NADC{0}}nagu PRRSV tüvega nakatunud sigade eksosomaalsete MiRNA-de väljendatud profiilide süstemaatiline tuvastamine ja võrdlemine

Lihtne kokkuvõte:Eksosoomid mängivad ainulaadset rolli viirusnakkuses, antigeeni esitlemises ja keha immuunsuse mahasurumisel/edendamisel. Sigade reproduktiiv- ja respiratoorse sündroomi viirus (PRRSV) on seatööstuses üks kahjustavamaid patogeene. Siin kasutasime PRRSV NADC{0}}nagu CHsx1401 tüve, et kunstlikult nakatada 42-ühepäevaseid sigu, isoleerida seerumi eksosoome ja tuvastada 33 oluliselt erinevalt ekspresseeritud (DE) eksosomaalset miRNA-d nakkus- ja kontrollrühmade vahel. 18 PRRSV infektsiooni ja immuunsusega seotud DE miRNA-d skriiniti kui potentsiaalseid funktsionaalseid molekule, mis osalesid PRRSV viirusnakkuse reguleerimises eksosoomide poolt.

Abstraktne:Eksosoomid on bioloogilised vesiikulid, mida sekreteerivad ja vabastavad rakud, mis toimivad rakkudevahelise suhtluse vahendajatena ja mängivad ainulaadset rolli viirusnakkuses, antigeeni esitlemises ja keha immuunsuse mahasurumisel/edendamisel. Sigade reproduktiiv- ja respiratoorse sündroomi viirus (PRRSV) on seatööstuses üks kahjustavamaid patogeene ja võib põhjustada emiste paljunemishäireid, sigade hingamisteede haigusi, kasvuvõime langust ja muid haigusi, mis põhjustavad sigade suremust. Selles uuringus kasutasime PRRSV NADC{0}}nagu CHsx1401 tüve 42-ühepäevaste sigade kunstlikuks nakatamiseks ja seerumi eksosoomide isoleerimiseks. Suure läbilaskevõimega sekveneerimistehnoloogia põhjal tuvastati seerumi eksosoomides enne ja pärast nakatumist 305 miRNA-d, millest 33 miRNA-d ekspresseeriti rühmade vahel oluliselt erinevalt (13 suhteliselt ülesreguleeritud ja 20 suhteliselt allareguleeritud). CHsx1401 genoomi järjestuse säilitamise analüüs tuvastas 8 konserveerunud piirkonda, millest kokku 16 erinevalt ekspresseeritud (DE) miRNA-d seostuvad eeldatavasti 3-le lähima konserveerunud piirkonnaga.0 CHsx1401 genoomi UTR, sealhulgas 5 DE miRNA-d, mis on võimelised seonduma CHsx-ga1401 30 UTR (ssc-miR-34c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR-486, ssc-miR-6529). Edasine analüüs näitas, et erinevalt ekspresseeritud miRNA-de sihtgeenid olid laialdaselt seotud eksosomaalse funktsiooniga ja kaasasündinud immuunsusega seotud signaaliradadega ning 18 DE miRNA-ga (ssc-miR-4331-3p, ssc-miR-744 , ssc-miR-320, ssc-miR-10b, ssc-miR-124a, ssc-miR-128 jne), mis on seotud PRRSV infektsiooni ja immuunsusega. potentsiaalsete funktsionaalsete molekulidena, mis osalevad PRRSV viirusnakkuse reguleerimises eksosoomide poolt.

cistanche taime suurendav immuunsüsteem

Märksõnad:PRRSV; seerumi eksosoom; miRNA-d

1. Sissejuhatus

Sigade reproduktiiv- ja respiratoorse sündroomi viirus (PRRSV) on üheahelaline positiivse ahelaga RNA-viirus, mille ümbrise struktuur kuulub sugukonda Nidovirales, perekonda Arteriviridae, perekonda Betaarterivirus [1,2]. See on sfääriline või ellipsoidne diameetriga 50–65 nm külmutuselektronmikroskoobi all [3,4]. PRRSV genoom on umbes 15 kb pikkune 50-pealise ja 30-kordse polüA-sabaga ning sisaldab vähemalt 10 avatud lugemisraami (ORF), mida ääristavad transleerimata piirkonnad (UTR-id) nii 50 kui ka 30 otsas [5,6] ja on ümbritsetud nukleokapsiidvalguga, lipiidide kahekihilise kattega, moodustades viirusosakesi. Eksosoomid kuuluvad ühekihilise membraanistruktuuriga vesiikulitesse ja neil on sama topoloogiline struktuur kui rakkudel [7]. Kuju on elektronmikroskoobi all "topsikujuline" või "kettakujuline" [8,9]. Eksosoomid võivad vereringesüsteemis eksisteerida pikka aega ja eksosoomides olevad ained võivad imenduda külgnevate rakkude või kaugemate retseptorrakkude poolt ning seejärel reguleerida retseptorrakke, et nad osaleksid rakkudevahelises geneetilise materjali vahetuses [10,11]. Need koosnevad peamiselt membraanipinna ainetest ja kaasas olevast sisust, sealhulgas rakupinna retseptorid, membraanivalgud, lahustuvad valgud, lipiidid, RNA (mRNA, miRNA, lncRNA ja viiruse RNA jne), genoomne DNA, mitokondriaalne DNA [12–14 ]. MikroRNA-d (miRNA-d) on evolutsiooniliselt konserveerunud endogeensete mittekodeerivate üheahelaliste väikeste RNA-de klass, mis koosneb 18–25 nukleotiidist (nt), mis pärsivad translatsiooniprotsessi, kutsudes esile sihtmärk-mRNA lagunemise või seondudes 30 UTR sihtmärk-mRNA-ga, mis viib transkriptsioonijärgse geeni vaigistamiseni, seejärel reguleerides geeniekspressiooni transkriptsioonijärgsel tasemel [15–17]. Arvatakse, et miRNA-d reguleerivad rohkem kui 60% imetajate geenidest pärast transkriptsiooni [18, 19]. MiRNA-d mängivad olulist rolli rakkudevahelises suhtluses ja neid saab kasutada ka potentsiaalse funktsionaalse molekulina haiguste ja viirusnakkuste, edasikandumise ja kaitse jaoks [20]. Üha rohkem uuringuid on näidanud, et miRNA-d võivad esineda kehavedelikes, nagu sülg, uriin, rinnapiim ja veri, ning toimida läbi keha vedeliku vereringesüsteemi [21,22]. Eksosomaalseid miRNA-sid peetakse geeniekspressiooni ja metabolismi endogeenseteks regulaatoriteks ning need võivad viidata erinevatele patoloogilistele seisunditele [23, 24].

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

Viimase kahe aastakümne jooksul on näidatud, et miRNA-del on oluline roll immuunrakkude arengu, kaasasündinud immuunvastuste ja omandatud immuunvastuste reguleerimisel. Teatatakse, et mõned teised miRNA-d kahjustavad PRRSV infektsiooni järgmistel viisidel, sihivad otseselt PRRSV genoomi või PRRSV retseptorit või mängivad rolli peremeesorganismi kaasasündinud immuunvastuse reguleerimisel. Perekond miR-26 võib oluliselt kahjustada viiruse replikatsiooni ning miR-26a võib pärssida 1. ja 2. tüüpi PRRSV tüvede replikatsiooni sigade alveolaarsetes makrofaagides (PAM), reguleerides I tüüpi interferooni (IFN) rada, mis on tõhusam kui miR-26b [25,26]. On kindlaks tehtud, et miR-30c ja miR-125b moduleerivad peremeesorganismi kaasasündinud immuunvastust, sihtides vastavalt I tüüpi IFN-i ja NF-κB-rada [27–29]. MiR-23, miR-378 ja miR-505 on viirusevastased peremeesfaktorid, mis on suunatud PRRSV-le ja neil on konservatiivsed sihtmärgid 2. tüüpi PRRSV tüvedes [30]. Samal ajal on tuvastatud, et peremeesorganismi miR-506 pärsib PRRSV replikatsiooni, suunates PRRSV retseptori CD151 otse MARC-145 rakkudesse [31]. miR-181 võib ka kaudselt pärssida PRRSV replikatsiooni, vähendades PRRSV retseptorit CD163 vere monotsüütides ja PAM-ides [32]. Lisaks võivad miRNA-d soodustada PRRSV replikatsiooni, sekkudes raku põhifüsioloogiasse. MiR-24-3p ja miR-22 sihivad PRRSV-nakkuse ajal otseselt HO-1 30 UTR-i, et pääseda heemi oksüdaasi-1 (HO-1) pärssimisest. kuumašoki valk (tuntud ka kui HSP32) PRRSV-l [33,34]. Sead on teadaolevalt PRRSV-le vastuvõtlikumad ja vähem võimelised end selle patogeeni organismi sattumise eest kaitsma [35]. Käesolevas uuringus uuriti selle viirusega nakatunud sigade kaasasündinud immuunsust ja omandatud immuunsust molekulaarsel tasemel, kasutades põllul levinud tüve. Seerumi eksosoomide isoleerimiseks ja tuvastamiseks enne ja pärast PRRSV-ga nakatumist kasutati seerumi eksosoomide isoleerimiskomplekti, transmissioonelektronmikroskoopiat (TEM), nanoosakeste jälgimise analüüsi (NTA) ja Western blot'i (WB), millele järgnes väikese RNA sekveneerimise analüüs, identifitseerimine, ja diferentsiaalsete ekspressioonitulemuste analüüs bioinformaatika meetodite abil, et saada mitu PRRSV-ga seotud seerumi eksosoomi miRNA-d, millele järgneb andmetulemuste tuvastamine kvantitatiivse reaalajas PCR-i (qRT-PCR) abil.

2. Materjalid ja meetodid

2.1. Loomkatsed

Kuus PRRSV antigeeni ja antikeha topeltnegatiivset tervet 42-päevast suurt valget siga paigutati sigade puhastoidusüsteemi isoleerimiseks, tervishoiuks ja keskkonnaga kohanemiseks. Kõik sead said piiranguteta vabalt süüa ja juua. Kui nad olid isolaatori tingimustega tuttavad, inokuleeriti sigadele nina kaudu 2 ml 105 TCID50/ml PRRSV NADC30-, nagu CHsx1401, mida mainisid eelkäijad [36,37]. Sigade veri enne (kontrollrühm, n=6) ja 7 päeva pärast (ravirühm, n=6) viiruse nakatamist koguti seerumi isoleerimiseks õõnesveenist. Seerumi rakujäägid eemaldati tsentrifuugimisega 3000 g juures 15 minutit. Kõik meie uuringus tehtud loomkatsed kiitis heaks Hiina Põllumajandusteaduste Akadeemia (CAAS) (Peking, Hiina), IASi loomateaduse instituudi loomaeetika komitee2022-130.

2.2. Seerumi eksosoomide eraldamine ja puhastamine

Eksosoomi eraldamine ja puhastamine viidi läbi, kasutades exoEasy Maxi komplekti (QIAGEN, Hilden, Saksamaa, kat. nr 76064) vastavalt tootja protokollile.

2.3. Transmissioonielektronmikroskoopia (TEM)

Ekstraheeritud eksosoomide suspensioonid kanti vormikarboga kaetud vaskvõrgule ja eksosoomid loputati PBS-ga ja värviti standardse uranüülatsetaadiga 3 minutit toatemperatuuril. Pärast mitu minutit toatemperatuuril kuivatamist visualiseeriti võrk ja pildistati 100 kV juures ülekandeelektronmikroskoobiga (HT-7700, Hitachi-High Tech, Tokyo, Jaapan).

2.4. Nanoosakeste jälgimise analüüs (NTA)

Ekstraheeritud eksosoomid lahjendati 1 × PBS-ga, muutes mahtu 10-lt 30 µL-le. Pärast proovi testimist analüüsiti seerumi eksosoomide kontsentratsiooni ja suurust N30E voolu nanoanalüsaatoriga, järgides tootja juhiseid (NanoFCM, Xiamen, Hiina).

2.5. Western Blot

Ekstraheeritud eksosoomiproovid lisati RIPA lüsaadile, mis oli segatud proteaasi inhibiitori (Invitrogen, Waltham, MA, USA) ja fenüülmetüülsulfonüülfluoriidiga (PMSF), et ekstraheerida eksosoomi valk, mida lüüsiti jääl 30 minutit. Seejärel määrasime Bradfordi komplekti juhiste kohaselt seerumi eksosoomivalgu kontsentratsiooni. Eksosoomivalgud läbisid termilise denaturatsiooni. Sama kogus valku eraldati 12% SDS-PAGE geelil ja kanti seejärel polüvinülideenfluoriidi (PVDF) membraanile (Millipore, Burlington, MA, USA). Seda leotati TBST-s, mis sisaldas 5% lõssipulbrit, ja suleti 1 tund toatemperatuuril. Leotasime membraani lahjendatud primaarses antikehas (anti-CD9 antikeha, Abcam, Boston, MA, USA, #ab92726; anti-CD81 antikeha, Abcam, Boston, MA, USA, #ab109201) üle öö temperatuuril 4 ◦C ja kogusime. esmane antikeha. Leotasime membraani lahjendatud sekundaarses antikehas, inkubeerisime seda toatemperatuuril 1 tund ja kogusime sekundaarse antikeha. Panime pestud PBST kile värskelt säilivale kilele, lisasime võrdse mahuga segatud ECL a / b kromogeenset lahust ja asetasime selle kemoluminestsentskujutisesse.

Tistanche kasulikud omadused meestele - tugevdavad immuunsüsteemi

Cistanche Enhance Immunity toodete vaatamiseks klõpsake siin

【Küsi lisa】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.6. Eksosomaalse väikese RNA järjestamine ja andmete analüüs

Eksosoomide kogu RNA ekstraheeriti Trizoliga vastavalt tootja juhistele. Seejärel tuvastasime RNA kontsentratsiooni ja optilise tiheduse (OD) väärtuse ning tuvastasime RNA lagunemise ja puhtuse 1% agaroosgeelelektroforeesiga. Vahepeal kasutati RNA terviklikkuse tuvastamiseks Agilent Bioanalyzer 2100. Pärast kvaliteedikontrolli kasutasime eksosoomide kogu RNA-d. Vastavalt tootja juhistele kasutasime Illumina® (Illumina, San Diego, CA, USA) jaoks NEB NEXT multiplex väikese RNA raamatukogu ettevalmistuskomplekti. Komplekt valmistas ette väikese RNA cDNA raamatukogu ja sekveneeris selle, et toota Illumina Novaseq 6000 platvormil 50 nt ühe otsaga lugemisi. Kõik väikese RNA raamatukogu ettevalmistamise protseduurid viis läbi Novogene (Peking, Hiina). Kvaliteedikontrolli järgsed andmed joondati sigade võrdlusgenoomiga (Sus scrofa 11.1), kasutades kikilipsu. Tuntud miRNA-d tuvastati andmebaaside miRbase (v22.0) [38] (https://www.mirbase.org, juurdepääs 14. jaanuaril 2022), miRdeep2 (v0.0.5) [39] ja miRevo (v1.1) abil. ) [40] ja neid kasutati uute miRNA-de ennustamiseks. Samal ajal teostas miRNA-de diferentsiaalekspressioonianalüüsi DESeq (v1.24.0) [41], mis nõudis |kordade muutmist| > 1,6 ja p < 0,05. Joondamine viidi läbi MEGA (V11) [42] abil, millele järgnes ühe aluse hindamine PHAST-i (v1.6.9) [43] abil ja 10 viiruse geeni, sealhulgas WUH3 (GenBank registreerimisnumber HM853973), VR2332 () kõige konserveeritumate piirkondade hindamine. GenBanki registreerimisnumber U87392), JXA1 (GenBanki registreerimisnumber EF112445), CH-1a (GenBanki registreerimisnumber AY032626), NADC30 (GenBanki registreerimisnumber HN654459), HUN4 (GenEF6HL5JZ06),3HL50Z06. 22-1812 (GenBanki registreerimisnumber MN648450), SC/DJY (GenBanki registreerimisnumber MT075480) ja Lelystad (GenBanki registreerimisnumber M96262.2). RNAhübriidi (V2.0) [44] kasutati tuvastatud miRNA järjestuse seondumise ennustamiseks viiruse CHsx1401 genoomi 3 0 UTR-iga. Geenide ennustamiseks kasutati Mirandat (v3.3a) ja RNAhybridi. Klastriprofiili [45] R-paketti kasutati sihtgeenide GO (Gene Ontology) funktsionaalseks rikastamise analüüsiks ja KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) raja rikastamise analüüsiks.

2.7. MiRNA ekspressiooni valideerimine RT-qPCR abil

Kogu RNA eraldati seerumi eksosoomidest, kasutades Trizoli (Invitrogen, Shanghai, Hiina) vastavalt tootja protokollile. Eraldatud RNA-d kontrolliti proovide RT-qPCR abil (n=6 rühma kohta). cDNA sünteesiti vastavalt miRNA 1. ahela cDNA sünteesikomplekti juhistele (stem-loop) (Vazyme, Nanjing, Hiina) ja fluorestsentsi kvantifitseerimine viidi läbi, kasutades ABI 7500 vastavalt miRNA universaalse SYBR qPCR põhisegu juhised (Vazyme, Nanjing, Hiina). Kasutatud termotsükli parameetrid olid järgmised: esimene etapp: 95 ◦C 30 s; 2. etapp: 95 ◦C 5 s, 60 ◦C 34 s ja 40 tsüklit; 3. etapp: 95 ◦C 15 s, 60 ◦C 1 min ja 95 ◦C 15 s. U6 geeni miRNA-de praimerijärjestusi kasutati võrdlusena [46] ja need on loetletud täiendavas tabelis S1. Kõik qRT-PCR kontrollimised viidi läbi, kasutades kolme bioloogilist kordust ja iga proovi jaoks kolme kordust. Transkriptide suhteline arvukus arvutati 2-Ct meetodil ning andmete analüüsiks ja kaardistamiseks kasutati vastavalt SPSS (v22.0) ja GraphPad Prism (v8.0). p < 0,05 tähendab, et erinevus on statistiliselt oluline.

3. Tulemused

3.1. Antigeeni ja antikeha suhteline väärtus pärast viiruse inokuleerimist

PRRSV antigeeni ja antikeha testide tulemused enne (päev 0) ja pärast (7. päev) nakatamist on toodud tabelis 1. PRRSV antigeeni ja antikeha seroloogiline tuvastamine enne nakatamist oli negatiivne ja antigeen oli positiivne pärast nakatamist, mis näitab, et sead nakatati edukalt CHsx1401-ga.

3.2. Seerumi eksosoomide eraldamine ja identifitseerimine

Seerumist eraldatud vesiikulid avastas TEM. Enamik vesiikuleid näevad keskel nõgusaid taldriku- või kettakujulisi eksosoome. Eksosoomide membraaniserv on nähtav ja morfoloogia on suhteliselt täielik (joonis 1A, B). Nanoosakeste jälgimise analüüs näitas, et 95, 73% eksosoomidest oli läbimõõduga 30–150 nm, peamiselt umbes 72, 25 nm, keskmise läbimõõduga 76, 22 nm, mis oli kooskõlas eksosoomide suurusomadustega (joonis 1C). See suurusvahemik oli sarnane TEM-i poolt tuvastatuga ja kinnitas veelgi nende vesiikulite identiteeti eksosoomidena. Western blot analüüs näitas, et seerumiproovidest eraldatud vesiikulid olid CD9 ja CD81 valkude suhtes positiivsed (joonis 1D). Ülaltoodud omadused vastavad eksosoomide identifitseerimisstandarditele, mille koostas Rahvusvaheline Ekstravesiikulite Ühing (ISEV) MISEV2018 [47].

Tabel 1. Antigeen ja antikeha (päev 0) ja (päev 7) nakatamisviirusega.

Joonis 1. Seerumi eksosoomide peamised omadused. (A, B) näitavad vesiikulite morfoloogilisi omadusi TEM abil. Skaala ribad on vastavalt 500 nm ja 100 nm. (C) NTA näitab enamiku vesiikulite läbimõõtu ja kontsentratsiooni. (D) Western blot näitas eksosoomimarkerite CD81 ja CD9 olemasolu seerumi eksosoomides. Märkus. Mix in WB tulemused on prooviga segatud suspensioon, mis on eraldatud exoEasy Maxi komplektiga

3.3. Seerumi eksosoomide väike RNA sekveneerimine

Iga proovi puhul ulatusid puhtad andmed 0,5 Gb-ni ja Q30 baasprotsent oli üle 96,20%. Iga proovi puhtad lugemised joondati sea võrdlusgenoomiga. 12 proovi hulgast sai kontrollrühm vastavalt 10 920 887, 10 248 696, 10 109 117, 10 655 494, 9 217 285 ja 9 782 523 lugemist. Ravirühm sai vastavalt 11 889 518, 10 593 504, 10 593 504, 12 846 080, 10 105 325, 11 729 451 ja 9 789 542 lugemist. Keskmiselt oli 77, 96% kõigist puhastest lugemistest pikkusega 19–22 nukleotiidi (nt) (joonis 2A). Kvaliteedikontrolli järgsed näidud moodustasid üle 92,59% lugemite koguarvust. Töödeldud puhtad lugemised joondati sea võrdlusgenoomiga ja 12 genoomi raamatukogu kaardistatud määr oli üle 92, 30% ja kaardistatud määr oli 94, 98% (joonis 2B). See näitas, et konstrueeritud seerumi eksosomaalne miRNA raamatukogu oli kõrge kvaliteediga ja sobilik edasiseks analüüsiks. Üksikasjad on loetletud täiendavas tabelis S2.

Joonis 2. Väikeste RNA transkriptsiooniandmete ülevaade. (A) Seerumi eksosoomiproovide lugemisloendite pikkusjaotus (nt=nukleotiidi); (B) võrdlusgenoomiga kaardistatud 12 proovi määr

3.4. MiRNA-de erinev ekspressioonianalüüs

Pärast tuvastatud miRNA ekspressiooni kvantitatiivset analüüsi skriiniti miRNA-sid eelnevalt jaotises 2.6 kirjeldatud lävede järgi. Kokku saadi 305 miRNA-d enne ja pärast CHsx1401 tüve inokuleerimist (kontroll, n=6; ravi, n=6). Kahe rühma vahel tuvastati kokku 33 erinevalt ekspresseeritud (DE) miRNA-d, 13 DE miRNA-d reguleeriti üles ja 20 DE miRNA-d vähendati ravirühmas (joonis 3 ja täiendav tabel S3).

3.5. miRNA sihtgeenide funktsionaalne rikastamise analüüs

Kokku ennustati 33 DE miRNA-ga 7283 sihtgeeni ning sihtgeenide funktsioonid keskendusid peamiselt MAPK kaskaadi positiivsele regulatsioonile, lipiidide metabolismi protsessile, rakusisese signaaliülekande reguleerimisele, ERK1 ja ERK2 kaskaadile jne (joonis 4A). ). Molekulaarsete funktsioonide osas keskenduvad erinevalt ekspresseeritud miRNA sihtgeenid peamiselt GTP-ensüümi reguleerivale aktiivsusele, kinaasi aktiivsusele, nukleosiidtrifosfataasi reguleerivale aktiivsusele ja teistele signaaliülekande ja energia metabolismiga seotud funktsioonidele (joonis 4B). Lisaks osalevad rakukomponentide hulgas sihtgeenid peamiselt supramolekulaarsete polümeeride, Golgi, autofagosoomide, rakupinna, varajaste endosoomide jne bioloogilistes funktsioonides (joonis 4C). Nende komponentide funktsioonid on tihedalt seotud eksosoomide moodustumisega, mis selgitab ka järjestuse täpsust. KEGG raja rikastamise analüüs näitas, et sihtgeenid olid märkimisväärselt rikastatud endotsütoosi, MAPK signaaliraja, Rap1 signaaliraja, sfingolipiidide signaaliraja ja PI3K Akt signaaliraja suhtes (p < 0.05) (joonis 5A). ). Samal ajal klassifitseeriti ja analüüsiti rikastatud radu. Tulemused näitasid, et sihtgeeni KEGG rada oli peamiselt rikastatud keskkonnateabe töötlemise, inimeste haiguste ja bioloogiliste süsteemide osas (joonis 5B).

Joonis 3. MiRNA-de diferentsiaalne ekspressioon eksosoomides. (A) miRNA-de vulkaanigraafik kontroll- ja ravirühmade vahel; (B) DE miRNA-de hierarhiline klastrite soojuskaart kontroll- ja ravirühmade vahel.

Joonis 4. DE miRNA-de sihtgeenide GO-funktsiooni rikastamise analüüs. (A) DE miRNA-de sihtgeenide bioloogiline protsess; (B) DE miRNA-de sihtgeenide molekulaarsed funktsioonid; (C) DE miRNA-de sihtgeenide rakulised komponendid

Joonis 5. Sihtgeenide KEGG raja rikastamise analüüs. (A) märkimisväärselt rikastatud KEGG rada DE miRNA-de sihtgeenidega; (B) oluliselt rikastatud KEGG radade klassifikatsioon.

3.6. Seerumi eksosomaalse miRNA ja PRRSV CHsx1401 genoomi sihtimise prognoosimine

Ühe aluse phastCons skoori järgi pärast PHAST-iga joondamist saadi viiruse genoomidest kokku kaheksa kõige konserveeritumat segmenti (mustad ribad tipukaardi kohal) (joonis 6). Konserveeritud segmendiga seotud miRNA-de ennustamise kaudu leiti, et kokku 31 DE miRNA-d seostuvad konserveerunud segmendiga. Nende hulgas, konserveeritud piirkonnas (14 644–15 020 nt), mis on CHsx1401 genoomi 30 UTR-ile (14 870–15 020) kõige lähemal, seostub sellega eeldatavasti 16 DE miRNA-d, sealhulgas 5 miRNA-d (ssc-}miR{{15). c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR-486 ja ssc-miR-6529), mis võivad seostuda CHsx1401 30 UTR-iga. Nendest miRNA-dest reguleeriti pärast nakatumist üles ainult ssc-miR-223 ja teised miRNA-d olid pärast nakatumist allareguleeritud. Üksikasju vaadake täiendavast tabelist S4.

Joonis 6. PHAST ennustatud CHsx1401 tüve genoomis konserveerunud segmendid

3.7. Eksosoomi funktsiooni ja PRRSV-ga seotud DE miRNA-de sõelumine

Sihtgeenide funktsionaalse rikastamise analüüsiga leiti mitmesuguseid erinevalt ekspresseeritud miRNA-sid, mis olid seotud eksosoomide ja PRRSV funktsiooniga. Nende hulgas on 11 DE miRNA-d, nagu ssc-miR-4331-3p, ssc-miR-744 ja ssc-miR-320, osalevad eksosoomide omastamisel ning nende sihtgeenid on peamiselt koondunud Ras geenide perekond, anneksiini perekond ja ADP ribosüülimise geenide perekond. Kaheksateist DE miRNA-d, sealhulgas sscmiR-10b, ssc-miR-124a ja ssc-miR-128, osalevad immuunsüsteemiga seotud radadel ning nende sihtgeenid on peamiselt koondunud MAPK-sse. geeniperekond, PIK3 geeniperekond ja proteiinfosfataasi geeniperekond. Kui viiruse invasioonis osaleb 11 DE miRNA-d, on seotud sihtgeenid koondunud peamiselt MAPK geeniperekonda ja proteiinfosfataasi geeniperekonda. Lisaks mitu erinevalt ekspresseeritud miRNA-d, näiteks uudne_102. Kuus DE miRNA-d, sealhulgas ssc-miR-320, ssc-miR-423-5p, ssc-miR-4331-3p, ssc-miR-7137-3p ja ssc-miR{{ 25}}, ekspresseeritakse koos eksosoomi funktsioonis, PRRSV viiruse invasioonis ja immuunsüsteemiga seotud radades, nagu on näidatud joonisel 7. Üksikasjad on näidatud täiendavas tabelis S5.

Joonis 7. Eksosoomi omastamise, PRRSV invasiooni ja immuunsusega seotud DE miRNA-d

3.8. DE miRNA-de QRT-PCR analüüs kahe rühma vahel

Kontrollimiseks valiti juhuslikult viis DE miRNA-d. qRT-PCR tulemuste kohaselt suurenes ssc-miR-19a ja ssc-miR-32 ekspressioon ravirühmas, samas kui ssc-miR-124a, ssc-miR{ {8}} ja ssc-miR-34c näitasid kontrollrühmas kõrgemat ekspressiooni, mis on kooskõlas järjestusandmetega (joonis 8).

Joonis 8. Viis DE miRNA-d, mis on valideeritud qRT-PCR abil

4. Arutelu

PRRSV on endiselt kangekaelne patogeen ülemaailmses seatööstuses, põhjustades maailmas tohutuid majanduslikke kahjusid. Praegu kasutatakse vaktsineerimist peamiselt PRRSV ennetamiseks ja tõrjeks, millest kõige laialdasemalt kasutatakse modifitseeritud elusviiruse (MLV) vaktsiini [48]. Kuigi see vaktsiin vähendas tõhusalt PRRS-i puhanguid ja esinemissagedust, suurendas see oluliselt ka viiruse geneetilist varieerumist ja mitmekesisust ning põhjustas viiruse rekombinatsiooni metsikute ja elusate vaktsiiniviiruste vahel [49, 50]. Viimastel aastatel on rekombinantse viiruse NADC30-nagu PRRSV tüve levik ja levimus põhjustanud Hiinas mitmeid sigade reproduktiiv- ja respiratoorse sündroomi puhanguid. Selles uuringus kasutatud CHsx1401 ja NADC30 sarnasus jäi 92, 2–99, 1% tasemele. Sellest ajast alates on sellest saanud Hiinas epideemiline tüvi. Eksosoome kui rakukommunikatsiooni vahendajaid leidub laialdaselt erinevates kehavedelikes ja neil on unikaalsed eelised haiguste diagnoosimisel ja ravimisel [51,52]. Varasemate aruannete kohaselt on eksosoomidel oluline suhtlusroll antigeeni esitlemisel [53], immuunvastusest [53,54], viiruse replikatsioonil [54], vähil [55], neurodegeneratiivsetel haigustel [56], angiogeneesil [57], kasvajarakkudel. ränne [58] ja invasioon [59] ning neil on kõrge uurimisväärtus.

Selles uuringus kasutati seerumi eksosoomide miRNA ekspressiooniprofiili konstrueerimiseks suure läbilaskevõimega sekveneerimistehnoloogiat ja tuvastati 33 DE miRNA-d. Nagu me kõik teame, võib peremeesorganismi kodeeritud miRNA seostuda viiruse genoomiga ja seejärel reguleerida viiruse replikatsiooni, sünteesi ja vabanemist, et piirata nakatumist ja mõjutada patoloogilist protsessi [15]. Loomadel on korduvalt teatatud ka viiruse genoomile suunatud miRNA-de uuringutest. gga-miR-454 ja gga-miR-130b kanade nakkusliku bursaalse haiguse korral võivad viiruse replikatsiooni pärssimiseks sihtida viiruse genoomi, samas kui gga-miR-21 on otseselt suunatud viirusvalku VP1 inhibeerimiseks. viirusvalgu translatsioon [60,61]. PRRSV uuringutes seondub ssc-miR-181 spetsiifiliselt viiruse genoomist ORF4 allavoolu väga konserveerunud piirkonnaga ja pärsib tugevalt PRRSV replikatsiooni [62]. Selles uuringus ei jõudnud ssc-miR-181 ekspressioonierinevus kahe rühma vahel märkimisväärsele tasemele. Meie uuringus võrreldi üheksa erineva PRRSV viiruse genoome CHsx1401 tüve omadega ja tuvastati kaheksa kõige konserveeritumat segmenti. Eeldati, et 31 DE miRNA-d võivad seostuda CHsx1401 8 kõige konserveerituma segmendiga ja 16 DE miRNA-d võivad seonduda konserveerunud järjestustega, mis on CHsx1401 30 UTR-i lähedal. Nende hulgas viis DE miRNA-d (ssc-miR-34c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR-486 ja ssc-miR{{ 36}}) võivad samaaegselt seostuda CHsx1401 30 UTR-iga. Lisaks ennustati, et ssc-miR-223 ülesreguleeritud ekspressioon seondub PRRSV genoomi 30 UTR sihtmärgiga. Tulemused näitasid, et viiruse genoomi konserveerunud järjestused võivad mängida selle patogeensuses võtmerolli ja miRNA-d, mis võivad seostuda erinevate PRRSV tüvede genoomide vahel olevate konserveerunud järjestustega, võivad omada olulist tähtsust viiruse patogeensuse kontrollimisel. Varasemate uuringute põhjal on tõestatud, et mõned erinevalt ekspresseeritud miRNA-d on PRRSV-ga seotud ja isegi otseselt seotud PRRSV regulatsiooniga, sealhulgas ssc-miR-10b [63], ssc-miR-378 [30] , ssc-miR-124a [64], let-7f-5p [65], ssc-miR-744 [66] ja ssc-miR{{57 }}a [67].

PRRSV võib vältida peremeesorganismi kaitset, segades kaasasündinud immuunvastust. Seda protsessi reguleerivad paljud signaalirajad, sealhulgas MAPK signaalirada, PI3K Akt signaalirada, autofagia, kemokiin ja TNF signaalirada. Praegu sisaldab MAPK signaalirada kolme peamist rada: ERK1/2, JNK ja p38 rada. MAPK kaskaadi aktiveerimine võib soodustada peremeesraku apoptoosi, aidata viirusel peremeesorganismi immuunkaitsevastuse eest põgeneda ja soodustada PRRSV replikatsiooni [68]. Lisaks võib c-Jun N-terminaalsete kinaaside (JNK-de) ja p38 aktiveerimine soodustada ka põletikufaktori IL-10 [68–70] vabanemist ja tugevdada põletikulist toimet. Lisaks apoptoosi esilekutsumisele võib PRRSV indutseerida ka autofagiat, mis võib soodustada PRRSV replikatsiooni. PI3K/Akt aktiveerimine on vajalik viiruse sisenemiseks ja viiruse replikatsiooni soodustamiseks ning PRRSV-aktiveeritud Akt inhibeerib peremeesraku apoptoosi, reguleerides negatiivselt JNK rada [71]. TNF See võib mängida olulist rolli põletikulise reaktsiooni esilekutsumisel ja reguleerimisel koos teiste põletikuliste teguritega, kuid TNF ekspressiooni mõjutab PRRSV replikatsiooni negatiivne regulatsioon [72]. Käesolevas uuringus on miRNA-d (ssc-miR-10b, ssc-miR-122-5p, ssc-miR-124a, ssc-miR-128, ssc-miR{ Nende radadega rikastatud {24}}a-5p jne) on seotud PRRSV-indutseeritud apoptoosi, autofagia ja põletikuga ning on tihedalt seotud viiruse immuunvastuse, immuunvastuse ja replikatsiooniga.

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

Raku plasmamembraan on rikas mitmesuguste lipiidiparvede poolest ning sfingolipiidide ja kolesteroolirikkad sfingolipiidid (sfingomüeliin ja glükosfingolipiidid) on lipiidiparvede võtmemolekulid. Lipiidide äratundmine mõnede viiruse valkude poolt võib olla viiruse sisenemise vajalik tingimus [73]. Ümbriseviirused sisestavad viiruse ümbrise glükoproteiinid lipiidiparvedesse viiruse sisenemise staadiumis, interakteeruvad lipiidiparvedes paiknevate retseptoritega või muutuvad nende loomulikust olekust aktiveeritud vormiks, et algatada või soodustada viiruse sisestamist/fusiooni, nagu HSV, SARS-i koroonaviirus ja põrsaste epideemilise kõhulahtisuse viirus [73,74]. Varasemad uuringud näitasid, et kolesterooli eemaldamine MARC-145 rakkude pinnalt vähendas oluliselt PRRSV infektsiooni, näidates, et PRRSV infektsiooni pärssimist vahendas spetsiifiliselt rakulise kolesterooli eemaldamine. Rakumembraani kolesterooli vähenemine pärssis oluliselt viiruse sisenemist, eriti viiruse kinnitumist ja vabanemist [75]. Sfingolipiidide metabolism võib reguleerida membraani struktuuri ja adhesiooni, mis on PRRSV viiruse invasioonil väga oluline. Endotsütoos oli selle uuringu kõige olulisem rikastus. Endotsütoos on sihtrakkude eksosoomide omastamise oluline mehhanism. Varasemad uuringud on näidanud, et eksosoomide omastamine on energianõudlik ja tsütoskeletist sõltuv protsess, mis tõstab esile endotsütoosi võimaliku rolli selles protsessis [76]. On tõestatud, et seda protsessi võivad vahendada mitmed rajad, sealhulgas fagotsütoos, makropinotsütoos, klatriin jne [77,78], mis viis endotsütoositud ainete erineva klassifikatsiooni ja rollini. Diferentsiaalselt ekspresseeritud eksosomaalsete miRNA-de rikastamine sellel rajal näitab, et eksosoomid mängivad PRRSV-nakkuses olulist rolli ning sisu transpordi ja eksosoomide omastamise reguleerimine võib viia patofüsioloogiliste muutusteni sihtrakkudes ja -organites.

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

5. Kokkuvõtted

PRRSV-ga nakatunud sigade seerumi eksosomaalsete miRNA-de tuvastamise ja bioinformaatika analüüsi abil saadi selles uuringus mitmesuguseid PRRSV-ga seotud radu ja erinevalt ekspresseeritud miRNA-sid, nagu ssc-miR-4331-3p, ssc-miR{{ 5}}, sscmiR-320, ssc-miR-10b, ssc-miR-124a, ssc-miR-128 jne, mis mängivad PRRSV-s potentsiaalseid funktsionaalseid rolle -indutseeritud immuunvastus, invasioon ja eksosoomide omastamine. Lisaks, kuna üks miRNA võib sihtida mitut geeni ja ühte geeni reguleerib ka mitu miRNA-d, täidavad mitmed miRNA-d ülaltoodud radadel mitmeid funktsioone. On tõestatud, et mõned miRNA-d reguleerivad PRRSV-nakkust, toimides võtmeretseptoritele või sihivad otseselt viiruse genoomi, näiteks ssc-miR-10b, ssc-miR-378, miR-124a, olgu-7f-5p, ssc-miR-744, ssc-miR-19a jne. Vahepeal ennustas käesolev uuring ka mitmesuguseid miRNA-sid, mis võivad seostuda CHX1401 viiruse genoomi 30 UTR-i kõige konservatiivsem fragment, sealhulgas ssc-miR-34c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR{{34} } ja ssc-miR-6529, mis võivad olla olulised viiruse patogeensuse reguleerimisel.

Viited

1. Snijder, EJ; Kikkert, M.; Fang, Y. Arteriviiruse molekulaarbioloogia ja patogenees. J. Kindral Virol. 2013, 94 p 10, 2141–2163. [CrossRef] [PubMed]

2. Lu, Y.; Zhang, Y.; Xiang, X.; Sharma, M.; Liu, K.; Wei, J.; Shao, D.; Li, B.; Tong, G.; Olszewski, MA; et al. Notch-signalisatsioon aitab kaasa põletikuliste tsütokiinide ekspressioonile, mis on indutseeritud kõrge patogeense sigade reproduktiiv- ja respiratoorse sündroomi viiruse (HP-PRRSV) infektsiooni poolt sigade alveolaarsetes makrofaagides. Dev. Comp. Immunol. 2020, 108, 103690. [CrossRef] [PubMed]

3. Dea, S.; Sawyer, N.; Alain, R.; Athanassious, R. Sigade reproduktiiv- ja respiratoorse sündroomi viiruse ultrastruktuurilised omadused ja morfogenees, mis on paljundatud väga läbilaskva MARC-145 rakukloonis. Adv. Exp. Med. Biol. 1995, 380, 95–98. [PubMed]

4. Dokland, T. PRRSV struktuuribioloogia. Virus Res. 2010, 154, 86–97. [CrossRef] [PubMed]

5. Johnson, CR; Griggs, TF; Gnanandarajah, J.; Murtaugh, MP Uus struktuurvalk sigade reproduktiiv- ja respiratoorse sündroomi viiruses, mida kodeerib kõigis arteriviirustes esinev alternatiivne ORF5. J. Kindral Virol. 2011, 92 p 5, 1107–1116. [CrossRef] [PubMed]

6. Lee, SC; Lee, S.; Yoo, GW; Choi, HW; Ei, YH; Park, CE; Shin, JH; Yoon, IJ; Kang, SY; Lee, C. Nõrgestatud sigade reproduktiiv- ja respiratoorse sündroomi viiruse tüve fenotüübilised ja genotüübilised analüüsid pärast järjestikust läbimist kultiveeritud sigade alveolaarsetes makrofaagides. J. Vet. Sci. 2018, 19, 358–367. [CrossRef] [PubMed]

7. Zebrowska, A.; Skowronek, A.; Wojakowska, A.; Widlak, P.; Pietrowska, M. Eksosoomide metabolism: keskenduge vähirakkude poolt vabanevatele ja inimkehavedelikes esinevatele vesiikulitele. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 3461. [CrossRef]

8. Bebelman, parlamendiliige; Smit, MJ; Pegtel, DM; Baglio, SR Ekstratsellulaarsete vesiikulite biogenees ja funktsioon vähi korral. Pharmacol. Seal. 2018, 188, 1–11. [CrossRef]

9. Zaborowski, parlamendiliige; Balaj, L.; Breakefield, XO; Lai, CP Ekstratsellulaarsed vesiikulid: koostis, bioloogiline tähtsus ja uurimismeetodid. Bioscience 2015, 65, 783–797. [CrossRef]

10. Almughlliq, FB; Koh, YQ; Peiris, HN; Vaswani, K.; Holland, O.; Meier, S.; Roche, JR; Burke, CR; Crookenden, MA; Arachchige, BJ; et al. Ringlevad eksosoomid võivad tuvastada metaboolse düsfunktsiooni ohus olevate lehmade biomarkereid. Sci. Vabariik 2019, 9, 13879. [CrossRef]

11. Zhang, RC; Du, WQ; Zhang, JY; Yu, SX; Lu, FZ; Ding, HM; Cheng, YB; Ren, C.; Geng, DQ Mesenhümaalsete tüvirakkude ravi perifeerse närvikahjustuse korral: narratiivne ülevaade. Neuraalne Regen. Res. 2021, 16, 2170–2176. [PubMed]

12. Bryzgunova, OE; Zaripov, MM; Skvortsova, TE; Lekchnov, EA; Grigorjeva, AE; Zaporožtšenko, IA; Morozkin, ES; Rjabtšikova, EI; Jurtšenko, YB; Voitsitskiy, VE; et al. Tervete inimeste ja eesnäärmevähiga patsientide uriinist pärinevate rakuväliste vesiikulite võrdlev uuring. PLoS ONE 2016, 11, e0157566. [CrossRef] [PubMed]

13. Camussi, G.; Deregibus, MC; Bruno, S.; Grange, C.; Fonsato, V.; Tetta, C. Eksosoomi/mikrovesiikulite vahendatud rakkude epigeneetiline ümberprogrammeerimine. Olen. J. Cancer Res. 2011, 1, 98–110. [PubMed]

14. Tamkovitš, SN; Tutanov, OS; Laktionov, PP Eksosoomid: genereerimine, struktuur, transport, bioloogiline aktiivsus ja diagnostiline rakendus. Biochem. Mosk. Suppl. Ser. Liige. Cell Biol. 2016, 10, 163–173. [CrossRef]

15. Bartel, DP mikroRNA-d: genoomika, biogenees, mehhanism ja funktsioon. Cell 2004, 116, 281–297. [CrossRef]

16. Gordino, G.; Costa-Pereira, S.; Corredeira, P.; Alves, P.; Costa, L.; Gomes, AQ; Silva-Santos, B.; Ribot, JC MicroRNA-181a piirab inimese δ T-rakkude diferentseerumist, sihtides Map3k2 ja Notch2. EMBO Rep. 2022, 23, e52234. [CrossRef]

17. Liu, B.; Yan, L.; Chi, Y.; Sun, Y.; Yang, X. Pikk mittekodeeriv RNA AFAP1-AS1 hõlbustab munasarjavähi progresseerumist, reguleerides miR-107/PDK4 telge. J. Ovarian Res. 2021, 14, 60. [CrossRef]

18. Kim, Y.; Lee, DH; Park, SH; Jeon, TI; Jung, CH MikroRNA-de ja transkriptsioonifaktorite koosmõju autofagia regulatsioonis mittealkohoolse rasvmaksahaiguse korral. Exp. Mol. Med. 2021, 53, 548–559. [CrossRef]

19. Kazmierczak, D.; Jopek, K.; Sterzynska, K.; Nowicki, M.; Rucinski, M.; Januchowski, R. MikroRNA ekspressiooni profiil ja potentsiaalne roll ravimiresistentsete geenide reguleerimisel tsisplatiini- ja paklitakseeliresistentsetes munasarjavähi rakuliinides. Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 526. [CrossRef]

20. Gong, Y.; Wei, X.; Sun, W.; Ren, X.; Chen, J.; Aweya, JJ; Ma, H.; Chan, KG; Zhang, Y.; Li, S. Eksosomaalne miR-224 aitab kaasa hemolümfi mikrobiota homöostaasile koorikloomade bakteriaalse infektsiooni ajal. PLoS patog. 2021, 17, e1009837. [CrossRef]

21. Cheng, Y.; Kou, W.; Zhu, D.; Yu, X.; Zhu, Y. Tulevikusuunad neerupealise koore kartsinoomi diagnoosimisel, prognoosimisel ja haiguste jälgimisel: uudsed mitteinvasiivsed biomarkerid. Esiosa. Endokrinool. 2022, 12, 811293. [CrossRef] [PubMed]

22. Gallo, A.; Tandon, M.; Alevizos, I.; Illei, GG Enamik seerumis ja süljes tuvastatavaid mikroRNA-sid on koondunud eksosoomidesse. PLoS ONE 2012, 7, e30679. [CrossRef] [PubMed]

23. Fänn, B.; Chopp, M.; Zhang, ZG; Liu, XS MikroRNA-de esilekerkivad rollid diabeetilise neuropaatia biomarkerite ja terapeutiliste sihtmärkidena. Esiosa. Neurol. 2020, 11, 558758. [CrossRef] [PubMed]

24. Wei, H.; Chen, Q.; Lin, L.; Sha, C.; Li, T.; Liu, Y.; Yin, X.; Xu, Y.; Chen, L.; Gao, W.; et al. Eksosoomide tootmise ja veoste sorteerimise reguleerimine. Int. J. Biol. Sci. 2021, 17, 163–177. [CrossRef]

25. Jia, X.; Bi, Y.; Li, J.; Xie, Q.; Yang, H.; Liu, W. Cellular microRNA miR{1}}a pärsib sigade reproduktiiv- ja respiratoorse sündroomi viiruse replikatsiooni, aktiveerides kaasasündinud viirusevastase immuunsuse. Sci. Rep. 2015, 5, 10651. [CrossRef]

26. Li, L.; Wei, Z.; Zhou, Y.; Jiang, Y.; Yu, L.; Zheng, H.; Tong, W.; Yang, S.; Zheng, H.; Shan, T.; et al. Peremees miR-26a pärsib sigade reproduktiiv- ja respiratoorse sündroomi viiruse replikatsiooni, reguleerides I tüüpi interferoone. Virus Res. 2015, 195, 86–94. [CrossRef]

27. Liu, F.; Wang, H.; Du, L.; Wei, Z.; Zhang, Q.; Feng, WH MicroRNA-30c on suunatud interferooni-alfa/beeta retseptori beetaahelale, et soodustada 2. tüüpi PRRSV infektsiooni. J. Kindral Virol. 2018, 99, 1671–1680. [CrossRef]

28. Zhang, Q.; Huang, C.; Yang, Q.; Gao, L.; Liu, HC; Tang, J.; Feng, WH MicroRNA-30c moduleerib I tüüpi IFN vastuseid, et hõlbustada sigade paljunemisvõimet ja respiratoorse sündroomi viirusega nakatumist, sihtides JAK1. J. Immunol. 2016, 196, 2272–2282. [CrossRef]

29. Wang, D.; Cao, L.; Xu, Z.; Fang, L.; Zhong, Y.; Chen, Q.; Luo, R.; Chen, H.; Li, K.; Xiao, S. MiR-125b vähendab sigade reproduktiiv- ja respiratoorse sündroomi viiruse replikatsiooni, reguleerides negatiivselt NF-κB rada. PLoS ONE 2013, 8, e55838. [CrossRef]

30. Zhang, Q.; Guo, XK; Gao, L.; Huang, C.; Li, N.; Jia, X.; Liu, W.; Feng, WH MicroRNA-23 inhibeerib PRRSV replikatsiooni, suunates otse PRRSV RNA-d ja võib-olla ka I tüüpi interferoone ülesreguleerides. Viroloogia 2014, 450–451, 182–195. [CrossRef]

31. Wu, J.; Peng, X.; Zhou, A.; Qiao, M.; Wu, H.; Xiao, H.; Liu, G.; Zheng, X.; Zhang, S.; Mei, S. MiR-506 inhibeerib PRRSV replikatsiooni MARC-145 rakkudes CD151 kaudu. Mol. Kamber. Biochem. 2014, 394, 275–281. [CrossRef]

32. Gao, L.; Guo, XK; Wang, L.; Zhang, Q.; Li, N.; Chen, XX; Wang, Y.; Feng, WH MicroRNA 181 pärsib sigade reproduktiiv- ja respiratoorse sündroomi viiruse (PRRSV) infektsiooni, suunates PRRSV retseptori CD163. J. Virol. 2013, 87, 8808–8812. [CrossRef]

33. Xiao, S.; Du, T.; Wang, X.; NIH.; Yan, Y.; Li, N.; Zhang, C.; Zhang, A.; Gao, J.; Liu, H.; et al. MiR-22 soodustab sigade reproduktiiv- ja respiratoorse sündroomi viiruse replikatsiooni, sihtides peremeesfaktorit HO-1. Vet. Microbiol. 2016, 192, 226–230. [CrossRef]

34. Xiao, S.; Wang, X.; NIH.; Li, N.; Zhang, A.; Liu, H.; Pu, F.; Xu, L.; Gao, J.; Zhao, Q.; et al. MikroRNA miR-24-3p soodustab sigade reproduktiiv- ja respiratoorse sündroomi viiruse replikatsiooni, pärssides heemoksüdaasi-1 ekspressiooni. J. Virol. 2015, 89, 4494–4503. [CrossRef]

35. Butler, JE; Sinkora, M.; Wang, G.; Stepanova, K.; Li, Y.; Cai, X. Tümotsüütide arengu häired on PRRS-i pandeemia aluseks: kontrollitav hüpotees. Esiosa. Immunol. 2019, 10, 1077. [CrossRef]

36. Zhou, L.; Wang, Z.; Ding, Y.; Stepanova, K.; Li, Y.; Cai, X. NADC{1}}sarnane sigade reproduktiiv- ja respiratoorse sündroomi viiruse tüvi, Hiina. Tekkima. Nakata. Dis. 2015, 21, 2256–2257. [CrossRef]

37. Zhou, L.; Yang, B.; Xu, L.; Jin, H.; Ge, X.; Guo, X.; Han, J.; Yang, H. Kolme modifitseeritud elusviiruse vaktsiini efektiivsuse hindamine sigade reproduktiiv- ja respiratoorse sündroomi viiruse NADC{2}}sarnase tüve vastu. Vet. Microbiol. 2017, 207, 108–116. [CrossRef]

38. Wong, N.; Wang, X. miRDB: Interneti-ressurss mikroRNA sihtmärgi ennustamiseks ja funktsionaalsete annotatsioonide jaoks. Nucleic Acids Res. 2015, 43, D146–D152. [CrossRef]

39. Friedländer, MR; Mackowiak, SD; Li, N.; Chen, W.; Rajewsky, N. miRDeep2 tuvastab täpselt teadaolevad ja sadu uudseid mikroRNA geene seitsmes loomaklaadis. Nucleic Acids Res. 2012, 40, 37–52. [CrossRef]

40. Wen, M.; Shen, Y.; Shi, S.; Tang, T. miREvo: integreeriv mikroRNA evolutsioonianalüüsi platvorm järgmise põlvkonna sekveneerimiskatseteks. BMC Bioinform. 2012, 13, 140. [CrossRef]

41. Anders, S.; Huber, W. Diferentsiaalne ekspressioonianalüüs järjestuste loendusandmete jaoks. Genome Biol. 2010, 11, R106. [CrossRef] [PubMed]

42. Tamura, K.; Stecher, G.; Kumar, S. MEGA11: Molekulaarevolutsioonilise geneetika analüüsi versioon 11. Mol. Biol. Evol. 2021, 38, 3022–3027. [CrossRef] [PubMed]

43. Hubisz, MJ; Pollard, KS; Siepel, A. PHAST ja RPHAST: Fülogeneetiline analüüs ruumi/aja mudelitega. Lühidalt. Bioinform. 2011, 12, 41–51. [CrossRef] [PubMed]

44. Krüger, J.; Rehmsmeier, M. RNAhybrid: mikroRNA sihtmärgi ennustamine lihtne, kiire ja paindlik. Nucleic Acids Res. 2006, 34, W451–W454. [CrossRef]

45. Yu, G.; Wang, LG; Han, Y.; Tema, QY clusterProfiler: R-pakett geeniklastrite bioloogiliste teemade võrdlemiseks. OMICS 2012, 16, 284–287. [CrossRef]

46. ​​Que, R.; Ding, G.; Chen, J.; Cao, L. Pankrease adenokartsinoomiga patsientide seerumi eksosomaalsete mikroRNA-de ja kliiniliste patoloogiliste tunnuste analüüs. Maailma J. Surg. Oncol. 2013, 11, 219. [CrossRef]

47. Théry, C.; Witwer, KW; Aikawa, E.; Alcaraz, MJ; Anderson, JD; Andriantsitohaina, R.; Antoniou, A.; Arab, T.; Archer, F.; Atkin-Smith, GK; et al. Minimaalne teave 2018. aasta ekstratsellulaarsete vesiikulite uuringute jaoks (MISEV2018): Rahvusvahelise Ekstratsellulaarsete Vesiikulite Ühingu seisukoht ja MISEV2014 juhiste värskendus. J. Extracell. Vesiikulid 2018, 7, 1535750. [CrossRef]

48. Lyoo, K.-S.; Choi, JY; Hahn, TW; Park, KT; Kim, HK Modifitseeritud elussigade reproduktiiv- ja respiratoorse sündroomi viiruse vaktsiiniga vaktsineerimise mõju nuumsigade kasvuvõimele välitingimustes. J. Vet. Med. Sci. 2016, 78, 1533–1536. [CrossRef]

49. Bian, T.; Sun, Y.; Hao, M.; Zhou, L.; Ge, X.; Guo, X.; Han, J.; Yang, H. Rekombinantne 2. tüüpi sigade reproduktiiv- ja respiratoorse sündroomi viirus NADC30-sarnase ja MLV-taolise vahel: põrsaste geneetiline iseloomustus ja patogeensus. Nakata. Genet. Evol. 2017, 54, 279–286. [CrossRef]

50. Li, Y.; Ji, G.; Wang, J.; Tan, F.; Zhuang, J.; Li, X.; Tian, ​​K. NADC täielik genoomi järjestus30-nagu sigade reproduktiiv- ja respiratoorse sündroomi viirus, mida iseloomustab rekombinatsioon teiste tüvedega. Genome Announc. 2016, 4, e00330-16. [CrossRef]

51. Kalluri, R.; Lebleu, VS Eksosoomide bioloogia, funktsioon ja biomeditsiinilised rakendused. Teadus 2020, 367, eaau6977. [CrossRef] [PubMed]

52. Miao, XY Hiljutised edusammud miRNA-de rolli mõistmisel eksosoomides ja nende terapeutilise potentsiaali mõistmisel. J. Integr. Põllumajandus. 2017, 16, 753–761. [CrossRef]

53. Shenoda, BB; Ajit, SK Immuunvastuste moduleerimine antigeeni esitlevatest rakkudest pärinevate eksosoomide abil. Clin. Med. Insights Pathol. 2016, 9 (lisa S1), CPath-S39925. [CrossRef] [PubMed]

54. Li, S.; Li, S.; Wu, S.; Chen, L. Eksosoomid moduleerivad viiruse replikatsiooni ja peremeesorganismi immuunvastuseid HBV infektsiooni korral. BioMed Res. Int. 2019, 2019, 2103943. [CrossRef]

55. Rohendamine, DW; Gopal, SK; Xu, R.; Simpson, RJ; Chen, W. Eksosoomid ja nende rollid immuunregulatsioonis ja vähis. Raku- ja arengubioloogia seminaridel; Academic Press: Cambridge, MA, USA, 2015; 40. köide, lk 72–81.

56. Howitt, J.; Hill, AF Eksosoomid neurodegeneratiivsete haiguste patoloogias. J. Biol. Chem. 2016, 291, 26589–26597. [CrossRef]

57. Ribeiro, MF; Zhu, H.; Millard, RW; Fan, G. Eksosoomid toimivad angiogeneesi pro- ja anti-angiogeneesis. Curr. Angiogenesis 2013, 2, 54–59. [CrossRef]

58. Lan, J.; Sun, L.; Xu, F.; Liu, L.; Hu, F.; Song, D.; Hou, Z.; Wu, W.; Luo, X.; Wang, J.; et al. M2 makrofaagidest pärinevad eksosoomid soodustavad rakkude migratsiooni ja invasiooni käärsoolevähi korral. Cancer Res. 2019, 79, 146–158. [CrossRef]

59. Aga, M.; Bentz, GL; Raffa, S.; Torrisi, MR; Kondo, S.; Wakisaka, N.; Yoshizaki, T.; Pagano, JS; Shackelford, J. Exosomal HIF1 toetab nasofarüngeaalse kartsinoomiga seotud LMP1-positiivsete eksosoomide invasiivset potentsiaali. Onkogeen 2014, 33, 4613–4622. [CrossRef]

60. Fu, M.; Wang, B.; Chen, X.; Tema, Z.; Wang, Y.; Li, X.; Cao, H.; Zheng, SJ gga-miR-454 pärsib infektsioosse bursaltõve viiruse (IBDV) replikatsiooni, suunates otse IBDV genoomse segmendi B ja tsütokiini signaalimise 6 (SOCS6) raku supressoreid. Virus Res. 2018, 252, 29–40. [CrossRef]

61. Fu, M.; Wang, B.; Chen, X.; Tema, Z.; Wang, Y.; Li, X.; Cao, H.; Zheng, SJ MicroRNA gga-miR-130b pärsib nakkusliku bursaalhaiguse viiruse replikatsiooni, suunates viiruse genoomi ja tsütokiinide signaaliülekande raku supressoreid. 5. J. Virol. 2018, 92, e01646-17. [CrossRef]

62. Guo, XK; Zhang, Q.; Gao, L.; Li, N.; Chen, XX; Feng, WH MikroRNA 181 ekspressiooni suurenemine pärsib sigade reproduktiiv- ja respiratoorse sündroomi viiruse replikatsiooni ning mõjutab viirusinfektsiooni kontrolli all hoidmist. J. Virol. 2013, 87, 1159–1171. [CrossRef] [PubMed]

63. Cong, P.; Xiao, S.; Chen, Y.; Wang, L.; Gao, J.; Li, M.; Tema, Z.; Guo, Y.; Zhao, G.; Zhang, X.; et al. Sigade alveolaarsete makrofaagide (PAM-rakkude) integreeritud miRNA ja mRNA transkriptoomid tuvastavad H-PRRSV ja N-PRRSV infektsiooniga seotud tüvespetsiifilised miRNA molekulaarsed signatuurid. Mol. Biol. Vabariik 2014, 41, 5863–5875. [CrossRef] [PubMed]

64. Li, N.; Huang, K.; Chen, Y.; Huang, Z.; Zhang, Y.; Leng, C.; Liu, Y.; Shi, J.; Xiao, S.; Yao, L. MicroRNA ssc-miR-124a avaldab peremeesgeenide CD163 allasurumise kaudu viirusevastast toimet sigade reproduktiiv- ja respiratoorse sündroomi viiruse vastu. Vet. Microbiol. 2021, 261, 109216. [CrossRef] [PubMed]

65. Li, N.; Du, T.; Yan, Y.; Zhang, A.; Gao, J.; Hou, G.; Xiao, S.; Zhou, EM MicroRNA let-7f-5p inhibeerib sigade paljunemisvõimet ja respiratoorse sündroomi viirust, sihtides MYH9. Sci. Vabariik 2016, 6, 34332. [CrossRef]

66. Zhen, Y.; Wang, F.; Liang, W.; Liu, J.; Gao, G.; Wang, Y.; Xu, X.; Su, Q.; Zhang, Q.; Liu, B. Diferentsiaalselt ekspresseeritud mittekodeeriva RNA tuvastamine Tongchengi ja suurte valgete sigade sigade alveolaarsetes makrofaagides reageeris PRRSV-le. Sci. Vabariik 2018, 8, 15621. [CrossRef]

67. Zhou, X.; Michal, JJ; Jiang, Z.; Liu, B. MicroRNA ekspressiooniprofiilide koostamine PRRSV-ga in vivo nakatunud põlisrahvaste Hiina Tongcheng sigade alveolaarsetes makrofaagides. J. Appl. Genet. 2017, 58, 539–544. [CrossRef]

68. Lee, YJ; Lee, C. Sigade reproduktiiv- ja respiratoorse sündroomi viiruse replikatsiooni pärsib ekstratsellulaarse signaaliga reguleeritud kinaasi (ERK) signaaliraja pärssimine. Virus Res. 2010, 152, 50–58. [CrossRef]

69. Laul, S.; Bi, J.; Wang, D.; Fang, L.; Zhang, L.; Li, F.; Chen, H.; Xiao, S. Sigade reproduktiivse ja respiratoorse sündroomi viirusnakkus aktiveerib sigade alveolaarsetes makrofaagides IL-10 tootmist NF-κB ja p38 MAPK radade kaudu. Dev. Comp. Immunol. 2013, 39, 265–272. [CrossRef]

70. Yin, S.; Huo, Y.; Dong, Y.; Fan, L.; Yang, H.; Wang, L.; Ning, Y.; Hu, H. c-Jun NH (2)-terminaalse kinaasi aktiveerimine on vajalik sigade reproduktiiv- ja respiratoorse sündroomi viiruse poolt indutseeritud apoptoosiks, kuid mitte viiruse replikatsiooniks. Virus Res. 2012, 166, 103–108. [CrossRef]

71. Fan, L. Signalisatsioonirajad, mis on seotud apoptoosi indutseerimise reguleerimisega peremeesrakkudes PRRSV infektsiooni korral. Virus Genes 2019, 55, 433–439. [CrossRef]

72. Lopez-Fuertes, L.; Campos, E.; Domenech, N.; Ezquerra, A.; Castro, JM; Domínguez, J.; Alonso, F. Porcine reproduktiiv- ja respiratoorse sündroomi (PRRS) viirus vähendab TNF-i tootmist nakatunud makrofaagides. Virus Res. 2000, 69, 41–46. [CrossRef]

73. Teissier, É.; Pécheur, EI Lipiidid kui viiruse sulandvalkude vahendatud membraanifusiooni modulaatorid. Eur. Biophys. J. 2007, 36, 887–899. [CrossRef]

74. Jeon, JH; Lee, C. Rakuline kolesterool on vajalik sigade nidoviiruse infektsiooni korral. Arch. Virol. 2017, 162, 3753–3767. [CrossRef]

75. Sun, Y.; Xiao, S.; Wang, D.; Luo, R.; Li, B.; Chen, H.; Fang, L. Rakumembraani kolesterool on vajalik sigade reproduktiiv- ja respiratoorse sündroomi viiruse sisenemiseks ja vabanemiseks MARC-145 rakkudesse. Sci. China Life Sci. 2011, 54, 1011–1018. [CrossRef]

76. Tian, ​​T.; Zhu, YL; Zhou, YY; Liang, GF; Wang, YY; Hu, FH; Xiao, ZD Eksosoomide omastamine klatriini poolt vahendatud endotsütoosi ja makropinotsütoosi kaudu ning miR-21 kohaletoimetamise vahendamine. J. Biol. Chem. 2014, 289, 22258–22267. [CrossRef]

77. Mulcahy, LA; Roosa, RC; Carter, DRF Ekstratsellulaarse vesiikulite omastamise marsruudid ja mehhanismid. J. Extracell. Vesiikulid 2014, 3, 24641. [CrossRef]

78. Zhang, M.; Zang, X.; Wang, M.; Li, Z.; Qiao, M.; Ah.; Chen, D. Eksosoomipõhised nanokandjad kui bioloogiliselt inspireeritud ja mitmekülgsed sõidukid ravimite kohaletoimetamiseks: hiljutised edusammud ja väljakutsed. J. Mater. Chem. B 2019, 7, 2421–2433. [CrossRef]