Põletikuga seotud neerukahjustuste mahasurumine pärast siirdamist uue PRC{2}} vabade radikaalide püüdja abil rottidel
Mar 18, 2022
Torsten R. Goesch 1, Nancy A. Wilson2, Weifeng Zeng2, Bret M. Verhoven2, Weixiong Zhong2Maya M. Coumbe Gitter3ja William E. Fahl1,3,*
Abstraktne:
Allograftneerudsiirdamine, mis käivitab peremeesraku ja antikehade poolt vahendatud äratõukereaktsioonineerud, on siirdamise ajal neerukahjustuste peamine põhjustaja. Siin küsisime, kas HRV{0}} pärsib neerusiirdamise korral täheldatud kahjustusi. Pruuni Norra (BN) roti neerud perfuseeriti in situ (UW lahus) koos 30 mM PrC-210 või ilma ja siirdati seejärel kohe Lewise (LEW) rottidele. 20 tundi hiljem analüüsiti siirdatud BN-i neerusid ja LEWrati plasmat.Neermõõdeti mitmete põletikuga seotud tsütokiinide histoloogiat ja neerude/seerumi taset, et hinnata mittevastavusega seotud neerupatoloogiat ja PrC-210kaitsetõhusust. 20 tundi pärast siirdamist: (i) allografti neerudes täheldati olulist histoloogilist neerutuubulite kahjustust ja mononukleaarsete põletikuliste rakkude infiltratsiooni; (ii)neerudfunktsiooninäitajad (kreatiniin ja BUN) olid oluliselt tõusnud; (iii) täheldati olulisi muutusi võtmetsütokiinides, st TIMP-1, TNF-alfa ja MIP-3A/CCL20 ning neerude aktiveeritud kaspaaside tasemetes. HRV-210-ravitud neerudes ja retsipientrottidel (i) vähenes neeru histoloogiline kahjustus (Banffi skoor) ja mononukleaarne infiltratsioon ravimata taustatasemeni; (ii) kreatiniin ja BUN olid oluliselt vähenenud; ja (iii) aktiveeritud kaspaaside ja tsütokiinide muutused vähenesid oluliselt, mõned taustal. Kokkuvõtteks võib öelda, et tulemused näitavad, et PrC{5}} võib pakkuda laialdaselt rakendatavat elundikaitset paljude siirdamistingimuste korral; see võib kaitsta siirdatud neere siirdamisprotsessi kõigis etappides ja pärast seda – elundidoonorlusest, transportimisest, taasimplantatsioonist ja operatsioonijärgsest põletikust –, et minimeerida ägedat ja kroonilist äratõukereaktsiooni.
Keiwords: neerudallograft; neeru äratõukereaktsioon; isheemia
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com
maca ženšenni cistanche
1. Sissejuhatus
Lõppstaadiumis neerupuudulikkus põhjustab üle 1,2 miljoni surma aastas kogu maailmas [1].Neersiirdamine on eelistatud ravi lõppstaadiumis neeruhaigusega patsientidele. Igal aastal tehakse maailmas üle 90000 neerusiirdamise.
Siirdamisprotsess ise põhjustab raku- ja elundikahjustusineerud, mis vähendab elundi pikaajalist ellujäämist. Kolm peamist neerukahjustust allotransplantaadi siirdamise ajal on (i) reaktiivsete hapniku- ja lämmastikuliikide (ROS ja RNS) põhjustatud kahjustus külmaisheemia ajal (külmhoiustamine) [2], (ii) ROS-i põhjustatud kahjustus implantaadi paigaldamisel. ("re-perfusioonikahjustus") [3] ja (iii) siirdamisjärgne põletik, mis vallandab kaasasündinud immuunvastuse ja antikehade poolt vahendatud äratõukereaktsiooni (ABMR) [4].
Neutrofiilid ja makrofaagid migreeruvad kahjustatud siirdamisse 6 tunni jooksul pärast reperfusiooni ja stimuleerivad kemokiini sünteesi residentsetes dendriitrakkudes, mis seejärel aktiveerivad T-lümfotsüüdid ja värbavad adaptiivseid immuunrakke. Kui need immuunrakud imbuvad proksimaalsetesse tuubulite epiteelirakkudesse, toodavad nad neutrofiilides müeloperoksidaasi ja makrofaagides nikotiinamiidadeniindinukleotiidfosfaadi (NADPH) oksüdaasi, mis mõlemad aitavad kaasa kohalikule vabade radikaalide tootmisele. Need põletikulised protsessid viivad komplemendi raja aktiveerumiseni ning rakkude edasise remodelleerumiseni ja lüüsini.neerudallotransplantaadiga [5]. ABMR võib tekkida kas ühe või mõlema, eelnevalt moodustatud transplantaadi vastaste alloantikehade või doonor-spetsiifilise antikeha (dnDSA) de novo arengu tulemusena [5–7]. Äge (min/päevas), üleminekul krooniliseks (päevad/nädalad), põletikuline reaktsioon allografti neerus koos pideva ROS-i ja põletikuliste tsütokiinide tootmisega, võib tekitada raske, isekestva vastuse, mis põhjustabneerudelundipuudulikkus.
Et paremini mõista patogeneesis osalevaid rakulisi ja molekulaarseid raduneerudallografti põletikku ja äratõukereaktsiooni, töötasime välja ja iseloomustasime rotimudelit, mis kordab enamikku kaasasündinud immuunvastuse, ABMR-i ja neeruorganite kaotuse kliinilistest kriteeriumidest [8]. Seda mudelit on kasutatud mitmete uudsete siirdamisjärgsete strateegiate hindamiseks.
Kaks praegu tunnustatud lähenemisviisi ägeda ja pikaajalise immuunvastuse vähendamiseksneerudallograft on: (i) suurendada võimalust leida ristsobiv doonor ja (ii) eemaldada olemasolevad antikehad doonori vastu.neerudallograft, kasutades desensibiliseerimisprotokolle [9,10].
Selles käsikirjas kirjeldatud töös küsisime, kas kolmas lähenemine ägeda ja pikemaajalise põletiku raskuse mahasurumiseks oleks kasulik. Manustasime siirdatud allograftile kohe toimivat vabade radikaalide püüdjat PRC-210neerudja retsipientrotile, et teha kindlaks, kas põletikuga seotud ROS-i kahjustusi on võimalik maha suruda. Kuigi põletikuga seotud ROSin-i pärssimise kontseptsioonneerudsiirdamine pole uus, uue, kohese toimega PRC-210 ROSscavengeri kasutamine siin on. Äsja siirdatud allotransplantaadis põletikku tekitavate ja tekitatud vabade radikaalide vahetu ja krooniline eemaldamine ja inaktiveerimineneerudwould significantly enhance the existing strategies to suppress allograft rejection and would provide another pathway to reduce post-transplant kidney cell damage, and with it, suppress Delayed Graft Function to improve survival of the kidney allograft.PRC-210 is a new small-molecule, aminothiol, free radical scavenger [11]; it has no measurable nausea/emesis nor hypotension side effects [12]. Unlike traditional antioxidants that act indirectly over hours to days via NrF-2 to activate the expression of protective genes [13], PRC-210 directly scavenges ROS to confer 100% protection in seconds [11]. PRC- 210 was the most potent of the 13 commonly studied "antioxidants" screened in an assay that scored the ability of molecules to prevent x-ray-induced damage to naked DNA; the majority of the tested "antioxidants" showed no protection [14,15]. In a related essay, the addition of PrC-210 30 s before a 60 s pulse of •OH to naked DNA provided complete protection against the •OH insult that induced >95-protsendiline DNA kahjustus kaitsmata kontrollidel [16]. Kahes varasemas näriliste neerusiirdamise uuringus [16, 17] näidati, et PRC-210 pärsib ROS-i põhjustatud neerukahjustusi, mis on põhjustatud (i) 30-tunnise külmsäilitamise ajal [17] ja (ii) implantaadi reperfusioonikahjustusega [16]. ] taustatasemele, kõrvaldades seega kaks olulist siirdatud neerude vigastuse allikat. Samuti on näidatud, et PRC-210 molekul pärsib vabade radikaalide põhjustatud vigastusi mitmetes teistes elundites [15,18]. Seega püstitasime hüpoteesi, et PrC-210 peaks samuti suutma kaitsta allotransplantaati oksüdatiivse stressi eest, mida tekitavad NII (i) raku- kui ka (ii) antikehade vahendatud äratõukereaktsioonid, mis toodavad kõrvalsaadusena vabu radikaale.
Selle hüpoteesi uurimiseks töötasime välja uue rotimudeli, mis vältis suurte isheemiliste ja reperfusioonijuhtumite esilekutsumist ning manustati PrC{0}} nii enne kui ka pärast implantatsiooni. Pruun roti neerud loputati PrC-210 sisaldava UW lahusega ja siirdati kohe süngeensetele Lewise roti retsipientidele. Külm isheemiline aeg oli praktiliselt kõrvaldatud. Kohe järgmine implantaat ja 8 tundi pärast sedaneerudimplantaadiga, said retsipientrotid süsteemseid PrC{0}}-süste annustes, mis võimaldasid siirdatud kehas pidevalt vabu radikaale eemaldada.neerud. Siirdatud neerud ja vereplasma koguti seejärel 20 tundi pärast siirdamist, et võimaldada mõõta nii PrC-210-and (i) põletikuliste kõrvalsaaduste pärssimist kui (ii)neerudkaitse.
maca ženšenni cistanche
2. Materjalid ja meetodid
2.1. Loomad
Täiskasvanud (200–250 g) isased Lewise ja BN rotid osteti Envigost (India-Napolis, IN, USA) ja neid hoiti Wisconsini ülikooli loomahooldusasutuses Madisonis, WI-s, USA-s. Kõik protseduurid viidi läbi vastavalt Wisconsini ülikooli loomade hooldamise ja kasutamise poliitikale. Loomahooldustöötajad teostasid iga päev loomade tervise hooldust, sealhulgas loomade surmajuhtumeid, toatemperatuuri, 12-tunnist valguse/pimeduse tsüklit ja puuride puhastamist. Toit ja vesi olid saadaval ad libitum. Selle uuringu kiitis perspektiivselt heaks Wisconsini ülikooli meditsiinikooli ja rahvatervise institutsionaalne loomade hooldamise ja kasutamise komitee (loomaprotokoll nr M005204). Kõik rühmad sisaldasid 4–6 looma.
2.2. Materjalid
Prekliinilise molekuli PrC-210 HCl aminotiooli sünteesi kirjeldati eraldi [19,20]. PrC-210 HCl kristalle (3-(metüülamino)-2-(metüülmonometüül)propaan-1- tiool) säilitatakse lämmastiku atmosfääris temperatuuril –20 ◦C ja isegi tavapäraselt sulatamisel, kasutamisel ja uuesti säilitamisel on kristalne PrC-210 massispektromeetria analüüsi järgi täiesti stabiilne rohkem kui 4 aastat. Teised keemilised reaktiivid saadi firmalt Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). UW Organ Preservation Solution osteti ettevõttest Bridge to Life, Columbia, SC, USA.
2.3. Kirurgiline ja eksperimentaalne protseduur
Nendes katsetes kasutatud siirdamisprotseduur on näidatud joonisel 1. BN-doonorrotil pärast aordi topeltligeerimist, parema neeruarteri ja -veeni ligeerimist ning vasaku neeruveeni kirurgilist lõiku vasakpoolne rottneerudperfuseeriti in situ, kasutades 5 ml toatemperatuuri UW lahust (15 sekundi jooksul). Perfusaat oli kas ainult UW lahus (rühmade jaoks "0 h" ja "20 h No Treatment") või UW lahus, millele oli lisatud kristalne PrC-210, et saavutada 30 mM [17] lisati, lahustati kohe ja pH reguleeriti algse UW lahuse pH väärtuseni 7,4, lisades 0,0619 µL 5N NaOH µmooli PrC-210 HCL soola kohta (FW: 220). PrC-210 tiooli (aktiivne vorm) poolväärtusaeg on füsioloogilistes pH lahustes, nagu UW lahus ja inimveri, ligikaudu 3,5 tundi [14]. Pärast in situ perfusiooni vasakpoolne BNneerudeemaldati kirurgiliselt ja õmbleti seejärel veresoonte ja kusejuha nüri anastomoosiga LEW-retsipientrotti vabanenud vasakusse neerupiirkonda. Õige LEWneerudligeeriti ja eemaldati vahetult enne. Viis minutit pärast LEW roti kirurgilist sulgemist sai rott süsteemse PrC{{0}} annuse (121 ug PrC-210 HCl kehamassi grammi kohta, mis võrdub 0.24 X Maksimaalne talutav annus) intraperitoneaalse süstimise teel. Nagu on näidatud joonisel fig 1, said rott ka intraperitoneaalselt süstitud annused PrC-210 (0,24 MTD) pluss 4 ja pluss 8 tundi pärast siirdamist. Rotid surmati pluss 20 tundi pärast siirdamist janeerudja analüüsimiseks koguti plasmaproovid. Igas ravirühmas oli vähemalt viis rotti.
2.4. Seerumi BUN ja kreatiniini mõõtmine
BUN-i ja kreatiniini mõõdeti seerumiproovides Catalyst One AnalyzerTechnology abil (IDEXX Laboratories, Westbrook, ME, USA).
2.5. Ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsid
Analüüsid viidi läbi nii, nagu on kirjeldatud ELISA komplekti protokollides (Roti TIMP-1, Cat# RTM- 100; Roti MIP3-A, Cat# DY540; Roti TNF-alfa, Cat# RTA{ {5}}; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). Lühidalt, roti plasma lahjendused lisati eelnevalt kaetud plaatidele, inkubeeriti 2 tundi 37 °C juures. Seejärel lisati testitava valgu jaoks spetsiifiline biotiiniga konjugeeritud antikeha ja inkubeeriti 1 tund 37 °C juures, pesti, konjugeeriti avidiiniga. lisati mädarõika peroksidaas, millele järgnes pesemine ja TMB substraadi lisamine. Reaktsiooni inkubeeriti 10–30 minutit, peatati väävelhappega ja loeti 450 nm juures.
2.6. Proteome Profiler Rat Cytokine Array
Analüüsid viidi läbi põhimõtteliselt nii, nagu on kirjeldatud toote protokollis. Lühidalt, plasmat inkubeeriti nitrotselluloosmembraanidega, mis olid kaetud püüdmis- ja kontrollantikehadega. Pärast inkubeerimist pesti membraane ja inkubeeriti streptavidiini HRP-ga. Protokolist kõrvalekaldumisena kasutasime kemoluminestsentsi tuvastamiseks SuperSignal West Femto (ThermoFisher, Madison, WI, USA; kataloogi nr 34094), kuna see andis tugevama signaali. Blotid visualiseeriti FotoDyne gel doc süsteemis.
2.7. Histoloogia
Formaliiniga fikseeritud (10 protsenti formaliini), parafiiniga,neerudlõigati 5 um suurusteks osadeks. Slaidid deparafineeriti, rehüdreeriti ksüleenist läbi gradueeritud etanooli seeria vette ja seejärel töödeldi allpool kirjeldatud viisil. Slaidid skanniti, kasutades Aperio Digital Pathology Slide Scanneri objektiivi 20-. Kõik H&E slaidid vaatas läbi dr Weixiong Zhong, MD, PhD, siirdamise patoloog ja hindas PTC, glomeruliidi (g), vaskuliidi (v)/intimaarteriidi, interstitsiaalse põletiku (I) ja C4d värvimise (Banff 2009 järgi) [21].
Eraldi määrati slaididele pimestatud number ja igalt H / E slaidilt tehti neerutuubulite mittekattuvad digitaalsed kujutised medulla ja ajukoore vahelisel liidesel. Hoolitseti selle eest, et see ei sisaldaks suuri veresoonte luumeneid ja glomeruleid. Punaste ja siniste pikslite automaatne kvantifitseerimine igas 10-neerudpilt tehti, kasutades ImageJ tarkvaras kirjutatud kohandatud makrot (https://imagej.nih.gov/ij/index.html
vaadatud 13. aprillil 2021). Punased pikslid peegeldasid proksimaalset torukujulist paksust, sealhulgas pintsli äärist. Tuumad kvantifitseeriti sinises kanalis. Siniste tuumapikslite ja punaste tuubulite suhe andis siirdamisjärgse valgete vereliblede infiltratsiooni korral põletikulise infiltratsiooni skoori.neerud. Hinded keskmistati ja joonistati Graphpad Prismi abil.
2.8. Aktiveeritud kaspaas-ensüümi aktiivsus
Aktiveeritud kaspaas 3 ja 7 aktiivsus sisseneerudhomogenaadi supernaatide määramiseks kasutati Apo-ONE fluorestseeruvat substraati (Promega, Madison, WI, USA) [16]. Lühidalt, sulatatudneerudsegati 8-kordse liigse lüüsipuhvriga, mis sisaldas 50 mM Na HEPES, pH 7,4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM DTT, 10 protsenti glütserooli ja homogeniseeriti 4 °C juures 30 sekundit Omni koehomogenisaatoriga. . Neeruhomogenaati tsentrifuugiti temperatuuril 4 °C (16,000- g) Eppendorfi mikrofuugis 20 minutit. Supernaate analüüsiti kohe kaspaaside aktiivsuse ja valgusisalduse suhtes Bradfordi meetodil, kasutades standardina veise seerumi albumiini. Aktiveeritud kaspaasi test viidi läbi järgmiselt: 5 uL supernaati (~ 40 ug supernate valku) lahjendati ülaltoodud lüüsipuhvriga kogumahuni 50 uL, segati süvendis 50 uL lahjendamata Apo-ONE substraadiga. must, läbipaistmatu, 96 süvendiga plaat 60-minutise reaktsiooni käivitamiseks. Plaate loksutati kiirusel 200 p/min temperatuuril 37 °C 60 minutit. DEVD kaspaasi substraadi peptiidi lõhustamist mõõdeti BMG Clariostari fluorestsentsplaadilugejaga ergastuslainepikkusel 499 nm ja emissioonilainepikkusel 521 nm. Igasse katsesse lisati kaspaasi standard.
2.9. Roti neeru mitokondrid
Puhastatud mitokondriaalne fraktsioon valmistati homogeniseeritud rotistneerudstandardse tsentrifuugimise tehnikaga [22]. Puhastatud mitokondrid suspendeeriti 0,15 M Tris HCl puhvris, pH 7,4.
Et teha kindlaks, kas eksogeense PrC{{0}} lisamine pärsib ROS-indutseeritud mitokondriaalse DNA fragmentatsiooni [22], lisasime 25 uL reaktsioonimahus (PCR-tuubis): 1{{29} } uL puhastatud mitokondrid, 5 uL PrC-210 lahjendust või vett (PrC-210 lisati 10 min enne Fe plus pluss pluss ADP pluss H2O2 ●OH generaatorit) ja 10 uL, mis sisaldas FeCl2 (2,5 mM; FW: 127), adenosiin-5'-difosfaadi naatriumsool (10 mM; FW: 427) ja H2O2 (lõppkontsentratsioon 0,003 protsenti). Pärast 20 minutit 37 °C juures segati 10 uL reaktsioonisegu 5 uL 6- geeli laadiva värvainega, mis sisaldas 0,3 protsenti SDS-i; tuubid istusid 1 minut 60 °C vees, seejärel laaditi 10 ul 1-protsendilise agaroosiga TAE geeli süvendisse ning 60 minuti pärast 60 V juures geelid värviti ja pildistati. Statistilise võrdluse võimaldamiseks tehti iga analüüsipunkti jaoks vähemalt kolm kordust.
2.10. Statistiline analüüs
Andmed on väljendatud keskmisena pluss /一 suguhaigused. Statistilise erinevuse ja p väärtuste määramiseks kasutati Studenti t-teste, kasutades GraphPad Prism 7.03 tarkvara. p-väärtusi alla 0,05 peeti oluliseks.
3. Tulemused
3.1. PrC-210 Neeru allotransplantaadi patoloogia supressioon
20 tundi pärast siirdamist siirdatud BN histoloogianeerud(Joonis 2A–D), mida raviti ainult UW lahusega, näitas selgelt suurenenud Banffi skoori tubuliidi ja peritubulaarse kapillaariidi korral (punased ja kollased nooled); summeeritud patoloogia hinded on näidatud paneelil E. BNneerudPrC{{0}}sisaldava UW lahusega perfuseeritud ja implantaadijärgsete intraperitoneaalsete PrC-210-i süsteemsete annuste manustamine (joonis 2D) näitas selgelt allasurutud neerude põletikulist patoloogiat ja allasurutud Banffi skoori tubuliidi ja peritubulaarsete haiguste korral kapillariit on võrdne "0 h" kontrollrühma BN-i Banffi tulemustega (joonis 2E). PrC-210 manustamine vähendas oluliselt nii kreatiini (p=0.032) kui ka BUN (p=0.046) neerukahjustuse markereid.
3.2. Aktiveeritud kaspaaside tase siirdamisjärgsetes neerudes
Aktiveeritud kaspaasi tasemed BN-sneerudhomogenaadid vähenesid BN allograftis märkimisväärseltneerudkes ei puutunud 20 tunni jooksul pärast siirdamist PrC{{0}}-raviga (joonis 5). BN-i neerude perfusioon PrC-210-sisaldava UW-lahusega ja siirdamine Lewise rottidele, kes said süsteemseid PrC-210 annuseid, andis tulemuseks sama aktiveeritud kaspaasi aktiivsuse, mida täheldati "0 h" kontrollneerudes.
3.3. Põletikuline tsütokiini tase pärast BN-i neeru allotransplantaati
Sõelumiskatsetesneerudhomogeneerida supernaate 0 h kontrollidest ja 20 h ilma ravitaneerudskriiniti Proteome Profiler 29 tsütokiini massiiviga, et tuvastada muutunud, põletikuga seotud tsütokiini ja kemokiini ekspressioonitasemeid 20 tundi pärast siirdamist. Nagu on näidatud kahel joonisel 6 mikrokiibi sisendil, ilmnesid muutused TIMP-1, TNF-alpha ja MIP-3a/CCL20 puhul. Seejärel kasutati nende muutuste kvantifitseerimiseks neeruhomogenaatides ja seerumites individuaalseid ELISA plaate, mis hõlmasid nüüd ka PrC-210-ga ravitud rotte. Nii TIMP-1 kui ka TNF-alfa tase tõusis 20 tundi pärast siirdamist ja mõlemal juhul langes nende tase PrC-210 juuresolekul (joonis 6A–C). MIP-3a/CCL20 tasemed tõusid 20 tunni pärast, kuid PrC{19}}-ravi saanud rottidel tõusid need oluliselt kõrgemaks (joonis 6D).
3.4. PrC-210 Roti neeru mitokondrite kaitse
Püsiv mitokondriaalne funktsioon ajal ja pärast sedaneerudsiirdamine on vajalik siirdatud organi ellujäämiseks. Siirdamisega seotud isheemia, isheemia-reperfusiooni ja implantatsioonijärgse põletiku ajal tekkiv ROS võib kõik mõjutada neerude mitokondrite jõudlust ja ellujäämist. Olulise mitokondriaalse rolli tõttu eraldasime mitokondrid roti neerudest ja tegime kindlaks, kas PrC-210 võib saavutatavate farmakoloogiliste kontsentratsioonide juures kaitsta neid organelle ROS-i insuldi eest.
Joonisel 7 on puhastatud rottneerudmitokondreid inkubeeriti ●OH generaatoriga [23]. Pärast lühikest reaktsiooni nägime roti neeru mitokondriaalse DNA olulist ROS-i fragmentatsiooni. Pärast ROS-i solvamist lahustati mitokondrite alikvoot SDS-i sisaldavas geeli laadimispuhvris ning mitokondriaalne DNA eraldati ja "suurus" määrati agaroosgeelkromatograafia abil (joonis 7). ROS-i solvang vähendas selgelt roti neeru mitokondriaalse DNA keskmist suurust (rada b) ja PrC-210 lisamine mitokondritele hoidis ära DNA katkemise (rajad c–g) PrC-s-210 kontsentratsioonist sõltuval viisil.
maca ženšenni cistanche
4. Arutelu
Allograftneerudsiirdamine, mis kutsub esile peremeesorganismi kaasasündinud raku- ja antikehade poolt vahendatud neeru äratõukereaktsiooni, on lühi- ja pikaajaliste haiguste peamiseks põhjuseks.neerudkahjustused siirdamise ajal ja sellega seotud hilinenud siirikufunktsioon on nähtav kuni 50 protsendil siirdatud neerudest. Tegime selle uuringu, et teha kindlaks, kas PrC-210 oleks efektiivne allotransplantaadi neerusiirdamise järgselt põhjustatud kahjustuste raskuse pärssimisel rotimudelis, mis kõrvaldab suures osas siirdamise isheemilise aja ja sellega seotud oksüdatiivse stressi. Eeldasime, et see lähenemine peaks võimaldama meil näha PrC-210 mõju siirdamisjärgsele põletikule minimaalse isheemiahäiretega.
TNF-alfa suurenemine ja oluline mononukleaarne infiltratsioon näitavad, et allotransplantaadi neerusiirdamine kutsub esile väljendunud ägeda põletiku 20 tunni jooksul pärast siirdamist ning see oli korrelatsioonis neerutuubulite rakkude kahjustusega, mida täheldatineerudhistoloogia (Banffi hinded). TNF-alfat toodavad peamiselt aktiveeritud makrofaagid ja see on raku signaalvalk, mis osaleb ägedas põletikus. See on tihedalt seotud allografti ägeda ja kroonilise äratõukereaktsiooni patogeneesiga [24].
Erinevalt ülaltoodud leidudest töötlemata BN-i kohtaneerud, PrC-210, mida manustati UW lahuse osana ja manustati süsteemselt siirdamisjärgsetele rottidele, vähendas nii TNF-alfa taset kui ka neerude infiltatsiooni mononukleaarsete rakkude poolt, mis mõlemad on vähenenud ägeda põletiku tunnused. PrC-210 vähendas neerukahjustust, nagu nähti histoloogilistes neerukahjustuste skoorides (Banff Scores), ravimata taustatasemeni ja alandas nii neerupatoloogia funktsionaalsete skooride, kreatiniini kui ka BUN-i taset.
Ravimata BN-i neerude põletikku seostati nii TIMP-1 kui ka MIP-3A/CCL20 suurenemisega. Võrdluseks nägime, et ravi PrC{3}} vähendas oluliselt TIMP-1 taset ja suurendas oluliselt MIP-3A/CCL20 taset.
Koe metalloproteinaasi-1 (TIMP-1) inhibiitor on ekstratsellulaarse maatriksi (ECM) sünteesi ja lagunemise oluline regulaator. Liigne ECM-i akumuleerumine on fibroosi arengu peamine patoloogiline mehhanism ägeda neerukahjustuse ajal ja pärast seda. Tavalises režiimis TIMP-1 sisuliselt puudubneerudkude [25], mida kinnitavad meie joonised 6A ja B, kuid teadaolevalt ekspresseerub TIMP-1 vigastatud neerudes, peamiselt neerutuubulite epiteelirakkudes, neerutuubulite basaalmembraanis ja interstitsiaalse tsütoplasmas. rakud. Suurenenud TIMP-1 ekspressioon oli positiivses korrelatsioonis samaaegse neerufunktsiooni halvenemisega [26]. PrC-210-ga ravitud rottidel ilmnes TIMP-1 taseme sügav langus (p=0,001) nii neeruhomogenaadis kui ka plasmas; see tähendab, et PrC-210 avaldab tugevat kaitsvat toimet siirdamisest põhjustatud neeru ekstratsellulaarse maatriksi ümberkorraldamise vastu.
Kemokiin MIP-3a/CCL20 aktiveerib CCR6 retseptori, mis ekspresseerub eelkõige regulatoorsetel T-rakkudel (Tregs). CCL20 ekspresseeritakse tubulaarsete endoteeli- ja interstitsiaalsete rakkude poolt ning see on ülesreguleeritud ka ägeda neerukahjustusega neerudes. CCL20–CCR6 rada mängib olulist rolli Treg-vahendatud T-rakkude värbamisel neerudesse ja Tregidel on kirjeldatud positiivset rollineerudparandamine, siirdamise taluvus ja neerude ellujäämine. Nii antikehade blokeerimine CCL20–CCR6 rajal kui ka CCR6-puudulike hiirte kasutamine ägedas staadiumis.neerudvigastuskatsed suurendasid neerupuudulikkuse raskust ja suremust [27]. See viitab sellele, et kliiniliselt võib CCL20 – CCR6 raja tõhustamine ja Treg aktiveerimine olla võimalik terapeutiline viis ägeda ja kroonilise haiguse piiramiseks.neerudvigastus [28]. Meie uuringus (joonis 6D) oli MIP-3a/CCL20 tase PrC-210--ga ravitud rottidel oluliselt kõrgem kui ravimata rottidel. Spekuleerime, et see on üks põhjusi nii (i) mononukleaarsete rakkude märkimisväärselt väiksemale värbamisele neerudesse (joonis 3C) kui ka (ii) neerukahjustuste olulisele vähenemisele (joonis 2) PrC-210--ravi saanud rottidel. .
Normaalne neeru mitokondriaalne funktsioon ja mis kõige tähtsam, selle solvamine neeru säilitamise, implantaadi ja implantatsioonijärgse põletiku etapis on olulised ROS-i vigastuse ja neerupuudulikkuse määrajad siirdamise ajal. Seega oli oluline, et PrC-210 pärsib täielikult mitokondriaalse DNA fragmentatsiooni (joonis 7) kontsentratsioonidel (2–4 mM), mis on saavutatud nii hiirte kui ka rottide plasmas, kellele manustati kas intraperitoneaalselt või suukaudsed süsteemsed 0.5 PrC-210 MTD annused, mida taluti tuvastatava toksilisuseta [29].
Meie varasemates neerusiirdamisega seotud uuringutes [16,17] nägime "külmaisheemia" ja "isheemia-reperfusiooni" kahjustusega kokkupuutuvate neerude aktiveeritud kaspaasi olulist suurenemist. Need isheemiast põhjustatud neerukahjustused vähendati PrC-210-ga töötlemisel taustale (joonis 8). Selle käsikirja uuringutes (joonis 5), kus külmisheemia ja isheemia-reperfusioon elimineeriti sisuliselt kohese siirdamisega, ei suurenenud aktiveeritud kaspaas siirdatud neerudes. Pigem vähenes aktiveeritud kaspaas märkimisväärselt pluss 20 h juures "Ravimata ravi" kontrollides ja ravi PrC{10}} kõrvaldas täielikult selle kaspaasi vähenemise pluss 20 h rottidel ja hoidis kaspaasi taseme stabiilsena. Meie tõlgendus nendest huvitavatest tulemustest seisneb selles, et siirdamisjärgsel perioodil puuduvad olulised isheemiast põhjustatud vabade radikaalide kahjustused ROS-i ja RNS-i kaudu.neerud, ei ole seotud rakusurma ja apoptoosi markereid nagu aktiveeritud kaspaasid. Pigem reguleerivad nende allografti neerusiirdamiste puhul äsja ekspresseeritud tsüto- ja kemokiinide põletikulised signaalid nüüd rakkude metabolismi, mis hõlmab apoptoosi raja mõjutamist. Kirjanduses kirjeldatakse, et TIMP-1 üleekspressioon põhjustab apoptoosi pärssimist [26]. Meie kaspaasi tulemused (joonis 5) toetavad seda kirjeldatud TIMP-1 efekti ja viitavad sellele, et TIMP-1 on oluline rakukahjustuse patofüsioloogia reguleerimisel pärast neeru siirdamist. Varasema TIMP-1 ekspressiooni PrC-210 pärssimise kinnituseks (joonis 6A, B), eemaldas ravi PrC-210 kaspaaside muutuse täielikult, hoides kaspaaside tasemed samal tasemel, nagu nähti kontroll "0 h" neerud. Kuna PrC-210 seerumi TIMP-1 tase pluss 20 tunni pärast (joonis 6B) peegeldab täpselt allotransplantaadi märkimisväärset allasurumist: (i) apoptoos (joonis 5), (ii) histoloogiline patoloogia (joonised 2 ja 2). 3) ja (iii) põletikuliste rakkude infiltratsioon (joonis 3), eeldame, et seerumi TIMP-1 taseme jälgimine inimese neeru allotransplantaadi retsipientidel on loogiline viis PrC-210 kliinilise efektiivsuse jälgimiseks tulevastes kliinilistes uuringutes. .
Oma senises töös [16, 17] oleme näidanud, et PrC-210 suudab kaitsta siirdatud neere nii külma-isheemia kui ka isheemia-reperfusioonikahjustuste eest. Selles uuringus näeme nüüd, et PrC{5}} kaitseb ka allotransplantaadi neere isheemiaga mitteseotud põletikuliste solvangute eest, mis tekivad pärast neeru implanteerimist. PrC-210 vähendab märkimisväärselt ägedate põletikuliste tsütokiinide, nagu TNF-alfa, taset ja pärsib TIMP-1 kemokiini ekspressiooni. Mõlemad sündmused ja potentsiaalselt täiendava CCL20 ekspressiooni toetamine eeldavad, et need: (i) vähendavad siirdamise neerukahjustust, (ii) pärsivad T-rakkude värbamist neerudesse ja (iii) pärsivad kaasasündinud ja adaptiivne immuunsüsteem. Joonisel 8 võtame need leiud kokku, et toetada rolli, mida meie arvates võib PrC- 210 mängida inimese neerusiirdamisel; see pärsib: i) külma isheemiaga reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) ja reaktiivsete lämmastikuliikide (RNS) kahjustusi taustal [17],
(ii) isheemia-reperfusiooni ROS-i kahjustus taustale [16] ja (iii) allotransplantaadi põletikuline kahjustus, mõnel juhul oluliselt taustal. Kuna PrC-210 esmane toimemehhanism PrC-210 jaoks on hapniku ja lämmastiku vabade radikaalide eemaldamine, tähendab see, et need vabad radikaalid on olulised neerukahjustuse põhjustajad, mida täheldatakse mitteisheemiliste seisundite korral, st allotransplantaadiga seotud põletik, mida selles käsikirjas uuriti.
Kokkuvõttes viitab see sellele, et PrC{0}} võib pakkuda laialdaselt rakendatavat elundikaitset paljude siirdamistingimuste korral; see võib kaitsta siirdatud neere siirdamisprotsessi kõigis etappides ja pärast seda – elundidoonorluse, transportimise, taasimplantatsiooni ja operatsioonijärgse põletiku eest, et minimeerida ägedat ja kroonilist äratõukereaktsiooni.
Cistanche tubulosa hoiab ära neeruhaiguse, proovi saamiseks klõpsake siin
Autori kaastööd:Uuringu läbiviimisel ja andmete analüüsimisel osalesid NAW, WZ (Weifeng Zeng), WZ (Weixiong Zhong), BMV ja MMCG; TRG ja NAW osalesid uuringute kavandamises ja andmete analüüsis; WEF ja TRG osalesid uurimistöö kavandamisel, uurimistöö läbiviimisel, andmete analüüsimisel ja töö kirjutamisel. Kõik autorid on käsikirja avaldatud versiooni läbi lugenud ja sellega nõustunud.
Rahastamine:Seda uurimistööd rahastas UW kliiniliste ja translatiivsete uuringute instituut ning andis UW ICTR-ile UL1TR002373 NIH/NCATS, Ameerika siirdamiskirurgide selts (133 AAA1552), American College of Surgeons (133 AAB2176) ning andis toetust WEF-ile (#). R03CA176799).
Institutsioonilise ülevaatenõukogu avaldus: selle uuringu kiitis tulevikus heaks Wisconsini ülikooli meditsiinikooli ja rahvatervise institutsionaalne loomade hooldamise ja kasutamise komitee (loomaprotokoll nr M005204).
Andmete kättesaadavuse avaldus:Uuringu andmed on selles käsikirjas täielikult saadaval. Huvide konflikt: autorid ei deklareeri huvide konflikti.
Viited
1. Wang, H.; Naghavi, M.; Allen, C.; Juuksur, RM; Bhutta, ZA; Casey, DC; Charlson, FJ; Chen, AZ; Coates, MM; Coggeshall, M.; et al. Ülemaailmne, piirkondlik ja riiklik oodatav eluiga, igasugune suremus ja põhjusspetsiifiline suremus 249 surmapõhjuse puhul, 1980–2015: süstemaatiline analüüs globaalse haiguskoormuse uuringu jaoks 2015. Lancet 2016, 388, 1459–1544. [CrossRef]
2. Ravi, E.; Chow, E.; Peipert, JD; Waterman, A.; Kwan, L.; Massie, AB; Thomas, AG; Bowring, MG; Leeser, D.; Flechner, S.; et al. Elusdoonori neerude saatmine ja siirdatud retsipientide tulemused. araablane. Archaeol. Epigr. 2017, 18, 632–641. [CrossRef] [PubMed]
3. Kaal, SC; Bell, PR; Nicholson, ML Neeruisheemia-reperfusiooni kahjustus. Br. J. Surg. 1996, 83, 162–170. [PubMed]
4. Sellarés, J.; De Freitas, peadirektoraat; Mengel, M.; Reeve, J.; Reinecke, G.; Sis, B.; Hidalgo, LG; Famulski, K.; Matas, A.; Halloran, PF Neerusiirdamise ebaõnnestumise põhjuste mõistmine: antikehade poolt vahendatud äratõukereaktsiooni ja mittejärgimise domineeriv roll. Olen. J. Siirdamine. 2012, 12, 388–399. [CrossRef]
5. Siedlecki, A.; Irish, W.; Brennan, DC hilinenud siiriku funktsioon neerusiirdamisel. araablane. Archaeol. Epigr. 2011, 11, 2279–2296. [CrossRef]
6. Hidalgo, LG; Campbell, peaminister; Sis, B.; Meinecke, G.; Mengel, M.; Chang, J.; Sellars, J.; Reeve, J.; Halloran, PF; Hidalgo, LG; et al. De NovoDonor-spetsiifilised antikehad neerusiirdamise biopsia ajal on seotud mikrovaskulaarse patoloogia ja hilise transplantaadi puudulikkusega. araablane. Archaeol. Epigr. 2009, 9, 2532–2541. [CrossRef]
7. Luupy, A.; Hill, GS; Jordan, SC Doonorispetsiifiliste HLA-vastaste antikehade mõju neerude hilisele allograftipuudulikkusele. Nat. Rev Nephrol. 2012, 8, 348–357. [CrossRef]
8. Huang, G.; Wilson, NA; Reese, SR; Jacobson, LM; Zhong, W.; Djamali, A. Transfusioonist põhjustatud ägeda antikehade poolt vahendatud äratõukereaktsiooni iseloomustus neerusiirdamise rotimudelis. araablane. Archaeol. Epigr. 2014, 14, 1061–1072. [CrossRef] [PubMed]
9. Jordaania, SC; Pescovitz, MD Presensibiliseerimine: probleem ja selle juhtimine. Clin. J. Am. Soc. Nephrol. 2006, 1, 421–432. [CrossRef] [PubMed]
10. Stegall, M.; Gloor, J.; Winters, J.; Moore, S.; DeGoey, S. Plasmafereesi ja suure doosiga IVIG desensibiliseerimise võrdlus neeru allotransplantaadi retsipientidel, kellel on kõrge doonorispetsiifilise alloantikeha tase. araablane. Archaeol. Epigr. 2006, 6, 346–351. [CrossRef] [PubMed]
11. Peebles, DD; Soref, CM; Fahl, WE ROS-püüdur ja uue PrC-210 aminotiooli radioprotektiivne efektiivsus. Kiirgus. Res. 2012, 178, 57–68. [CrossRef]
12. Soref, CM; Häkker, TA; Fahl, WE on uus suukaudselt aktiivne aminotiooli radioprotektor, mis ei põhjusta iiveldust ja hüpotensiooni kõrvaltoimeid oma suurimate radioprotektiivsete annustega. Int. J. Radiat. Oncol. 2012, 82, e701–e707. [CrossRef]
13. Techapiesancharoenkij, N.; Fiala, JL; Navasumrit, P.; Croy, RG; Wogan, GN; Groopman, JD Sulforaphane, vähktõve kemopreventiivne aine, indutseerib membraani biosünteesiga seotud radu vastuseks aflatoksiin B1 põhjustatud koekahjustustele. Toksikool. Rakendus Pharmacol. 2015, 282, 52–60. [CrossRef] [PubMed]
14. Jermusek, F.; Benedict, C.; Dreischmeier, E.; Brand, M.; Under, M.; Jeffery, JJ; Ranallo, FN; Fahl, WE CT kiirgusest põhjustatud DNA kahjustuste märkimisväärne mahasurumine normaalsetes inimese rakkudes PrC-210 radioprotektori poolt. Kiirgus. Res. 2018, 190, 133–141. [CrossRef] [PubMed]
15. Häkker, TA; Diarra, G.; Fahl, BL; Tagasi, S.; Kaufmann, E.; Fahl, WE Isheemia-reperfusioonirakkude surma märkimisväärne vähenemine hiirte müokardiinfarkti korral, kasutades kohese toimega PrC-210 ROS-püüdurit. Pharmacol. Res. Perspektiiv. 2019, 7, e00500. [CrossRef]
16. Vann, NM; Fahl, MEIE; Redfield, RR Hiire neeruisheemia-reperfusioonirakkude surma märkimisväärne vähenemine, kasutades vahetu toimega PrC-210 reaktiivsete hapnikuliikide püüdjat. Siirdamine. Otsene. 2019, 5, e549–e555. [CrossRef] [PubMed]
17. Verhoven, BM; Karim, AS; Vann, NM; Fahl, CJS; Wilson, NA; Redfield, RR; Fahl, WE parandasime märkimisväärselt rottide neerude külmhooneid, kasutades UW organite säilituslahust, mida on täiendatud kohese toimega PrC-210 vabade radikaalide püüdjaga. Siirdamine. Otsene 2020, 6, e578. [CrossRef]
18. Giese, APJ; Guarnaschelli, JG; Ward, JA; Choo, DI; Riazuddin, S.; Ahmed, ZM Aminotiooli PrC{1}} radioprotektiivne toime merisea kiiritatud sisekõrvale. PLoS ONE 2015, 10, e0143606. [CrossRef]
19. Copp, RR; Peebles, DD; Fahl, WE Uue aminotioolradioprotektorite perekonna prototüübi liikme süntees ja kasvu reguleeriv aktiivsus. Bioorganic Med. Chem. Lett. 2011, 21, 7426–7430. [CrossRef]
20. Fahl, MEIE; Peebles, D.; Copp, RR Aminotiooli ühendid ja koostised kasutamiseks koos vähiraviga. USA patent 7 314 959, 12. aprill 2004.
