Uudse kvertsetiini atsetüülitud derivaadi struktuurne disain, süntees ja antioksüdant, antileishmania, põletiku- ja vähivastane toime

Lisateabe saamiseks. kontakt:tina.xiang@wecistanche.com

Abstraktne: kvertsetiin(Q) on bioloogilise potentsiaaliga bioflavonoid; aga halb lahustuvus vees, ulatuslik ensümaatiline metabolism ja vähenenud biosaadavus piiravad selle biofarmakoloogilist kasutamist. Selle uuringu eesmärk oli viia läbi Q atsetüülimise teel struktuurne modifikatsioon, saades seega kvertsetiinpentaatsetaadi (Q5) analoogi, et uurida rakukultuuride bioloogilisi potentsiaale (antioksüdant, antileishmania, põletikuvastane ja tsütotoksilisus). Q5 iseloomustati FTIR-, 'H- ja 13C NMR spektri abil. Theantioksüdantpotentsiaali hinnati radikaali ABTS· plus suhtes. Põletikuvastast potentsiaali hinnati põletikueelse tsütokiini kasvaja nekroosifaktori (TNF) ja lämmastikoksiidi (NO) tootmise mõõtmisega BALB/c hiirte peritoneaalsetes makrofaagides. Tsütotoksilisuse testid viidi läbi AlamarBlue meetodil vähirakkudes HepG2 (inimese hepatokartsinoom), HL-60 (promüelotsüütiline leukeemia) ja MCR-5 (terved inimese kopsufibroblastid) ning MTT meetodit C6-rakkude puhul. kultuurid (roti glioom). Q ja Q5 näitasid antioksüdantset aktiivsust vastavalt 29 protsenti ja 18 protsenti, mis on õigustatud hüdroksüülrühmade asendamisega atsetüülrühmadega. Q ja Q5 näitasid NO ja TNF tootmise kontsentratsioonist sõltuvat vähenemist (lk<0.05); q="" and="" q5="" showed="" higher="" activity="" at="" concentrations="">40μM when compared to dexamethasone （20 μM）. For the HL-60 lineage, Q5 demonstrated selectivity, inducing death in cancer cells, when compared to the healthy cell line MRC-5（IC50>80 μM). Lõpuks kontrolliti Q5 tsütotoksilist paremust （IC50=11 μM）, mis 50 µM juures 24 tunni jooksul kutsus esile muutused C6 glioomirakkude morfoloogias, mida iseloomustab ümar kehakuju (kirjanduses pole veel kirjeldatud ). Analoogil Q5 oli potentsiaalne bioloogiline toime ja see võib olla paljutõotav edasisteks uuringuteks teiste rakukultuuride, eriti närvirakkude vastu.

Märksõnad: kvertsetiin;süntees; kvertsetiin pentaatsetaat; antioksüdant; antileishmania; põletikuvastane;tsütotoksiline toime

Toodete kohta lisateabe saamiseks klõpsake nuppu

1. Sissejuhatus

kvertsetiinon bioflavonoid, millel on tõestatud mõju tervisele ja hästi dokumenteeritud biokeemiline aktiivsus. Seda ühendit peetakse polüfenoolide hulgas üheks tugevamaks antioksüdandiks [1-3]. Oma omaduste tõttu on kvertsetiini testitud erinevate terapeutiliste rakenduste jaoks, ntantioksüdant, parasiidivastane,põletikuvastaneja vähivastased tegevused [4,5]. Parasiithaiguste puhul on flavonoidid kõrge huvigrupp. Selle põhjuseks on nende madal toksilisus peremeesorganismidele ja mitmed mehhanismid, mille abil nad saavad infektsioonide ajal patoloogiliselt muutunud protsesse moduleerida [6].Flavonoididneil on leishmaniaasi ravimiseks mitu sihtmärki ja need hõlmavad sihtmärke, nagu arginaas, ribonukleotiidreduktaas ja topoisomeraas II [7, 8].

kvertsetiinomab mitut vähivastast toimet mitut tüüpi tahkete kasvajate puhul. Lisaks on tõestatud, et sellel on aktiivsus HL-60 rakkudes (mis pärineb ägedast müeloidleukeemiast (AML)), mis vähendab oluliselt kasvaja kasvu, vähendades kasvajasisest oksüdatiivset stressi, aktiveerides rakuvälise reguleeritud kinaasi (ERK) signaali ja järgnev apoptoos [9]. Kvertsetiin parandas põletikueelset vastust, vähendades IL-6 ja TNF ekspressiooni positiivse põletikuvastase toimega inimese THP1 makrofaagide populatsioonides [10].

Erinevate vähitüüpide seas on glioom üks agressiivsemaid ja halva prognoosiga. Kahjuks ei ole peamised ravimeetodid (kirurgiline eemaldamine, kiiritusravi ja keemiaravi) tõhusad. Patsientide keskmine üldine elulemus jääb ligikaudu 14 kuuks [11]. Sellegipoolest on uued ühendid, nagu temosolomiid [12], retinoidid [13] ja flavonoidid [14] näidanud glioomivastast toimet. Kvertsetiini kasvajavastast toimet on kirjeldatud glioblastoomi rakkude suhtes, mis on glioomidest kõige agressiivsemad [15].

Ebanormaalsed immuunvastused on seotud paljude haiguste, sealhulgas autoimmuunhaiguste, allergiate, vähi ja neurodegeneratiivsete haiguste tekke ja arenguga.Flavonoididneil on potentsiaalne immunomoduleeriv toime ja neid uuritakse alternatiividena kliiniliseks kasutamiseks. Kvertsetiin võib avaldada olulist immunomoduleerivat toimet Th-1 ja Th-2 profiilist pärinevate tsütokiinide rakulisele tootmisele ja lümfotsüütide proliferatsioonile, reguleerides rakulist immuunsust[16]. Lisaks võib kvertsetiin erinevalt moduleerida interleukiini geenide ekspressiooni perifeerse vere mononukleaarsetes rakkudes (PBMC), soodustades Th-1 profiili, mis soodustab rakulist immuunsust gamma-interferooni (IFN-y) poolt, mis vähendab Th{ {6}} profiil, mis on seotud humoraalse immuunsuse ja makrofaagide aktiveerimisega IL-i poolt-4 [17].

Madal lahustuvus vees, ulatuslik metabolism ja ensümaatiline lagunemine piiravad kvertsetiini biosaadavust ja vähendavad biofarmakoloogilist kasutamist raviainena[13]. Huvitav lähenemisviis polüfenoolide madala biosaadavuse ületamiseks, et testida ja uurida nende in vivo aktiivsust, on loodusliku ühendi keemiline modifitseerimine, mis suurendab lahustuvust ja aeglustab ainevahetust. Seega uuritakse paljusid sünteetilisi viise, näiteks atsetüülimist, amiinide lisamist ja broomimist, oksiimideks muutmist ja kompleksi moodustamist hüdrasiinidega [18-20].

Selles uuringus teostame kvertsetiini struktuurse modifikatsiooni, mille eesmärk on saada analoog kvertsetiinpentaatsetaat (Q5), et hinnata antioksüdantide potentsiaali, põletikuvastast toimet ja vähirakkude, hepatokartsinoomi (HepG2), promüelotsüütilise leukeemia kasvu pärssimist. (HL-60) ja roti glioomi (C6) rakud.

2. Tulemused ja arutelu

2.1.Süntees ja iseloomustus

Analoogkvertsetiini (3,3', A',5,7-pentaatsetaat) sünteesiks kasutati totaalse atsetüülimise meetodit, mis kohandati kirjandusest leitud katsetingimustega [21]. Nii säilib äädikhappe anhüdriid atsüüliva ainena ja püridiin katalüsaatorina.

Saadud toodet (Q5), kollast tahket ainet, iseloomustas sulamistemperatuur vahemikus 178-186 kraadi, mis on kooskõlas kirjanduse andmetega[18]. Lisaks näitas kvertsetiini ja toote FTIR-i võrdlev analüüs kvertsetiini hüdroksüülidele iseloomulike neeldumisribade puudumist 3400 cm-1 ulatuses ja ribade ilmumist 1600-1650 cm-' ümber, mis viitavad karbonüülestrile. , mis näitab hüdroksüülrühmade asendamist atsetüülrühmadega: IR (KBr)v(cm-1):1761,1652,1615, 1505, 1442,1377,1208,1176,1121,1085,1012,892,83 ja 6,0692,83 (Joonis 1). Spektreid võrreldi kirjanduses kirjeldatutega [21].

Kvertsetiini (Q) ja saadud produkti (Q5) tuumamagnetresonantsi (NMR) analüüsid näitasid täielikku atsetüülimist, kusjuures hüdroksüülidele iseloomulikud singletid kadusid üle 9 ppm H NMR spektris (täiendavad joonised S1, S2 ja S{ {4}}S6) ja suurte ja iseloomulike metüüli signaalide ilmumine spektri alifaatsetes piirkondades vahemikus 2 kuni 3 ppm. 13C NMR spektri puhul (täiendavad joonised S3 ja S7-S9) näitas saadud produkt estri karbonüülide tüüpiliste signaalide suurenemist 170 ppm lähedale ja signaalide teket vahemikus 20 kuni 21 ppm, mis vastavad kemikaalile. metüülide viie alifaatse süsiniku nihked, mida kontrollitakse signaalide integreerimisega. Spektreid võrreldi kirjanduses kirjeldatutega [22].

Biasutto et al. [23] olid teerajajad estritel põhinevate prekursorite uurimisel, et suurendada kvertsetiini biosaadavust. Oma uuringute põhjal on Mattarei jt. [21] soodustas kvertsetiini täielikku atsetüülimist ja sai Q5 derivaadi suure saagisega (79-97 protsenti). Hiljuti on Mohajeri jt. [24] saadi kuumutamisel (180 kraadi 6 tundi) analoogi Q5 saagisega 85%. Käesolevas uuringus oli Q5 süntees tõhus ja saime ühe ühendi, mida on kirjanduses kirjeldatud andmete kohaselt korralikult iseloomustatud.

2.2. Antioksüdant ABTS· pluss radikaalne aktiivsus

Q ja Q5 antioksüdantse aktiivsuse võrdlev analüüs näitas, et kvertsetiin (Q) oli ABTS* pluss radikaali eemaldamisel aktiivsem kui O5 (vastavalt 29 protsenti ja 18 protsenti), IC50 väärtustega (μM) 188,850±0,003 ja 379,560±0,004 vastavalt Q ja Q5 puhul.

Flavonoidide antioksüdantne aktiivsus on otseselt seotud nende molekulaarstruktuuriga. On kaks mehhanismi, mille kaudu fenoolsed ühendid saavad oma antioksüdantseid funktsioone täita: vesinikuaatomite ülekanne ja elektronide loovutamine [25]. Kvertsetiini suurepärane antioksüdantne toime tuleneb hüdroksüülide ja nende vesinike olulisest panusest, mis asendatakse Q5 analoogis atsetüülidega, vähendades seega vesiniku annetamise või vabade radikaalide eemaldamise võimet sünteetiliste molekulide poolt.

Teaduskirjandusest ei leitud andmeid Q5 ühendi antioksüdantse toime kohta. Oh, jt. [26] hindas kvertsetiinestri preparaate ja nende antioksüdantset toimet, näidates, et kvertsetiinil oli testitud proovide seas kõrgeim radikaale püüdev aktiivsus. Seetõttu on hüdroksüülrühmade suur panus kvertsetiini antioksüdantsesse toimesse hädavajalik [27].

2.3.Antileishmania aktiivsus

In order to evaluate the activity of the compound(O and O5)against the promastigote forms of the two Leishmania species, the 50% inhibitory concentration(IC50)was calculated from the cell viability assay in axenic culture. For Leishmania braziliensis, Q and Q5 had ICs0 values>l ± 4,7 μM） selle liigi puhul võrreldes L. braziliensisega.

Tasdemir et al. [8] võrdles flavonoidide ja nende analoogide (saadud kvertsetiinist) antitrüpanosoomi ja leishmaniaalset toimet ning leidis, et need on tugevad ja tõhusad algloomavastased ained L donovani amastigootsete vormide (IC50=1.0ug ml) vastu. -l). L.amazonensis'e promastigootvormide puhul Fonseca ja Silva jt.[27] leitud kvertsetiiniga töödeldud kultuurides IC50=31,4 uM 48 tunni jooksul. Lisaks teatasid nad rakkude kasvu täielikust peatamisest 96 μM kvertsetiiniga 96 tunni jooksul, mis näitab rahuldavat antileishmanial-dal aktiivsust. Cataneo jt. [28] hindas kvertsetiini (kuni 192 μM）) promastigootidevastast toimet L. brasiliensis'e vastu makrofaagide kõhukelmerakkudes. L. major promastigootsetes kultuurides näitas kvertsetiin ja selle analoog kvertsetiin-pentaatsetaat kontsentratsioonist sõltuvat toimet (IC). 50 =2,5±0,92 ja 2,85±0,99 μM vastavalt 【24】.

Mõned autorid on näidanud, et kvertsetiin põhjustab L amazonensis promastigootide surma mitokondriaalse membraani düsfunktsiooni kaudu, mis on tingitud reaktiivsete hapnikuliikide [27, 28] ja muude sihtmärkide, nagu arginaas [7], ribonukleotiidreduktaas [8, 29] ja topoisomeraas, tootmisest. II[30]. Selles uuringus saadud tulemused näitavad, et testitud ühendite (Q ja Q5) puhul tuleks kaaluda teisi teste, võttes arvesse in silico teste sihtmärkide uurimiseks, mis võivad olla seotud täheldatud surmamehhanismidega.

2.4. Põletikuvastased ja tsütotoksilised toimed

Seejärel keskendusime uudse derivaadi bioloogilise aktiivsuse hindamisele. Esiteks määrati BALB / c hiirtelt saadud peritoneaalsetes makrofaagides Q ja Q5 mittetoksilised kontsentratsioonid. CCs0 väärtused ei näidanud tsütotoksilisust kontsentratsioonidel, mis on võrdsed või väiksemad kui 80 μM (joonis 2A, D). Deksametasoon ei olnud testitud kontsentratsioonil (20 μM) tsütotoksiline. Selle põhjal viidi läbi järgmised katsed kontsentratsioonidel, mis ei ületanud 80 μM.

Uuriti Q ja Q5 immunomoduleerivat aktiivsust, et teha kindlaks ühendite mõju põletikueelse vahendaja sekretsioonile. Ühendite (Q ja Q5) immunomoduleerivat toimet hinnati algselt peritoneaalsete makrofaagide kultuurides lämmastikoksiidi tootmise kaudu. Nagu oodatud, suurendas makrofaagide aktiveerimine LPS PLUS IFNy-ga nitritite tootmist (joonis 2B, E). Töötlemine kvertsetiiniga pärssis kontsentratsioonist sõltuval viisil nitriti tootmist (lk<>

Pentadaktüülühend (Q5) ei näidanud 20 μM juures sarnast aktiivsust. Huvitaval kombel oli aktiivsus mõlema ühendi puhul oluline kõrgeimate testitud kontsentratsioonide (40 ja 80 µM) juures. Kõrgeima testitud kontsentratsiooni korral (80 uM) olid ühendite toimed sarnased aktiveeritud makrofaagide kultuurides täheldatuga ja 20 µM deksametasooniga töödeldud. Ühendid ei olnud testitud kontsentratsioonidel (20, 40 ja 80 µM) peritoneaalsete makrofaagide suhtes tsütotoksilised.

Selle paremaks iseloomustamisekspõletikuvastaneÜhendite (O ja O5) toime tõttu määrati põletikulise tsütokiini TNF kvantifitseerimine ensüümseotud immunosorbentanalüüsi (ELISA) meetodil. Makrofaagide stimuleerimine, kasutades LPS-i ja INF-y, kutsus esile TNF-i tootmise märkimisväärse suurenemise. Ravi Q ja Q5-ga vähendas oluliselt TNF tootmist (lk<0.05) in="" a="" concentration-dependent="" manner="" (figure="" 2c,="">

Põletikuliste tegurite vähendamist kvertsetiini poolt on kirjeldatud mitmeti, sealhulgas Th-2 põletikuliste profiilide moduleerimist, mis on seotud kaitsega närvihaiguste korral [31,32]. Kvertsetiini põletikuvastast toimet on kirjanduses hästi kirjeldatud [33,34]. Siiski on vähe uuringuid, mis näitavad O5 analoogi põletikuvastast potentsiaali. See uuring kinnitab Cheni jt järeldusi. [35], kes tõestasid Q ja O5 rolli LPS-i poolt indutseeritud NO tootmise pärssimisel kontsentratsioonist sõltuval viisil, ilma RAW 264.7 makrofaagide liinile kahjulike tsütotoksiliste mõjudeta. Lisaks näitas see uuring Q5 enneolematut toimet põletikueelse tsütokiini TNF inhibeerimisel.

Saadud andmed näitavad poolsünteetilise molekuli (O5) mõju säilimist; teiste tegurite, nagu tsütokiini IL-10, annus võib aga olla nende profiilide hindamisel perspektiivikas. Seetõttu võib Q5 pidada potentsiaalseks molekuliks tulevaste in vitro ja in vivo testide jaoks, mille eesmärk on täiendav põletikuvastase toimega terapeutiline alternatiiv.

Testitud ühendite (Q ja Q5) tsütotoksilisust hinnati 20, 40 ja 80 uM juures, kasutades AlamarBlue kolorimeetrilist meetodit terves rakuliinis (MRC-5, inimese kopsufibroblastid) ja kahes erinevas vähirakuliinis. , HepG2 (inimese hepatotsellulaarne kartsinoom) ja HL-60 (inimese promüelotsüütiline leukeemia), nagu on näidatud joonisel 3. Doksorubitsiin oli standardravim, mida kasutati positiivse kontrollina.

Nagu on näidatud joonisel 3, ei näidanud kvertsetiin (Q) HepG2 rakkude puhul olulist tsütotoksilist aktiivsust kõrgeima uuritud kontsentratsiooni juures (80 μM) ja selle pentaatsetaadi analoog (Q5) näitas aktiivsuse vähenemist (IC{{4). }},9 μM). Vähirakuliini HL-60 puhul ei olnud kvertsetiin eriti aktiivne (IC50=51,3 uM); Huvitaval kombel oli Q5 aga oluliselt aktiivsem kui kvertsetiin, mille IC50 oli 33,6 uM. Standardravimi doksorubitsiini IC50 väärtused jäid vahemikku 0,1 kuni 0,2 uM vähirakuliinide puhul, millel oli oluline tsütotoksiline toime terve rakuliini MRC-5 suhtes (tabel 1), mida ühendite (Q ja Q5) puhul ei täheldatud. .

For the HL-60 cell line, the Land O5presented values of 51.3 and 33.6 μM, respectively, in agreement with Massi et al.[17]. Regarding cytotoxicity in non-tumor cells, O and Q5 presented IC50 values >80 μM, mis näitab selektiivset profiili vähirakuliini suhtes. Vähesed uuringud on näidanud kvertsetiin O5 analoogi aktiivsust vähirakuliinides. Kuid Q5 aktiivsust HeLa kasvajarakkude liinis dokumenteeris Danihelovået al. [22], mis näitas, et kvertsetiini atsetüülitud estrid olid kõige tõhusamad tsütotoksilised derivaadid. Andmeid Q5 tsütotoksilise rolli kohta HepG2 liinirakkudes ei leitud. Kirjandusest leiti ainult üks uuring, mis näitas, et kvertsetiini tetraatsetüülitud analoogil oli kaspaasi -3 aktiveerimise kaudu oluline mõju HL-60 liinirakkude pärssimisele, soodustades apoptoosi [36].

C6 rakukultuuri tsütotoksilisuse tuvastamiseks kasutati kolorimeetrilise meetodi MTT testi. Kvertsetiin ja Q5 kutsusid esile 57{{10}} nm MTT neeldumise vähenemise, mis näitab mitokondriaalse dehüdrogenaasi aktiivsust ja viitab rakkude elujõulisuse vähenemisele C6 rakkudes. Nagu on näidatud joonisel 4, suutis kvertsetiini poolt indutseeritud tsütotoksilisus C6-rakkudes kontsentratsioonides, mis on üle 25 uM 72 tunni jooksul (joonis 4A), samas kui 0,78 µM Q5 72 tunni jooksul suutis vähendada rakkude elujõulisust (joonis 4B). ). Täheldati, et 50 uM kvertsetiin(O) ja O5 vähendasid rakkude elujõulisust vastavalt 41,3 protsendini ± 2,9 protsendini ja 47,5 protsendini ±1,2 protsendini, võrreldes kontrollrühmaga (100,0 protsenti ±6,4 protsenti) (joonis 4A, B). . DMSO-ga (0,05 protsenti) töödeldud C6 kultuurides ei visualiseeritud olulisi muutusi rakkude elujõulisuses võrreldes töötlemata rakkudega.

Saadud tulemuste põhjal uurisime seejärel optilise mikroskoopia abil ühendite Q ja Q5 (50 μM) morfoloogilisi mõjusid C6 rakkudele 24, 48 ja 72 tunni pärast. Kvertsetiinpentaatsetaat (Q5) kontsentratsioonis 50 μM kutsus esile muutused C6 glioomirakkude morfoloogias esimese 24 tunni jooksul, tsütoplasma pikenemise nähtava vähenemisega võrreldes kontrollrühmaga (joonis 5). Pärast 48-tunnist töötlemist Q5-ga omandasid rakud ümara morfoloogia, mida iseloomustas rakukeha ja vormitu membraani tagasitõmbumine (mida teaduskirjanduses ei ole kirjeldatud), erinevalt kvertsetiinist, millel oli selle ravi ajal morfoloogiline aspekt. sarnane fibroblastidele [37]. Kõik muud morfoloogilised muutused visualiseeriti rakkudes muudes ravitingimustes.

Hüdroksüüli asendamine atsetüülrühmadega võib soodustada kvertsetiini analoogide paremat rakkude imendumist, soodustades erinevaid bioloogilisi teste, eriti vähirakkudes [38, 39]. Bispo da Silva jt. [40] näitasid, et C6-rakkude töötlemisel flavonoidide rutiini ja kvertsetiiniga vähenes oluliselt õhema ja bipolaarse morfoloogilise fenotüübiga C6-rakkude osakaal võrreldes kontrollkultuuridega. C6-rakkude töötlemine flavonoididega pärssis elujõuliste C6-rakkude rändeomadusi pärast 24-tunnist töötlemist. Kontrolltingimustes oli mikroglia ümaram fenotüüp; pärast rutiinravi omandas enam kui 50 protsenti rakkudest hargnenud multipolaarse fenotüübi ja ülejäänud amööboidse fenotüübi, mis mõlemad viitavad aktiveerumisele.

Uuringud näitavad, et kvertsetiin häirib raku signaaliülekande radade reguleerimist, mis on seotud rakusurmaga apoptoosiga ja rakutsükli progresseerumise etappides [41,42]. Santos jt. [14] viitas inimese glioblastoomi GL-15 rakkude kasvu võimalikule vähenemisele. Bi et al. [43] visualiseerisid U87 ja U251 inimese glioblastoomirakkude autofagia esilekutsumist annusest sõltuval viisil.

Saadud tulemused kinnitavad Danihelova jt. [22], milles kvertsetiini molekuli sisestatud atsetüülrühmad soodustasid vähivastase toime paranemist. Lisaks näitasid nad vähirakkude, eriti närviliinide rakkude suuremat tropismi. See uuring on O5 analoogiga võrreldes C6 glioomirakkude ravis enneolematu. Dell'Albani jt. [44]näitasid kvertsetiini atsüülderivaatide paremat toimet inimese glioomitüvede U373-MG ja hiire glioomi 9L kultuurides, näidates apoptoosi põhjustatud surmateed. Rakkude morfoloogia muutmine ümaraks profiiliks võib viidata surmamehhanismidele, nagu apoptoos, mis on laialdaselt omistatud kvertsetiinile [45-47]. Tulevikus võivad testid tervete närvirakkudega aidata seda hüpoteesi selgitada.

3. Materjalid ja meetodid

3.1.Reaktiivid ja materjalid

Kõik reagendid (kvertsetiin, püridiin, äädikhappe anhüdriid, trikoloroisotsüanuurhape, diklorometaan, 2,4-dinitro-fenüülhüdrasiin, hüdroksüülamiinvesinikkloriid, naatriumatsetaat, petrooleeter, väävelhape, kaaliumpersulfaat) ja kaubanduslikult saadaolev puhastus (Ouimex, Merck, Brasiilia ja Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA). Kõigi standardlahuste ja proovide valmistamiseks kasutati Milli-Q Plus veepuhastussüsteemist (Millipore, Molsheim, Prantsusmaa) saadud ülipuhast vett (takistusvõimega 18 MOcm-I). Kõik laboriklaasid pesti 10-protsendilises vees. o/ø） HNO3 lahusega 24 tundi, loputati kõrge puhtusastmega veega ja kuivatati toatemperatuuril.

3.2. Süntees ja iseloomustus

Struktuurne analoog saadi pärastkvertsetiinmolekulaarne modifikatsioon ligipääsetavamalt ja reprodutseeritavamalt sünteetiliselt teelt (Penta atsetüülimine). Rakendasime rohelise keemia põhimõtteid, vähendades ainete kasutamist. Pentadaktüülanaloog (Q5) saadi pärast kvertsetiini molekulaarset modifitseerimist sünteetiliselt, kasutades atsüüliva ainena atseetanhüdriidi ja katalüsaatorina püridiini.

Segu, mis sisaldas kvertsetiini (300 mg, 1 nt.), äädikhappe anhüdriidi (0,80 ml, 20 nt) ja püridiini (7,5 ml), segati magnetiliselt toatemperatuuril. Pärast 24-tunnist segamist lisati reaktsioonisegule 250 ml diklorometaani. Seejärel pesti reaktsioonisegu 10% HCl-ga (3 x 100 ml), lahjendatud NaOH-ga (3 x 50 ml) ja veega (3 x 100 ml); kuivatatud veevaba naatriumsulfaadiga; filtreeritud; ja aurustatakse rootoraurustis (Fisatom, Minas Gerais, Brasiilia)[21]. O5 kogus ja saagis olid vastavalt 280 mg ja 54 protsenti.

Kvertsetiini molekuli struktuurimuutusreaktsiooni jälgiti õhukese kihi kromatograafiaga (TLC), kasutades lahustitena heksaani ja etüülatsetaadi (1:1) segu. Füüsikalis-keemilise iseloomustuse jaoks kasutati sulamistemperatuuri. Fourier' teisenduse infrapuna (FTIR) testid nõrgestatud täieliku peegelduse (ATR) meetodil viidi läbi FTIR Spectrum 100S mudeliga (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA), saades skaneerivad spektrid keskmises infrapunases (4000 kuni 600 cm-1).

Proov (mass ~50 mg) asetati ATR-kristallidele ja allutati käsitsi mehaanilise pressi abil ligikaudu 20 N rõhule. FTIR-spektreid jälgis tarkvara OriginPro8 OriginLAB4 (www.originlab.com, juurdepääs 10. septembril 2021). Tuumamagnetresonantsi (NMR) spektrid registreeriti Bruker Avance IⅢI500 MHz (Uster, Šveits) spektromeetriga -500 MHz 1H NMR jaoks ja 125 MHz 13C NMR jaoks, kasutades lahustina DMSO-d. Keemilised nihked väljendati ppm skaalal (ug/mL) ja sisemise võrdlusalusena kasutati kloroformi (CHCla).

NMR-spektreid töödeldi TopSpin⑤4.{1}} tarkvaraga (Bruker Biospin, Coventry, UK) ja võrreldi kirjanduse andmetega [38]. NMR andmed olid: 'H NMR (5{34}}{44}} MHz, CDCl3) 2,34 (6H, s, -OCOCH3); 2,35 (3H, s, -OCOCH3); 2,35 (3H, s, -OCOCH3); 2,44 (3 H, s, -OCOCH3); 6,88 (1 H, d, J=2,5 Hz); 7,34 (1 H, d, J=2.{51}} Hz);7,36 (1 H, d, J=8,5); 7,70 (1 Hd, J=2, 0 Hz); 7,73 (1H, dd, J1=8,5 Hz, J 2=2. 0Hz）; 13cnmr （125 MHz, CDCL3） Δ 170.04; 169,24; 167. 167. 86; 167,79; 156,87; 154,28; 150,43; 144.40; 142,0; 123.013; 12.123; 127.123; 127,78; ;113,89; 108,96; 21,16; 21,02; 20,65; ja 20.49.

3.3. Antioksüdant ABTS* pluss radikaalne aktiivsus

ABTS* pluss sekvestreerimisaktiivsus kohandati Dormani ja Hiltuneni [48] kirjeldatud meetodiga. Kaaliumpersulfaat ja ABTS (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) lahustati destilleeritud vees, saades lõppkontsentratsiooniks vastavalt 2,45 mM ja 7 mM. ABTS-lahus valmistati mõlema lahuse lisamisega vahekorras 1:1 ja seejärel inkubeeriti lahust toatemperatuuril 16 tundi pimedas.

Saadud intensiivselt värvitud lahus reguleeriti enne kasutamist spektrofotomeetris etanooliga neeldumiseks {{0}},7 ± 0,05 nm lainepikkusel 734 nm. Kasutasime 30 μL proove või Troloxi (Sigma Aldrich⑧, St. Louis, MO) võrdlusstandardina erinevates kontsentratsioonides (5, 10, 25, 50, 75 ja 100 μM), lisati 3 ml proovile. ABTS* pluss lahus ja oodati reageerimist 6 minutit. Neeldumist mõõdeti lainepikkusel 734 nm, võrreldes pimekatsega (etanool). ABTS· pluss puhastusvõime arvutati järgmiselt:

ABTS* pluss puhastusefekt ( protsenti ){{0}} (1- A0/A1) × 100;

kus A0 on kontrolli neelduvus ja A1 on proovi või standardi neelduvus. Kõik määramised viidi läbi kolmes eksemplaris. IC5so väärtused arvutati ja väljendati keskmisena ± SD ühikutes μM.

3.4.Antileishmania aktiivsus

Lamazonensis'e (MHOM/BR88/BA-125Leila tüvi) ja Lbraziliensis'e (MHOM/BR88/BA-3456) promastigoote (1 × 10 kraadi süvendi kohta) kasvatati 96-süvendiplaadil Schneideri sööde (Sigma-Aldrich⑧, St. Louis, MO, USA), millele on lisatud 10 protsenti veise loote seerumit (FBS; GIBCO) ja 50 ug ml-gentamütsiin (Life, Carlsbad, CA, USA) ning töödeldud erinevate kontsentratsioonidega. 100 µM; Q5 kuus lahjendust 1–2. Parasiite inkubeeriti 72 tundi 26 kraadi juures. Seejärel lisati 2 tunni jooksul 20 μl süvendi kohta AlamarBlue'd (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Lugemine viidi läbi spektrofotomeetris, kasutades lainepikkusi 570 ja 600 nm. Akseenilise kultuuri inhibeerimise arvutamine määrati töötlemata kontrolli põhjal [49].

3.5. Põletikuvastased ja tsütotoksilised toimed

3.5.1.Narkootikumid

Immunomoduleerivates testides kasutati positiivse kontrollina deksametasooni (Sigma-Aldrich⑧, St. Louis, MO, USA), sünteetilist glükokortikoidi. Doksorubitsiini (doksorubitsiinvesinikkloriid, Laboratory IMA SAIC, Buenos Aires, Argentina) kasutati vähivastase võrdlusravimina. Kõik ühendid lahustati dimetüülsulfoksiidis (DMSO; PanReac, Barcelona, ​​Hispaania) ja lahjendati testides kasutamiseks rakukultuurisöötmes. DMSO lõppkontsentratsioon oli kõigis katsetes alla 1 protsendi.

3.5.2.Loomad

BALB/c hiired vanuses 4-10 nädalat saadi Goncalo Monizi Institute/FIOCRUZ-BA (IGM, Salvador, Bahia, Brasiilia) vivaariumist, kus neid hoiti puurides, mis sisaldasid maksimaalselt viit hiirt. Kõiki puure hoiti aklimatiseeritud ruumis temperatuuril 21 kraadi ± 1 kraadi 12-h valguse/pimeduse tsüklis, vee ja toiduga ad libitum kogu katseperioodi vältel. Loomadega tehtud katsed kiitis heaks Goncalo Monizi/FIOCRUZ-BA Instituudi eetika- ja loomade kasutamise komitee (IGM{6}}/15).

3.5.3. Rakud

Kasutati HL-60 (inimese äge promüelotsüütiline leukeemia) ja HepG2 (inimese hepatotsellulaarne kartsinoom) saadi Ameerika tüüpkultuuride kollektsioonist – ATCC (Rockville, ML.USA). Kvertsetiini(O) ja O5 derivaadi selektiivsuse hindamiseks mittevähirakkude proliferatsiooni suhtes kasutati MRC-5 liini (inimese kopsufibroblast), mis saadi samuti ATCC-st. Rakuliine kasvatati rakkudes. kultiveerimispudelid (maht 75 cm3 250 ml), kasutades RPMI 1640 söödet (GibcoTM), millele oli lisatud 10 protsenti veise loote seerumit (GibcoM) ja 50 ug/ml gentamütsiini (GibcoTM). Rakke hoiti inkubaatorites, mille atmosfäär oli 5 protsenti CO, 37 kraadi juures ja seda jälgitakse iga päev. Kõiki rakuliine testiti mükoplasma suhtes, kasutades Hoechsti värvimise mükoplasma tuvastamise komplekti (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). C6 rakuliin tuletati roti gliaalkasvajatest, mis olid indutseeritud n-nitrosometüüluureaga [50]. Neid glioomirakke kultiveeriti nii, nagu on kirjeldanud de Oliveira et al. [51]. Rakke inkubeeriti 37 kraadi juures niisutatud inkubaatoris 5% CO2 juures. C6 rakke kasvatati rakukultuuri tassidel (100-mm Ø, TPP) DMEM söötmes, millele oli lisatud 100 UI/mL penitsilliini G, 100 ug/ml streptomütsiini, 7 mM glükoosi, 2 mM L-glutamiini, 1 mM püruvaati, ja 10 protsenti vasikaloote seerumit. Kultuurikeskkonda vahetati iga 2 päeva järel. 24 tundi enne töötlemist külvati C6 rakud 35 mm läbimõõduga Petri tassidele või 96-süvendiga plaatidele tihedusega 3,5 × 10* rakku süvendi kohta.

Kõiki rakuliine testiti mükoplasma suhtes, kasutades Mycoplasma Stain Kit (Sigma-Aldrich), et kinnitada saastumiseta rakkude kasutamist. Teave rakuliinide kohta sisaldub andmebaasis "Rio de Janeiro rakupank (BCRJ)": rakk HepG2 (kood: 0291), rakk HL-60 (kood: 0104) ja rakk C6 (kood: 0057) .

3.5.4. Tsütotoksilise aktiivsuse test

Testitud ühendite (Q ja Q5) tsütotoksilisuse hindamiseks HL-60 (inimese äge promüelotsüütiline leukeemia) ja HepG2 rakkudele kasutati Alamar Blue (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) kolorimeetrilist meetodit. Alamar Blue (resasuriin) on indikaator, mis tekitab vastusena metaboolsele aktiivsusele kolorimeetrilisi muutusi ja fluorestsentssignaali. Resasuriin redutseeritakse metaboolselt aktiivsete rakkude poolt resorufiiniks. Oksüdeeritud vorm on sinine (mittefluorestseeruv / mitteelujõuline rakk) ja redutseeritud vorm on roosa (fluorestseeruv / elujõuline rakk). Resasuriini redutseerimine resorufiiniks peegeldab rakkude elujõulisust [52].

Analüüsis jaotati rakud {{0}}süvendplaatidele eelnevalt määratletud tihedusega 0,3 × 1{{10}} kraadi rakku/ml HL-60 liini ja 0,7 × 10 rakku/ml HepG2 liini rakkude puhul. Ühendid lisati kaheksas kontsentratsioonis (80 kuni 0,62 uM), välja arvatud doksorubitsiin, mida kasutati kontsentratsioonides vahemikus 0,003 kuni 5 µM. Negatiivne kontroll sai sama koguse DMSO-d (0,025 protsenti). Plaate inkubeeriti 72 tundi ahjus 37 kraadi ja 5% CO2 juures. Pärast seda perioodi lisati 20 μl süvendi kohta Alamar Blue ja plaate inkubeeriti veel 4 tundi. Plaate loeti spektrofotomeetriga (Spectramax 190, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) lainepikkustel 570 ja 600 nm.

C6 rakkude elujõulisus määrati kolorimeetrilise meetodi abil, mida on kirjeldanud Hansen et al. [53]. MTT (3-4,5-dimetüültiasool-2-üül,25-difenüültetrasoolumbromiid) lahustati toas steriilses fosfaatpuhverdatud soolalahuses (PBS) kontsentratsioonil 5 mg/ml temperatuuril ja lahus steriliseeriti täiendavalt, lastes seda läbi 0.2-mm filtri ja säilitati 4 kraadi juures pimedas. Testis jaotati rakud 96-süvendiplaatidele C6 rakuliini jaoks etteantud tihedusega 3,5 × 10* rakku/ml. Ühendid lisati kaheksas kontsentratsioonis (80 kuni 0,39 uM).

Igasse süvendisse lisati MTT lõppkontsentratsiooniga 2 mg/ml ja rakke inkubeeriti 2 tundi. Pärast seda lüüsiti rakud 20% (w/ø) naatriumdodetsüülsulfaadi (SDS) ja 50% (o/ø) dimetüülformamiidi (DMF) lahusega (pH 4,7) üleöö toatemperatuuril [54,55] inkubeerides. . Neeldumist mõõdeti spektrofotomeetri mikroplaadilugejaga (570 nm), Thermo ScientificFlash Varioskan (versioon 3001, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Soome). Iga kontsentratsiooni jaoks kasutati kaheksat kordust. Rakkude elujõulisust väljendati neeldumise protsendina lainepikkusel 570 nm ja kontrolliks võeti 100 protsenti. Pärast töötlemist hinnati rakkude morfoloogiat valgusmikroskoopia abil optilise mikroskoobi abil (pöördmikroskoop Eclipse TS100, Nikon Instruments, Tokyo, Jaapan) ja pildistati digikaameraga (Coolpix S4300, Nikon Instruments, Tokyo, Jaapan).

3.5.5. Makrofaagide kultuur

Kõhukelme eksudaadi makrofaage (2 × 105 rakku süvendi kohta) inkubeeriti 96-süvendiga plaatidel DMEM söötmes, millele oli lisatud 10 protsenti PBS ja 50 ug/ml gentamütsiin, kolmes eksemplaris, stimuleeritud või mitte LPS-ga (500 ng/mL) ja IFN-y (5 ng/mL) ja töödeldud või mitte töödeldud erinevate ühendite kontsentratsioonidega (20,40 ja 80 uM). Rakke hoiti inkubaatoris 37 kraadi ja 5% CO2 juures 4 24 h. Pärast seda perioodi koguti kultuuri supernatandid tsütokiinide ja lämmastikoksiidi annuste määramiseks. Mõnedes testides asendati tsütotoksilisuse hindamiseks supernatant keskmise ja 10% Alamar Blue'iga (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ja plaadid. inkubeeriti veel 4 tundi. Spektrofotomeetri näit viidi läbi 570 ja 600 nm juures.

3.5.6. TNF annus

TNF mõõtmine viidi läbi rakukultuuri supernatantidest, kasutades sandwich ELISA tehnikat, kasutades Development System kitsDuoset ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MI, USA) vastavalt tootja soovitustele. ELISA plaadid (NUNC-IMMUNO PLATE Maxisorp Surface) sensibiliseeriti 50 μL/süvendi kohta püüdmisantikehaga kontsentratsioonis 2 ug/ml, lahjendati PBS-is 1x ja inkubeeriti 16 tundi 4 kraadi juures. Plaate pesti kolm korda 1 × PBS/0.05 protsenti Tween 20 ja blokeeriti 100 μL süvendi kohta 1 × PBS ja 0,05 protsenti Tween 20 ja 0,1 protsenti veise albumiiniga 2 tunni jooksul. .

Seejärel 50 μL süvendi kohta proove, tris-soolapuhvris (20 mM Trix aluses ja 150 mM NaCl) lahjendatud rekombinantide tühiproov ja standardkõver. Toatemperatuuril lisati 2 tunniks 0,1 protsenti veise albumiini ja 0,05 protsenti Tween 20. Standard lahjendati seeriaviisiliselt (1:2) algkontsentratsioonist 2000 pg/ml 11 korduva lahjendusega. Plaati pesti kolm korda PBS/0,05% Tweeniga ja inkubeeriti 50 µl tuvastamisantikehaga (biotinüülitud) kontsentratsioonis 400 ng/ml 2 tundi.

Plaati pesti kolm korda PBS/{0}},05% Tweeniga ja inkubeeriti 20 minutit avidiin-peroksidaasiga, mis oli lahjendatud 1:200. Arendus viidi läbi TMB substraadi (Thermo Fisher) lisamisega ja katkestati 0, 05 M fosforhappega. Reaktsiooni näit määrati spektrofotomeetriga (Spectramax) (Molecular Devices, San Jose, CA, USA) koos 450 nm filtriga. Analüüsid viidi läbi tarkvaraga Softmax 4.3.1 (Molecular Devices, San Jose, CA, USA).

3.5.7.Lämmastikoksiidi annustamine

Nitriti tootmist makrofaagide supernatantides hinnati selle oksüdatiivse produkti, nitriti, kvantifitseerimise kaudu Griessi meetodil [50]. Neeldumine määrati spektrofotomeetris (Spectramax) (Molecular Devices, San Jose, CA, USA) 570 nm filtriga. Analüüsid viidi läbi tarkvaraga Softmax Software 4.3.1 (Molecular Devices, San Jose, CA, USA) ja tulemused väljendati μM nitritis, mis põhines naatriumnitriti standardkõveral algkontsentratsiooniga 400 uM.

3.6. Statistiline analüüs

Uuringutes rühmadevaheliste võrdluste statistilise olulisuse määramiseks kasutati ühesuunalist ANOVA testi, millele järgnes Bonferroni mitmekordse võrdluse järeltest. Tulemusi peeti statistiliselt olulisteks, kui p<0.05. all="" analyses="" were="" performed="" using="" the="" graphpad="" prism="" version="" 5.01="" program="" (graphpad="" software,="" san="" diego,="" ca,="">

4. Järeldused

Kvertsetiini analoogide sünteesikeskkonna tingimused ja reaktsioonid näitasid kirjanduses kirjeldatud andmete kohaselt ühe nõuetekohaselt iseloomustatud ühendi saamisel tõhusust. Q ja Q5 antioksüdantse aktiivsuse võrdlev analüüs näitas, et kvertsetiin (O) oli ABTS* pluss radikaali eemaldamisel aktiivsem kui O5 (vastavalt 29 protsenti ja 18 protsenti). Vähenenud antioksüdantide potentsiaal ei näidanud sekkumist immunomoduleerivasse ja kasvajavastasesse toimesse. Selles uuringus pakutud keemilised modifikatsioonid suurendasid proliferatsioonivastast toimet ja säilitasid põletikuvastase aktiivsuse, kuid mitte tsütotoksilisuse aktiivsust tervetes testitud rakkudes.

Olemasolev atsetüülitud derivaat (Q5) parandas tsütotoksilisust vähi hepatotsellulaarsetes rakkudes (HepG2), promüelotsüütilise leukeemia (LH-60) rakkudes ja eriti glioomirakkudes (C6). Kaubeldavad roti glioomi C6 rakud näitasid morfoloogilist enneolematut rakusurma mustrit. Q5 kontsentratsioonis 50 μM 24 tunni jooksul kutsus esile muutused C6glioomi rakkude morfoloogias, mida iseloomustas ümar kehakuju (mida teaduskirjanduses ei kirjeldatud), erinevalt kvertsetiinist, millel oli fibroblastitaoline morfoloogia.

Kvertsetiini atsetüülitud derivaatide mõju paremaks mõistmiseks, eriti neuronaalsetes rakkudes, on vaja teha täiendavaid uuringuid. See uuring võimaldas esmakordselt kasutada struktuurselt modifitseeritud kvertsetiini närvirakkudes potentsiaalsete neuroprotektiivsete mõjude jaoks.

Viited

1. Formica, JV; Regelson, W. Ülevaade kvertsetiini ja sellega seotud bioflavonoidide bioloogiast. Food Chem. Toksikool. 1995, 33, 1061–1080. [CrossRef]

2. Materska, M. Kvertsetiin ja selle derivaadid: keemiline struktuur ja bioaktiivsus – ülevaade. Pol. J. Food Nutr. Sci. 2008, 58, 407–413.

3. Wang, TY; Li, Q.; Bi, KS Bioaktiivsed flavonoidid ravimtaimedes: struktuur, aktiivsus ja bioloogiline saatus. Asian J. Pharm. Sci. 2018, 13, 12–23. [CrossRef] [PubMed]

4. D'Andrea, G. Kvertsetiin: mitmekülgsete terapeutiliste rakendustega flflavonool? Fitoteraapia 2015, 106, 256–271. [CrossRef]

5. Araújo, MV; Queiroz, AC; Silva, JFM; Silva, AE; Silva, JKS; Silva, GR; Silva, ECO; Souza, ST; Fonseca, EJS; Camara, CA; et al. Flavonoidid kutsuvad esile rakusurma Leishmania amazonensis'es: in vitro iseloomustus voolutsütomeetria ja Ramani spektroskoopia abil. Analüütik 2019, 144, 5232–5244. [CrossRef] [PubMed]

6. Faixová, D.; Hrˇcková, G.; Kubašková, TM; Mudro ˇnová, D. Valitud isofllavoonide parasiitidevastane toime flflatworms'ile. Helmintoloogia 2021, 58, 1–16. [CrossRef]

7. Manjolin, LC; Reis, MBG; Maquiaveli, CC; Santos-Filho, OA; Silva, ER Toidu flavonoidid fisetiin, luteoliin ja nendest saadud ühendid inhibeerivad arginaasi, mis on Leishmania (Leishmania) amazonensis'e infektsiooni keskne ensüüm. Food Chem. 2013, 141, 2253–2262. [CrossRef]

8. Tasdemir, D.; Kaiser, M.; Brun, R.; Yardley, V.; Schmidt, TJ; Tosun, F.; Rüedi1, P. Flflavonoidide ja nende analoogide antitrüpanosomaalne ja antileishmaniaalne toime: In vitro, in vivo, struktuuri ja aktiivsuse seose ning kvantitatiivse struktuuri ja aktiivsuse seose uuringud. Antimikroobne. Agensid Chemother. 2006, 50, 1352–1364. [CrossRef] 9. Lee, WJ; Hsiao, M.; Chang, JL; Yang, SF; Tseng, TH; Chang, CW; Chow, JM; Lin, KH; Lin, YW; Liu, CC; et al. Kvertsetiin indutseerib mitokondriaalset apoptoosi reaktiivsete hapnikuliikide vahendatud ERK aktivatsiooni kaudu HL-60 leukeemiarakkudes ja ksenotransplantaadis. Arch. Toksikool. 2015, 89, 1103–1117. [CrossRef]

10. Drummond, EM; Harbourne, N.; Marete, E.; Martyn, D.; Jacquier, J.; O'Riordan, D.; Gibney, ER Põletikueelsete biomarkerite inhibeerimine THP1 makrofaagides kummeli, nurmenuku ja paju koorest saadud polüfenoolide poolt. Phytother Res. 2013, 27, 588–594. [CrossRef]