Kokkuvõte
Uurida sünergilisi pärssivaid toimeidTsistanche derticolaFenüületanoidsed glükosiidid (PHG) ja glabridiin (GLA) naha pigmentatsioonil, PHG -de optimaalne massisuhe GLA -d sõeluti esialgselt läbiin vitroTürosinaasi aktiivsuse inhibeerimise testid, 1, 1- difenüül -2- Picrylhydrasyl (DPPH) radikaalne hävitamine ja 2,2'-azino-bis (3- etüülbensiazoliin {{8 {8}} Sulfon) (ABTSS) (ABTS) (ABTS) (ABTS) (ABTSS) (ABTSS. Edasised hinnangud viidi läbi kolme rakulise mudeli abil:

UVB-indutseeritud B16F10 melanogeneesi mudel melaniini sünteesi inhibeerimise hindamiseks türosinaasi aktiivsuse ja melaniini sisalduse kaudu;

Lipopolüsahhariidi (LPS) indutseeritud HACAT põletikuline mudel põletikuvastaste efektide hindamiseks, mõõtes interleukiini -6 (IL -6) ja kasvaja nekroosifaktori (TNF-) supressiooni;

AAPH (2,2'-Azobis (2- amidinopropaan) dihüdrokloriidi põhjustatud HACAT-oksüdatiivne stressimudel antioksüdantse aktiivsuse määramiseks superoksiidi dismutaasi (SOD) ja katalaasi (CAT) tugevnemise kaudu.

Nende mudelite abil tuvastati optimaalne PHG/GLA massi suhe. Tulemused näitasid, et PHG/GLA lahused (valmistatud fosfaatpuhverdatud soolalahuses, PBS-is, pH, 6,8) massisuhetes 1: 1, 5: 1 ja 10: 1 näitasid olulist türosinaasi inhibeerimist ja sünergilist antioksüdantset toimet. Türosinaasi inhibeerimise määr oli vastavalt 94,37%, 92,93%ja 88,06%; DPPH radikaalide hävitamise määr ulatus 89,44%, 88,72%ja 88,10%-ni; ABTS⁺ koristamise määr oli 100,13%, 100,01%ja 99,87%. 25 ug/ml juures DMEM -is, PHG/GLA (1: 1, 5: 1, 10: 1) ei näidanud tsütotoksilisust B16F10 või HACAT -rakkude suhtes. Kuvatud PHG/GLA (1: 1) DMEM -lahendusparem türosinaasi pärssimine(23,80% jääk aktiivsus) märkimisväärseltvähendatud melaniinisisaldus(30,90%) ja edestas muid suhteid ja monoteraapiaid IL -6/TNF-i summutamisel ja SOD/CAT aktiivsuse parandamisel. PHG -de ja GLA sünergistlik kombinatsioon leevendas tõhusalt sKin hüperpigmentatsioon, pärssides melanogeneesi, vähendades põletikku jaAntioksüdantide võime suurendamine.

Märksõnad
Tsistanchedertaticola fenüületanoidsed glükosiidid;; glabridiin; sünergistlik toime; melanogenees; antioksüdant; põletikuvastane; farmaatsiatoode

 

 

 

Tsistanchedertaticola ekstrakt koosKõrgetasemelineFenüületanoidsed glükosiidid naha valgendamiseks

WhatsApp meile lisateabe saamiseks

 

Eksperimentaalne osa

1.1 Materjalid, reagendid ja instrumendid

Hiire melanoomirakudB16F10 (kataloog nr: STCC20013G -1), Wuhan ServiceBio Technology Co., Ltd.

Inimene immortaliseeritud keratinotsüüdidHacat (kataloog nr: Icell-H066), Icell Bioscience Inc., Shanghai, Hiina.

Tsistanche fenüületanoidglükosiidid (PHG)jaglabridiin (GLA), Shaanxi Tianxingjian Biological Chemical Technology Co., Ltd.

Türosinaas, Hefei BASF Biotechnology Co., Ltd.

Arbutin (ARB)jaL-türosiin, Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, Hiina.

1, 1- difenüül -2- picrylhydrazyl (dpph), Tokyo Chemical Industry Co., Jaapan.

2,2′-Azino-Bis (3- etüülbenzotiazoliin -6- sulfoonhape) diammmoniumsool (ABTS), Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd.

Askorbiinhape (VC), Tianjin Damao Chemical Reagendi tehas.

Kaaliumsulfaatjaveevaba etanool, Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd.

Naatriumhüdroksiid, Chengdu Huayi Pharmaceutical Abiscient Manufacturing Co., Ltd.

Dipotassiumfosfaat, Shanghai Sanpu Chemical Co., Ltd.

L-dopa, Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd.

Lahtrite loendamise komplekt -8 (CCK8), Peking Sinoinvitrogen Biotechnology Co., Ltd.

Triton x -100, dimetüülsulfoksiid (DMSO), 2,2′-Azobis (2- metüülpropionamidiin) Dihüdrokloriid (AAPH)jalipopolüsahhariid (LPS), Peking Solarbio Science & Technology Co., Ltd.

DMEM kõrge glükoosisisaldusega sööde, Thermo Fisher Scientific (Hiina).

Loote veise seerum (FBS), Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd.

Penitsilliini-streptomütsiini lahus, Shanghai Dashier Bio-Technology Co., Ltd.

Inimese il -6 ELISA KIT, Inimese TNF-ELISA komplektjaInimese kassi Elisa komplekt, Wuhan Fine Biotech Co., Ltd.

Kogu superoksiidi dismutaasi (SOD) analüüsi komplekt, Nanjing Jianchengi bioinseneri instituut. Kõik reaktiivid olid analüütilise klassi.

Kasutatud instrumendid:

Multiskan FC täislainepikkusega mikroplaadi lugejajaHeracell 371 CO2 inkubaator, Thermo Fisher Scientific, USA.

Kq -200 vdb ultrahelipuhastaja, Kunshan Ultrasonic Instruments Co., Ltd.

Dvkw-d -2 digitaalne termostaatiline veevann, Peking Yongguangingi meditsiiniinstrumentide tehas.

Dhg -9246 elektriline termostaatiline lööklaine kuivatusahi, Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.

KN4006B UVB ultraviolettkiirguse instrument(Kiirituse intensiivsus: 8 MW/cm²), Xuzhou Kenuo Medical Instrument Equipment Co., Ltd.

1.2 meetodid

Esiteks lahustati PHG-d ja GLA kas fosfaatpuhverdatud soolalahuses (PBS, pH =6. 8) või 50% etanoolilahus{{{0}}}. 0 0 1, 0.. Seejärel segati PHG -d ja GLA -dM (PHGS): M (GLA)=40: 1, 20: 1, 10: 1, 5: 1, 1: 1: 1: 5, 1:10, 1:20 ja 1:40, PHGS/GLA lahuste ettevalmistamine kogumassi kontsentratsiooniga0.4 g/L, märgistatud kuiPHG/GLA (40: 1) ~ PHGS/GLA (1:40), vastavalt.

 

1.3 biokeemilised katsed

1.3.1 Türosinaasi aktiivsuse inhibeerimise test

96- kaevuplaadil,50 μl katseproovi lahust, 50 μl PBS (pH =6. 8)ja50 μl L-türosiini lahust (1 g/L)lisati järjestikku. Plaati inkubeeriti 10 minutit 37 -kraadises veevannis. Siis,5 0 μl türosinaasi lahust (0,4 g/l, samaväärne 200 U/ml -ga)Lisati ja plaati inkubeeriti uuesti 37 -kraadises veevannis veel 10 minutit.

Arbutin (ARB)kasutati positiivse kontrollina jaPBS (pH =6. 8)kasutati tühja juhtimisena.

Lahuse neeldumine kell490 nmmõõdeti mikroplaadilugeja abil ja in vitro türosinaasi pärssimise kiirust (%) arvutati võrrandi (1) abil.

 

 

Valemis:

A _ reaktsioonon proovilahuse neeldumine, mis sisaldab L-türosiini lahust, PBS ja türosinaasi lahust.

A _ reaktsiooni juhtimineon proovilahuse neeldumine, mis sisaldab L-türosiini lahust ja PBS ilma türosinaasi lahuseta.

A _ tühion L-türosiini lahuse, PBS ja türosinaasi lahuse sisaldava lahuse neeldumine ilma proovita.

A _ tühi juhtelementon L-türosiini lahuse ja PBS-i sisaldava lahuse neeldumine ilma proovi ja türosinaasi lahuseta.

1.3.2 DPPH vabade radikaalide eemaldamise aktiivsuse määramine

Esiteks, {{0}}}. 0197 g (0,05 mmol) DPPH -d kaaluti ja lahustati täpselt 250 ml veevaba etanoolis, et valmistada DPPH -töölahus kontsentratsiooniga kontsentratsiooniga koondama0. 2 mmol/l.

Seejärel lahustati PHS ja GLA 50% etanoolis, et valmistada PHG ja GLA etanoolilahuseid massi kontsentratsioonidega{{{0}}}. 0 0 1, 0.. VC etanoolilahused valmistati samal viisil.

Seejärel segati PHS ja GLA etanoolilahusedM (PHGS Solution): M (GLA lahendus)=40: 1, 20: 1, 10: 1, 5: 1, 1: 1, 1: 5, 1:10, 1:20, 1:40Erinevate massisuhetega PHG/GLA 9 etanoolilahust, mis on märgistatud järgmiseltPHG/GLA (40: 1) ~ PHGS/GLA (1:40).

Lõpuks,100 μl iga proovilahustja100 μl DPPH töölahustlisati 96- kaevuplaadile, segati ühtlaselt ja inkubeeriti pimedas toatemperatuuril 30 minutit. Neeldumine kell517 nmmõõdeti mikroplaadilugeja abil. Positiivse kontrollina kasutati riskikapitali ja iga katset korrati kolm korda.

DPPH vabade radikaalide eemaldamise kiirus (%) arvutati võrrandi (2) abil.

 

Valemis:

A1on proovilahenduse + DPPH töölahenduse neeldumine.

A2on 50% etanooli + DPPH töölahenduse neeldumine.

A3on proovilahenduse neeldumine + 50% etanooli.

 

1.3.3 ABTS⁺ vabade radikaalide eemaldamise tegevuse määramine

Kõigepealt1 g (1,82 mmol) ABTSlahustati deioniseeritud vees, et valmistada töötavat lahust lõppkontsentratsiooniga7,4 mmol/L. 0. 5 g kaaliumi persulfaadilahustati deioniseeritud vees, et valmistada kaaliumi persulfaadi töölahust lõppkontsentratsiooniga2,6 mmol/L. Segati võrdsed mahud ABTS -i töölahuse ja kaaliumsulfaadi töölahuse ja lasti pimedas reageerida 12 tundi, et valmistada ABTS⁺ töölahus.

Seejärel PHG, GLA ja VC etanoolilahused, samuti PHG/GLA etanoolilahendused koos suhtegaPHG/GLA (40: 1) ~ PHGS/GLA (1:40), valmistati vastavalt jaotises 1.3.2 kirjeldatud meetodile.

Lõpuks,40 μl iga proovilahustja160 μl ABTS⁺ töölahustlisati 96- kaevuplaadile, segati ühtlaselt ja reageeriti toatemperatuuril pimedas 6 minutit. Lahuse neeldumine kell734 nmmõõdeti mikroplaadilugeja abil.

ABTS⁺ vaba radikaali eemaldamise kiirus (%) arvutati võrrandi (3) abil.

 

 

Valemis:

A1on proovilahenduse + abts⁺ töölahuse neeldumine.

A2on deioniseeritud vee + abts⁺ töölahuse neeldumine.

A3on proovilahuse neeldumine + deioniseeritud vee.

1.4 raku katsed

1.4.1 Rakukultuur

Pärast B16F10 ja HACAT-rakkude taaselustamist külvati need DMEM-i kõrge glükoosikeskkonda (mis sisaldas 10% veise loote seerumit ja 1% penitsilliini-streptomütsiini lahust) ja kultiveeriti AT37 kraad, 5% CO2ja70% niiskus24 tundi inkubaatoris. Rakkude kasvu olekut täheldati mikroskoobi all ja raku kasvutingimuste põhjal viidi vajaduse korral läbi keskmise muutusi või pääsustust.

1.4.2 Eksperimentaalne rühmitus

Logaritmic-faas B16F10 ja HACAT-rakud külvati 96- kaevuplaatidesse sobiva raku tihedusega ja kultiveeriti 24 tundi, et võimaldada rakkude kleepumist. Erinevate kontsentratsioonidega proovilahendused valmistati DMEM -söötme abil.

Katserühmad olid järgmised:

Normaalne rühm

Modelligrupp

PHG-d madala annusega rühm(125 ug/ml)

PHGS keskmise annuse rühm(250 ug/ml)

PHG-d suure annusega rühm(500 ug/ml)

GLA madala annusega rühm(6,25 ug/ml)

GLA keskmise annuse rühm(12,5 ug/ml)

GLA suure annusega rühm(25 ug/ml)

PHG/GLA (1: 1) rühm(25 ug/ml)

PHS/GLA (5: 1) rühm

PHS/GLA (10: 1) rühm

JaoksUVB-indutseeritud pigmentatsioonimudel B16F10 rakkudes, töödeldi mudelirühma rakke30 μl PBS (pH =7. 4)ja kiiritatud UVB ultraviolettkiirguse instrumendi all3 cm seadme alljaoks110 sekundit. Katserühmi eeltöödeldi100 μl erinevaid proovilahendusi1 tund enne lisamist30 μl PBSja kiirgamine UVB -seadme all 110 sekundit. Normaalset rühma töödeldi pidevalt kõrge glükoosisisaldusega DMEM-söötmega ja tühi rühm ei sisaldanud rakke, vaid asendati võrdse koguse söötmega.

JaoksLPS-i indutseeritud põletiku mudel HACAT rakkudes, mudeligruppi raviti20 ug/ml LPS PBS -lahus24 tundi. Katserühmi eeltöödeldi100 μl erinevaid proovilahendusi24 tundi enne lisamist20 ug/ml LPS -lahusVeel 24 tundi. Normaalset rühma töödeldi pidevalt kõrge glükoosisisaldusega DMEM-söötmega ja tühi rühm ei sisaldanud rakke, vaid asendati võrdse koguse söötmega.

JaoksAAPH-indutseeritud oksüdatiivne stressimudel HACAT rakkudes, mudeligruppi raviti25 mmol/l aaph lahus24 tundi. Katserühmi eeltöödeldi100 μl erinevaid proovilahendusi24 tundi enne lisamist25 mmol/l aaph lahusVeel 24 tundi. Normaalset rühma töödeldi pidevalt kõrge glükoosisisaldusega DMEM-söötmega ja tühi rühm ei sisaldanud rakke, vaid asendati võrdse koguse söötmega.

Iga rühm oli üles seatud3 kordavad kaevuja kultiveeritud aadressil37 kraad, 5% CO2ja70% niiskusinkubaatoris.

1.4.3 tsütotoksilisuse test

Tsütotoksilisust mõõdetiCCK8 meetod. Logaritmilise faasi B16F10 ja HACAT rakud lagundati0. 25% trüpsiin3 minutit. Pärast seda, kui seedimine on söötmega peatatud, pipeteeriti rakud korduvalt, et valmistada raku suspensiooni tihedusega1 × 10⁴ rakud/ml. Rakud külvati ühtlaselt 96- kaevuplaatidesse100 μl süvendi kohtaja PBS lisati perifeersetele kaevudele. Pärast rakkude järgimist lisati proovilahuste erinevad kontsentratsioonid koos koos3 kordavad kaevu rühma kohtaja rakke kultiveeriti37 kraad, 5% CO2ja70% niiskusjaoks24, 48 ja 72 tundiEnne meediumi äraviskamist.

Kõigi rühmade jaoks100 μl CCK8 DMEM kõrge glükoosisisaldusega sööde (mis sisaldab 10% CCK8)lisati ja inkubeeriti60 minutit. Lahuse neeldumine kell450 nmmõõdeti mikroplaadilugeja abil.

Rakkude elujõulisus (%) arvutati võrrandi (4) abil.

 

Valemis:

A _ töödeldudon kaevu sisaldavate rakkude, CCK8 lahuse ja proovilahuse neeldumine.

A _ tühion kaevu sisaldava keskmise ja CCK8 lahuse neeldumine, kuid ilma rakkudeta.

A0on kaevu sisaldavate rakkude ja CCK8 lahuse neeldumine, kuid ilma proovilahuseta.

1.4.4 Türosinaasi aktiivsuse test

Türosinaasi aktiivsuse mõõtmiseks kasutati L-DOPA meetodit. Pärast rakkude töötlemist48 tundiNagu jaotises 1.4.2 kirjeldatud, visati supernatant ära ja kaevud pesti kaks korda PBS -iga (pH =7. 4). Siis,50 μl 1% Triton x -100 lahenduslisati igasse kaevu ja paigutati kohe –80 -kraadisesse sügavkülmikusse30 minutit. Rakke sulatati toatemperatuuril lüüsimiseks.

Pärast eelsoojendamist aadressil37 kraadjaoks5 minutit, 10 μl 10 mmol/l l-dopa lahustlisati igasse kaevu ja inkubeeriti37 kraadi, 5% CO2 ja 70% niiskusjaoks1 tund. Neeldumine kell475 nmmõõdeti mikroplaadilugeja abil. Iga katset korratikolm kordaja türosinaasi aktiivsus (%) arvutati võrrandi (5) abil.

Valemis:

A _ katseon kaevu sisaldavate rakkude ja proovilahuse neeldumine UVB kiiritamisel.

A _ normaalneon kaevu sisaldavate rakkude ja proovilahuse neeldumine ilma UVB -kiirguseta.

A _ tühion kaevu sisaldava söötme neeldumine, kuid ilma rakkudeta.

 

1.4.5 Melaniini sisu mõõtmine

Melaniini sisalduse mõõtmiseks kasutati NaOH lüüsimismeetodit. Pärast rakkude töötlemist72 tundiNagu jaotises 1.4.2 kirjeldatud, visati supernatant ära ja kaevud pesti kaks korda PBS -iga.100 μl NaOH vesilahust, mis sisaldab 10% DMSO (1 mol/L)lisati igasse kaevu ja plaat pandi a90 -kraadine ahijaoks1 tund. Neeldumine kell490 nmmõõdeti mikroplaadilugeja abil. Iga katset korratikolm kordaja melaniini sisaldus (%) arvutati võrrandi (5) abil.

 

1.5 Põletikuliste tegurite ja oksüdatiivsete stressi näitajate mõõtmine

Pärast rakkude töötlemist48 tundinagu on kirjeldatud jaotises 1.4.2,HACATi rakudIgast rühmast koguti ravskaaslane, tsentrifuugiti ja supernatant koguti. IL -6 ja TNF- kontsentratsioone mõõdeti vastavalt ELISA komplektide juhistele.

Pärast rakkude töötlemist48 tundi, HACAT-rakud koguti rakukaaslase abil, mida tehti korduvate külmumiste tsüklitega, et indutseerida raku lüüsi, ja tsentrifuugiti AT12, 000 p / min 10 minutit 4 kraadi juures. Supernatant koguti ja tegevusedMätasja kontsentratsioonidKassmõõdeti ELISA komplekti juhiste abil.

 

1.6 Kombinatsioonindeksi mõõtmine

SelleKombineeritud indeks (CI) meetod[20] kasutati selleks, et hinnata, kas PHG -de ja GLA kombinatsioonil erinevatel massisuhtedel näitas sünergistlikku toimet türosinaasi aktiivsuse ja antioksüdatsiooni pärssimisel. Kombineeritud indeks arvutati võrrandi (6) abil.

 

Valemis:

D1jaD2esindavad kahe ravimi vastavaid kontsentratsiooni (G/L) kombineeritud ravis, mis on vajalik saavutamiseksx% aktiivsus.

Dxtähistab iga üksiku aine kontsentratsiooni (g/l), kui seda kasutatakse üksix% aktiivsus.

SelleCompuSyn tarkvarakasutati arvutusteks:

CI> 1näitab antagonistlikku toimet.

Ci=1tähistab aditiivset efekti.

CI <1näitab sünergistlikku mõju.

 

1.7 Andmete analüüs

Kõiki andmeid väljendati järgmiselt"Keskmine ± standardhälve (x̄ ± S)"ja arutelud põhinesid keskmistel väärtustel.

Statistiline analüüs viidi läbi, kasutadesGraphpad Prism 9.5. 0. Mitme rühma võrdlusteks kasutati ühesuunalist ANOVA-d (dispersiooni analüüsi). AP-väärtus <0. 05peeti statistiliselt oluliseks.