuiTrpm6tasemed ei erinenud oluliselt kontroll-siRNA-ga transfekteeritud rakkudest nii 0,1 kui ka 0,02 mM tingimustes. Need tulemused näitavad Mg2 pluss-sõltuvat regulatiivset mehhanismiTrpm6väljend, mis selgitabTrpm6alareguleerimine Cnnm{0}}puudulike hiirte neerudes.
Tingimuslik katkestamineTrpm6 (mööduv retseptori potentsiaal melastatiiniga seotud 6)neerus. Järgmisena võtsime eesmärgiks genereeridaTrpm6-puudulikud hiired, mille tähtsust täiendavalt uuridaTRPM6aasta määrusesvererõhk. Kasutasime rekombinanti kandvat embrüonaalse tüvirakkude (ES) klooniTrpm6alleel (Trpm6-), mis sisaldab splaissingu aktseptorjärjestust, mis sunnib enneaegset mRNA splaissimist ja mille tulemuseks on pärast eksonit 6 kärbitud mRNA. Kimäärsed heterosügootsed hiired saadi ES-rakkude blastotsüsti süstimisega ja rekombinatsioon kinnitati PCR-ga. Me ületasime needTrpm6pluss /- hiired, aga eiTrpm6-/--off_kevad saadi. See tulemus on kooskõlas varasemate aruannetega, mis näitavad embrüonaalset letaalsustTrpm6-puudulikud hiired24,25
Seetõttu tegime neeruspetsiifilise tingimusliku katkestuseTrpm6kasutades Six2-Cre-d, mis võimaldab GFP-ga sulandatud Cre rekombinaasi tõhusat ja spetsiifilist ekspressiooni embrüonaalses neerus.Trpm6fl/, kuus{0}}Cre hiirt (neeruspetsiifilineTrpm6-puudulikud hiired) sündisid eeldatava Mendeli suhtega. Väljendi määramiseksTRPM6, viisime läbi immunoblotanalüüsid, kasutades anti-TRPM6antikeha.TRPM6valgu tase neerudes vähenes oluliseltTrpm6fl/fl, kuus{0}}Cre hiirt, kuid teistes elundites olulisi muutusi ei täheldatud. Immunofluorestsentsvärvimise analüüsid ei näidanud ka ekspressiooniTRPM6NCC-positiivsetes DCT rakkudes. Me ei täheldanud märkimisväärsetTRPM6-positiivne signaal enam kui 100 sellises NCC-positiivsete rakkude klastris, mis viitab sellele, etTRPM6ekspressioon on Trpmfi/ DCT rakkudes peaaegu täielikult alla surutud; Kuus{0}}Cre hiirt. Need tulemused kinnitavad neeruspetsiifiliste edukate genereerimistTrpm6- puudulikud hiired.
Esmalt uurisime neeruspetsiifilist toimetTrpm6- magneesiumi homöostaasi puudus. Hoidsime hiiri metaboolsetes puurides ja kogusime uriini- ja seerumiproove, millele seejärel tehti magneesiumitaseme kolorimeetriline kvantifitseerimine, kasutades Xylidyl Blue-I. Seerumi magneesiumisisaldus oli oluliselt madalamTrpm6l/l; Kuus{0}}Cre hiirt võrreldes kontrollrühma hiirtegaTrpm6pluss / pluss ; Kuus2-Cre hiirt, samas kui magneesiumisisaldus uriinis oli kõrgem. Tegime ka induktiivsidestatud plasma emissioonispektroskoopia (ICP-ES) analüüse, et mõõta mitut peamist metallielementi seerumis ja leidsime, et Trpmd/ mõjutas oluliselt ainult magneesiumi taset; Kuus2-Cre hiirt. Need tulemused näitavad selgelt, et neeruspetsiifilistel Trpm{4}}puudulikel hiirtel on hüpomagneseemia koos neerude magneesiumi kadumisega, nagu on täheldatud neeruspetsiifilise Cnnm{6}}defitsiidiga mitsel4 puhul.
Tsirkadiaanse variatsiooni puudumineverisurvetja reniini aktiivsus. Järgmisena allutasimeTrpm6i/l; Kuus{0}}Cre hiirtverisurvetmõõtmised raadiotelemeetria abil. Süstoolne ja diastoolnevererõhkaastal olid mõlemad väärtused oluliselt madalamadTrpm6l/; Kuus{0}}Cre hiirt kui kontrollhiirtel. Tähelepanuväärne on, et tavaline ööpäevane variatsioonvererõhk, kus hiirtel olid kõrged väärtused pimedal perioodil ja madalad väärtused valgusperioodil, ei täheldatudTrpm6f/l; Kuus{0}}Cre hiirt. Et uurida, kas ööpäevarütm kulgeb normaalselt, kasutasime hiirte liikumisaktiivsuse mõõtmiseks raadiotelemeetriat ja kinnitasime väga selget ööpäevase variatsiooni.Trpm6l/; Kuus{{0}}Cre hiirt. Uurisime ka vasopressiini (AVP) ja kahe kellageeni Bmall ja Per2 mRNA taset ajus ja neerudes; Kõikidel on teadaolevalt tüüpiline ööpäevane varieeruvus27,28. Analüüsisime kuuel erineval ajahetkel (valguse perioodi jaoks 0,4,8 Zeitgeber Times (ZT) ja pimeda perioodi jaoks 12,16,20 ZT). Kontrollhiirtel on selged ööpäevased ekspressioonimustrid, nagu varem teatati28, ja jällegi, me ei leidnud olulisi kõrvalekaldeidTrpm6/il; Kuus{0}}Cre hiirt. Kontrollisime ka Trpm7 ekspressioonitaset, mis kodeerib Mg2 pluss läbilaskvat kanalit, mis on tihedalt seotudTRPM6, neerudes. Väljendusmustrid olid mõlemas väga sarnasedTrpm6pluss / pluss ; Kuus2-Cre ja Trpm6f/; Kuus2-Cre hiirt ja neil ei olnud selgeid ööpäevaseid mustreid. Kokkuvõttes järeldame, et ööpäevane rütm kulgeb normaalseltTrpm6i; Kuus{0}}Cre hiirt. Seda on peetudverisurvettõus nii inimestel kui ka hiirtel aktiivsel perioodil (hiirtel pimedal ja inimestel valgusperioodil) toimub vastusena reniini verre sekretsiooni suurenemisele2. Mõõtsime reniini aktiivsust vereproovides, mis koguti ülalkirjeldatud kuuel erineval ajahetkel. Kontrollhiirte proovides täheldati pimedatel perioodidel vere reniini aktiivsuse selget suurenemist, kuid hiirte proovide puhul olulist tõusu ei täheldatud.Trpm6/lKuus{0}}Cre hiired. Mõõtsime ka noradrenaliini taset veres, mille vabanemist stimuleerib teadaolevalt reniin-angiotensiini süsteemi aktiveerimine29,30. Nagu oodatud, kadus ka nende ööpäevane varieeruvusTrpm6, kuus2-Cre hiirt. Samal ajal ei mõjutanud vere angiotensinogeeni (AGT), teise kiirust piirava molekuli hiirtel reniin-angiotensiini süsteemi aktiveerimiseks31 valgu taset.Trpm6 puudus. Tulemused viitavad sellele, et reniini tsirkadiaanse varieeruvuse vähenemine on olulineverisurvetkõrvalTrpm6-puudus.
LähedusTRPM6- ekspresseerivad rakud reniini sekreteerivateks rakkudeks. Reniini ekspresseeritakse JG rakkudes ja sekreteeritakse neist neerudes17, 18. JG-rakud on otseses kontaktis makula densaga, mis asub DCT kõrval ja stimuleerib reniini sekretsiooni JG-rakkudest vastusena uriini Cl-taseme vähenemisele18. Immunofluorestsentsvärvimine reniini ja neuronaalse lämmastikoksiidi süntaasi (nNOS), makula densa markeri jaoks, ei näidanud mingeid kõrvalekaldeid glomerulite läheduses täheldatud positiivsete signaalide mustris ega intensiivsuses.Trpm6f/; Kuus{0}}Cre hiirt. Seetõttu ei näi reniini sekretsiooni ja selle regulatsiooniga otseselt seotud rakke märkimisväärselt mõjutavatTrpm6puudus. NaguTRPM6on DCT-s koos NCC-ga, uurisime järgmisena ruumilist seostTRPM6/NCC-ekspresseerivad rakud (DCT) ja makula densa või JG rakud. Sagitaalsete DCT sektsioonide konfokaalsed kujutised näitasid peaaegu täielikku kattumistTRPM6ja NCC signaale kogu DCT ulatuses. Seejärel värvisime nNOS ja NCC jaoks ning leidsime, et nNOS ja NCC positiivsed alad on ühendatud ilma signaalide kattumiseta. Lisaks topeltvärvimine reniini ja NCC jaoks.TRPM6/NCC paljastas, et mõnedTRPM6/NCC-d ekspresseerivad rakud asuvad reniini ekspresseerivate JG-rakkude läheduses, mis viitab sellele, etTRPM6/NCC-d ekspresseerivad rakud, aga ka makula densa, võivad reniini sekretsiooni oluliselt mõjutada.
Häiritud reniini sekretsioon pooltTrpm6 (mööduv retseptori potentsiaal melastatiiniga seotud 6)puudus. Üldiselt mängib autonoomne närvisüsteem ööpäevarütmi progresseerumise korraldamisel otsustavat rolli. Arvatakse, et reniini sekretsiooni JG rakkudest aktiivsel perioodil stimuleerib noradrenaliin, mis eritub neerude sümpaatilistest neuronitest32. Sellise stimulatsiooni mõju reniini sekretsioonile otseseks uurimiseks valmistasime neeruviilud ja stimuleerisime neid -adrenoretseptori (AR) agonisti isoproterenooliga. Tulemused näitasid pärast 30-minutilist isoproterenooli stimulatsiooni viilu jäänud reniini-positiivse signaali väga selget vähenemist. Kvantitatiivsed analüüsid näitasid, et reniini positiivse signaaliga ümbritsetud glomerulite protsent vähenes pärast isoproterenooli stimuleerimist ligikaudu 80 protsendilt 30 protsendile, mis näitab massilise reniini sekretsiooni esinemist. Siiski ei täheldanud me isoproterenooli stimuleerimise olulist mõju reniini signaalile neerulõikudes.Trpm6/1; Kuus2-Cre hiirt. Tulemuse kinnitamiseks mõõtsime pärast isoproterenooli manustamist ka vere reniini aktiivsust. Tulemused näitavad, et vere reniini aktiivsuse olulist tõusu täheldati ainult kontrollhiirtel, samas kui südame löögisageduse suurenemist täheldati tavaliselt mõlemal tüvel. Need tulemused viitavad sellele, et reniini sekreteerivad JG-rakud ei suuda reageerida neerude sümpaatiliste neuronite stimulatsioonile, mis on kooskõlas ööpäevase suurenemise kadumisega.verisurvetja reniini aktiivsusTrpm6l/fl; Kuus{0}}Cre hiirt.
JG rakke saab stimuleerida ka sekreteerima reniini vastuseks prostaglandiinidele, mille hulgas peetakse kõige olulisemaks prostaglandiini E2 (PGE2), kuna seda sekreteerivad füsioloogiliselt makula densa rakud, kui uriini Cl-i tase väheneb17,18. Lisaks on samuti teada, et PGE, neeruviilude töötlemine võib tõhusalt stimuleerida reniini sekretsiooni33. JG rakkude stimuleerimine PGE2 ja isoproterenooliga aktiveerib tavaliselt cAMP tootmist, mis lõpuks põhjustab reniini sekretsiooni. Seetõttu testisime ka PGE ja membraani läbilaskva cAMP analoogi dibutülüül-cAMP(db-cAMP) toimet.PGE2 ja db-cAMP stimuleerisid edukalt reniini sekretsiooni Trpmdi/A, Six'i neeruviiludes{12}} Cre hiired ja kontrollhiired. See näitab, etTrpm6 defitsiit ei tühista üldist mehhanismi, mis on seotud väliste näpunäidete tuvastamisega, rakusiseste signaalide edastamisega ja reniini sekretsiooni teostamisega, kuid see mõjutab spetsiifiliselt vastust -AR-le.
-AR ekspressiooni vähenemine JG rakkudesTrpm6 (mööduv retseptori potentsiaal melastatiiniga seotud 6)puudus. Kahjustatud -AR retseptori vastusTrpm6l/l; Kuus2-Cre hiirt ajendasid meid uurima -AR retseptori ekspressiooni olekut ja seega teostasime JG rakkudes ekspresseeritud peamise -AR alatüübi 1-AR immunofluorestsentsi34. Nagu varem teatatud34, leidsime ribataolise värvumise mustri nii kontroll- kui ka Trpmdi/l, Six2-Cre hiirte neeruosades. On teada, et 1-AR ekspresseerub tugevalt nii veresoontes kui ka JG rakkudes34 ning järjepidevalt olid positiivsed ka 1-AR-positiivsed rakud ribataolise värvumise lõpus kontrollhiire neerudes. reniini värvimiseks (näidatud nooleotsaga). Seevastu Trpm6l/fl värvimine; Kuus2-Cre hiire neerus näitas väiksemat arvu 1-AR/reniini topeltpositiivseid rakke, mis viitab sellele, et 1-AR ekspressioon oli JG rakkudes vähenenud. Selle leiu kinnitamiseks eraldasime JG rakud, kasutades Percolli tihedusgradiendi tsentrifuugimise meetodit vastavalt eelmisele aruandele35. Immunoblotanalüüsid näitasid, et reniin-positiivsed JG-rakud on 3. riba fraktsioonis rikastatud, mis on kooskõlas nende raportiga35, ja 1-AR ekspressioon selles riba 3 fraktsioonis oli spetsiifiliselt palju madalam Trpmdi/1 puhul; Kuus{25}}Cre hiirt. Üheskoos leidsime selleTrpm6defitsiit vähendab 1-AR ekspressioonitaset JG rakkudes, mis on kooskõlas reniini sekretsiooni häirega.
Kunstliku sekkumise mõju tsirkadiaanileverisurvetvariatsioon. Viimases katsekomplektis testisime erinevate sekkumiste mõju ööpäevaseleverisurvetvariatsioon. Reniini tähtsuse kinnitamiseks manustati metsiktüüpi hiirtele kliiniliselt kättesaadavat reniini inhibiitorit aliskireeni36. meeldibTrpm6ablatsioon, aliskireeni manustamine osmootse minipumba kirurgilise implanteerimise teel pärssis oluliselt ööpäevastverisurvetvariatsioon. Järgmisena viisime läbi neerude denervatsioonioperatsioonid, kuna -AR aktiveerimine JG rakkudel sümpaatilise närvisüsteemi kaudu on peamine viis reniini sekretsiooni stimuleerimiseks ööpäevasel viisil2. Jällegi leidsime, et sekkumine surus allaverisurvetvariatsioon. Need tulemused on kooskõlas meie mudeliga, et -AR-vastuse ja reniini sekretsiooni defektid põhjustavadvererõhkvariatsioon Trpmdl/l; Kuus{0}}Cre hiirt.
Testisime ka toidu magneesiumisisalduse tõstmise mõju. Sel eesmärgil toideti metsikut tüüpi hiiri 1 kuu jooksul kõrge Mg-sisaldusega dieediga, mis sisaldas 0,6 protsenti (tavaline toit:0,3 protsenti magneesiumi). Nagu oodatud, oli neil hiirtel kõrgenenud vere Mg tase. Seejärel kontrollisime väljendi tasetTRPM6DCT-s; see vähenes drastiliselt kõrge Mg-sisaldusega dieediga toitmisel ja selle ulatus vähenesTRPM6ekspressioon oli suurem kui neeru Cnnm2 ablatsioon. Kui me mõõtsimevererõhknendel hiirtel avastasime, et kõrge Mg-sisaldusega dieediga toidetud hiirtel olid oluliselt väiksemadverisurvetvariatsioon kuiTrpm6-puudulikud hiired, mis on kooskõlas meie arusaamaga, et neeruTRPM6on tsirkadiaani jaoks olulinevererõhkvariatsioon.
Tabel 1 Geenid, mis olid Cnnm2flfl/flfl neerudes üles- või allareguleeritud; Kuus2-Cre hiirt.
Arutelu
Selles uuringus näitasime selle tähtsustTRPM6 (mööduv retseptori potentsiaal melastatiiniga seotud 6)aasta määrusesvererõhk. Eelkõige näitame ööpäevase variatsiooni peaaegu täielikku kadumistvererõhkneeruspetsiifilistesTrpm6- puudulikud hiired. Samuti avastasime, et reniini, peamise vererõhku reguleeriva hormooni, sekretsioon oli aastal tõsiselt katkestatud.Trpm6-puudulikud hiired, mis on kooskõlas vaadeldud näitajategavererõhkfenotüüp. Mitmed aruanded on näidanud, et TRPM7, teine Mg2 pluss läbilaskev kanal, mis on väga sarnaneTRPM6, mõjutab ka vererõhku37,38. TRPM7 hoiab äravererõhkAngiotensiin II manustamisel, pärssides veresoonte endoteelirakkude reaktsiooni angiotensiin II37-le. Vastupidi, hiljuti teatati, et TRPM7 hõlbustab ka tõusuvererõhkleptiini manustamisel, vahendades Mg2 pluss sissevoolu unearteri keharakkudesse38. Seega on TRPM7 roll sellesvererõhkregulatsioon on mitmetähenduslik. Kuna aga TRPM7 ekspressioonitaset neerudes ei mõjutanud neerudTrpm6ablatsioon (täiendav joonis 5), näib, et TRPM7 ei ole selles uuringus täheldatud fenotüüpides otseselt seotud.
Nagu täheldati Cnnm{0}}puudulike hiirte puhul,vererõhkaastal vähendati väärtusiTrpm6-puudulikud hiired (joonis 2)14. Siiski tuleb märkida, et nende hiirte vahel oli selge erinevus. Cnnm2 häired üldiselt vähenevadvererõhk, kuid ööpäevane varieeruvus oli siiski selgelt jälgitav. Seevastu see variatsioon kadus aastalTrpm6- puudulikud hiired. Selline kvalitatiivne erinevus on kooskõlas ka meie tähelepanekuga, et reniini ööpäevane varieeruvus säilis Cnnm2-puudulikel hiirtel (täiendav joonis 9). Tuleb märkida, et nii CNNM2 kui kaTRPM6arvatakse, et need on olulised renaalse Mg2 pluss reabsorptsiooni jaoks, vahendades vektoriaalset Mg2 pluss transporti läbi DCT, ja tõepoolest, hiirtel, kellel oli kummagi geeni puudulikkus, ilmnes identne neeru Mg2 pluss raiskav fenotüüp (joonis 1 ja viide 39). Kvalitatiivne erinevusvererõhkfenotüüp Cnnm{0}}ja vahelTrpm6-puudulikud hiired viitavad sellele, et Mg2 pluss transport DCT-s, mis on kahe molekuli ühine funktsioon, ei ole otseselt seotud tsirkadiaanse variatsiooniga.vererõhkja reniini sekretsiooni, mis viitab sellele, et CNNM{0}}sõltumatu rollTRPM6on nende intrigeerivate fenotüüpide aluseks.
Mitmed mehhanismid töötavad, et stimuleerida reniini sekretsiooni JG rakkudest, et säilitadavererõhk. Nende hulgas peetakse neerude sümpaatiliste neuronite sisendit peamiseks rolli suurendamisel.vererõhktsirkadiaanse variatsiooni aktiivsel perioodil32. Need neuronid sekreteerivad noradrenaliini, mis seondub JG rakkudel -AR-ga ja aktiveerib selle, et stimuleerida cAMP tootmist, mis viib lõpuks reniini sekretsioonini1732. Meie katsetes kasutati neerulõike, mis on saadudTrpm6-defitsiidiga hiirtel, stimuleerimine isoproterenooliga, mis on -AR agonist, ei avaldanud mingit mõju reniini sekretsioonile, samas kui stimuleerimine PGE2 või db-cAMP-ga suurendas tõhusalt reniini sekretsiooni (joonis 4). Macula densa sekreteerib PGE2 vastusena madalale uriini Cl-tasemele ja see aktiveerib JG rakkudes EP2 ja EP4 retseptoreid, mis sarnaselt -AR aktiveerimisega stimuleerib lõpuks cAMP tootmist40. Seetõttu viitavad need tulemused sellele, et -AR signaalimine tühistatakse JG rakkudes selektiivseltTrpm6-puudulikud hiired, mõjutamata allavoolu cAMP-vahendatud signaalirada. Järjekindlalt näitas hiire neerulõikude immunofluorestsents ja isoleeritud JG rakkude immunoblotanalüüs, et -AR ekspressioon vähenes oluliselt JG rakkudesTrpm6-puudulikud hiired (joonis 5). Selline vähenenud -AR ekspressioon peaks muutma JG-rakud võimetuks sekreteerima reniini vastuseks sümpaatilisele närvistimulatsioonile aktiivsel perioodil, kõrvaldades seeläbi vere reniini taseme ööpäevase kõikumise javererõhk. Tuleb märkida, et on olemas uuring, milles kasutati 1/ 2-AR knockout hiiri, mis näitas vähenenud ööpäevastvererõhkvariatsioon naguTrpm6-puudulikud hiired41. Nad omistasid selle vähenenud lokomotoorsele aktiivsusele, kuid on endiselt võimalik, et reniini aktiivsuse ööpäevane varieerumine aitab vähendada ööpäevast varieerumist.vererõhke. Teise võimalusena võib nende hiirte ebatavaline taust (C57BL6/J, 129 ja VFB segataust; kasutasime puhast C57BL6/ tausta) varjata -AR mõjuvererõhkvariatsioon; geneetiline taust on tsirkadiaani jaoks kriitilise tähtsusegavererõhkvariatsioon42.
cistanche kulturism
Kuidas kaotusTRPM6 (mööduv retseptori potentsiaal melastatiiniga seotud 6)DCT rakkudes põhjustab JG rakkudes vähenenud -AR ekspressiooni, on jäänud tabamatuks. Muud tüüpi rakkudega tehtud katsed on näidanud, et -AR ekspressiooni reguleerivad erinevad molekulid, mis teadaolevalt vahendavad rakkudevahelist signaaliülekannet: Glükokortikoidide lisamine vas deferensist pärineva rakuliini DDT1 MF-2 söötmele suurendab -AR ekspressiooni43. Samuti teatati, et lämmastikoksiid (NO) pärssis -AR lagunemist südamerakkudes GRK24 S-nitrosüülimise kaudu. Nende molekulide hulgas on tähelepanuväärne, et NO eritub neerude makula densa rakkudest, stimuleerides JG rakke parakriinsel viisil, et suurendada reniini sekretsiooni45. Kuigi nNOS-i, NO-d tootva ensüümi, ekspressioon neerudes, on piiratud makula densa rakkudega, on need otseses kontaktis DCT-rakkudega, mis on neerutuubuli järgmine segment6. Seega on võimalik, etTrpm6DCT rakkude puudulikkus põhjustab JG rakkudes -AR ekspressiooni vähenemist, mõjutades NO tootmist või vabanemist külgnevatest makula densa rakkudest.
On teada, et JG-rakud suhtlevad ka teiste rakkudega, moodustades vaheühendusi ümbritsevate rakkudega, näiteks mesangiaalrakkudega, ja saavad reniini sekretsiooni pärssimiseks Ca2 pluss7. Kuigi JG-rakud ja DCT-rakud ei puutu üksteisega otseselt kokku, paiknevad nad siiski tihedalt (viide 46 ja joonis 3) ning on võimalik, et need rakud kasutavad vaheühendatud sidet läbi sekkuvate rakkude, näiteks mesangiaalrakkude; väidetavalt ekspresseerivad kõik kolm rakutüüpi Cx3747,48, konneksiini isovorm, mis oligomeriseerub ja moodustab vaheühendusi. Täiendav analüüs võib tuvastada molekuli ja marsruudi, mis vastutab rakkudevahelise signaaliülekande eest DCT ja JG rakkude vahel, mis on oluline häiritud ööpäevase üldise mehhanismi paljastamiseks.vererõhkvariatsioonTrpm6-puudus.
sisseTrpm6-defitsiidiga hiirtel kadus mitte ainult reniini, vaid ka noradrenaliini taseme ööpäevane kõikumine veres. Reniini-angiotensiini süsteemi aktiveerimine stimuleerib noradrenaliini vabanemist vereringesse29,30 ja seega tundub mõistlik, etTrpm6 (mööduv retseptori potentsiaal melastatiiniga seotud 6)vere reniini ja noradrenaliini taseme ablatsioon oli sarnane. Kuna noradrenaliin mõjutab reniini sekretsiooni soodustamiseks ka JG-rakkude -AR-i, eeldatakse, et need kaks molekuli moodustavad positiivse tagasisideahela, stimuleerides üksteise sekretsiooni. Siiski tuleb märkida, et isoproterenooli manustamise katsete tulemused näitavad selgelt reniini sekretsiooni defekti (joonis 4) ja seega näib see olevat nii reniini kui ka noradrenaliini ööpäevase variatsiooni kadumise peamine põhjus.
Siiani on hüpertensiivsete patsientide raviks välja töötatud ja kasutatud mitmesuguseid tõhusaid ravimeid. Märkimisväärne hulk patsiente näitab siiski resistentsust tavapäraste ravimeetodite suhtes, mis kasutavad erinevate funktsionaalsete mehhanismidega peamiste antihüpertensiivsete ravimite kombinatsiooni4. Sellise resistentse hüpertensiooni raviks on katseliselt läbi viidud neeru sümpaatiliste neuronite kirurgiline denervatsioon endovaskulaarsete kateetrite abil50. Selle praktiline tõhusus parandamiselvererõhkkontroll on olnud vastuoluline51,52, kuid hiljuti avaldatud uuringud on näidanud, et see on oluliselt vähenenudvererõhkvõrreldes võltskontrollidega53,54. Samuti on erinevaid tulemusi neerude denervatsiooni mõju kohta ööpäevasele variatsioonilevererõhk. Mõned aruanded näitasid, et ulatusvererõhkneerude denervatsioonist tingitud vähenemine oli aktiivsetel perioodidel suurem53, kuid teised ei teatanud muutustest ööpäevases variatsioonis.vererõhk55,56. Laboratoorsete loomadega tehtud analüüsis pärsisid meie neerude denervatsioonioperatsioonid hiirte vastu ööpäevase variatsiooni.vererõhk(Joonis 6). Sarnaseid operatsioone tehti ka rottide vastu, kuid isegi kontroll-metsiktüüpi rottidel ei esine peaaegu mingit ööpäevastvererõhkesiteks varieerumine57,58, mistõttu operatsiooni mõju on raske hinnata. Vaja on rohkem uuringuid, et selgitada välja neerude denervatsiooni mõju tsirkadiaanilevererõhkvariatsioon, mis aitaks meil mõista ka üksikasjalikumat mehhanismivererõhkdüsregulatsioon pooltTrpm6-puudus.
Telemeetrilised mõõtmisedvererõhk, südame löögisagedus ja liikumisaktiivsus. Telemeetrilised mõõtmisedvererõhkviidi läbi järgmiselt4.Vererõhkmuundurid (TAl1PA-C10, Data Sciences International) sisestati kirurgiliselt 2- kuni 3-kuuste hiirte vasakusse ühisesse unearterisse anesteesia all (intraperitoneaalsel manustamisel 0,3 mg/ kg medetomidiini, 4 mg/kg midasolaami ja 5 mg/kg butorfanooli). Pärast 3-nädalast taastumist süstoolne ja diastoolnevererõhkväärtused registreeriti iga 60 minuti järel 2-minutilise proovivõtuga, kasutades Dataquest ART tarkvara (Data Sciences International). Kirjed saadi vähemalt viiel järjestikusel päeval ja iga hiire kohta määrati iga päev samal ajal tehtud mõõtmiste keskmised ja neid kasutati edasisteks statistilisteks analüüsideks, välja arvatud lisajoonis 4. Nakamori et al.68 põhjal, neeru denervatsioon tehti 2 nädalat enne sisestamistvererõhkmuundurid järgmiselt. Neerud paljastati kõhu sisselõikega ja neerusoonte ümber lõigati sidekude. Seejärel sukeldati neerusooned 2 minutiks 95% etanooli ja seejärel 2 minutiks PBS-i. Võltsoperatsioon viidi läbi samaväärse protseduuriga ilma etanooli sukeldamiseta. Aliskireeni manustati 25 mg/kg/päevas osmootse pumba (1004, ALZET) subkutaanse manustamise teel ja registreerimist alustati päevast pärast pumba kasutuselevõttu. Magneesiumi lisamiseks toideti hiirtele 1 kuu enne magneesiumiga rikastatud dieeti, mis sisaldas 0,6 protsenti magneesiumi (CLEA Jaapan).vererõhkmõõtmine.
Südame löögisagedust mõõdeti sama raadiotelemeetriasüsteemiga, välja arvatud see, et salvestamine viidi läbi 30-s plaanipärase proovivõtuga iga minut ja edasiseks analüüsiks kasutati ühte mõõtmist.
Lokomotoorset aktiivsust hinnati sama raadiotelemeetria süsteemi abil, jälgides anduri signaali tugevuse muutusi, mis on tingitud looma liikumisest. Sel juhul sisestati andurid kirurgiliselt parema külje nahaalusesse ruumi. Salvestused viidi läbi samade ajavahemike järel, nagu eespool kirjeldatud.
cistanche kulturism
Viited
1. Giles, TDCirkadiaanrütmvererõhkja seost kardiovaskulaarsete sündmustega.J. Hüpertensioon. 24, S11-S16 (2006).
2. Smolensky, MH, Portaluppi, F.& Hermida, RC inVererõhkMonitoring in Cardiovascular Medicine and Therapeutics, 3. EDT (eds White, WB) II osa, ptk 6, 105-128(Springer, 2016).
3. Witteman, JCet al. USA naiste toitumistegurite ja hüpertensiooni perspektiivuuring. Tiraaž 80, 1320-1327(1989).
4. Ascherio, A. et al. USA meeste toitumistegurite ja hüpertensiooni perspektiivuuring. Tiraaž 86,1475-1484(1992).
5. Ascherio, A. et al. Toitetegurite perspektiivne uuring,vererõhkja USA naiste hüpertensioon. Hüpertensioon 27,1065-1072(1996).
Märge:ülaltoodud ei ole täielik viidete loend
