EphrinB2 (EphB2) reno-kaitsvad toimed

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Zhimin Huang, Simeng Liu, Anna Tang, Laith Al-Rabadi, Mark Henkemeyer, Patrice N. Mimche ja Yufeng Huang

Sissejuhatus

Kroonilist neeruhaigust (CKD) iseloomustab püsiv põletik ja järkjärguline fibroosi suurenemine, sealhulgas glomeruloskleroos ja tubulointerstitsiaalne fibroos, mis lõpuks põhjustablõppstaadiumis neeruhaigus(ESRD) olenemata põhihäirest|1]. See viitab lõplikule ühisele rajale ESRD jaoks. Selle ühise raja peamiste vahendajate parem mõistmine võib potentsiaalselt kaasa tuua sihipärasemate ravimeetodite väljatöötamise kroonilise neeruhaiguse progresseerumise vältimiseks või tagasipööramiseks.

Erütropoetiini tootvad hepatotsellulaarsed (Eph) retseptori türosiinkinaasid ja neile vastavad Eph retseptoriga interakteeruvad (Ephrin) ligandid moodustavad suure konserveerunud membraaniga ankurdatud signaalvalkude perekonna, mis kontrollivad erinevaid raku-raku interaktsioone kogu arengu ja täiskasvanueas [2]. Rakkude ja rakkude kokkupuutel põhjustavad EphB-EphrinB interaktsioonid eelkõige dimeere, tetrameere ja kõrgemat järku valguklastreid, mis viib kahesuunaliste signaalikaskaadide aktiveerimiseni, mis levivad retseptorit ekspresseerivasse rakku (edasisuunaline signaalimine) ja ligandi- väljendav rakk (pöördsignaal)[3-5]. Arvestades, et arvatakse, et Eph-Efriini kahesuunaline signaalimine osaleb paljudes rakkude ja rakkude interaktsioonides, migratsioonis ja adhesioonis nii embrüonaalse arengu kui ka füsioloogilise koeparanduse ajal 2,6-10], pole üllatav, et düsregulatsioon Nendest molekulidest on seostatud koefibroosiga. Tõepoolest, EphB-EphrinB signaaliülekande rollid kudede fibrogeneesis on avastatud mitmes vaskulaarse [11], südame [12], naha [13], kopsu [14] ja maksafibroosi [15, 16] hiiremudelis. Nende retseptorite ja ligandide potentsiaalsed funktsioonid seoses neeru patofüsioloogiaga on aga suures osas teadmata.

Täiskasvanu neeru glomerulites paikneb EphrinB1 glomerulites oleva podotsüütide pilu diafragmas[17], EphrinB2 ekspresseerub peamiselt glomerulaarsetes endoteelirakkudes (EC) ja arterite silelihastes [18], samas kui EphrinB3 on vaevu tuvastatav19]. Eph-retseptorite glomerulaarne ekspressioon või jaotus on endiselt ebaselge, kuigi mõned uuringud näitasid, et haruldane rakk ekspresseerib EphB4 küpsetes glomerulites [18]. Neerutuubulites tuvastatakse EphrinB1 kogu nefronis ja see võib mõjutada tubulaarsete epiteelirakkude tsütoarhitektuuri [19]. Peale selle, et EphrinB2 ekspresseerub arteriaalsetes silelihasrakkudes ja EC-des, leiti seda ohtralt ka arenevate ja täiskasvanud neerude ühendustuubulites ning kortikaalsetes ja medullaarsetes kogumiskanalites [18].EfriinB2 (EphB2) retseptorit ekspresseeritakse rohkesti medulla sisemise ja välimise tuubulites, sealhulgas distaalsetes sirgetes tuubulites ja Henle ahela õhukeses harus, kus see on koondunud rakkude basaalküljele. EphB4 ekspressioon on piiratud medulla kapillaaridega. EphB6 ekspresseeritakse eelistatult nii ajukoore kui ka välimise medulla neerurakkudes ja tuubulites, sealhulgas proksimaalsetes ja distaalsetes tuubulites. Kuid EphB6-l endal puudub katalüütiline aktiivsus ja see ei tööta tõenäoliselt sõltumatu retseptorina, vaid pigem annab signaali osana hetero-oligomeersest signaalikompleksist koos teiste EphB retseptoritega in vivo [20].

Varem teatati, et EphrinB2 pöördsignalisatsioon oli kaitstud kapillaaride harvendamise ja fibroosi eest pärast neerukahjustust, mis oli põhjustatud ühepoolsest kusejuha obstruktsioonist (UUO) või isheemia-reperfusiooni (IR) vigastusest, kuna hiirtel, kellel puudus EphrinB2-PDZ-sõltuv signaalimine, oli raskem. veresoonte vigastus ja suurenenud fibroos pärast neerukahjustust [21]. Siiski on ka võimalik, et PDZ-surnud EphrinB2 valk toimib tugevama ligandina, et stimuleerida EphB edasist signaalimist, ja see võib olla ülaltoodud uuringus täheldatud liigse neerufibroosi põhjus. Lisaks ei määranud ülaltoodud uuring, milline EphB retseptor osaleb pärast vigastust neerupatoloogias, kui üldse. Arvestades EphB2 olulist profibrootilist rolli (EphB2)hiljuti täheldatud signaaliülekanne maksafibroosis[15,16] ja EphB2 kõige rikkalikum ekspressioon (EphB2)neeru torukujulistes rakkudes[19] oletame, et EphB2 (EphB2)on tõenäoliselt seotudneeru-fibroos. Käesolevas uuringus uurisime, kas EphB2 on suurenenud (EphB2)on täheldatud ka erinevate neeruhaiguste ja EphB2 ekspressiooni ja signaalimise korral (EphB2)on kaasatud selle arendamisseneeru-buss EphB2 (EphB2)knockout(KO) ja pesakonnakaaslaste kontrollhiired ühepoolseks saamiseksneeru-IR vigastus. Näitasime, et EphB2 (EphB2)Eksperimentaalsete hüpertensiivsete ja diabeetiliste CKD hiiremudelite ja kroonilise neeruhaiguse all kannatavate patsientide ekspressiooni- ja signaalimisvõime on märkimisväärselt ülesreguleeritud pärast IR-kahjustust hiiremudelis ja neerudes. Veelgi enam, EphB2 geneetiline kadu (EphB2)KO hiirtel kaitsesid neere tugevalt IR-kahjustuse eestneeru-kahju, düsfunktsioon ja fibroos, tuvastades seega selle retseptori otsustava rolli ebasoodsate rakuliste sündmuste vahendamisel, mis mõjutavad neerusid haiguse progresseerumise ajal.

cistanche meessoost eelisedjaoksneerud

Tulemused

EphB2 (EphB2)on pärast vigastust neerudes ülesreguleeritud ja aktiveeritud

Kõigi EphB ja Ephrin-B molekulide transkripte normaalses täiskasvanud hiire neerus hinnati RT-PCR-ga (täiendav joonis S1A), mis näitas, et kõige silmatorkavamad amplifikatsiooniproduktid olid EphB2. (EphB2), EphB4, EphrinB1 ja EphrinB2. On näidatud, et EphB4 ekspresseerub peamiselt veresoonte EC-del ja on vajalik veresoonte struktuurse terviklikkuse jaoks ning seda ei tuvastata peamistes fibroosiga seotud neerurakkudes [21, 26]. Lisaks näitasid meie andmed, et neeru tubulaarsed epiteelirakud ja tubulaarsed fibroblastid ekspresseerivad EphB2 (EphB2)retseptor ja sarnased EphrinB1 ja EphrinB2 ligandid (vt lisajoonist S1B). Seejärel uurisime võimalikke muutusi ekspressioonis pärast IR-kahjustust ja leidsime, et EphB2 (EphB2)mRNA ja valgu tasemed olid WT IR-vigastatud neerus oluliselt ülesreguleeritud võrreldes vigastamata kontrollneeruga (CTL) (joonis 1A-C). Sellega kooskõlas tehakse immunoblotid, kasutades EphB1/EphB2 jaoks fosfospetsiifilist antikeha (EphB2)mis annab türosiinkinaasi katalüütiliselt aktiivse retseptori (p-EphB1/2) näidu, tuvastas IR-vigastatud WT hiire neeru olulise suurenemise (joonis 1B, D). Koelõikude IF-analüüs, kasutades anti-EphB2. (EphB2)antikehad kinnitasid retseptorvalgu ekspressiooni suurenemist WT IR-vigastatud neerudes, eriti tubulaarsetes epiteelirakkudes ja tubulointerstitsiaalsetes rakkudes (joonis 1E). Oluline on see, et EphB2 pole (EphB2)signaalid tuvastati EphB2 immunoblotides või IF-s neerudes (EphB2)KO hiired (EphB2-/), mis demonstreerivad antikehade reaktiivide spetsiifilisust. Lõpuks tuvastati WT hiirte IR-vigastatud neerudes ka EphrinB2 valgu ekspressiooni märkimisväärne suurenemine, kuigi huvitaval kombel seda suurenemist EphB2 vigastatud neerudes ei tuvastatud. (EphB2)KO hiired (joonis 1B, F).

Joonis 1.EphB2 (EphB2)ekspressioon suureneb hiirte neerudes pärast IR-kahjustust 2 nädala jooksul

(A) EphB2 retseptori, EphrinB1, EphrinB2 mRNA tasemeid analüüsiti hiirte neerudes, kasutades reaalajas RT-PCR-i. Tulemused on näidatud kordne muutus võrreldes kontralateraalsete neerudega (CTL). Vearibad tähistavad keskmist ± SD, n=5 looma.

(B) EphB2, fosfor-EphB2 (pEphB21594), EphrinB2 ja GAPDH Western blot analüüsid EphB2 plus/plus (WT ja EphB2-/(KO) hiirte neerudest. Molekulmass märgiti paremale.

Graafikud võtavad kokku EphB2(C), p-EphB2(D) ja EphrinB2 (F) ribatiheduse mõõtmise tulemused.*P<0.05 vs.ephb2+/+="">

(E) EphB2 plus/plus ja EphB2-/- hiirte külmutatud neerulõigud pärast IR-kahjustust värviti EphB2 (punane) ja DAPI/DNA-ga (sinine). Suurendus, × 200. EphB2 KO hiirte immunoblotanalüüsides ega IF-värvides ei tuvastatud EphB2-d.

cistanche herbasaab ravidaneerudhaigusparandadaneerufunktsioon

Et teha kindlaks, kas EphB2 ekspressioon on ülesreguleeritud (EphB2)ja EphrinB geene võis täheldada ka teistes neeruhaiguste loommudelites, uurisime II tüüpi diabeetiliste db/db hiirte [27] ja deoksükortikosteroonatsetaadi (DOCA) soola ja angiotensiin (Ang) II infundeeritud hüpertensiivsete hiirte [22] neerusid. RT-PCR analüüs. Andmed näitavad, et EphB2 (EphB2), EphrinB1 ja EphrinB2 transkriptid suurenesid mõlema mudeli puhul neerudes märkimisväärselt (täiendav joonis S2). Seejärel teostasime EphB2 jaoks IF-värvimise (EphB2)neerubiopsiates kroonilise neeruhaigusega patsientidel, kellel on diagnoositud lgA nefropaatia (IgAN) koos glomeruloskleroosi, tubulaarse atroofia ja interstitsiaalse fibroosiga, mis on määratud PAS-i värvimisega (joonis 2A). Võrreldes tavaliste katsealustega, silmatorkav kõrgenenud EphB2 muster (EphB2)valku ja edasisuunalist signaaliülekannet (värvimine p-EphB1/2 antikehadega) tuvastati mitte ainult haigestunud glomerulites, vaid ka nende IgAN-i patsientide neerude haigusega seotud tubulaarses piirkonnas (joonis 2B, C). Immunohistokeemiline värvimine, kasutades sama p-EphB2-vastast antikeha, mida kasutati IF-värvimiseks, näitas lisaks, et nende IgAN-patsientide puhul täheldati tugevat p-EphB2 värvimist peamiselt tubulaarsetes rakkudes ja mõnel juhul tubulointerstitsiaalsetes rakkudes (joonis 2D). Seevastu ainult mõned torukujulised rakud värviti normaalses neerus p-EphB2 suhtes nõrgalt (joonis 2D). EphB2 poolkvantifitseeritud integreeritud tiheduse tasemed (EphB2)või p-EphB2 värvumine neeru tubulointerstitsiaalses piirkonnas, mis on määratud ImageJ abil, on näidatud vastavalt paremal. Need andmed näitavad, et EphB2 ülesreguleeritud ekspressioon ja edastamise signaalimise potentsiaalne aktiveerimine on EphB2 silmapaistev tunnusjoon.neeru-fibroos.

Joonis 2. EphB2 (EphB2)ekspressioon suureneb inimese neeru biopsia koeskroonilise neeruhaigusega võrreldes tavaliste isikutega Neeru biopsia lõigud neeru normaalsest osast (NC, n{0}}) ja lgAN-i patsientidelt (Oxfordi patoloogiline tüüp T=1 [38]) (n=7) Nanjingi meditsiiniülikoolist värviti PAS-iga (A), EphB2-ga (punane) (B) ja fosfor-EphB2-ga (p-EphB2) (punane) (C). Suurendus, × 200. DAPI-ga värvitud DNA (sinine) toimis IF-värvimise tuumade värvimise kontrollina (IF-värvimine viidi läbi nii, nagu on kirjeldatud hiire koe puhul). Inimmaterjali kasutamise kiitis heaks kohalik eetikakontrolli nõukogu. Suurendus × 200. Nooled näitasid fibroosi glomeruli ja tubulointerstitsiaalses piirkonnas. (D) Immunokeemia värvimine p-EphB2 jaoks (värvitud pruuniga) (kasutades sama pEphB2-vastast antikeha kui primaarset antikeha, mida kasutati IF-värvimisel ja peroksidaasiga konjugeeritud küülikuvastast lgG-d (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.) sekundaarse antikehana antikeha ja positiivne värvumine töötati välja 3,3'-diaminobensidiini abil) viidi läbi nende lgAN-i neeru biopsia kudede parafiiniga manustatud 3-μm lõikudel ja värviti hematoksüliiniga. Negatiivse kontrollina asendati primaarne antikeha immuuneelse lgG-ga ja spetsiifilist värvumist ei täheldatud. Suurendus × 400. EphB2 või p-EphB2 värvumise suhteline integreeritud pikslitihedus, eriti neerutuubulointerstitsiaalses piirkonnas, nagu on kvantifitseeritud ImageJ abil, on näidatud iga värvimisfoto paremal pool.*P<0.05 vs.="" normal="" kidney="">

Joonis 3.EphB2 (EphB2)-KO hiirtel on pärast IR-kahjustust paranenud neerufunktsioon ja atroofia ning vähenenud tubulaarsed vigastused ja tubulointerstitsiaalne fibroos (AC) Seerumi BUN (A), Cr tase (B) ja neeru kaal (C) (n=5/rühm).*P<0.05 vs.ephb2+/+="" mice.="" (d,="" e)representative="" microscopic="" images="" showing="" pas="" staining="" (d)="" and="" masson's="" trichrome="" staining="" (e)="" of="" the="" kidney="" sections="" were="" used="" to="" detect="" tubular="" injury,="" inflammation,="" and="" collagen="" deposition="" (stained="" blue).="" magnification,×200.(f,="" g).="" the="" graphs="" summarized="" the="" results="" of="" tubular="" injury="" (f="" and="" collagen="" deposition="" (g)="" quantified="" by="" imagej.(h,="" d)="" mrna="" expression="" of="" tubular="" injury="" markers,="" ngal(h)="" and="" kim-1="" ()="" in="" the="" kidney="" following="" ir=""><0.05 vs.ephb2+/="" contralateral="" kidney=""><0.05 vs.ephb2+/+="" ir-injured="">

EphB2 (EphB2)KO kaitseb neere IR-indutseeritud vigastuse ja fibroosi eest

Neerukahjustuse ja fibroosi IR mudelis põhjustas 35-min isheemiaprotokoll WT hiirtel 2 nädala pärast tüüpilise raske kroonilise ühepoolse neerukahjustuse, sealhulgas neerufunktsiooni kahjustuse, mida tõendab suurenenud seerumi BUN ja Cr tase (joonis 3A, B) (kuigi siin mõõdetud BUN või Cr seerumitasemed peegeldavad ainult osaliselt IR-vigastatud neeru funktsiooni halvenemist, on nii seerumi BUN kui ka Cr tase ühepoolsetel WT hiirtelneeru IR kahjustusolid märkimisväärselt suurenenud võrreldes vigastusteta WT normaalsete hiirtega (BUN vs. normaalne: 26,81±4,25 vs. 17,3±0,37 mg/dl; Cr: 0,3{{1{{12} }}}1±0,029 vs. 0,158±0,064 mg/dl)) ja neerude atroofia, mis ilmneb neerude kaaluindeksi vähenemisest (IR-vigastatud neeru kaalu suhe kontrollrühmast, vigastamata neeru kaal) (joonis 3C) ). Histoloogiliselt näitas WT-hiirte IR-vigastatud neer tüüpilist tubulointerstitsiaalset mononukleaarsete rakkude infiltratsiooni ja akumuleeritud kollageeni ladestumist, mis määrati PAS-värvimise ja Massoni trikroomvärvimisega (joonis 3D-G). IR-ga vigastatud EphB2-/-hiirtel vähenes BUN-i ja Cr-i tase võrreldes WT-ga vigastatud hiirtega ning märkimisväärselt vähem neeruatroofiat, tubulaarset vigastust ja tubulointerstitsiaalset fibroosi. Samuti hinnati neutrofiilide želatinaasiga seotud lipokaliini (NGAL) ja neerukahjustuse molekuli -1(KIM-1) mRNA neerutranskripte, kuna mõlemad on kinnitatud kui neerutorukeste vigastuse varajased ennustavad markerid. Andmed näitasid, et kuigi NGAL ja KIM-1 ekspresseerusid väga tugevalt WT-hiirte IR-vigastatud neerudes, vähenes nende ekspressioon märkimisväärselt, vastavalt 77,2 ja 88,5% võrra EphB{{33}vigastatud neerudes. }/ mutantsed hiired (joonis 3H-I). See näitab, et hiirtel, kellel puudus EphB2 ekspressioon, vähenes infrapunavigastuse järgne torukujuline kahjustus. (EphB2)retseptor.

Joonis 4.EphB2 (EphB2)-KO hiirtel on pärast IR vigastust vähenenud tubulaarne - SMA värvumine ja fibrootiliste markerite neeruvalgu tase

(A) EphB2 plus/plus t ja EphB2-/- hiirte külmutatud neerulõigud pärast IR-kahjustust värviti -SMA-ga (punane) ja DAPI/DNA-ga (sinine) ning analüüsiti konfokaalse mikroskoopia abil. Suurendus, × 200.

(B) Graafikud võtavad kokku ImageJ-ga kvantifitseeritud -SMA sadestumise tulemused.*P<0.05 vs.ephb2+/t="" contralateral="" kidney="">

(C) FN, -SMA, N-kadheriini ja GAPDH Western blot analüüsid EphB2 plus/plus ja EphB2-/7- hiirte CTL ja IR-ga vigastatud neerudest. Molekulmass märgiti paremal pool.n=5 looma/rühm.

(DF) Graafikud võtavad kokku FN (D), -SMA (E) ja N-kadheriini (F) ribatiheduse mõõtmise tulemused.*P<0.05 vs.="" ephb2+/+=""><0.05 vs.="" ephb2+/+="" ir-injured="">

kõrbetsitanche'i eelisedpealneerud

-SMA suureneb tavaliselt tubulaarsete rakkude diferentseerumisel fibroblastideks või fibroblastide aktiveerimisel müofibroblastideks või veresoonte remodelleerumisel. Neerulõikude IF-analüüsi kasutades tuvastasime WT-hiirte IR-vigastatud neerude torukujulistes rakkudes -SMA värvumise märgatava suurenemise, mis oli vastus, mis EphB2 puhul dramaatiliselt tühistati. (EphB2)-/- hiired (joonis 4A, B). Seda tähelepanekut toetasid ka immunoblotanalüüsid, mis näitasid -SMA kõrgenenud valgutaseme ja mesenhümaalse/fibrootilise fenotüübi silmatorkavat vähenemist, mida iseloomustab N-kadheriini ja FN ekspressioon EphB2 IR-vigastatud neerudes. (EphB2)-/-hiired võrreldes WT kontrollidega (joonis 4C-F). Täiendav analüüs näitas, et fibrootiliste markerite, sealhulgas kollageeni tüüpi Iol (Col-Io1), Col-II 1, Col-IVcl ja FN suurenenud mRNA tase IR-vigastatud neerus vähenes oluliselt ka EphB2-s. (EphB2)-/-mutandid (joonis 5). Need andmed näitavad, et EphB2 (EphB2)KO kaitseb neere IR-indutseeritud tubulaarse EMT ja fibroosi eest.

Joonis 5. Kvantitatiivne RT-PCR profibrootiliste ja põletikuliste markerite geeniekspressiooni analüüsiks

Kogu RNA valmistati kontralateraalsetest (CTL) või IR-vigastatud neerudestEphB2pluss pluss jaEphB2-/- hiired. Andmed on keskmised ± SD, n=5 looma rühma kohta.*P<0.05>EphB2pluss / pluss CTL, #P<0.05>EphB2pluss / pluss IR-vigastatud neer.

EphB2 (EphB2)KO leevendab tugevat neerupõletikku, oksüdatiivset stressi ja proliferatiivseid reaktsioone pärast IR-kahjustust

Koefibroosi peamiste modulaatoritena mängivad TGF 1, plasminogeeni aktivaatori tüüp 1 inhibiitor (PAI-1), trombotsüütidest pärinev kasvufaktori retseptor (PDGFR) ja metalloproteinaasi koe inhibiitor (TIMP1) olulist rollineeru-fibroos. Ootuspäraselt suurenesid TGF 1, PAI-1, PDGFR- ja TIMP1 neerude mRNA tasemed WT hiirte IR-vigastatud neerudes märkimisväärselt, võrreldes nende sisemiste vigastamata CTL neerudega (joonis 5). Kuid nende profibrootiliste modulaatorite mRNA ekspressioon oli EphB2-7- hiirte IR-vigastatud neerudes tugevalt nüri. Need tulemused on kooskõlas vähenemiseganeeru-fibroostäheldasime EphB{0}}hiirtel pärast IR-kahjustust.

EphB2 toime täiendavaks kontrollimiseks (EphB2)Seotud raku allavoolu signaaliradade KO puhul täheldasime, et neeru RNA transkriptid NF-kB-p65, monotsüütide kemoatraktandi valgu -1(MCP-1), interleukiini (IL)-1B ja Nox2 suurenes WT hiirte IR-vigastatud neerudes (joonis 5). Lisaks oli NF-KB-p65, Nox2 ja selle kofaktori p47Phox neeruvalgu tootmine WT hiirte IR-vigastatud neerudes palju suurem võrreldes CTL-neerudega, mis näitab NF-KB-vahendatud põletikuraja ja Nox2 aktiveerumist IR-hiirtes. vigastatud neer. Kuid nende vahendajate tasemed paranesid või pöördusid normaalse taseme lähedale KO hiirtel, kellel puudus EphB2 (EphB2)väljendus (joonis 6A-D). Seriini/treoniini kinaasi (Akt) ja MAPK/ERK radade fosforüülimine ja signaalimine suurenes WT hiirte infrapunavigastatud neerudes, mis EphB2-/-hiirtel vähenes dramaatiliselt, lähenedes normaalsele tasemele (joonis 6A, E, F). Antikeha F4/80, mis teadaolevalt märgistab makrofaage, näitas oluliselt F4/80 pluss rakkude absoluutarvu suurenemist tubulointerstitsiaalses piirkonnas WT hiirte infrapunavigastatud neerudes, samas kui F4/80 pluss rakke oli neeruveresoontes vähe. CTL neerud, mis näitab makrofaagide kuhjumist ja põletikku kahjustatud neerudes. Kuid F4/80 pluss rakkude arv vähenes EphB{15}}hiirtel suuresti, lähenedes normaalsele tasemele, mida täheldati vigastamata neerudes (joonis 7A, B). Lisaks testisime Ki-67, tuumavalgu suhtes, mis toimib raku proliferatsioonimarkerina. Kooskõlas Akt ja ERK1/2 aktiveerimisega WT-hiirte infrapunavigastatud neerudes tuvastas IF-värvimine Ki{21}}positiivsete rakkude arvu dramaatilise suurenemise tubulointerstitsiaalses piirkonnas. Seevastu EphB2-7-hiirtel oli infrapunakiirgusega vigastatud neerudes Ki-67 palju väiksem arv ja värvumise intensiivsus, mis sarnanesid rohkem normaalsele vigastamata neerule (joonis 7C, D). Need andmed näitavad, et EphB2 kustutamine (EphB2)inhibeerib NF-kB-vahendatud põletikku, NADPH oksüdaasi poolt vahendatud oksüdaasi teket ja aktivatsiooni ning Akt- ja ERK1/2-vahendatud rakkude proliferatsiooni hiirte IR-kahjustusega neerudes. Seega EphB2 (EphB2)võib olla olulineneeru-põletikulineja proliferatiivsed reaktsioonid, mis soodustavad fibroosi.

Joonis 6. Põletikuliste, oksüdatiivse stressi ja proliferatiivsete markerite neeruvalgu tasemed

(A) NF-kBp65, Nox2, p47phox, p-Akt, pERK1/2, t-ERK1/2 ja GAPDH Western blot analüüsid kontralateraalsetest (CTL) ja IR-vigastatud neerudestEphB2 (EphB2)/ jaEphB2-/-hiired. Molekulmass oli märgistatud paremal. n=5 looma/rühm.

(BF) Graafikud võtavad kokku NF-kB-p65 (B), Nox2 (C), p47Phox(D), p-Akt (E), pERK1/2/t-ERK1/2 (F) ribatiheduse mõõtmise tulemused. ), vastavalt. *P<0.05 vs.="">EphB2pluss / pluss CTL.#P<0.05 vs.="">EphB2*/ pluss IR-vigastatud neer.

Vähenenud apoptoos EphB2 neerudes (EphB2)-/-hiired pärast IR vigastust

IR-kahjustusega neerusid iseloomustab ka ulatuslik neerutuubulite epiteelirakkude apoptoos. TUNELi värvimine näitas WT hiirte IR-vigastatud neeruosades apoptoosi olulist tõusu võrreldes CTL-i neerudega (joonis 8A, B), mis EphB2-7 hiirtel vähenes dramaatiliselt. Need tulemused toetavad EphB2 rolli (EphB2)KO apoptoosi ja parandusmehhanismide pärssimisel neerukahjustuse korral. Selline EphB2 täiendav toime (EphB2)võib selgitada ka piiratud fibroosi, mis esineb EphB{0}}hiirtel pärast IR-indutseeritud kroonilist vigastust.

valulikkus neerudes

EphB2 (EphB2)signaalimisega seotud profibrootiline rada

NanoStringi geeniekspressiooniga testitud 760 geeni hulgas (näidatud joonisel 9A, geeniekspressiooni soojuskaart) oli tõendeid diferentsiaalse geeniekspressiooni kohta (korrigeeritud P<0.05)in the="" ir-injured="" kidney="" of="" wt="" mice="" relative="" to="" the="" wt="" ctl="" kidney="" (wt-ir="" vs.="" wt-ctl)="" for="" 506="" genes(356genes="" were="" up-regulated="" and="" 150="" genes="" were="" down-regulated)with="" an="" estimated="" false="" discovery="" rate="" of="" 5%.="" the="" up-regulated="" 356="" genes="" include="" all="" molecules="" that="" we="" have="" observed="" in="" their="" rna="" expression="" or="" protein="" production="" using="" real-time="" rt-pcr="" or="" western="" blot="" assay="" described="" above="" and="" these="" genes="" encode="" for="" fibrotic="" markers="" such="" as="" col-iol,="" col-iiol,="" col-ivαl,="" and="" fn;="" emt="" markers="" such="" as="" α-sma="" and="" vimentin;="" inflammatory="" factors="" and="" oxidative="" enzymes="" such="" as="" nf-kb,="" mcp-1,="" il-1β,="" and="" nox2;="" growth="" factors="" and="" proliferation="" markers="" such="" as="" tgfβ1,="" pai-1,="" pgdfrβ1,="" timp-1,="" mek="" kinase,="" akt-1="" and="" ki-67,="" and="" caspase-3,="" -4,="" and-12="" that="" regulate="" inflammation="" and="" apoptosis.="" however,="" all="" those="" increased="" markers="" that="" were="" significantly="" attenuated="" in="" the="" ir-injured="" kidney="" of=""> (EphB2)Ülalkirjeldatud reaalajas RT-PCR või Western blot testiga määratud KO-hiirte võrdlus WT hiirtega (KO-IR vs. WT-IR) kinnitati ka NanoStringi geeniekspressiooni testiga. Alla reguleeritud geenide hulka kuuluvad superoksiiddismutaas 1 (SOD1)[28], heemoksügenaas 1 (Hmox1)[29] ja tioredoksiin 1,2 (Txn1,2)[30], mis näivad olevat antioksüdantide perekonda. Nende geenide vähenemine on seotud suurenenud oksüdatiivse stressiga, mida täheldati IR-vigastatud WT neerus. Kuid sellist SOD1 ja Txn1, 2 vähenemist IR-vigastatud EphB2 puhul ei toimunud (EphB2)KO neer. Ilmselt avastas NanoStringi geeniekspressiooni test samaaegselt mitu kandidaatgeeni, mis on seotud IR-indutseeritud geenidega.neeru-vigastusja fibroos. Nimelt vähenes 230 356-st ülesreguleeritud geenist (kokku 64,6 protsenti, kohandatud P-ga<0.05)and 129="" of="" 150="" down-regulated="" genes="" were="" reversed="" to="" varying="" degrees（total="" 86%个,="" with="" adjusted=""><0.05）in the="" ir-injured="" kidney="" of="" ephb2-/-mice="" compared="" with="" wt="" mice(ko-ir="" vs.="" wt-ir).="" all="" those="" ameliorated="" molecules="" are="" involved="" in="" 50="" ameliorated="" annotated="" pathways="" (shown="" in="" figure="" 9b,="" a="" heatmap="" of="" pathway="" scores).="" among="" those,="" the="" common="" profibrotic="" pathways,="" shown="" in="" figure="" 9c,="" that="" will="" contribute="" to="" the="" development="" of="">neeru-fibroos, nagu EMT ja põletikulised ja proliferatiivsed rajad, on IR-vigastatud neerudes märkimisväärselt aktiveeritud või ülesreguleeritud, kuid IR-vigastatud EphB2-s oluliselt paranenud. (EphB2)KO neer. Üllataval kombel näitas see analüüs ka seda, et lisaks antioksüdantide vähenenud mRNA ekspressioonile ilmnes ka neerutuubulite rakkude energia metabolism, nagu de novo lipogenees, glükoneogenees, kolesterooli metabolism, peroksisoomi proliferaator-aktiveeritud retseptori (PPAR) signaaliülekanne ja eriti rasvhapete metabolism. Kuumakaardil loetletud oksüdatiivse stressi rajana, joonis 9B), mis on suuresti hävinud IR-vigastatud neerus, püsis dramaatiliselt IR-vigastatud EphB2-s. (EphB2)KO neer (nagu on näidatud joonisel 9D). Need tulemused viitavad veel sellele, et enamik molekule, mis on seotudneeru-vigastusja fibroosi reguleerib EphB2 või on sellega seotud (EphB2)signaalimine. Eelkõige EphB2 (EphB2)signaalimine võib olla seotud või vahendada neerutuubulite rakkude mitokondriaalset energia metabolismi, nagu mitokondriaalne rasvhapete oksüdatsioon ja lipotoksilisus neeruhaiguste korral.

Joonis 7.EphB2 (EphB2)KO vähendab makrofaagide infiltratsiooni ja tubulaarsete rakkude proliferatsiooni neerudes pärast IR-kahjustust EphB2 plus/plus ja EphB2-7hiirte (n=5/igaüks) neerulõigud pärast infrapunakiirguse vigastust värviti värvidega F4/80 (punane) (A), Ki-67 (punane) (C) ja DAPI/DNA (sinine) ning analüüsiti konfokaalse mikroskoopia abil. Suurendus, × 200. Graafikud võtavad kokku pildiga ImageJ kvantifitseeritud F4/80 pluss (B) ja Ki-67 pluss lahtrite (D) tulemused.*P<0.05 vs.ephb2+/+="" contralateral="" kidney=""><0.05 vs.ephb2+/+="" ir-injured="">

Joonis 8.EphB2 (EphB2)KO vähendab tubulaarsete rakkude apoptoosi neerudes pärast isheemia-reperfusiooni (IR) vigastust (A) EphB2 plus/plus ja EphB2-7- hiirte ((n=5/igaüks) neerulõigud pärast infrapunakiirguse vigastust värviti TUNELiga (roheline) ja DAPI/DNA-ga (sinine) ning analüüsiti kasutades konfokaalne mikroskoopia. Suurendus, × 200. (B) Graafikud võtavad kokku TUNEL pluss rakkude tulemused, mis on kvantifitseeritud ImageJ-ga.*P<0.05 vs.ephb2++="" contralateral="" kidney=""><0.05 vs.="" ephb2+="" ir-injured="">

Ⅰ Ⅱ OSAKS KLIKI SIIA