Sidt2 on autofagia-lüsosomaalse lagunemise raja võtmevalk ning oluline neeru struktuuri ja filtreerimisfunktsiooni säilitamiseks
Nov 07, 2023
Autofagia regulatsioon ja homöostaas on elundi morfoloogia ja funktsiooni säilitamiseks hädavajalikud. Lüsosomaalse membraanivalguna mõjubSidt2pealneeru struktuurjaneeru autofagiaon siiani teadmata. Selles uuringus leidsime, et neerudSidt2−/−hiirtel ilmnesid muutused basaalmembraani paksenemises, jala protsesside sulandumises ja mitokondriaalses turses, mis viitab sellele, etneeru struktuur on kahjustatud. Suurenenud uriini valgusisaldus 24 tunni pärast näitas, etneerufunktsioonsai ka kannatada. Samal ajal puudumineSidt2põhjustas happeliste lüsosoomide arvu vähenemist, happe hüdrolaasi aktiivsuse ja ekspressiooni vähenemist lüsosoomis ning pH tõusu lüsosoomides, mis viitab sellele, et lüsosoomi funktsioon oli pärastSidt2kustutamine. Autofagolüsosoomide kuhjumine, LC3-II ja P62 valgu taseme tõus ning P62 mRNA taseme langus näitasid, etSidt2geen põhjustas ebanormaalse autofagia rajafloh. Klorokiini eksperiment, immunoFluorestsentsi autofagosoom, lüsosoomi liitmise test ja Ad-mcherry-GFP-LC3B näitasid veel, et pärastSidt2deletsioon, autofagosoomide tootmine ei suurenenud, kuid autofagosoomide ja lüsosoomide liitmine ja autofagolüsosoomide lagunemine olid häiritud. InkubeerimiselSidt2−/−autofagia aktivaatori rapamütsiiniga rakke leidsime, et see võib aktiveerida autofagiat, mis väljendus autofagosoomide suurenemisena, kuid see ei suutnud parandada autofagolüsosoomide lagunemist. Vahepeal näitas see veelgi, etSidt2geen mängib olulist rolli autofagolüsosoomiprotsesside sujuvas kulgemises. Kokkuvõttes puudumineSidt2geen põhjustas lüsosoomi funktsiooni halvenemist ja happeliste lüsosoomide arvu vähenemist, mis viis autofagolüsosoomide moodustumise ja lagunemise häireteni, mis lõpuks väljendusidneerude ebanormaalne struktuur ja funktsioon. Sidt2on oluline lüsosoomide normaalse funktsiooni ja neerude füsioloogilise stabiilsuse säilitamiseks.
SISSEJUHATUS
Traditsiooniline seisukoht on, et lüsosoomid on rakkude prügilatest, et eemaldada rakkude tekitatud jäätmed [1–3]. Paljud uuringud on aga näidanud, et lüsosoomide roll on palju keerulisem ja võib hõlmata raku signaaliülekannet, kasvaja teket, arengut ja muid aspekte, mis mõjutavad keha elutegevust [4–10]. Lüsosoomid on tavaliselt rikastatud sellistes kudedes nagu maks ja neer [11]. Seetõttu on lüsosomaalne düsfunktsioon tihedalt seotud ka maksa ja neerude kudede haigustega, nagu Gaucheri tõbi [12], mukopolüsahharidoos [13], Niemann-Picki tõbi [14], hiline glomeruloskleroos [15], idiopaatiline membraanne nefropaatia [16]. jne. Lüsosoomi membraanivalgud (LMP-d) on membraani komponendid, mille funktsioon ei ole mitte ainult lüsosoomi terviklikkuse säilitamine, vaid mis osalevad ka erinevates aspektides, nagu rakusisene signaaliülekanne ja -regulatsioon, mis on olulised lüsosoomi funktsiooni säilitamiseks. ja raku elutegevused [17–19].
Praeguseks on avastatud üle 100 LMP-d, kuid enamiku nende funktsioonid on siiani teadmata [20]. Transmembraanne 7 superperekonna liige 1 (TM7SF1) on oluline neeru podotsüütide funktsiooni säilitamiseks [21] ja mängib olulist rolli neerude arengu protsessis [22]. Chloride Voltage-Gated Channel 5 (ClC-5) on neerutuubulites väljendatud kloriidioonide (Cl(−)) kanal, mis on neerutuubulite normaalseks toimimiseks hädavajalik [23]; kui see on muteerunud, võib see põhjustada Denti tõbe [24]. Chloride Voltage-Gated Channel 7 (ClC-7) üleekspressioon hoiab ära neerutuubulite epiteelirakkude apoptoosi, mis on põhjustatud redoks-reduktsioonihäiretest [25]. Need uuringud näitavad, et lüsosoomiga rikastatud neerukoe komponentidena on LMP-d normaalse funktsiooni säilitamiseks hädavajalikud, kuid nende patogeensuse konkreetne mehhanism on endiselt ebaselge.
SID1 transmembraanne perekond, liige 2 (Sidt2) on äsja avastatud LMP, mis ekspresseerub kõrgelt maksa- ja neerukudedes [26]. Varasemad uuringud on näidanud, et Sidt2 deletsioon võib põhjustada maksaga seotud haigusi, mis väljenduvad maksa steatoosi ja maksa lipiidide metabolismi häiretena [11, 18]. Hiljutises uuringus leidsime, et Sidt2-/-hiirte neerud said samuti kahju, kuid konkreetne mehhanism on ebaselge. Lüsosoomid on autofagia jaoks olulised täidesaatvad organid [10]. Kas autofagia reguleerimine on seotud? Selles uuringus uurisime lüsosomaalse funktsiooni (autofagia) ja haiguse vahelist seost ning uurisime Sidt2-ga seotud mehhanismi, mis põhjustab neerukahjustusi, mis on suureks abiks LMP ja haiguse vahelise seose uurimisel.
TULEMUSED
Sidt2−/− mudel näitab sedaneerukahjustuson seotud autofagolüsosoomide akumulatsiooniga
Sidt2-/- hiirte valmistamise meetod on näidatud joonisel 1A. Saadud homosügootne hiire saba DNA sekveneeriti ja sekveneerimise tulemus oli unimodaalne (joonis 1B) ning teises eksonis toimus 199 bp fragmendi kadu. PCR genotüübi tuvastamise abil leidsime, et Sidt2+/+ (metsikut tüüpi, WT) hiirtel oli 685 aluspaari DNA segmendid, samas kui Sidt2-/- hiirtel oli 486 aluspaari (joonis 1C). Nagu on näidatud joonisel. 1D, Sidt2 valku oli vaevalt võimalik tuvastada Sidt2 - / - hiirtel kui WT, mis viitas sellele, et mudel oli edukalt ehitatud. Uriinianalüüsiga leiti, et Sidt2-/- hiirtel oli 24-tunnise uriinivalgu sisaldus WT-ga võrreldes oluliselt suurenenud (joonis 1E), mis viitab sellele, et pärast Sidt2 kustutamist oli neerude filtreerimisbarjäär kahjustatud. Transmissioonelektronmikroskoopia vaatlused (joonis 1F) näitasid, et võrreldes WT hiirtega (a–f) ilmnesid Sidt2-/- hiire neerudes jalaprotsesside difuusne sulandumine, glomerulaarmembraani paksenemine (g, h), neerutorukeste epiteel. rakuturse, mikrovilli kahjustused (i, j), mitokondriaalne turse, vakuoolitaolised muutused ja selgroogude kadumine (k, l). Huvitaval kombel on Sidt2-/- hiirtel esinenud ka suur hulk autofagolüsosoomide akumulatsioone (näidatud punaste nooltega, m, n) ja nende arv oli oluliselt suurem kui kontrollil (joonis 1G). Rakutasandil leidsime, et Sidt2 oli oluline ka neerurakkude ellujäämiseks. Sidt2 geeni deletsioon põhjustab MPC5 ja SV40 MES 13 rakkude vähenenud proliferatsiooni ja suurenenud apoptoosi (täiendav joonis 1).
Sidt2 geeni deletsioon põhjustab muutusi happeliste lüsosoomide arvus ja funktsioonis hiire neerurakkudes
Rakumudelite saamiseks kasutati MPC5 ja SV40 MES 13 rakkude Sidt2 geeni väljatõrjumiseks Crispr-Cas9 tehnoloogiat. MRNA ja valgu taseme kontrollid (joonis 2-C) viidi läbi vastavalt qRT PCR ja Western blot abil, mis näitavad, et mudelid olid edukalt ehitatud. Lüsosoomide vahendatud lagunemissüsteem on autofagia lagunemise võtmeetapp. Kas Sidt2 väljalülitamine mõjutab asendamatu LMP-na lüsosoomiga seotud valkude ekspressioone? Mõõtsime peamist LMP lüsosoomiga seotud membraanivalku 1 (LAMP1). Tulemused näitasid, et LAMP1 ekspressioon vähenes pärast Sidt2 deletsiooni MPC5 ja SV40 MES 13 rakkudes (joonis 2D, E). Lisaks kasutasime LysoTrackerit happeliste lüsosoomide märgistamiseks ja leidsime, et happeliste lüsosoomide arv vähenes pärast Sidt2 deletsiooni mõlemat tüüpi rakkudes (joonis 2F, G). Seejärel mõõtsime lüsosomaalset katepsiin B (CTSB) ja leidsime, et hiire neerukoes (joonis 2H, I), MPC5 rakkudes (joonis 2J, K) ja SV40 MES 13 rakkudes (joonis 2L, M) olid ekspressioonid. CTSB sisaldus Sidt2-/- mudelites vähenes, mis näitab, et Sidt2 geeni kustutamisel vähenes proteolüütilise ensüümi aktiivsus lüsosoomides. Samamoodi vähenes oluliselt CTSB prekursori ekspressioon Sidt2-/- rühma kahte tüüpi rakkudes, mis näitab, et CTSB-d mõjutati ka pärast Sidt2 deletsiooni. Lisaks kasutasime LysoSensorit lüsosoomide happelise keskkonna tuvastamiseks. Mida madalam on fluorestsentsi intensiivsuse suhe, seda kõrgem on lüsosoomi pH väärtus. Tulemused näitasid, et pärast Sidt2 deletsiooni pH väärtus tõusis (joonis 2N, O) ja hapestumine oli ebanormaalne. Edasiseks uurimiseks, kas ülaltoodud lüsosomaalsed kõrvalekalded olid tingitud ebanormaalsest lüsosoomide arvust või ebanormaalsetest lüsosomaalsetest funktsioonidest, uurisime rakke elektronmikroskoopia abil (joonis 2P). Leidsime, et pärast Sidt2 deletsiooni primaarsete lüsosoomide arvus ja lüsosoomide koguarvus (kaasa arvatud primaarsed ja sekundaarsed lüsosoomid) ei ole ilmseid muutusi (joonis 2Q).
Neerude autofagia rada on pärast Sidt2 eemaldamist ebanormaalne
Nagu eespool mainitud, täheldati Sidt2 - / - hiirte neerurakkudes suurt hulka autofagolüsosoomide akumuleerumisi, mis viitab sellele, et autofagia rada oli ebanormaalne. Western blot analüüsi abil näidati, et LC3-fosfatidüületanoolamiini konjugaadi (LC3-II) ja sekvestosoomi 1 (P62) valgu tase Sidt2-/- neerudes suurenes oluliselt. hiirtel ja autofagiaga seotud valgu ekspressioonide suurenemine autofagiaga seotud 5 (Atg5), autofagiaga seotud 7 (Atg7) ja autofagiaga seotud 12 (Atg12) (joonis 3A, B). Kuid P62 mRNA tase langes oluliselt (joonis 3C), mis viitab sellele, et autofagia rada oli pärast Sidt2 in vivo elimineerimist ebanormaalne. Seejärel leidsime, et autofagia valkude LC3-II, P62, Atg5, Atg7 ja Atg12 ekspressioonid suurenesid ka kahes neerurakkude tüübis pärast Sidt2 deletsiooni (joonis 3D–G), mis oli ühtlane. koos in vivo. LC3-II suurenemine viitas autofagosoomide suurenemisele neerurakkudes pärast Sidt2 deletsiooni, mis võib olla põhjustatud autofagia aktiveerumisest või autofagosoomide blokeeritud lagunemisest. P62 immunofluorestsents (joonis 3H) näitas selgelt P62 sisalduse suurenemist Sidt2-/- rakkudes (joonis 3I). Vastupidiselt valgu tasemele näitas qRT-PCR, et P62 vähenes oluliselt mRNA tasemel (joonis 3J), mis näitab, et P62 suurenemine oli seotud ebapiisava lagunemisega. Atg5, Atg7 ja Atg12 suurenemine näitas, et autofagia algas ja kujunes normaalselt, kuid P62 kuhjumine viitas ka autofagia protsessi takistustele ja see vastuolu nõudis meilt autofagia voo tegeliku olukorra täiendavat uurimist.
In vitro näitab klorokiini kasutamine vähenenud autofagia voogu pärast Sidt2 kadu. Klorokiini katse on üks klassikalisi autofagia voo jälgimise katseid. Et mõista LC3-II ja P62 suurenemise põhjuseid pärast Sidt2 deletsiooni, kasutasime klorokviini (CQ), mis on autofagia allavoolu inhibiitor, et mõjutada rakke, et jälgida autofagia voogu. Esiteks kasutasime erinevaid kontsentratsioonigradiente, et kinnitada, et CQ poolt inhibeeritud küllastuskontsentratsioon oli MPC5 ja SV40 MES 13 rakkudes 50 μM (joonis 4-F). Lisaks sellele kontsentratsioonile, kui CQ kontsentratsioon jätkas suurenemist, ei suurenenud LC3-II ja P62 küllastumiseni. Seetõttu kasutasime autofagia voo täielikuks pärssimiseks 16 tunni jooksul 50 μM CQ stimulatsiooni ja sel ajal kadusid LC3-II erinevused Sidt2+/+ ja Sidt2−/− rühma vahel. MPC5 ja SV40 MES 13 rakud. Samamoodi kadusid pärast 50 μM CQ töötlemist ka Sidt2 kustutamisest põhjustatud P62 erinevused (joonis 4G, H, J, K). Autofagia voo statistika näitas, et see vähenes, kui Sidt2 puudus (joonis 4I, L), mis kinnitas veelgi, et LC3-}II ja P62 ekspressiooni suurenemine pärast Sidt2 deletsiooni oli tingitud autofagia kliirensi ebaõnnestumisest. pigem autofagia taseme tõus (autofagia aktiveerimine).
Autofagosoomi-lüsosoomi fusiooni katkemine in vitro pärast Sidt2 deletsiooni Kliirens ja lagunemine on autofagia protsessi keskmine ja hiline etapp, mis hõlmab autofagosoomi sulandumist vähenenud pärast Sidt2 deletsiooni (joonis 5D), mis näitab, et autofagosoomid ja lüsosoomid olid kahjustatud.
Joonis 1Neerukahjustusja autofagolüsosoomide akumuleerumine Sidt2-/- hiirtel. Cre-LoxP süsteemi geeni sihtimise skeem; B ülaltoodud on Sidt2 geeni väljalülitatud hiire saba DNA eksporditud järjestusskeem; allpool on sekveneerimiskaart, nool näitab puuduva geeni asukohta. Võrreldes WT hiirtega toimub eksonis 2 199 bp geenikadu; C Sidt2 DNA taseme kontrollimine (ekstraheeritud sabakoest). Praimeriga amplifitseeritud toode sisaldab baasi väljatõrjumise piirkonda, mis on näidatud kui Sidt2+ /+(WT), Sidt2+/− või Sidt2−/−; D-valgu taseme kontrollimine Sidt2 valgu ekspressioonitasemete tuvastamiseks Western blot meetodil; E-neeru 24 h uriinivalk WT ja Sidt2−/− hiirtel; WT-hiirte (a, f) ja Sidt2-/- hiirte (g-n) neerude ultra-mikromorfoloogiline struktuur. Võrreldes WT hiirega on Sidt2-/- hiire neerus jalaprotsesside sulandumine, basaalmembraani paksenemine (g, h), neerutorukeste epiteelirakkude turse, mikrovilli kahjustus (i, j), mitokondriaalne hävimine (k, l) ja autofagolüsosoomide kogunemine (m, n); G neeru autofagolüsosoomide koguarv WT ja Sidt2-/- hiirtel. *P < 0.05, **P < 0,01.
Joonis 3 Sidt2 deletsioon häirib autofagia rada. WT ja Sidt2-/- rakkude autofagiaga seotud valgu ekspressioonitasemete tuvastamine Western blot meetodil; Western blot testi tulemuste B statistilised diagrammid; C P62 mRNA ekspressioonitase WT ja Sidt2-/- hiirte neerukudedes; MPC5 raku autofagia raja valkude D ekspressioonitasemed enne ja pärast Sidt2 knockouti; (D) diagrammi E statistiline graafik; Autofagia raja valkude F ekspressioonitasemed SV40 MES 13 rakkudes enne ja pärast Sidt2 knockouti; G (F) diagrammi statistiline diagramm; H P62 immunofluorestsents MPC5 ja SV40 MES 13 rakkudes enne ja pärast Sidt2 knockouti; I immunofluorestsentsi tulemuste statistilised diagrammid; J P62 mRNA ekspressioonitasemed MPC5 ja SV40 MES 13 rakkudes enne ja pärast Sidt2 knockouti. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.
Ad-mCherry-GFP-
LC3B fluorestsentsi topeltmärgistamine viitab sellele, et autofagolüsosoomide moodustumine ja selle lagunemise rada blokeeriti pärast Sidt2 deletsiooni. Ad-mCherry-GFP-LC3B transfektsioonikatset saab kasutada dünaamilise autofagia voo muutuste tuvastamiseks rakkudes. Autofagia protsessi käigus koguneb mCherry-GFP-LC3B autofagosoomi membraanile ja avaldub fluorestsentsmikroskoobi all kollaste laikudena. Kui autofagosoomid ja lüsosoomid liidetakse autofagolüsosoomide moodustamiseks, kustutab lüsosoomi happeline keskkond GFP fluorestsentsi, nii et see avaldub punaste laikudena. Seetõttu saab LC3-ga seotud GFP-d kasutada ainult autofagosoomide tuvastamiseks, samas kui mCherry suudab samaaegselt tuvastada autofagosoome ja autofagolüsosoome. Kui rohelised ja punased fluorestsentslaigud kombineeritakse ja kuvatakse kollaste fluorestsentslaikidena, vastab see autofagosoomidele. Sel ajal võib punane fluorestsents viidata autofagolüsosoomidele ja samuti võib see näidata autofagolüsosoomide moodustumise sujuvust [27]. MPC5 rakud ja SV40 MES 13 rakud nii Sidt2+/+ kui ka Sidt2−/− rühmades transfekteeriti Ad-mCherry GFP-LC3B adenoviirusega ja pildistati konfokaalse lasermikroskoobiga (joonis 6A). Leiti, et pärast Sidt2 deletsiooni suurenes kollaste fluorestseeruvate punktide arv ja vähenes punaste fluorestseeruvate punktide arv (joonis 6B, C), mis näitas, et Sidt2-/- rühmas autofagosoomide arv suurenes ja autofagolüsosoomid vähenesid. Selle põhjuseks on asjaolu, et autofagolüsosoomide moodustumisel esines takistusi ja autofagolüsosoomi lagunemisrajad olid blokeeritud, mis viis autofagosoomi lagunemise takistusteni.
Rapamütsiin ei parandanud Sidt2 deletsioonist põhjustatud P62 akumulatsiooni, vaid pigem süvendas seda. Rapamütsiin (RAPA) on mTOR-i inhibiitor ja aktiveerib autofagiat. Kui RAPA toimis Sidt2+/+ ja Sidt2−/− rühmade MPC5 ja SV40 MES 13 rakkudele, suurendas see LC3-II kogust mõlemas rühmas. See tähendas, et RAPA võib aktiveerida autofagia ülesvoolu. Samamoodi avastasime, et LC3-II taseme tõus RAPA-ga Sidt2−/− rühmas oli ilmsem kui kontrollrühmas (Sidt2+/+ rühm), mis näitab, et kui RAPA tegutses Sidt2−/− rühmas ei paranenud autofagosoomide lagunemine ikka veel. Vahepeal jälgisime ka muutusi P62-s ja leidsime, et kui RAPA toimis MPC5 ja SV40 MES 13 rakkude Sidt2+/+ rühmale, ei muutunud P62 oluliselt, mis näitab, et autofagia voog oli normaalne. Kui RAPA toimis Sidt2-/- rühmale, suurenes P62 ekspressioonitase veelgi võrreldes sellega, mis oli enne manustamist, ja oli ka selgem kui kontrollrühmas pärast RAPA-ravi (joonis 7A, B, D, E). Seejärel, et uurida P62 valgu ebajärjekindla ekspressiooni põhjuseid pärast Sidt2+/+ ja Sidt2−/− rühma ravi RAPA-ga, mõõtsime P62 mRNA taset ja leidsime, et tase tõusis. pärast RAPA-ravi nii rühmades Sidt2+/+ kui ka Sidt2−/− ning Sidt2+/+ rühmas oli tase kõrgem kui Sidt2−/− rühmas (joonis 7C). , F), mis võib veelgi tõestada, et autofagia voog oli Sidt2+/+ rühmas sujuv, samas kui autofagia vooluhäire tekkis autofagia lõpus Sidt2−/− rühmas, st autofagolüsosoomide lagunemine. link. Samuti uurisime Sidt2 mõju neerurakkude proliferatsioonile ja apoptoosile aktiveeritud autofagia tingimustes ning leidsime, et pärast seerumivaba söötme poolt indutseeritud autofagia rakuaktivatsiooni, võrreldes kontrollrühmaga, vohas Sidt2-/- rühma inhibeeriti veelgi ja apoptoos oli ilmsem (täiendav joonis 2).
Joonis fig 5 Autofagosoomi ja lüsosoomi sulandumist takistatakse pärast Sidt2 deletsiooni. LC3B ja LAMP1 immunofluorestsents-kolokaliseerimine MPC5 ja SV40 MES 13 rakkudes enne ja pärast Sidt2 väljalülitamist, analüüs Pearsoni korrelatsioonikoefitsiendiga; LC3B fluorestsentspunktide B võrdlus enne ja pärast Sidt2 väljalülitamist MPC5 ja SV40 MES 13 rakkudes; Pearsoni korrelatsioonikordaja C võrdlus enne ja pärast Sidt2 väljatõrjumist MPC5 ja SV40 MES 13 rakkudes; D liitumiskiiruse võrdlus enne ja pärast Sidt2 väljatõrjumist MPC5 ja SV40 MES 13 rakkudes (LAMP1 ja LC3B samaaegselt paiknevate fluorestseeruvate täppide arvu suhe LAMP1 fluorestseeruvate täppide arvusse); *P < 0,05, **P < 0,01.
Wecistanche'i tugiteenus - Hiina suurim tsistanšeksportija:
E-post:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel:+86 15292862950
Lisateabe saamiseks ostke:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
