Tsütokiinide imendumine inimese neeruperfusiooni ajal vähendab siiriku funktsiooniga seotud põletikulise geeni allkirja hilinemist

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

John R. Ferdinand1,2|Sarah A. Hosgood2,3|Tom Moore2,3|Ashley Ferro1|Christopher J. Ward1|Tomas Castro-Dopico1|Michael L. Nicholson2,3|Menna R. Clatworthy1,2

1 Molekulaarse immuunsuse üksus, Cambridge'i ülikooli meditsiiniosakond, molekulaarbioloogia labor, Cambridge, Ühendkuningriik

2 Riiklik Terviseuuringute Instituudi vere ja siirdamise uurimisüksus elundidoonorluses, Cambridge, Ühendkuningriik

3 Cambridge'i ülikooli kirurgiaosakond, Cambridge, Ühendkuningriik

Siirdamine on optimaalne ravi enamiku lõppstaadiumiga patsientide jaoksneerudhaiguskuid elundite puudus on suur väljakutse. Normotermilist masinperfusiooni (NMP) on kasutatud marginaalsete elundite taastamiseks; mehhanismid, mille kaudu NMP võib elunditele kasu tuua, pole aga hästi teada. Kasutades samalt doonorilt saadud inimneerupaare, võrdlesime NMP mõju külmhoiustamise mõjuga maailmale.neerudtranskriptsioon. Leidsime, et külmladustamine põhjustas geeniekspressiooni globaalse vähenemise, sealhulgas põletikuraja geenid ja need, mis on vajalikud energiatootmisprotsesside jaoks, nagu oksüdatiivne fosforüülimine (OXPHOS). Seevastu NMP ajal oli OXPHOS geenide, aga ka mitmete immuun- ja põletikuraja geenide märgatav ülesreguleerimine. Kasutades biopsiaid neerudest, millele tehti NMP ja mis seejärel siirdati, leidsime, et pikaajalise hilinenud transplantaadi funktsiooniga (DGF) elundites esines kõrgem põletikulise geeni ekspressioon. Seetõttu kasutasime põletikueelsete tsütokiinide eemaldamiseks hem-adsorberit (HA). See nõrgestatud põletikuline geeniekspressioon suurendas OXPHOS raja geene ja sellel oli potentsiaalselt kliiniliselt oluline toime DGF-iga seotud geenisignatuuri ekspressiooni vähendamisel. Üheskoos näitavad meie andmed, et põletikueelsete vahendajate adsorptsioon perfusaadist kujutab endast potentsiaalset sekkumist, mis võib parandada elundite elujõulisust.

MÄRKSÕNAD:kliinilised uuringud/praktika, siiriku hilinenud funktsioon (DGF), doonorid ja annetamine: surnud,neerud(allotransplantaadi) funktsioon / düsfunktsioon,neerudhaigus: immuun-/põletikuline, neer

Neerufunktsiooni parandav Cistanche herb

1. SISSEJUHATUS

Neersiirdamine on optimaalne ravi enamiku patsientide jaokslõppstaadiumisneerudhaigus, millel on kasu nii elukvaliteedile kui ka kvantiteedile.1 Elundite puudus on suur väljakutse ning saadaolevate neerude arvu suurendamiseks on kasutatud mitmeid strateegiaid, sealhulgas surnud vereringeelundite surma (DCD) doonorite ja laiendatud kriteeriumidega doonorite (ECD) kasutamine. ), mis mõlemad on seotud suurema hilinenud siiriku funktsiooni (DGF) määraga võrreldes surnud ajutüve surma (DBD) doonoritega.2,3 DCD neerude puhul aitab kokkupuude sooja isheemiaga vereringe lakkamise protsessis oluliselt kaasa DGF-ile. . DGF tekib isheemilise torukujulise raku kahjustuse või surma tõttu, mis võib stimuleerida kaasasündinud immuunsüsteemi aktivatsiooni NLRP3 põletikukoostu kaudu, mis viib interleukiini (IL)1 ja IL18 tekkeni.{6}} Tõepoolest, põletikuliste tsütokiinide esinemine uriinis on kasutatakse biomarkerinaägeneerudvigastusja DGF.{0}}

Normotermiline masinperfusioon (NMP) võimaldab siirdatud elundeid perfuseerida soojade hapnikuga rikastatud punaste verelibledega, kui puuduvad ringlevad immuunkomponendid, sealhulgas komplement ja neutrofiilid.{0}} Seda protsessi on kasutatud marginaalsete elundite15 ja elundite taastamine, et hõlbustada neerude siirdamist, millest algselt keelduti pärast riikliku elundite eraldamise teenuse pakkumist.16 Meie varasem kogemus NMP-ga andis aluse randomiseeritud kontrollitud uuringule, et hinnata selle efektiivsust DGF-i ennetamisel DCD-de neerudes,17 kuid mehhanismid, mille kaudu NMP võib siirdatud neerudele kasulik olla, pole täielikult teada. Lisaks küsimus, kas täiendav manipuleerimineneerudNMP ajal, näiteks põletikueelsete tsütokiinide ja kemokiinide eemaldamine perfusaadist, võib pakkuda täiendavat kasu elundi optimeerimisel enne siirdamist, mida pole inimese neerude puhul käsitletud, kuid meie uuring sigade NMP kohta näitas paljutõotavaid tulemusi.

Siin kasutasime nende kahe küsimuse lahendamiseks erapooletut lähenemisviisi, kasutades inimese transkriptoomilist analüüsineerudNMP alguses ja lõpus võetud biopsiad, et hinnata globaalseid muutusi geeniekspressioonis. Kasutasime inimese neerupaare ühelt doonorilt, mis võimaldas võrrelda erinevate sekkumiste mõju identse geneetilise taustaga elundites ja sai hinnata nende muutuste mõju siiriku tulemuse prognoosile.

Tsistanche ekstrakti kasulikkus: ennetab ägedatneerudvigastus

2. TULEMUSED

2.1. Paaritud neerud on geneetiliselt sarnased ja kasulikud mudelid sekkumiste hindamiseks

Uurisime elundite säilimise ja NMP-ga seotud transkriptsioonilisi muutusi kahes sõltumatus uuringus, millest igaühel oli viis paari neerusid, mis moodustasid kokku 10 paari 20 inimese neeru kohta. Neist kaks olid pärit DBD-st ja kaheksa DCD-doonoritelt (tabel S1, S2 ja joonis S1). Nendes uuringutes võtsime enne ja pärast sekkumist (külmhoone või NMP) kortikaalseid biopsiaid ning uurisime transkriptsioonimaastikku RNA sekveneerimise (RNA-Seq) abil. Paaritud neerude ja samast paarisbiopsiate kasutamineneerudvõimaldas meil kontrollida bioloogilist variatsiooni ja eemaldada see segaja analüüsist välja (joonis S2A). Meie kinnitasime sedaneerudpaarid algavad ühise transkriptsioonimaastikuga (joonis S2B) ja rakendavad igaühele erinevaid sekkumisineerudpaaris oleme võimelised uurima bioloogilisest varieerumisest sõltumatu sekkumise mõju.

JOONIS 1 Neerud, mis on avatud külmhoones, näitavad piiratud muutusi geeniekspressioonis võrreldes nendega, kellele tehakse NMP. Saadi neerupaar, mida siirdamisel ei kasutata. Üksneerudhoiti staatilises külmhoones ja teisele tehti normotermiline masinperfusioon (NMP). Väliskoorest võeti biopsiad alguses ja 2 tunni pärast. B, vulkaani graafik, mis näitab geeniekspressiooni muutust 2 tunni pärast näidatud rühmas võrreldes algusega. Punased punktid näitavad erinevalt ekspresseeritud geene, millel on kohandatud P-väärtus<0.05 and="" the="" experimental="" group="" is="" indicated="" above="" the="" plot.="" c,="" gene="" set="" enrichment="" analyses="" of="" the="" differential="" expressions="" from="" b="" against="" the="" hallmarks="" pathways.="" only="" significant="" pathways="" (fdr="" q="" value=""><0.05) are="" plotted.="" red="" dots="" indicate="" positive="" enrichment="" and="" blue="" negative,="" the="" size="" of="" the="" dot="" is="" inversely="" correlated="" with="" the="" fdr="" q="" value="" and="" the="" position="" indicates="" the="" normalized="" enrichment="" score="" (nes).="" d,="" heatmap="" of="" the="" top="" 20="" significantly="" upregulated="" genes="" during="" nmp,="" genes="" are="" ranked="" by="" log2="" fold="" change.="" e,="" string="" analysis="" of="" the="" top="" 50="" genes="" upregulated="" during="" nmp.="" the="" color="" of="" each="" node="" indicates="" membership="" of="" each="">

JOONIS 2 NMP-le järgneva transkriptoomi korrelatsioon siiriku hilinenud funktsiooni pikkusega. Geeni ekspressioon korreleeriti DGF-i pikkusega biopsiates, mis võeti pärast NMP-d randomiseeritud kliinilise uuringu osana. Joonistatud on 1000 geeni ekspressioonitasemed, millel on tulemusega suurim korrelatsioon. B, GSEA viidi läbi korrelatsiooni jaoks A-st tunnusmärkide andmekogumiga. Ainult olulised rajad (FDR q väärtus<0.05) are="" plotted.="" red="" dots="" indicate="" positive="" enrichment="" and="" blue="" negative,="" the="" size="" of="" the="" dot="" is="" inversely="" correlated="" with="" the="" fdr="" q="" value="" and="" the="" position="" indicates="" the="" normalized="" enrichment="" score="">

2.2. NMP põhjustab OXPHOS-i ja põletikuliste radade geenide arvu suurenemist võrreldes külmhoonega

Et uurida võimalikke mehhanisme, mille abil NMP võib neere mõjutada, võtsime esialgu viisneerudpaari (n {{0}} DCD doonorit ja n=1 surnud ajutüve surma [DBD] doonorit, joonis S1, tabel S1) ja viidi läbi aja 0 (0 tundi) kortikaalne biopsia . Sel hetkel randomiseeriti neerud staatiliseks külmhooneks või NMP-ks, nagu eelnevalt kirjeldatud 10 (joonis 1A). 2 tunni pärast võeti mõlemast neerust teine ​​biopsia ja viidi läbi RNA-Seq. Võrreldes geeniekspressiooni aja 0- ja 2-tunniste biopsiate vahel, avastasime, et staatilisesse külmhoonesse paigutatud neerudel ei olnud ühegi üksiku geeni ekspressioonis statistiliselt olulisi muutusi, kui neid korrigeeriti mitme testimise jaoks (joonis 1B , vasak paneel). Seevastu 2-tunnise NMP jooksul reguleeriti 956 geeni üles ja 353 geeni alla (joonis 1B, parem paneel). Järgmisena hindasime muutusi geenirühmade ekspressioonis ühises rajas, võrreldes kümneid või sadu geene, mitte ühtegi üksikut geeni, vähendades seeläbi veelgi bioloogilise indiviididevahelise variatsiooni mõju analüüsile. See näitas muutusi funktsionaalselt olulistes radades, kus iga üksiku geeni ekspressioon selles rajas ei muutunud statistilise olulisuse saavutamiseks piisaval määral. See geenikomplekti rikastamise analüüs (GSEA) näitas, et külmhoidmisel oli oluline mõju mitmetele metaboolsetele radadele (joonis 1C, vasak paneel). Eelkõige vähenes märgatavalt oksüdatiivse fosforüülimise (OXPHOS) geenide arv, mis on ATP genereerimiseks vajalik põhirada.19 Seevastu OXPHOS oli NMP ajal oluliselt ülesreguleeritud radade hulgas (joonis 1C, parem paneel), millel on potentsiaalsed eelised. rakkude elujõulisuse ja rakkude homöostaasi taastamise jaoks. Lisaks indutseeriti NMP ajal mitmeid immuun- või põletikuliste protsessidega seotud radu, kusjuures suurimat tõusu näitas "TNF-i signaalimine NFkB kaudu". Sellega seoses olid TNF, samuti IL1B ja neutrofiile värbavad kemokiinid CXCL8 (IL8) ja CXCL2 2-tunnistes NMP biopsiates enim reguleeritud geenide hulgas (joonis 1D). 50 parima ülesreguleeritud geeni stringanalüüs näitas biokeemiliselt seotud geenide ülesreguleerimist, mis olid koondatud neljaks peamiseks sõlmeks; IL8 ja neutrofiile värbavad kemokiinid, põletikuga seotud geenid, NFkB signaalimine ja transkriptsiooniregulatsioon (joonis 1E). Pange tähele, et DBD ja DCD neerud olid algtasemel transkriptsiooniliselt sarnased (joonis S2C) ja NMP ajal muutuvad geenirajad olid DBD ja DCD neerudes sarnased (joonis S2D). Üheskoos näitab meie analüüs, et NMP ajal suureneb geenide ekspressioon, mis soodustavad energia tootmist, millel on potentsiaalselt kasulik mõju elundile, kuid samaaegne põletikueelsete geenide esilekutsumine, mis võib olla kahjulik.

Cistanche tubulosa ekstrakt: parandab neerufunktsiooni

2.3. Põletikuraja geenid NMP neerudes, mis on seotud siiriku pikaajalise hilinenud funktsiooniga

Külmhoiustamise ja NMP ajal toimuvate transkriptsioonimuutuste seostamiseks kliiniliste tulemustega teostasime RNA-Seq biopsiatest, mis võeti 33 DCD neerust, mis olid läbinud NMP, osana randomiseeritud kliinilisest uuringust, mille käigus hinnati selle efektiivsust.17 Proovid olid saadaval aadressil neerude alamhulk, mis randomiseeriti uuringu NMP rühma, mis seejärel siirdati (tabel S3, joonis S1). DGF on tavalisem DCD neerudes ja on klassikaliselt määratletud kui dialüüsi nõue esimesel siirdamisjärgsel nädalal. Vahetul siirdamisjärgsel perioodil saavad mõned patsiendid aga hüperkaleemia tõttu ühe dialüüsiepisoodi, mis ei pruugi tingimata kajastada märkimisväärset ägedat tubulaarnekroosi. Seetõttu kasutasime mudelit, mis korreleerib geeniekspressiooni siirdamisoperatsiooni ja viimase dialüüsiseansi vahelise ajaga (st DGF-i kestusega). See näitas märkimisväärsemaid transkriptsioonilisi muutusi dialüüsi vajavatel transplantaatidel pärast esimest 24 tundi pärast siirdamist (joonis 2A), samuti olulist positiivset korrelatsiooni põletikuraja geenide ekspressiooni vahel, sealhulgas "TNFA signaalimine NFkB kaudu" ja "põletikulise vastuse" rada. DGF-i pikkus koos nende radade suurema rikastamisega neerudes, mille DGF-i siirdamise järgselt oli pikem (joonis 2B). Seevastu DGF-i pikkus korreleerus negatiivselt "OXPHOS" raja geenide ekspressiooni ulatusega (joonis 2B). Kokkuvõttes näitavad need andmed, et pärast NMP-d on neerud, millel on madalam põletikuraja geenide ekspressioon ja kõrgem "OXPHOS" raja geenide ekspressioon, vähem vastuvõtlikud pikaajalisele DGF-ile pärast siirdamist. See toetaks järeldust, et NMP ajal toimuvatel molekulaarsetel muutustel võib olla nii kasulik (OXPHOS-i raja geenide esilekutsumine) kui ka kahjulik (põletikuliste radade geenide esilekutsumine) mõju.

2.4. Uriini eraldumine ja neerude verevool NMP ajal näitavad erinevaid seoseid OXPHOS-i ja põletikuraja geenidega

NMP ajal toodetud uriini kogus on üks paljudest parameetritest, mis sisalduvad kirurgilise kvaliteedi hindamise skoorides, mida kasutatakse elundite kasutamise otsuste suunamiseks,15 kuid kas kõrge uriinieritus NMP ajal näitab tõesti head prognoosi neerude ja selle aluseks olevate molekulaarsete radade jaoks, mis aktiveeritakse kõrge uriinieritusega neerud on ebaselged. Kokku 10 neerus, millele tehti NMP (ainult NMP neerud, tabel S1 ja S2, joonis S1), täheldasime 2-tunnise perfusiooniperioodi jooksul uriinieritust vahemikus 0 kuni 340 ml (Joonis 3A vasak paneel). Pange tähele, et kui võrdlesime kahes sõltumatus katses NMP ajal muutuvaid radu viies neerus, leidsime, et indutseeriti sarnaseid radu (joonis S3A), mis kinnitab meie katseplaani reprodutseeritavust ja radade, mitte üksikute geenide võrdlemise kasulikkust. 2-tunnistes perfusioonijärgsetes biopsiates korreleerus 11 geeni ekspressioon sel perioodil toodetud uriini mahuga. Nende hulka kuulusid kuumašoki valgud (HSP), HSPA1A, HSPA1B ja HSPH1, mis korreleerusid positiivselt suurenenud uriinieritusega (joonis 3A parem paneel). Geenikomplekti rikastamise analüüs näitas, et uriini väljund korreleerus positiivselt ka "TNF-i signaaliülekandega NFkB" raja geenidega ja negatiivselt OXPHOS geenidega perfusioonijärgsetes biopsiates (joonis 3B, S3C). Sarnaselt korreleerus perfusioonieelsetes biopsiates OXPHOS negatiivselt uriini eritumisega nendes neerudes, samas kui immuunaktivatsiooniga seotud teed, sealhulgas "TNF-i signaalimine NFkB kaudu" ja "allografti äratõukereaktsioon", korreleerusid positiivselt uriinieritusega, mis viitab sellele, et NMP-l oli nendele protsessidele väike mõju. , või muudel analüüsitud radadel suure uriinieritusega neerudes (joonis 3B, S3C-D). Kuna meie kliinilistes proovides täheldati põletikuraja geenide esilekutsumist pikaajalise DGF-iga (joonis 2B), seavad need andmed kahtluse alla dogma, et elujõulisemates, "tervemates" neerudes esineb kõrge uriinieritus, ja viitavad sellele, et tegelikult võib nendes neerudes olla rohkem. põletikupotentsiaali, on vähem võimelised tootma energiat ja see ei muutu NMP ajal oluliselt.

Neerude verevoolu perfusiooni ajal on hinnatud ka parameetrina, mis võib kajastada hilisemat siirdamisfunktsiooni.15 Kümnes uuritud neerus oli neerude verevool 2-tunnise perfusiooni ajal vahemikus 14,1 kuni 168,8 ml/min (Joonis 3C, vasak paneel). 2-tunnistes perfusioonijärgsetes biopsiates korreleerusid kaheksa geeni märkimisväärselt positiivselt neerude verevoolu suurenemisega (joonis 3C parem paneel), sealhulgas HSPA1L, kuid selle geenide loendi ja uriinieritusega korreleeruvate geenide vahel ei olnud otsest kattumist (joonis 3A). ). Geenikomplekti rikastamise analüüs näitas, et kõrge neerude verevool korreleerus positiivselt OXPHOS geenidega 0-tunniste biopsiate käigus, kuid erinevalt kõige suurema uriinieritusega oli perfusioonil märkimisväärne mõju, mille tulemuseks oli negatiivne korrelatsioon OXPHOS-iga. raja geenid 2 tunni võrra (joonis 3D, joonis S4A-B). Neerude verevool korreleerus negatiivselt paljude immuun- ja põletikuliste geenide radadega nii 0- kui ka 2-tunnistes biopsiates (joonis 3D, joonis S4B), erinevalt uriinieritusest (joonis 3B, joonis S3C). Need andmed koos viitavad sellele, et neerude verevool ja uriinieritus ei pruugi olla elujõulisema neeru samaväärsed näitajad, kuid esimene võib tõesemalt tuvastada neeruneerudDGF-i pikenemine on väiksem.

tsistanche kasulikkus ja kõrvaltoimed: põletikuvastane

2.5. Hem-adsorberi lisamine perfusiooniahelasse ei mõjuta perfusiooni parameetreid, kuid vähendab oluliselt põletikulise geeni ekspressiooni, sealhulgas NLRP3 ja IL1B

Analüüsid kohtaneerudperfusaat on näidanud põletikueelsete tsütokiinide ja kemokiinide kontsentratsiooni olulist suurenemist hüpotermilise ja NMP ajal.20,21 Need bioaktiivsed molekulid tsirkuleerivad neerudesse, mis võib põhjustada edasist põletikku. Arvestades, et meie analüüs siirdatudneerudproovid näitasid, et TNF-sõltuvate geenide indutseerimine NMP neerudes oli seotud DGF-iga (joonis 2B), oletasime, et tsütokiinide ja kemokiinide eemaldamine perfusiooniahelast võib nõrgendada põletikulise geeni induktsiooni, millel on potentsiaalselt kasulik mõju neerudele. Selline lähenemine on näidanud mõningast tõhusust süsteemse põletikulise reaktsiooni sündroomiga patsientidel 22, 23 ja seda seostati suurenenud neerude verevooluga sigade neerudes, kellele tehti NMP.18 Selle testimiseks inimese neerudes võtsime veel viis neerupaari ja teostasime NMP 4 tundi koos biopsiatega, mis võeti 0, 2 ja 4 tundi (joonis S1). Igal juhul lisati ühe neeru perfusiooniahelasse igas paaris (NMP pluss HA) tsütosooli hem-adsorber (HA), mis eemaldab molekulid molekulmassiga 10-50 kDa (joonis 4A). Ootuspäraselt põhjustas HA lisamine perfusaadis mitmesuguste tsütokiinide madalama kontsentratsiooni (joonis 4B), kuid see ei mõjutanud neerude verevoolu, uriini eritumist ega koostist, hapnikutarbimist ega happe-aluse homöostaasi (joonis 4C, Tabel S4, S5). Seega ei mõjutanud HA üle 4 tunni NMP-d praegu kliiniliselt kvaliteedihindamise skooride genereerimiseks kasutatavatele perfusiooniparameetritele, kuid avaldas olulist mõju geeniekspressioonile; Pärast NMP-d reguleeriti 1794 ja 4026 geeni vastavalt 2 ja 4 tunni pärast üles, sealhulgas TNF ja IL6 (joonis 4D, E). kuid ainult pool sellest arvust (n=898 ja n=2606) suurenes, kui HA oli olemas (joonis 4D, joonis S5A ja B). Alareguleeritud geenide arvu vähendas ka HA lisamine (joonis 4D). Pärast 4-tunnist NMP-d reguleeriti HA lisamisega 46 geeni oluliselt üles ja 181 geeni alla (joonis 4F). See nõrgenenud transkriptsioonivastus hõlmas NLRP3 põletikulise aktivatsiooniga seotud geene, nagu IL1B, NLRP3 ja CASP1 (joonis 4G, joonis S4B) ja mõningaid neutrofiile värbavaid kemokiine (joonis S5C), mida varem seostati loommudelites neerukahjustusega.24,25 See näitab, et lahustuvad vahendajad vabanevadneerudtsirkuleerida ja juhtida põletikuliste geenide de novo ekspressiooni elundis, kuid seda saab leevendada nende eemaldamisega perfusiooniringist.

JOONIS 4 Hem-adsorberi lisamine normotermilise masina perfusiooniahelasse avaldab olulist mõju tsütokiinide tasemele perfusaadis ja transkriptsioonis, kuid mitte seadmel registreeritud füüsikalistele parameetritele. Samalt doonorilt võeti paar inimneeru, üks paarist läbis 4 tunni jooksul standardse normotermilise masina perfusiooni (NMP) protokolli ja teisele.neerudläbis NMP, lisades ahelale hem-adsorberi. RNA-Seq proovid võeti enne perfusiooni (0 tundi), 2 tunni pärast ja lõpus (4 tundi). B, võtmetsütokiinide kontsentratsioon perfusaadis pärast 4-tunnist NMP-d. Joon tähistab neerupaare. Tsütokiinide mõõtmised normaliseeriti perfusaadi valgu kogusisaldusele. Esitatud P-väärtus pärineb paaris-t-testist tsütokiinide vähendamiseks HA lisamisega. C, uriini tootmine ja neerude verevool (RBF) kogu perfusiooni aja jooksul. Roheline joon tähistab ainult NMP-d ja oranži, millele on lisatud hem-adsorber. D, Venni diagramm, mis näitab oluliselt erinevalt väljendatud geenide arvu, kui võrrelda 2-h või 4-h proove eel(0-h) proovidega. Punased diagrammid on ülesreguleeritud geenid ja sinised allareguleeritud. Ristmik on geenid, mis ekspresseeritakse mõlemal ajahetkel samas suunas. E, näidatud geenide log2 normaliseeritud ekspressiooniväärtused koe transkriptoomi perfusioonis, on näidatud standardsed vearibad. F, vulkaani graafik ainult NMP ja NMP pluss HA paaripõhiseks võrdlemiseks 4 tunni pärast. Punane tähistab kohandatud P-väärtusega erinevalt ekspresseeritud geene<0.05. g,="" as="" for="">

neeruhaiguste raviks cistanche ekstrakt

2.6. HA, mis on seotud siiriku funktsiooniga seotud hilinenud geenisignatuuri vähenemisega

Geenikomplekti rikastamise analüüs näitas "TNF signaaliülekande NFkB kaudu" raja olulist vähenemist NMP pluss HA neerudes, võrreldes ainult NMP-ga (joonis 5A-B). Nimelt ei vähendanud HA olemasolu mitte ainult põletikulise geeni ekspressioonineerudaga ka suurenenud OXPHOS ja rasvhapete metabolismi radu, mis mõlemad aitavad kaasa energia tootmisele (joonis 5A-B). Seetõttu toetavad HA-ga toimuvad muutused geeniekspressiooni radades järeldust, et selle mõju on kliiniliselt kasulik, kuna see vähendas "TNFA signaaliülekannet NFkB" raja geenide kaudu ja suurendas "OXPHOS" raja geene, mis mõlemad olid seotud lühema ajaga. DGF-i kestus (joonis 2B).

NMP transkriptsiooniliste muutuste ja kliiniliste tulemuste vahelise seose edasiseks uurimiseks püüdsime kureerida DGF-iga neerudes esinevat geenisignatuuri. Tuvastasime 100 parimat positiivselt (UP) ja negatiivselt (DOWN) reguleeritud geeni (reastatud logaritmi muutuse järgi), mis korreleerusid DGF-i pikkusega 33 kliinilise uuringu proovis (joonis 5C, andmed S1). Avastasime suurema uriinieritusega proovides DGF-i suurenenud pikkusega seotud geenisignatuuri olulise rikastumise (joonis 5D), mis viitab sellele, et kõrge uriinieritus NMP ajal tuvastab neerud, millel on DGF-i pikemaajaline risk. DGF-i signatuuri ja neerude suurema verevooluga seotud geenide vahel ei olnud statistiliselt olulist korrelatsiooni (joonis 5E). Järgmisena hindasime, kas ja kuidas HA lisamine NMP ahelasse mõjutas DGF "UP" ja "DOWN" geenisignatuuride ekspressiooni. Tähelepanuväärselt näitas see, et DGF-i suurenenud pikkusega seotud geenisignatuuri ekspressioon vähenes oluliselt HA lisamisega ja DGF-i vähenenud pikkusega seotud signatuur suurenes märkimisväärselt HA lisamisega (joonis 5F).

Üldiselt viitavad meie tuvastatud transkriptsioonimuutused sellele, et NMP-l on külmhoonega võrreldes potentsiaalne kasu, kuna see mõjutab energia tootmist neerudes. Kuid perfusiooni ajal vabanevad mõned bioaktiivsed molekulid neerust perfusiooniahelasse, tekitades võimendussilmuse, mis põhjustab neerude uuesti sisenemisel põletikku. Nende molekulide eemaldamine katkestab selle ahela ja võib olla kasulik põletiku vähendamiseks ja energiatootmise suurendamiseks, suurendades veelgi NMP kasulikku mõju ja vähendades vastuvõtlikkust DGF-i suhtes (joonis 6).

JOONIS 5 Singi adsorberi lisamine vähendab DGF-iga seotud geenisignatuuri. GSEA analüüs HA lisamise mõju kohta transkriptoomile pärast 4-tunnist NMP-d võrreldes geenikomplektide tunnuste rajaga. Joonistatakse ainult olulised rajad. Punased punktid näitavad positiivset rikastamist ja sinised negatiivset, punkti suurus on pöördvõrdelises korrelatsioonis FDR q väärtusega ja asend näitab normaliseeritud rikastamise skoori (NES). B, GSEA rikastusdiagrammid Hallmarki andmebaasi võtmeradade jaoks, et võrrelda A-ga. Rida näitab jooksvat rikastamise skoori ja viiuli graafik näitab genokomplekti liikmegeenide jaotust igas analüüsis kasutatud järjestatud geeniloendis. C, nelja suurima positiivse (UP) ja negatiivse (DOWN) korrelatsiooni soojuskaart DGF-i pikkusega ja seda kasutatakse DGF-i geeniekspressiooni allkirja osana. Täielik DGF-i allkiri lisaandmetes. DF-i, DGF-iga seotud geenisignatuuri kasutati koos GSEA-ga, et uurida signatuuri ekspressiooni korrelatsioonis 2-h uriini väljundi ja 2-h transkriptoomiga (D), korrelatsioonis 2-h RBF 2-h transkriptoomiga (E) ja HA lisamise mõju transkriptoomile 4 tunni pärast (F). Krundid nagu A

JOONIS 6 Graafiline kokkuvõte. V, Külmhoiustamise ajal väheneb transkriptsioon globaalselt. NMP ajal on geenide ekspressioon mitmetes radades ülesreguleeritud, sealhulgas oksüdatiivne fosforüülimine (OXPHOS) ja põletikuraja geenid, nagu TNF, IL8 ja NFkB. B vasak paneel, NMP ajal vabanevad põletikulised vahendajad (kollased ringid).neerudperfusioonilahusesse. Nad tsirkuleerivad ja stimuleerivad põletikueelse geeni transkriptsiooni neerudes ning on seotud energiaraja tootmisgeenide vähenemisega, vähendades ATP-d. Parem paneel, hem-adsorberi (HA) olemasolu katkestab selle põletikulise võimendussilmuse

Neerufunktsiooni parandav Cistanche herb

3. ARUTELU

Meie andmed näitavad, et külmhoone on efektiivne geeniekspressiooni oluliste muutuste piiramisel. See on kooskõlas näriliste mudelitega, kus kuni 18 tundi külmhoones hoitud neerud näitasid vähe muutusi põletikueelsete tsütokiinide, sealhulgas IL1, TNF ja IL6, ekspressioonis.26 Meie kasutame erapooletut, globaalset transkriptsiooniprofiili, mitte. väikese arvu kandidaatgeenide mõõtmine võimaldas meil analüüsida konkreetsetel radadel leitud geenirühmade ekspressiooni. See näitas OXPHOS-i ja glükolüüsiraja geenide ekspressiooni olulist vähenemist külmkambris säilitatavates neerudes, mis võib potentsiaalselt vähendada nende neerude võimet genereerida ATP-d, kooskõlas varasema uuringuga, mis näitas ATP vähenemist külmhoonegaaside neerudes.27 Põletikueelsete radade hulk vähenes ka külmhoiustamise ajal, sealhulgas TNF-i aktiveerimine NFkB kaudu ja reaktiivsete hapnikuliikide rada, mis võivad olla potentsiaalselt kasulikud. Siiski võib juhtuda, et külmhoidmine seab need rajad vaid ajutiselt kinni ja pärast reperfusiooni retsipiendis tekivad põletikulise geeni ekspressioonis sarnased muutused, mida täheldati NMP-s.

NMP-l oli OXPHOS-i ja glükolüüsiraja geenidele külmhoiustamisele vastupidine mõju, suurendades nende ekspressiooni, suurendades raku võimet ATP genereerimiseks ja homöostaasi taastamiseks. Märkimisväärne on see, et inimese neerude hüpotermiline hapnikuga perfusioon suurendab ka ATP taset võrreldes külmhoonega 27, mistõttu võib hapnikuga varustamise taastamine olla nende protsesside peamine stiimul, mitte normotermia. Sellegipoolest on need muutused tõenäoliselt elundile kasulikud, arvestades meie tähelepanekut negatiivse korrelatsiooni kohta OXPHOS-raja geenide suurenenud ekspressiooni ja pikaajalise DGF-i vahel.

Hameedi jt hiljutises artiklis28 viidi läbi ka NMP transkriptoomiline analüüs kolmes NMP-ga neerus. Kahjuks ei teinud autorid oma andmeid avalikult kättesaadavaks, seega pole põhjalik võrdlus meie andmekogumiga võimalik. Kuid nende käsikiri näitas immuunvastusega seotud geenide indutseerimist NMP ajal, sealhulgas IL1B, CXCL2 ja TNF, mis on kooskõlas meie leidudega.

Kliinilise uuringu kontekstis NMP läbinud neerude analüüsimisel korreleerisime geeniekspressiooni allkirju pigem DGF-i kui DGF-i esinemissagedusega (määratletud kui vajadus dialüüsi järele esimese nädala jooksul pärast siirdamist). Nimelt olid 1-päevase või lühema DGF-i kestusega neerud transkriptsiooniliselt väga sarnased neerudega, millel DGF-i ei olnud, mis peegeldab tõenäoliselt pigem dialüüsi vajadust peri-operatiivsest hüperkaleemiast kui heauskse DGF-i tõttu. Leidsime, et pikem DGF oli seotud TNFA signaaliülekande kõrgema ekspressiooniga NFkB raja geenide kaudu ja OXPHOS-iga seotud geenide madalama ekspressiooniga. Need andmed viitavad sellele, et suurenenud OXPHOS-i ja vähenenud immuunsignalisatsiooniga neerud võivad omada paremat potentsiaali doonorite neerudena, kuid see järeldus nõuab valideerimist suuremas perspektiivuuringus.

Samuti hindasime molekulaarseid protsesse, mis korreleeruvad NMP ajal uriini eritumise ja neeruverega. Neid parameetreid on varem kasutatud koos mitmete muude meetmetega perfuseeritud neerude kvaliteedi hindamise skoori loomiseks. Uriini eritumise ja neerude verevoolu kõrgeid väärtusi peetakse elujõulisemaks siirikuks.15 Meie andmed näitavad, et kõrge uriinierituse ja neerude kõrge verevooluga korreleeruvad teed erinevad ning tegelikult näitavad need parameetrid vastupidist seost põletikuliste radadega. . Suurt uriinieritust seostati immuunraja geenide kõrgema ekspressiooniga, samas kui kõrge neerude verevool oli nende radadega negatiivses korrelatsioonis. Samuti leidsime, et meie loodud DGF-i geenisignatuur oli rikastatud neerudes, millel oli NMP ajal kõrge uriinieritus, mis viitab sellele, et see parameeter võib erinevalt praegusest dogmast tuvastada neerud, millel on pikema DGF-i oht. Üks võimalik seletus on see, et väga kõrge uriinieritus peegeldab neerusid, millel on rohkem torukujulisi kahjustusi, millel puudub võime uriini kontsentreerida. Seega võib uriinierituse osas esineda "kuldvillaku efekt", mille puhul madala/vähe uriinieritusega neerud on filtraadi moodustumises oluliste kõrvalekalletega, väga suure uriinieritusega neerudel on oluline torukujuline kahjustus, mis välistab uriini kontsentratsiooni. Seda hüpoteesi tuleks testida suurema hulga neerudega, mis hiljem siirdati.

NMP 4 tunni jooksul indutseeriti neerudes põletikulisi geene. Siiski väärib märkimist, et praegune kliiniline praktika hõlmab ainult 1-tunnist NMP-d ja see toime ei pruugi lühema perfusiooniaja jooksul ilmneda. Pikemal perfusioonil võib aga olla kasu hapnikuga varustamise ja energiatootmise taastamisel ning meie katses võib tsütosooli HA sisestamine perfusiooniahelasse oluliselt muuta immuungeeni induktsiooni negatiivsed mõjud. Need andmed näitavad, et neerude poolt NMP käigus genereeritud põletikulised vahendajad sisenevad perfusiooniahelasse ja on võimelised süvendama steriilset põletikku ning et nende eemaldamine parandab NMP ajal täheldatud põletikuraja geenide esilekutsumist. Oluline on see, et näitasime, et HA lisamine mõjutab geenide ekspressiooni, mis on kliiniliselt seotud halvemate tulemustega. Meie DGF-i geenisignatuur saadi proovidest, mis läbisid NMP-d osana selle efektiivsust hindavast kliinilisest uuringust, võimaldades meil siduda meie paaris neeruuuringutes täheldatud muutused siirdatavate neerude kliiniliste tulemusnäitajatega. Siiski on selle rakendamine kliinilise uuringu kontekstis vajalik, et lõplikult tõestada selle kasutamise kasulikkust neerude siirdamise eel. HA on mittespetsiifiline ja võib eemaldada molekulid, mis on kasulikud, lisaks neile, mis on elundile kahjulikud. Leidsime, et HA netomõju neeru transkriptoomile näis olevat kasulik, kuid võib juhtuda, et tõestatud kahjulike vahendajate spetsiifiline eemaldamine võib olla veelgi tõhusam.

Neerupaarid, mida kasutasime, pärinesid samast indiviidist ja olid seetõttu geneetiliselt identsed ning kogenud sarnast keskkonda kogu doonori elu jooksul. Kinnitasime, et nende aja 0 transkriptoom oli äärmiselt sarnane (joonis S2 A, B). Nendest biopsiatest võetakse aga proov väikesest osast neerust ja neerupaare võib asümmeetriliselt mõjutada patoloogia, näiteks tsüstid või väikeste veresoonte haigus. Täiendav hoiatus on see, et kõik siin esitatud sekkumiskatsetes kasutatud neerud lükati siirdamiseks tagasi ja mõned esindavad siirdatud elundeid kvaliteedispektri alumises otsas. Sellegipoolest täheldasime viie neeru rühmade geeniradade võrdlemisel väga reprodutseeritavaid tulemusi. Samuti suutsime näidata, et DCD ja DBD neerudel oli perfusioonile sarnane reaktsioon. Kombineerides selle meie kureeritud NMP-järgse DGF-i allkirjaga, suutsime ennustada potentsiaalset kliinilist kasu. Seda eksperimentaalset lähenemisviisi võiks kasutada prekliinilise vahendina tulevaste sekkumiste võimaliku terapeutilise efektiivsuse kontrollimiseks, et võimaldada kandidaatsekkumiste ratsionaalset valikut kliinilisteks uuringuteks.

Kokkuvõtlikult võib öelda, et meie uuring annab esimese globaalse NMP-d läbivate inimese neerude transkriptsiooniprofiili, mis lahendab erinevad molekulaarsed rajad, mis NMP-s aktiveeruvad võrreldes külmhoonega, ja näitab, et NMP ajal neerudest toodetud või neerudest vabanevate bioaktiivsete molekulide kahjulik mõju võib ümber pöörata HA lisamisega. Lisaks vähendas see sekkumine pikaajalise DGF-iga seotud geenide ekspressiooni, andes tugeva mehaanilise põhjenduse sellise sekkumise rakendamiseks tulevases kliinilises uuringus. Meie andmed mõjutavad ka perfusioonistrateegiaid väljaspool neerusid, sealhulgas maksa- ja kopsusiirdamisel, mis viitab sellele, et nendes kontekstides, kus NMP-d kasutatakse üha enam, tuleks uurida bioaktiivsete molekulide eemaldamist perfusaatidest. Lõpuks tõstab meie uuring esile globaalse transkriptsiooniprofiilide koostamise kasulikkust paarisneeruduudsete sekkumiste hindamiseks perfusiooniga organitesse; transkriptsioonilised muutused eelnevad muutustele valkude arvukuses (tavaliselt kasutatakse seda biomarkeritenaneerudvigastus) ja kümneid tuhandeid geenitranskripte saab hõlpsasti mõõta. Seega võib RNA mõõtmine anda siirdamiseks võetud inimorganite rakufunktsiooni varajase ja tundliku näidu, mida saab tulevastes uuringutes rakendada.

TUNNUSTUS

Autorid tänavad kõiki elundidoonoreid ja nende perekondi. Clatworthy Lab on tänulik MRC molekulaarbioloogia labori pakutavate põhiseadmete eest. See töö viidi läbi, kasutades ressursse, mida pakub Cambridge'i andmepõhise avastamise teenus (CSD3), mida haldab Cambridge'i ülikooli teadusuuringute arvutusteenus, mida pakuvad Dell EMC ja Intel, kasutades Tier{2}} rahastamist inseneri- ja füüsikateaduste uurimistööst. nõukogu (kapitalitoetus EP/P020259/1) ja DiRACi rahastamine teaduse ja tehnoloogia rajatiste nõukogult (www. Dirac. ac. Ühendkuningriik).

AVALIKUSTAMINE

Autoritel ei ole huvide konflikti avalikustada, nagu on kirjeldanud American Journal of Transplantation.

AUTORI KAASALAD

JRF, SH, MLN ja MRC kavandasid uuringu ja tõlgendasid andmeid. JRF, SH, TM, CJW, AF ja TCD viisid läbi katsed. JRF, SH ja MRC lõid jooniseid ja tabeleid. MRC kirjutas põhikäsikirja. JRF ja SH lõid meetodid ja jooniste legendid, JRF, SH ja MLN redigeerisid käsikirja.

Cistanche kasulikkus: parandab neerufunktsiooni

Viited:
1. Methven S, Steenkamp R, Fraser S. Ühendkuningriigi neeruregistri 19. aastaaruanne: 5. peatükk 2015. aastal neeruasendusravi saanud Ühendkuningriigi täiskasvanud patsientide elulemus ja surmapõhjused: riiklikud ja keskusepõhised analüüsid. Nefron. 2017;137(1):117–150.
2. Summers DM, Johnson RJ, Allen J et al. Ühendkuningriigis pärast südamesurma annetatud neerude siirdamist mõjutavate tegurite analüüs: kohordiuuring. Lancet. 2010;376(9749):1303–1311.
3. Summers DM, Johnson RJ, Hudson A, Collett D, Watson CJ, Bradley JA. Doonori vanuse ja külmsäilitusaja mõju Ühendkuningriigis pärast vereringeelundite surma annetatud neerude retsipientide tulemustele: kohortuuring. Lancet. 2013;381(9868):727–734.
4. Friedewald JJ, Rabb H. Põletikulised rakud isheemilise ägeda neerupuudulikkuse korral.NeerInt. 2004;66(2):486–491.
5. Kono H, Rock KL. Kuidas surevad rakud hoiatavad immuunsüsteemi ohu eest. Nat Rev Immunol. 2008;8(4):279–289.
6. Berry M, Clatworthy MR. Immunoteraapia ägedateneerudvigastus. Immunoteraapia. 2012;4(3):1–12.
7. Parikh CR, Coca SG, Thiessen-Philbrook H jt. Postoperatiivsed biomarkerid ennustavad ägedatneerudvigastused ja halvad tulemused pärast täiskasvanute südameoperatsiooni. J Am Soc Nephrol. 2011;22(9):1748–1757.
8. Hall IE, Yarlagadda SG, Coca SG jt. IL-18 ja uriini NGAL ennustavad dialüüsi ja transplantaadi taastumist pärast sedaneerudsiirdamine. J Am Soc Nephrol. 2010;21(1):189–197.
9. Malyszko J, Lukaszyk E, Glowinska I, Durlik M. Biomarkers of delayed graft function as a form of acuteneerudvigastus sisseneerudsiirdamine. Sci Rep. 2015;5:11684.
10. Hosgood SA, Nicholson ML. Esimene inimese neerusiirdamine pärast ex vivo normotermilist perfusiooni. Siirdamine. 2011;92(7):735–738.
11. Yong C, Hosgood SA, Nicholson ML. Ex vivo normotermiline perfusioon neerusiirdamisel: minevik, olevik ja tulevik. Curr Opin organisiirdamine. 2016;21(3):301–307.
12. Fisher A, Andreasson A, Chrysos A jt. Vaatlusuuring doonori ex vivo kopsuperfusiooni kohta Ühendkuningriigi kopsusiirdamisel: DEVELOP-UK. Tervise tehnoloogiline hinnang. 2016;20(85):1–276.
13. Slama A, Schillab L, Barta M jt. Standardne doonori kopsude hankimine normotermilise ex vivo kopsuperfusiooniga: prospektiivne randomiseeritud kliiniline uuring. J Südame kopsusiirdamine. 2017;36(7):744–753.
14. Nasralla D, Coussios CC, Mergental H jt. Randomiseeritud uuring normotermilise säilitamise kohta maksasiirdamisel. Loodus. 2018;557(7703):50–56.
15. Barlow AD, Hamed MO, Mallon DH, et al. Ex vivo normotermilise perfusiooni kasutamine hüljatud inimese doonorkõhunäärmete kvaliteedi hindamiseks. Olen J siirdamine. 2015;15(9):2475–2482.

16. Hosgood SA, Saeb-Party K, Hamed MO, Nicholson ML. Inimese neerude edukas siirdamine, mida peeti siirdamatuks, kuid taastati Ex Vivo normotermilise masina perfusiooni abil. Olen J siirdamine. 2016;16(11):3282–3285.
17. Hosgood SA, Saeb-Party K, Wilson C, Callaghan C, Collett D, Nicholson ML. Randomiseeritud kontrollitud avatud uuringu protokoll, mis käsitleb ex vivo normotermilist perfusiooni versus staatiline külmhoone doonorluses pärast vereringe surmaga lõppenud neerusiirdamist. BMJ avatud. 2017;7(1):e012237.
18. Hosgood SA, Moore T, Kleverlaan T, Adams T, Nicholson ML. Hemoadsorptsioon vähendab eksperimentaalses mudelis põletikulist vastust ja parandab verevoolu ex vivo neeruperfusiooni ajal. J Transl Med. 2017; 15 (1): 216.
19. Krebs HA. Trikarboksüülhappe tsükli ajalugu. Perspect Biol Med. 1970;14(1):154–170.
20. Hoogland ER, de Vries EE, Christiaans MH, Winkens B, Snoeijs MG, van Heurn LW. Masina perfusiooni biomarkeri kontsentratsiooni väärtus DCD-sneerudsiirdamised. Siirdamine. 2013;95(4):603–610.
21. van Balkom BWM, Gremmels H, Ooms LSS jt. Säilitusvedelikus olevad valgud kui doonorite neerude siiriku hilinenud funktsiooni ennustajad pärast vereringeelundite surma. Clin J Am Soc Nephrol. 2017;12(5):817–824.
22. Kogelmann K, Jurczak D, Scheller M, Druner M. Hemoadsorptsioon CytoSorbi poolt septilistel patsientidel: juhtumite seeria. Kriitiline hooldus. 2017; 21(1):74.
23. David S, Thamm K, Schmidt BMW, Falk CS, Kielstein JT. Kehavälise tsütokiini eemaldamise mõju veresoonte barjääri funktsioonile septilise šokiga patsiendil. J Intensiivravi. 2017;5:12.
24. Li L, Huang L, Vergis AL jt. Neutrofiilide toodetud IL-17 reguleerib IFN-gamma-vahendatud neutrofiilide migratsiooni hiirtelneerudisheemia-reperfusiooni kahjustus. J Clin Invest. 2010;120(1):331–342.
25. Hayama T, Matsuyama M, Funao K jt. Neutrofiilide elastaasi inhibiitori kasulik mõju neerude sooja isheemia-reperfusioonikahjustusele rottidel. Transplant Proc. 2006;38(7):2201–2202.
26. Saat TC, Susa D, Roest HP jt. Põletikuliste, tsütoprotektiivsete ja vigastusgeenide ekspressiooniprofiilide võrdlus ajusurma ja südamesurma doonorite neerudes. Siirdamine. 2014;98(1):15–21.
27. Ravaioli M, Baldassare M, Vasari F jt. Adenosiintrifosfaadi (ATP) taseme taastamise strateegiad pärast enam kui 20-tunnist külmaisheemiaaega inimese äärealadelNeerPookoksad. Anni siirdamine. 2018;23:34–44.
28. Hameed AM, Lu DB, Patrick E jt. Lühiajaline normotermiline masinperfusioon noorendab äravisatud inimese neere. Otsene siirdamine. 2019;5(11):e502.