Taimse aine akteosiidi selektiivne tsütotoksilisus kasvajarakkude vastu ja selle mehaanilised arusaamad

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Christina Cheimonidi jt

ABSTRAKTNE

Looduslikke tooteid iseloomustab äärmuslik struktuurne mitmekesisus ja seega on need ainulaadsed allikad uudsete kasvajavastaste ainete tuvastamiseks. Siin teatame, et taimne aineakteosiidLippia citriodora lehtedest täiustatud fütokeemiliste meetoditega eraldamisel ilmnes suurenenud tsütotoksilisus metastaatiliste kasvajarakkude suhtes; toimis sünergias erinevate tsütotoksiliste ainete ja sensibiliseeritud kemoresistentsete vähirakkudega.Akteosiidei olnud füsioloogilises rakulises kontekstis toksiline, samas suurendas see oksüdatiivset koormust, mõjutas proteostaatiliste moodulite aktiivsust ja pärssis kasvaja rakuliinides maatriksi metalloproteinaase. Intraperitoneaalne või suukaudne (joogivee kaudu) akteosiidi manustamine melanoomi hiiremudelil suurendas kasvajate antioksüdantseid vastuseid; siiski pärssis ainult intraperitoneaalne manustamine kasvaja kasvu ja kutsus esile kasvajavastaseid reaktiivseid immuunvastuseid. Massispektromeetria identifitseerimise/kvantitatsiooni analüüsid näitasid, et intraperitoneaalne manustamineakteosiidSelle tulemuseks oli oluliselt kõrgem, võrreldes suukaudse manustamisega, ühendi kontsentratsioon ravitud hiirte plasmas ja kasvajates, mis viitab sellele, et selle in vivo kasvajavastane toime sõltub manustamisviisist ja saavutatud kontsentratsioonist kasvajas. Lõpuks näitasid seda molekulaarse modelleerimise uuringud ja ensümaatilise aktiivsuse testidakteosiidinhibeerib proteiinkinaasi C. Kokkuvõttes on akteosiidil paljutõotav keemiline tugi uute kasvajavastaste ainete väljatöötamisel.

Märksõnad:Akteosiid, Vähk, Looduslik ühend, Oksüdatiivne stress, Proteostaas, Immunomodulatsioon

cistanche akteosiid

1. Sissejuhatus

Kantserogeneesi iseloomustab mitmete raku signaaliülekanderadade dereguleerimine ja see on seotud suurenenud raku oksüdatiivse, replikatiivse, metaboolse, genotoksilise ja proteotoksilise stressiga [1]. Nende stressifenotüüpide kohanemiseks ja ületamiseks reguleerivad pahaloomulised rakud (peale onkogeenide) mitut mitte-onkogeenset rada, mille eesmärk on kas alla suruda või (vähemalt) leevendada jätkuvat stressi. Erinevate mitte-onkogeensete radade hulgas, mida tuumorigeneesi ajal sageli ülesreguleeritakse, on proteostaasivõrgu (PN) moodulid koos raku antioksüdantide vastustega [2, 3].

PN põhikomponendid on kaks peamist lagunemismasinat, nimelt autofagia-lüsosoomi rada (ALP) ja ubikvitiini-proteasoomi rada (UPP), koos rakuliste molekulaarsete chaperonide võrgustikuga. ALP osaleb peamiselt valguagregaatide ja kahjustatud organellide lagunemises [4], samas kui UPP lagundab normaalseid lühiealisi valke ja parandamatuid valesti volditud või voltimata valke [5–8]. 26Seukarüootne proteasoom koosneb 19S reguleerivatest osakestest (RP) ja 20 Score osakestest (CP); viimane koosneb neljast virnastatud heptameerist rõngast (kaks -tüüpi ümbritsevad kahte -tüüpi), mis moodustavad tünnilaadse struktuuri. Kümotrüpsiinitaoline (CT-L), trüpsiinitaoline (TL) ja kaspaasitaoline (CL) proteasoomi peptidaasi aktiivsus paikneb vastavalt 5, 2 ja 1 proteasoomi subühikus [6]. Proteasoomi inhibiitorite Bortesomiibi (Velcade®; nimega PS-341) ja Carfifilzomib'i tõestatud kliiniline efektiivsus erinevate hematoloogiliste pahaloomuliste kasvajate vastu [9] on andnud "kontseptsiooni tõestuse" UPP-le kui paljulubavale strateegiale. vähi ravi. Raku antioksüdantide kaitseradade kompleksne võrgustik, mida kantserogeneesi ajal sageli ülesreguleeritakse [3,10], sisaldab antioksüdantseid ensüüme, aga ka mitmeid transkriptsioonifaktoreid, mis mobiliseerivad tsütoprotektiivseid genoomseid vastuseid; nende hulka kuuluvad kahvlipea kast O (Foxo) ja tuumafaktoriga erütroid 2-seotud faktor (Nrf-2). Nrf-2 on kesksel kohal rakkude kaitsmisel oksüdatiivsete ja/või ksenobiootiliste kahjustuste eest, kuna see stimuleerib antioksüdantide ja II faasi geenide ekspressiooni [11-13].

Meie ja teised tegime hiljuti ettepaneku, et nende kasvajasõltuvuste (st proteostaatiliste moodulite ja/või antioksüdantide vastuse radade) sihtimine või ROS-i raku taseme tõstmine transformeeritud genotüübi kontekstis pakub potentsiaalset terapeutilist akent kasvajarakkude selektiivseks tapmiseks [3 ,14]; toetuseks on teatatud vähirakkude selektiivsest surmamisest väikese molekuli poolt, mis suurendas raku ROS-i taset [2]. Eeldatakse, et kombinatoorsed lähenemisviisid, mis hõlmavad ka kasvajavastaste immuunvastuste [15] aktiveerimist, suurendavad tõenäoliselt PN-i ja antioksüdantide vastuste inhibeerimise ja/või raku ROS-i taseme tõstmise kaudu pakutavat terapeutilist akent.

Erinevatest allikatest (taimed, mereorganismid, mikroorganismid jne) pärinevaid looduslikke tooteid (ekstrakte või puhtaid ühendeid) (NP-d) uuritakse nende äärmise struktuurilise mitmekesisuse ja keemilise keerukuse tõttu, et kontrollida nende võimet toimida kasvajavastaste ainetena. nad toimivad pleiotroopselt, moduleerides mitut raku signaaliülekande rada [16]. Väidetavalt aktiveerivad NP-d põletikuvastaseid, kasvajavastaseid ja/või metastaseerumisvastaseid reaktsioone [16,17] ning väldivad ka mitme ravimiresistentsust [18,19]. Nende hulgas on fenoolsed ühendid (sealhulgas fenüületanoidglükosiidid) äratanud märkimisväärset huvi nende teatatud rolli tõttu erinevate inimeste haiguste ennetamisel ja/või ravis.

Akteosiid, mida nimetatakse ka kasutuseks või verbaskosiidiks [20], on paljudest kaheidulehtedest eraldatud fenüületanoidglükosiid. Väidetavalt avaldab akteosiidil mõningaid huvitavaid bioloogilisi toimeid, sealhulgas antioksüdantseid, põletikuvastaseid ja raku apoptoosi reguleerivaid omadusi [21,22]. Sellegipoolest ei ole selle võimalikku kasvajavastast toimet käsitletud. Siin teatame, et akteosiidil ilmnes suurenenud tsütotoksilisus imetajate vähirakkude suhtes, ilma et füsioloogilises rakulises kontekstis ilmnes ilmne toksiline toime. Lisaks pärssis akteosiid melanoomi kasvaja kasvu Vivo hiiremudelis, aktiveerides (muu hulgas) kasvajavastaseid reaktiivseid immuunvastuseid.

mõjudcistanche akteosiid

2. Materjalid ja meetodid

2.1. Taimne materjal ja ekstraheerimine

kuivatatud Lippia citriodora (Lamiaceae) lehti (4,5 kg) osteti Kreekast Ateenast kohalikult turult. Lehed pulbristati ja ekstraheeriti mehaanilise segamisega 12 tundi metanooliga (2 × 20 L). Metanooliekstrakt aurustati kuivaks ja pesti CH2Cl2/MeOH 98/2 (15 L) seguga. Lahustumatu jääk eraldati ja kuivatati, saades rohekaskollase pulbri (450 g).

2.2. Akteosiidi puhastamine ja UPLC-HRMS analüüs

Osa (10 g) ülalnimetatud jäägist allutati vastuvoolukromatograafiale, kasutades kiirtsentrifugaaljaotuskromatograafia (FCPC) aparaati (Kromaton, Prantsusmaa); kahefaasilise lahustisüsteemina kasutati EtOAc/EtOH/H2O segu vahekorras 5/0,5/4,5. Kogutud fraktsioonid allutati õhukese kihi kromatograafiale; seejärel vaadeldi kromatogramme UV-lambi all (254 ja 365 nm) ja visualiseeriti metanoolvanilliinsulfaadiga pihustamisega, millele järgnes kuumutamine kaks minutit. Ülalmainitud protsessiga eraldati kokku 2,1 g akteosiidi (puhtus 90 protsenti või suurem). Akteosiidi identifitseerimine viidi läbi tuumamagnetresonantsi (NMR) ja massispektromeetria (MS) spektrite abil, samas kui selle puhtus määrati kindlaks UPLC-MS ja NMR analüüsiga; üksikasju vt Suppl. Materjalid ja meetodid.

2.3. Rakuliinid

Inimese kopsuembrüonaalsed fibroblastid (IMR90 rakud) koos hiire rakuliinidega B16.F1, B16.F10, YAC-1 ja WEHI-164 saadi American Tissue Culture Collectionist (ATCC). U2 OS ja Sa OS inimese osteosarkoomi rakuliinid annetas lahkelt prof V. Gorgoulis (Meditsiinikool, Ateena Riiklik ja Kapodistri ülikool, Kreeka), samas kui KH OS osteosarkoomi rakud ja kemoresistentsed osteosarkoomi rakuliinid [23] dr E. Gonose (National Hellenic Research Foundation, Kreeka) annetus. Hiire vähi rakuliinid C5N ja A5 kuuluvad mitmeastmelise hiire naha kantserogeneesi mudelisse [24,25] ja need annetas prof A. Balmain (Comprehensive Cancer Center, California Ülikool, USA). Kasutatud rakuliinide kultiveerimistingimused on esitatud väljaandes Suppl. Materjalid ja meetodid.

kasucistanche akteosiid

2.4. Melanoomi hiiremudel isane

C57BL/6 hiired (25–30 g kaaluga, 6–8 nädala vanused) saadi Hellenic Pasteuri Instituudist ja neid hoiti kontrollitud temperatuuril (22 kraadi) ja valgusperioodil (12 tundi valgust: 12 tundi pimedas). ), millel on vaba juurdepääs veele ja toidule. Hiirtele inokuleeriti subkutaanselt 105 B16.F1 melanoomi rakku (100 µl PBS-is) ja need jaotati juhuslikult 3 rühma (n=5/rühm). Kui kasvajad muutusid palpeeritavaks (11. päev), said hiired akteosiidi kahel viisil; kas intraperitoneaalselt (IP) (1 mg hiire kohta lahjendatuna 200 μL PBS-is; kokku 6 annust, mida manustatakse ülepäeviti) või suu kaudu joogiveega (OR) (2,5 mg hiire kohta; kokku 13 annust 13 järjestikusel päeval). Kontrollhiirtele manustati PBS-i. Kasvaja kasv registreeriti iga 2 päeva järel, mõõtes digitaalse nihikuga moodustunud kasvajate suuremat ja väiksemat telge. Mõõtmised muudeti kasvaja mahuks, kasutades valemit: kasvaja maht (cm3)=suurtelg × väiketelg2 × 0,5. 28. päeval loomad surmati emakakaela dislokatsiooniga ja põrnad eemaldati aseptiliselt. Katset korrati kolm korda sarnaste tulemustega.

Splenotsüüdid eraldati individuaalselt homogeniseeritud põrnadest ja testiti kohe nende tsütotoksilisuse suhtes võrreldes raku sihtmärkidega B16.F1, YAC-1 ja WEHI-164. Tsütotoksilisust hinnati efektorrakkude degranulatsiooni tulemusena rakupinnal CD107 kokkupuute tuvastamise põhjal. Splenotsüüte (105 rakku süvendi kohta) kultiveeriti koos sihtmärkidega 96-süvendi U põhjaga mikroplaatidel efektori ja sihtmärgi (E:T) suhtega 100:1, temperatuuril 37 kraadi 5% CO2 atmosfääris. Igasse süvendisse lisati FITC-konjugeeritud CD107a- ja CD107b-vastased monoklonaalsed antikehad (25 μL/ml) ja monensiin (6 μL/mL; kõik firmalt BD Biosciences). Rakud koguti 6 tundi hiljem ja analüüsiti FACSCanto II voolutsütomeetriga. Paralleelselt lõigati kasvajad välja ja töödeldi allavoolu analüüside jaoks, nagu on kirjeldatud Suppl. Materjalid ja meetodid.

cistanche akteosiid