Rapamütsiin muudab alternatiivselt mitokondriaalset dünaamikat dendriitrakkudes, et vähendada neeru isheemilist reperfusioonikahjustust
Feb 22, 2022
Abstraktne:Dendriitrakud (DC-d) on ainulaadsed immuunrakud, mis suudavad siduda kaasasündinud ja adaptiivseid immuunvastuseid ning immuunmetabolism mõjutab oluliselt nende fenotüüpi. Rapamütsiin on makroliidühend, millel on immunosupressiivsed funktsioonid ja mida kasutatakse siiriku kadumise vältimiseks neerusiirdamisel. Käesolevas uuringus hinnati ex vivo rapamütsiiniga töödeldud DC-de terapeutilist potentsiaali kaitstaneerudakuutse hiiremudelisneerukahjustus (AKI). Rapamütsiini ühekordse (S) töötlemise (Rapa-S-DC) puhul töödeldi Veh-DC-sid rapamütsiiniga (10 ng / ml) 1 tund enne LPS-i. Seevastu rapamütsiini mitmekordse (M) raviga (Rapa-M-DC) tehti 3 ravi 7 päeva jooksul. Ainult mitmekordne DC-de ex vivo rapamütsiinravi kutsus esile mitokondriaalse metabolismi püsiva ümberprogrammeerimise. Nendel DC-del oli 18-korda rohkem mitokondreid, peaaegu 4- korda suurem hapnikutarbimise määr ja need tootsid rohkem ATP-d võrreldes Veh-DC-dega (Veh-ga töödeldud kontroll-DC-d). Raja analüüs näitas, et IL10 signaaliülekanne on pärast Rapamycin-ravi muutunud immunofenotüübi peamist soodustavat rada võrreldes oluliselt madalamate tsütokiinide Tnfa, Il1b ja Il6 kandjaga, samal ajal kui mitokondriaalse sisalduse Pgc1a, Tfam ja Ho1 regulaatorid jäid kõrgemaks. Kriitiline on rapamütsiiniga töödeldud DC-de adoptiivne ülekandmine WT-retsipientidele 24 tundi enne kahepoolsetneerudisheemia kaitses oluliseltneerudvigastusest, mille paranemine on märkimisväärne 3-kordaneerufunktsioon. Lõpuks kaitses osaliselt ka suuremat mitokondrite arvu sisaldavate DC-de infusioon (töödeldi ex vivo tervete isoleeritud mitokondritega (10 µg/ml) üks päev varem)neerudIRI-st. Need uuringud näitavad, et suurema mitokondrite sisaldusega ex vivo ümberprogrammeeritud DC-de ennetav infusioon omab terapeutilist võimet indutseerida põletikuvastast regulatiivset fenotüüpi, et kaitsta.neerudvigastusest.
Märksõnad:dendriitrakk; rapamütsiin; mitokondrid; äge neerukahjustus; isheemiline reperfusioonikahjustus
SissejuhatusÄgeda haiguse patobioloogianeerukahjustuson mitmefaktoriline ja hõlmab keerulisi koostoimeidneeru-parenhüümirakud ja immuunrakud [1,2]. Aastalneerud,tavalised dendriitrakud (DC-d) on peamine immuunrakkude alamhulk ja neid leidub tihedalt interstitsiaalses ruumis koguneerud[3–5]. DC-d on üks peamisi kaasasündinud immuunsusega seotud rakutüüpe ja on olulised patogeenide eest kaitsmiseks. Meie varem avaldatud töö luuüdist pärinevate DC-de kasutamisega on näidanud, et DC-ravi võib reguleerida erinevaid AKI-ga seotud kaasasündinud ja adaptiivseid immuunvastuseid [6, 7].
DC-d paiknevad laialdaselt kõigis kudedes, DC-de alamhulk (CD11c pluss DC-d) asubneeru-parenhüüm. Kuid need CD11c pluss DC-d mängivad halvenemisel ka patogeenset rollineerukahjustuspärast isheemia-reperfusioonikahjustust (IRI) [8]. IRI on defineeritud kui vigastus, mis tuleneb hapnikuga küllastunud vere taasjuhtimisest elundisse pärast isheemiaperioodi ning seda esineb sageli müokardiinfarkti, insuldi ja tahke elundi siirdamise korral. Vastuseks IRI-le moodustavad CD11c ja DC-d märkimisväärse osa põletikuliste rakkude infifiltraadist.neeru-pabertaskurätik.
DC-d on võimelised ära tundma patogeeniga seotud molekulaarseid mustreid (PAMP) erinevate mustrituvastusretseptorite kaudu, mis asuvad DC-de pinnal, nagu näiteks teemaksulaadsed retseptorid (TLR) ja NOD-sarnased retseptorid. Mustrituvastusretseptorite (PRR-ide) seondumine nende spetsiifiliste PAMP-idega põhjustab mitmete radade aktiveerimist, sealhulgas põletikueelseid reaktsioone, antimikroobsete peptiidide sünteesi ja lümfotsüütide poolt vahendatud adaptiivse immuunsuse esilekutsumist [9]. Märkimisväärseid uuringuid on pühendatud DC-de rakulise bioenergeetika muutuste uurimisele PAMP-de aktiveerimisel. On kindlaks tehtud, et DC-de aktiveerimine lipopolüsahhariidiga (LPS; PAMP, mis erineb gramnegatiivsetest bakteritest) selle spetsiifilise retseptoriga TLR4 seondumise kaudu põhjustab metaboolse muutuse väga tõhusast oksüdatiivsest fosforüülimisest protsessiks, mis on väga sarnane Warburgi metabolismile ehk aeroobsele glükolüüsile. . Warburgi metabolismi iseloomustab glükolüüsist tekkiva püruvaadi suunamine laktaadiks muundamisele energia tootmiseks ja transpordist mitokondritesse, et läbida TCA tsükli kaudu katabolism, hoolimata piisavast hapniku kättesaadavusest. Selle nähtuse üks seletus hõlmab ühte paljudest TLR4 aktiveerimise allavoolu mõjudest, milleks on rapamütsiini (mTOR) imetajate sihtmärgiks oleva seriini/treoniini kinaasi suurenenud aktiivsus. mTOR-i inhibeerimine rapamütsiini poolt säilitab mitokondriaalse funktsiooni aktiveeritud DC-des, vähendades iNOS-i, kusjuures rapamütsiiniga töödeldud DC-sid stimuleeritakse LPS-i juuresolekul, millel on vähenenud aeroobse glükolüüsi tase [10]. mTORC1 inhibiitoreid, nagu rapamütsiini, kasutatakse praegu tahkete elundite siirdamisel võimaliku alternatiivina kaltsineuriini inhibiitoritele, et vältida kroonilisi haigusi.neeru-allotransplantaadi kahjustus, kuna sellel on ka potentsiaal CD4 pluss CD25 pluss regulatoorsete T-rakkude laienemiseks [11,12]. Siiski võib rapamütsiini kasutamine siirdamisel põhjustada põletikulisi tüsistusi, sealhulgas perifeerset turset, kreatiniini taseme tõusu ja trombotsütopeeniat. Varasemad uuringud on näidanud, et LPS-i kokkupuude suurendab hüpoksiliste stiimulite kahjulikku mõju ja rapamütsiin nõrgestab [8, 13].
Eesmärk on välja töötada meetodid FDA poolt heaks kiidetud kliinilise klassi ravimite (nt Rapamycin) kasutamiseks, et kutsuda esile regulatiivseid DC-sid, mis suudavad kontrollida soovimatuid kaasasündinud ja adaptiivseid immuunvastuseid. Selle uuringu eesmärk oli määrata rapamütsiiniga stimuleeritud BMDC-de potentsiaalne kaitsemehhanism(id) prekliinilises hiiremudelis.neerudIRI. BMDC-de ex vivo ravi rapamütsiiniga väldib süsteemsete ravimite süstimisega seotud kahjulikke kõrvalmõjusid ja põletikulisi tüsistusi. Enamiku farmakoloogiliste ühendite või ravimite optimaalne annus ja ajastus sõltuvad erinevatest parameetritest. Vähirakkudes inhibeerib rapamütsiini väike annus võrreldes suurte annustega erinevalt mTORC1 ja mTORC2, mille tulemuseks on rakutsükli progresseerumise osaline või täielik inhibeerimine [14]. Kõigi meie ex vivo BMDC-de konditsioneerimisuuringute jaoks praeguses käsikirjas valisime rapamütsiini madala annuse 10 ng / ml, tuginedes varem teatatud uuringutele tolerogeensete BMDC-dega [15, 16]. Mitme annuse (kolm või üks) ajastus põhines meie varem avaldatud tööl hiire BMDC-de paljundamisega ja lisati GMCSF-iga [17, 18]. Meie praegused andmed näitavad, et nii ühe- kui ka mitmekordne DC-de töötlemine rapamütsiiniga kutsub pärast LPS-i stimuleerimist esile vähem tugevaid immunogeenseid vastuseid (madalamad tsütokiinid ja kaasstimuleerivad molekulid). Kas ühe või mitme rapamütsiiniga töödeldud DC-de ülekandmine kaitseb võrdseltneerudIRI-st IRI süngeensetes (C57BL/6 BMDC → C57BL/6 hiired) või allogeensetes (BALB/c BMDC → C57BL/6 hiired) mudelites. Kuid mitmekordne ex vivo ravi rapamütsiiniga (3 ravi 7 päeva jooksul) suurendas lisaks immunogeensete reaktsioonide vähendamisele ka mitokondrite arvu ja funktsiooni (Seahorse Analyzer) võrreldes kandjaga töödeldud DC-dega. Need eksperimentaalsed tähelepanekud viitavad sellele, et suurema mitokondrite arvuga DC-d võivad muutuda reguleerivaks ja nende DC-de ülekandmine võib kaitstaneerudisheemilisest vigastusest. Nagu meie hiljutine uuring, milles kasutati FTY720-ga töödeldud DC-sid, näitas [18], põhjustavad farmakoloogilised või mitokondriaalsed siirdamised, mis kutsuvad esile suurema mitokondrite arvu immuunrakkudes (DC-d või makrofaagid), nendel rakkudel põletikuvastase fenotüübi, mis võib olla tingitud mitokondrite säilimisest. oksüdatiivne fosforüülimine (OXPHOS) ja vähendatud üleminekuga glükolüüsile energia saamiseks pärast stimuleerimist. Nende mõjude jaoks suurendasime eksogeenselt mitokondrite arvu DC-des, et testida, kas mitokondrite suurem arv võib mitokondriaalseid siirdamist kasutades esile kutsuda regulatiivse fenotüübi. Nende Mito-DC-de ülekandmine on kaitstudneerudIRI-st; erinevalt Rapa-DC-dest ei ole neil Mito-DC-del pärast LPS-i stimuleerimist vähenenud immunogeensed vastused (MHCII, kaasstimuleerivad molekulid ja tsütokiinid), mis võib viidata sellele, et mitokondrite koopiaarvu suurenemine võib alistada eksogeense LPS-i stimulatsiooni poolt põhjustatud funktsionaalsed muutused. Selles uuringus ja nagu varem näidatud [6, 7, 18], leitakse pool miljonit süsteemselt süstitud DC-d (vehiikuliga, rapamütsiiniga või mitokondritega töödeldud) valdavalt ainult põrnas ja signaali ei leita vähe või üldse mitte. aastalneerud. Põrnas, nagu FTY{0}}DC-d, võivad rapamütsiini ja mitokondriterikkad DC-d esile kutsuda põletikuvastase reaktsiooni, mille tulemuseks on kaitseneerudIRI. Need seemnelised leiud pakuvad uudseid tõendeid, mis viitavad sellele, et mitokondrite arvu suurendamine (eksogeenselt mitokondriaalse siirdamise või farmakoloogilise sekkumise (FTY720 või rapamütsiin) kaudu) immuunrakkudes võib olla uus terapeutiline moodus, et lõpuks reguleerida nende immunoloogilisi reaktsioone ennetamiseks ja/või varajaseks raviks.neerukahjustus.
Materjalid ja meetodid
HiiredKõik loomadega seotud protseduurid ja käitlemine viidi läbi kooskõlas riiklike terviseinstituutide laboriloomade hooldamise ja kasutamise juhendiga ning Bajwa UTHSC protokolli number, 18-080, kinnitamise kuupäev 28.09.2018, kiideti heaks Ameerika Ühendriikide ülikoolis. Tennessee terviseteaduste keskuse (UTHSC) institutsionaalsed loomade hooldamise ja kasutamise komiteed. Laboratoorsete loomade hooldamise eeskirjad järgivad rahvatervise teenuste humaanse hooldamise ja laboriloomade kasutamise poliitikat. Kõik tulemused esitatakse viisil, mis on kooskõlas ARRIVE'i juhistega [19]. Kõigi ülekandeuuringute jaoks osteti C57BL/6J ja BALB/c hiired firmast The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA). Hiiri peeti tavalistes vivaariumi korpustes 12-tunnise valguse/pimeduse tsükliga chow dieedil ja vesi oli vabalt saadaval.
Neeruisheemia-reperfusioonikahjustus Kõiki üksikasjalikke kirurgilisi protseduure järgiti nagu varem teatatud [18]. C57BL/6 isastel hiirtel (vanused 8–12 nädalat) tehti 26-min kahepoolne isheemia, millele järgnes 20–24-tunnine reperfusioon. Lühidalt, kõik isased hiired anesteseeriti ketamiini ja ksülasiini segu intraperitoneaalse (ip) süstimisega, buprenorfiini subkutaanse süstiga ja asetati soojale padjale, et hoida kehatemperatuuri 34,5–36 °C. Seejärel randomiseeriti hiired vale- või IRI-operatsiooni seisundisse. Tehti kahepoolne flflank sisselõige. Kehatemperatuuri kontrolliti ja hoiti kogu isheemilise perioodi vältel. Shamopereeritud hiirtel tehti sama protseduur, välja arvatud veresoonte kinnitamine ja kirurgiliste haavade sulgemine. Hiired, kellel oli üksneerudilma reperfusioonita 24 tundi pärast isheemiat, jäeti kogu analüüsist välja.
Neerufunktsiooni hindamine ja histoloogiaVeri koguti anesteesia all retroorbitaalsest siinusest ja plasma kreatiniin (mg/dL) määrati ensümaatilise meetodi abil, mille tootja protokolli (Diazyme Laboratories, Poway, CA, USA) tehti väiksemaid muudatusi, ja vere uriini lämmastiku (BUN) abil. ) ja kreatiniini mõõtmiseks kasutati QuantiChrom Urea Assay komplekti (DIUR-100, BioAssay Systems, Hayward, CA, USA), nagu eelnevalt kirjeldatud [18,20]. histoloogia jaoksneerudfikseeriti üleöö 4% PLP-s või 10% formaliinis ja sisestati parafiini.Neerudvalmistati ette H&E värvimiseks, nagu eelnevalt kirjeldatud [18], ja fotod tehti heleduse/kontrastsuse reguleerimisega EVOS-mikroskoobiga (Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, USA). Torukujulise vigastuse skoori kvantifitseerimiseks hinnati sektsioone, loendades tuubulite protsendi, mis näitasid rakunekroosi, pintsli piiride kadumist, kipsi moodustumist ja tuubulite laienemist järgmiselt: 0=normaalne; 1=Vähem kui 10 protsenti või sellega võrdne; 2=10 kuni 25 protsenti ; 3=26 kuni 50 protsenti ; 4=51 kuni 75 protsenti ; 5=Suurem kui 75 protsenti või sellega võrdne. Igast välimisest medullast hinnati viis kuni 10 fivälja ja hinnati pimesi. Histoloogiline muutus väljendati ägeda tubulaarse nekroosina (ATN), mida hinnati eelnevalt kirjeldatud viisil [7, 21]. Apoptootilised rakud tuvastati TUNEL testiga (In Situ Cell Death Detection kit, TMR Red; Roche, Basel, Šveits) vastavalt tootja juhistele.
Luuüdi (BM) tuletatud dendriitrakkude (DC) kultuur ja adoptiivne ülekanne8–10 nädala vanuseid C57BL/6J või BALB/c WT isaseid hiiri kasutati DC-de genereerimiseks tervetest BM-i prekursoritest [22]. GMCSF-rikas supernatant saadi J558L rakkudest, mis olid stabiilselt transfekteeritud hiire GMCSF-ga. Rakuliini andis helde kingitus dr Ira Mellmanilt (Yale'i ülikooli bioloogia osakond, New Haven, CT, USA). Lühidalt, värskelt eraldatud BM-i kultiveeriti 6 ng/ml rekombinantse hiire GMCSF-ga (kokku 3 ravi) 8 päeva RPMI 164{30}}-s (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Rapamütsiini optimaalne annus 10 ng/ml otsustati pärast erinevate annuste (0,1–10 ng/ml) testimist. BMDC-d töödeldi 10 ng/ml rapamütsiiniga (Sigma, St. Louis, MO, USA) kokku kolm korda või 1-üleöö). BMDC-sid töödeldi TLR4 agonisti lipopolüsahhariidiga (LPS; Escherichia coli serotüüp 0111:B4: 100 ng/ml; Sigma-Aldrich); või vehiikulit (1 × PBS) 24 tunni jooksul süngeensete uuringute (C57BL/6J BMDCs → C57BL/6J hiired) söötmes ja allogeensete uuringute jaoks (BALB/c BMDCs → C57BL/6J hiired) ravimata. Rakud pesti ja 0,5 × 106 rakku hiire kohta süstiti intravenoosselt (iv) naiivsetele hiirtele 1 päev enne kahepoolsetneerudIRI. BMDC-d märgistati MitoTracker CMXRos Red või MitoTracker Deep Red (100 nM, 30 min @ 37 °C, Invitrogen) või Mitosox (5 µM; 10 min @ 37 ◦C; Invitrogen).
Kvantitatiivne reaalajas PCRSuhtelist mitokondriaalse DNA (mtDNA) ekspressioonitaset mõõdeti nagu eelnevalt kirjeldatud [23]. Lühidalt, kogu genoomne DNA eraldati ja võrdses koguses (5 ng) kasutati RTPCR jaoks, kasutades ND1 asenduspraimeritena mtDNA jaoks ja HK2 praimereid tuuma DNA (nDNA) jaoks ja ND6 inimese mtDNA jaoks, nagu eelnevalt kirjeldatud [23, 24]. Kogu RNA eraldati ja pöördtranskribeeriti cDNA-ks ning RT-PCR viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud [7, 25, 26].
Mitokondrite eraldamine ja kvantifitseerimineMitokondrid eraldati HEK293 rakkudest, nagu eelnevalt kirjeldatud [18]. Lühidalt, 60 cm HEK293 rakkude plaadid koguti, lisades 5 ml homogeniseerimispuhvrit (300 mmol/L sahharoosi, 10 mmol/L HEPES-KOH, 1 mmol/L EGTA-KOH, pH 7,4) ja 1 mg subtilisiin A proteaasi Bacillus licheniformis (Sigma-Aldrich). Üksikasjaliku mitokondrite isoleerimise protokolli leiate meie eelmisest avaldatud käsikirjast [18].
2 Seahorse Fluxi bioanalüsaatorSeitsmepäevased BMDC-d kanti üle Seahorse 24-süvendiga koekultuuriplaatidele ja mõõdeti hapnikutarbimise kiirus (OCR) ning parameetrid arvutati vastavalt eelnevalt kirjeldatule [25] järgmise modifikatsiooniga. Pärast basaalhingamissageduse, oligomütsiini (Sigma; 2 µM), FCCP (Sigma; 1,5 µM; karbonüültsüaniid 4- (triflfluorometoksü)-fenüülhüdrasoon (FCCP)) ja elektronide transpordiahela (kompleks I ja III) inhibiitorite mõõtmist, rotenooni (Sigma; 0,5 µM) ja antimütsiin A (Sigma; 0,5 µM)) süstiti testi ajal järjestikku. Põhiline mitokondriaalne hingamine, ATP-ga seotud hingamine, protonni leke (ATP-ga mitteseotud hapnikutarbimine), maksimaalne hingamine, mitte-mitokondriaalne hingamine, reservi hingamismaht, hingamiskontrolli suhe ja sidumise efektiivsus määrati tervetes rakkudes vastavalt Brand et al. . [27]; Iga katserühma jaoks kasutati N=4–5 süvendit ja katseid korrati vähemalt 3 korda.
Voolutsütomeetriline analüüs, Western blot ja ELISAVoolutsütomeetria andmete kogumine viidi läbi FACS Caliburiga (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) koos Cyteki {{0}}värvilise voolutsütomeetria uuendusega (Cytek Development, Inc., Fremont, CA, USA). Andmeid analüüsiti FlowJo tarkvaraga 9.0 (Tree Star, Ashland, OR, USA), nagu eelnevalt kirjeldatud [6, 7, 28]. ELISA jaoks koguti sööde BMDC-dest 24 tundi pärast töötlemist 100 ng/ml LPS-ga. TNF, IL6 või IL10 tasemeid mõõdeti hiire ELISA komplektide (Invitrogen) abil, järgides tootja protokolli ja nagu eelnevalt kirjeldatud [18]. Veh- või Mito-DC-d, mida töödeldi LPS-iga ja ilma 6 või 24 tundi, kasutati koguvalgu eraldamiseks, kasutades RIPA lüüsipuhvrit, millele oli lisatud proteaasi ja fosfataasi inhibiitori kokteili (Thermo Fisher Scientifific, Vernon Hills, IL, USA). GAPDH lüsaadi supernatandid kas keedeti (10 minutit temperatuuril 100 ◦ C) ja lüsaadid jäeti näriliste OXPHOS kokteili jaoks 10 minutiks toatemperatuurile (Abcam, Cambridge, MA, USA) [18]. Üksikasjalikumaid meetodeid on eelnevalt kirjeldatud [18].
Andmed ja statistiline analüüsAndmete analüüsimiseks ja esitamiseks kasutati GraphPad Prism 8 (GraphPad Inc., San Diego, CA, USA). Andmeid analüüsiti pärast teisendamist, kui see oli vajalik normaaljaotuse genereerimiseks, 2-sabaga t-testi või 1-viisi ANOVA abil koos post-hoc analüüsiga. Kahe rühma analüüsimiseks kasutati kahepoolset paaritu t-testi. p Olulisuse näitamiseks kasutati väärtust 0,05 või sellega võrdne.
Tulemused
Mitu ravi rapamütsiiniga (Rapa-M) kutsub esile suurema mitokondrite arvu ja vähem immunogeenseid DC-sidC57BL/6 WT DC-d isoleeriti ja paljundati 8 päeva GMCSF-i ja vehiikuli (1X PBS) või rapamütsiini (10 ng/ml) juuresolekul, kokku kolm töötlemist. DC-sid töödeldi 100 ng/ml LPS-ga üle öö. LPS-iga töödeldud DC-sid kasutati RNASeq jaoks või märgistati erinevate mitokondriaalsete värvainetega. RNASeqi andmed kinnitasid varasemaid andmeid, et ravi rapamütsiiniga indutseerib vähem immunogeenseid DC-sid madalamate põletikueelsete tsütokiinidega, mis reguleerivad kaasasündinud ja adaptiivseid immuunvastuseid IL10-ga kui peamise muutumisrajaga (täiendav materjali joonis S1A, B ja tabel S1). Võrreldes vehiikuliga raviga suurendas rapamütsiinravi mitokondriaalset sisaldust BMDC-des (joonis 1A), mida kontrolliti MitoTracker CMXRos Rediga (50 nM) koos LPS-iga ja ilma. Samamoodi oli märkimisväärselt kõrgem märgistus MitoTracker Deep Red (100 nM) ja oluliselt madalam märgistus MitoSoxiga (5 uM) ja pärast üleöist LPS-i stimuleerimist Rapa-M-DC-s võrreldes Veh-DC-ga (joonis 1B, C). MFI histogrammide poolkvantifitseerimine kõigi mitokondriaalsete värvainete jaoks (joonis 1D). Lisaks värvisid Veh- ja Rapa-M-DC-d JC-1 abil, et kontrollida, kas ravi rapamütsiiniga muutis mitokondrite membraani potentsiaali. Mitmekordne rapamütsiiniga töötlemine ei muuda mitokondrite membraani algtaseme potentsiaali võrreldes vehiikuliga töödeldud kontroll-BMDC-dega, nagu on näidatud immunofluorestsentsi (lisamaterjali joonis S2A) ja voolutsütomeetriaga (lisamaterjali joonis S2B, C).
(Veh) ja märgistatud (A) MitoTracker CMXRos (50 nM) või (B) MitoSox (5 µM) või (C) MitoTracker Deep Red (100 nM) . (D) Mitokondrite värvainete MFI poolkvantifitseeritud analüüs märgistatud voolutsütomeetria andmetega. (E) DC-d külvati Seahorse XF-24e analüsaatorisse, stimuleeriti LPS-iga ja ilma 24 tundi ning hapnikutarbimise kiirus (OCR) määrati järjestikuste oligomütsiini (1), FCCP (2) ja töötluste käigus. antimütsiin A/rotenoon (3). (F) Basaalse OCR-i ja ATP tootmise kvantifitseerimine. (G) Pgc1a ja Tfam mRNA tasemed Veh-DC-s ja Rapa-M-DC-s, mida töödeldi 100 ng/ml LPS-ga või jäeti 24 tunniks stimuleerimata. (H) MHC II, kaasstimuleerivate molekulide (CD40/80/86) ja PDL1 ekspressiooni voolutsütomeetria analüüs määrati LPS-stimulatsiooniga ja ilma. (I) IL10, IL6 ja TNF ELISA Veh-DC-st ja Rapa-M-DC-st, mida töödeldi 100 ng/ml LPS-ga 24 tundi. (J-L) Il10, Tnfa ja Il6 mRNA tasemed Veh-DC-s ja Rapa-M-DC-s, mida töödeldi 100 ng/ml LPS-ga või jäeti 24 tunniks stimuleerimata. * p Väiksem või võrdne 0,05, ** p Väiksem või võrdne 0,01 ja *** p Väiksem või võrdne 0,001, ühesuunaline ANOVA, millele järgneb Tukey järeltest. Andmed esindavad kolme korduse keskmisi ± SEM.
Muutunud mitokondriaalne funktsioon, bioenergeetiline analüüs hinnati Seahorse Bioanalyzeri abil. Nagu varem teatatud [18], vähendas LPS hapnikutarbimist võrreldes Veh-kontrollidega Veh-DC-des ootuspäraselt (joonis 1E, sinine kuni must joon). Huvitaval kombel on rapa-M DC-del LPS-iga või ilma selleta kõrgem basaal-OCR (joonis 1E, rohelisest siniseni joon ajahetkel null). Rapa-M-DC näitas suutmatust suurendada maksimaalset hingamisvõimet pärast FCCP süstimist stimuleerimata rakkudes, mida säilitati LPS-i stimulatsiooniga, näidates, et rapamütsiin vähendab vaba hingamisvõimet, nagu meie varem teatatud töö FTY-DC-ga [18]. LPS-iga töödeldud DC-del oli OCR-iga mõõdetud ATP tootmine vähenenud (sinine kuni must) võrreldes Veh-DC-dega. Rapa-M-DC näitas märkimisväärselt suuremat ATP tootmist võrreldes Veh-DC-ga nii stimuleerimata kui ka LPS-i poolt stimuleeritud DC-des (joonis 1F). Rapa-M-DC-d näitasid peroksisoomi proliferaatoriga aktiveeritud retseptori gamma-kaasaktivaatori 1-alfa (Pgc1a) mRNA tasemeid võrreldes Veh-DC-dega (joonis 1G) ning Pgc1a ja mitokondriaalse transkriptsioonifaktori A (Tfam) geeniekspressiooni. ) hoiti pärast LPS-i stimuleerimist Rapa-M-DC-des. Need andmed näitavad, et BMDC-de paljundamine rapamütsiini juuresolekul suurendas mitokondriaalset sisaldust, basaalset OCR-i ja ATP tootmist.
Et testida, kas rapamütsiin lisaks mitokondrite arvu ja funktsiooni suurendamisele indutseeris pärast LPS-i testimist ka muutusi alalisvoolu kaasstimuleerivates molekulides. Huvitav on see, et pärast LPS-ravi on Rapa-M-DC kaasstimuleerivate antigeeni esitlemismolekulide (CD80, CD86 ja CD40), MHCII ja PDL1 ekspressioonitasemed oluliselt madalamad. võrreldes Veh-DC-ga (joonis 1H, sinine vs punane). Huvitaval kombel olid Rapa-M-DC-d sarnased PDL1 ekspressioonitasemetega võrreldes Veh-DC-dega, kuid nende PDL1/CD{15}} suhe suurenes pärast LPS-i stimuleerimist oluliselt võrreldes LPS-iga töödeldud Veh-DC-dega, kus PDL1/CD{{ 18}} vähenenud (Veh/Veh 0.59 ± 0.03 vs. Veh/LPS 0.43 ± 0.{{33 }}02, p < 0,001="" ja="" rapa/veh="" 0,56="" ±="" 0,001="" vs="" rapa/lps="" 0,73="" ±="" 0,02,="" p="">< 0,05).="" veh-="" ja="" rapa-m-dc-de="" vahel="" ei="" täheldatud="" olulisi="" muutusi="" cd11c="" ekspressioonis,="" kuigi="" rapa-m-dc-l="" oli="" madalam="" külgne="" hajumise="" signaal,="" mis="" näitab="" rakkude="" väiksemat="" suurust="" pärast="" lps-i="" stimuleerimist="" (andmeid="" pole="" näidatud).="" rapa="" m-dc-del="" oli="" kõrgem="" suhteline="" mtdna/ndna="" tase="" võrreldes="" veh-dc-dega="" (105,7="" ±="" 8,7="" vs="" 196,8,9="" ±="" 49,3),="" mis="" näitab,="" et="" ravi="" rapamütsiiniga="" suurendab="" dc="" mitokondrite="" arvu.="" rapamütsiin="" vähendas="" märkimisväärselt="" lps-i="" indutseeritud="" il6,="" il10="" ja="" tnfa="" geeniekspressiooni="" ning="" tnf="" ja="" il6="" valgu="" kontsentratsiooni,="" kuid="" säilitas="" kõrgema="" il10="" taseme="" võrreldes="" lps-iga="" töödeldud="" veh-dc-ga="" (joonis="" 1i="" –="" l).="" teised="" geenid,="" mida="" teadaolevalt="" reguleerib="" rapamütsiin="" (autofagia="" või="" põletik),="" on="" loetletud="" täiendavas="" materjali="" tabelis="" s2.="" rohelisega="" tähistatud="" lps-i="" järgsed="" geenid="" olid="" allareguleeritud="" ja="" punasega="" ülesreguleeritud="" võrreldes="" vastava="">
Rapa-M-DC ülekandmine kaitseb neere isheemilise vigastuse eestKõik DC-d aktiveeriti enne ülekandmist 100 ng/ml LPS-ga kõigis süngeensetes uuringutes (C57BL/6 BMDC → C57BL/6 hiired). Pool miljonit DC-d süstiti üks päev enne 26-min kahepoolsetneerudIRI. Uuringu kavandi skeem (joonis 2A). Kontrollina süstiti hiirtele rakuvaba (NC) kontrollina 1 × PBS. Võrreldes NC ja Veh-DC-ga töödeldud hiirtega, kaitsesid Rapa-M-DC-ga töödeldud hiired märkimisväärseltneerudvigastusest, plasma kreatiniin (joonis 2B); nendel hiirtel täheldati sarnaseid muutusi BUN-is [Sham 41,30 ± 3,4 vs NC 159,75 ± 3,2 vs Veh-DC 151,82 ± 1,5 vs Rapa-M-DC 114,68 ± 16,3; p < 0,05="" nc="" või="" veh-dc="" vs="" rapa-m-dc].="" morfoloogilised="" muutused="" (joonis="" 2c,="" d)="" olid="" paralleelsed="" funktsionaalsete="" uuringutega.="" rapa-m-dc-ga="" ravitud="" hiirtel="" on="">neerudKim1 mRNA tasemed [Veh DC 0.016 ± 0.009 vs Rapa-M-DC {{2{{23} }}}.001 ± 0,002], Ngal [Veh-DC 2,14 ± 1,2 vs Rapa-M-DC 0,12 ± 0,09] ja Tnfa [Veh-DC 0,19 ± 0,15 vs Rapa-M-DC 0,0005 ± 0,0002] võrreldes Veh-DC-ga töödeldud hiirtega. Nendes uuringutes ja nagu varem näidatud [6, 7, 17, 18], on Veh-DC-ga ravitud hiirtel poole miljoni annusega võrreldavad muutusedneerufunktsioonjaneerudtsütokiini profiil. Süngeense ülekande uuringutes on Rapa-M-DC-dega ravitud hiirtel vähenenud apoptoos (terminaalne desoksünukleotidüültransferaasi vahendatud digoksigeniini deoksüuridiini hüüdotsa märgistus [TUNEL]) võrreldes Veh-DC-ga ravitud hiirtega (Veh-DC 3,8 ± 1,4 vs Rapa- M-DC 1,1 ± 0,6; p < 0,05);="" tuneli="" analüüsi="" tüüpilised="" pildid="" on="" näidatud="" lisamaterjali="" joonisel="" s3.="" huvitaval="" kombel="" ei="" toimunud="" rapa-m-dc-ga="" töödeldud="" hiirtel="" infifiltreeruvate="" neutrofiilide="" arvus="" olulisi="" muutusi="" võrreldes="" veh-dc-ga="" (andmeid="" pole="" näidatud),="" mis="" viitab="" sellele,="" et="" rapa-m-dc-ga="" töödeldud="" hiirtel="" ei="" pruugi="" kemokiinides="" muutusi="" olla,="" kuigi="" nende="" infifiltreeruvate="" kaasasündinud="" immuunrakkude="" funktsioon="" võib="">
Ühekordne ravi rapamütsiiniga (Rapa-S) kutsub esile vähem immunogeenseid DC-sid ilma mitokondriaalset dünaamikat muutmataJärgmisena testisime, kas ühest ravist rapamütsiiniga piisas regulatiivse fenotüübi esilekutsumiseks, muutes seega regulatiivse DC-de fenotüübi esilekutsumise teostatavuse kliiniliselt olulisemaks. WT DC-d isoleeriti ja paljundati 8 päeva GMCSF juuresolekul, kokku kolm ravi. Seitsmepäevaseid DC-sid töödeldi rapamütsiiniga (10 ng/mL) enne töötlemist 100 ng/mL LPS-ga üleöö inkubeerimiseks ja märgistati järgmisel päeval MitoTracker CMXRos'iga. Punane (50 nM). Võrreldes kandjaraviga ei muuda Rapa-S-ravi mitokondriaalset sisaldust BMDC-des (joonis 3A) LPS-iga ja ilma. Samamoodi ei muutunud märgistus MitoTracker Deep Red (100 nM) ja MitoSox (5 µM) ning pärast üleöist LPS-i stimuleerimist Rapa-S-DC-s võrreldes Veh-DC-ga. (Joonis 3B, C). MFI histogrammide poolkvantifitseerimine kõigi mitokondriaalsete värvainete jaoks (joonis 3D). Sarnaselt mitme ravi analüüsiga värviti Veh- ja Rapa-S-DC-d kasutades JC{{20}}, et kontrollida, kas ühe rapamütsiiniga töötlemine muudab mitokondrite membraani potentsiaali. Ühekordne ravi rapamütsiiniga ei muuda mitokondrite membraani algtaseme potentsiaali võrreldes vehiikuliga töödeldud kontroll-BMDC-dega, nagu on näidatud immunofluorestsentsiga (lisamaterjali joonis S2A) ja flflow tsütomeetriaga (lisamaterjali joonis S2B, C). LPS vähendas oodatult hapnikutarbimist võrreldes Veh-kontrollidega Veh-DC-des (joonis 3E, sinine kuni must joon). Rapa-S-DC-del ei olnud basaal-OCR-i muutusi (joonis 3E, rohelisest siniseni joon ajahetkel null). Kui ATP tootmine kvantifitseeriti, vähendas LPS ATP tootmist, mõõdetuna OCR-iga (sinine kuni must) Veh-DC-des ja Rapa-S-DC-des (joonis 3F). Siiski näitasid Rapa-S-DC-d Pgc1a mRNA tasemeid võrreldes Veh-kontrollidega ja need tasemed säilisid Rapa-S-DC-des pärast LPS-i (joonis 3G), Tfami transkriptsioonitasemetes ei täheldatud vähe või üldse mitte. Järgmisena testisime, kas ühekordne ravi rapamütsiiniga kutsus esile muutuse DC kaasstimuleerivates molekulides pärast LPS-i. Huvitav on see, et pärast LPS-ravi on Rapa-S-DC-l oluliselt madalam kaasstimuleerivate antigeeni esitlusmolekulide (CD80, CD86 ja CD40), MHCII, ekspressioonitase. ja PDL1 võrreldes Veh-DC-ga (joonis 3H). Rapa-S-DC-del oli PDL1 ekspressioonitase Veh-DC-dega võrreldes sarnane ja PDL1/CD86 suhe vähenes pärast LPS-i stimuleerimist sarnaselt Veh-DC-dega (Veh/Veh 0). 59 ± 0,03 vs Veh/LPS 0,43 ± 0,002, p < 0,001="" ja="" rapa-s/veh="" 0,69="" ±="" 0,02="" vs="" rapa-s/lps="" 0,56="" ±="" 0,008,="" p="">< 0,05).="" ühekordne="" ravi="" rapamütsiiniga="" vähendas="" oluliselt="" lps-i="" indutseeritud="" il6,="" il10="" ja="" tnfa="" geeniekspressiooni="" koos="" il10="" madalamate="" valgukontsentratsioonidega,="" tnf-s="" vähe="" või="" üldse="" mitte="" ning="" pärast="" lps-iga="" töötlemist="" (joonis="" 3i="" –="" l).="" teised="" teadaolevad="" rapamütsiiniga="" reguleeritavad="" geenid="" (autofagia="" [beclin,="" atg7,="" atg9,="" lc3b="" ja="" lamp2]="" või="" põletik="" [il1b,="" il12p40,="" tlr4,="" nos2,="" hif1a="" ja="" ho1])="" olid="" pärast="" lps-i="" stimuleerimist="" ainult="" osaliselt="" reguleeritud,="" võrreldes="" kandja="" dc-dega="" (lisa).="" materjalitabel="">
Rapa-S-DC ülekandmine kaitseb neere isheemilise vigastuse eestKõik DC-d aktiveeriti 100 ng/ml LPS-ga või töödeldi rapamütsiiniga (10 ng/ml) enne ülekandmist kõigis süngeensetes uuringutes (C57BL/6 BMDC → C57BL/6 hiired). Pool miljonit lõvi DC-d süstiti üks päev enne kahepoolsetneerudIRI. Uuringu kavandi skeem (joonis 4A). Kontrollina süstiti hiirtele rakuvaba (NC) kontrollina 1 × PBS. Võrreldes Veh-DC-ga ravitud hiirtega, kaitsesid Rapa-S-DC-ga töödeldud hiired märkimisväärseltneerudvigastusest tingitud plasma kreatiniin (joonis 4B); nendel hiirtel täheldati sarnaseid muutusi BUN-is [Veh-DC 151,82 ± 1,5 vs Rapa-S-DC 139,53 ± 3,8]. Morfoloogilised muutused (joonis 4C, D) olid paralleelsed funktsionaalsete uuringutega. Rapa-S-DC-ga ravitud hiirtel on madalamneerudKim1 [Veh-DC 0.016 ± 0.{{10}}{{20}}9 vs Rapa mRNA tasemed -S-DC 0.004 ± 0,002], Ngal [Veh DC 2,14 ± 1,2 vs Rapa-S-DC 0,14 ± 0,008] ja Tnfa [Veh-DC 0,196 ± 0,196 ± 1,2 0,15 vs Rapa-S-DC 0,0017 ± 0,001] võrreldes Veh-DC-ga töödeldud hiirtega.
Rapa-M-DC või Rapa-S-DC allogeenne BMDC ülekanne kaitseb neere isheemilise vigastuse eest võrdseltPool miljonit DC-d süstiti 1 päev enne kahepoolsetneerudIRI allogeensete (BALB/C BMDC→C57BL/6 hiired) ülekandeuuringute jaoks. Uuringu kavandi skeem (joonis 5A). Kontrollina süstiti hiirtele rakuvaba (NC) kontrollina 1x PBS-i. Võrreldes Veh-DC-ga töödeldud hiirtega, kaitsesid Rapa-M-DC või Rapa-S-DC-ga töödeldud hiired oluliseltneerudvigastusest (joonis 5B). Morfoloogilised muutused (joonis 5C, D) olid paralleelsed funktsionaalsete uuringutega. Rapamütsiini DC-dega ravitud hiirtel on madalamneerudKim1 [Veh-DC 0.04 ± 0.{{10}}2 vs Rapa-M-DC 0 mRNA tasemed. 005 ± 0.0{{30}}2 vs Rapa-S-DC 0.{{37} }05 ± 0.0002], Ngal [Veh-DC 0,57 ± 0,3 vs RapaM-DC 0,19 ± 0,11 vs Rapa- S-DC 0,05 ± 0,01] ja Tnfa [Veh-DC 0,037 ± 0,02 vs Rapa-M-DC 0,007 ± 0,003 vs Rapa-S-DC 0,008 ± 0,005] võrreldes Veh-DC-ga töödeldud hiirtega. Allogeense ülekande uuringutes oli hiirtel, keda raviti Rapa-M-DC või Rapa-S-DC-ga, vähenenud apoptoosi TUNEL võrreldes hiirtega, keda raviti Veh-DC-ga (Veh-DC 16,7 ± 8,2 vs Rapa-M-DC 7,2 ± 2,5 vs Rapa- S-DC 9,1 ± 0,1).
Eksogeensete mitokondritega koormatud DC-d (Mito-DC), millel on kõrgem mitokondriaalne dünaamika ja immunogeensem fenotüüp pärast LPS-i stimuleerimistWT DC-d eraldati ja paljundati 8 päeva GMCSF juuresolekul, kokku 3 ravi. Seitse päeva vanu DC-sid töödeldi üleöö inimese eksogeensete mitokondritega (10 µg/ml). Võrreldes vehiikuliga töötlemisega on mitokondritega töödeldud DC Mito-DC-del mitokondrid kõrgemad. Mitokondrid eraldati inimese HEK293 rakuliinist. BMDC-sid analüüsiti inimese mitokondrite olemasolu suhtes hiire WT DC-des, kasutades inimese mtDNA praimereid NADH dehüdrogenaasi (ND) jaoks. Inimese [mtDNA] suhteline sisaldus Veh-DC-s oli {{10}},26 ± 0,10 versus 16,8 ± 0,59; p < 0,001,="" bmdc-dest="" eraldatud="" genoomse="" dna="" suurenemine="" 63-="" korda.="" praeguse="" testi="" piirang="" seisneb="" selles,="" et="" see="" mõõdab="" inimese="" või="" hiire="" mtdna-d="" võrreldes="" tuuma="" dna-ga="" ja="" veh-dc-s="" tuvastatud="" inimese="" mtdna="" väike="" kogus="" võib="" olla="" tingitud="" nd="" järjestuse="" väikesest="" kattumisest="" pcr-testis="" või="" võimalusest,="" kuna="" me="" oleme="" mis="" näitab="" suhtelist="" ekspressiooni="" hiire="" tuuma="" dna="" suhtes.="" et="" teha="" kindlaks,="" kas="" suurem="" mitokondriaalne="" sisaldus="" muutis="" ka="" mitokondriaalset="" funktsiooni,="" viidi="" läbi="" bioenergeetiline="" analüüs,="" kasutades="" seahorse="" bioanalyzerit.="" lps="" vähendas="" ootuspäraselt="" hapnikutarbimist="" võrreldes="" veh-kontrollidega="" veh-dc-des="" (joonis="" 6a,="" sinine="" kuni="" must="" joon).="" mito-dc-del="" on="" kõrgem="" basaal-ocr="" (joonis="" 6a,="" rohelisest="" siniseni="" joon="" ajahetkel="" null).="" pärast="" ravi="" lahtiühendatava="" fccp-ga="" näitas="" mito-dc="" suutmatust="" suurendada="" maksimaalset="" hingamisvõimsust="" stimuleerimata="" rakkudes,="" mida="" säilitati="" lps-i="" stimulatsiooniga,="" näidates,="" et="" isoleeritud="" mitokondritega="" töötlemine="" vähendab="" vaba="" hingamisvõimet="" (tõenäoliselt,="" kuna="" juba="" maksimaalse="" ocr-i="" korral="" põhiolekus).="" kui="" atp="" tootmine="" kvantifitseeriti,="" vähendas="" lps="" atp="" tootmist,="" mõõdetuna="" ocr-iga="" (sinine="" kuni="" must)="" veh-dc-des.="" mito-dc="" näitas="" lps-stimuleeritud="" dc-des="" oluliselt="" suuremat="" basaal-ocr="" ja="" atp="" tootmist="" võrreldes="" veh-dc-ga="" (joonis="" 6b).="" mito-dc-d="" näitasid="" pgc1a="" kõrgenenud="" mrna="" taset="" ja="" huvitaval="" kombel="" oluliselt="" madalamat="" tfam-i="" võrreldes="" veh-kontrollidega="" (joonis="" 6c).="" pgc1a="" ja="" tfami="" erinevused="" nendes="" katsekomplektides="" pärast="" lps-i="" stimuleerimist="" võrreldes="" joonistel="" 1="" ja="" 3="" toodud="" andmetega="" on="" tõenäoliselt="" tingitud="" balb/c="" bmdc-de="" kasutamisest.="" võrreldes="" c57bl/6="" bmdc-dega="" on="" balb/c="" dc-del="" pärast="" stimuleerimist="" olulised="" muutused="" mitokondrites="" ja="" tsütokiinide="" tootmises="" [29,30].="" nende="" muutuste="" tõttu="" dc-des="" oleme="" ajalooliselt="" kasutanud="" balb/c="" hiirtel="" võrreldes="" c57bl/6-ga="" kõrgemat="" isheemilist="" aega,="" et="" neil="" oleks="">neerudvigastus [6,18]. Need andmed näitavad, et eksogeensete tervete mitokondrite ülekandmine suurendab mitokondrite sisaldust, basaalset OCR-i ja ATP tootmist. See viitab põletikuvastase fenotüübi potentsiaalile DC-des pärast ravi eksogeensete mitokondritega, nagu on näidatud meie eelmises uuringus [18]. Järgmisena testime, kas eksogeensete mitokondritega töödeldud DC-d, mille tulemuseks on suurenenud mitokondrite arv ja funktsioon, kutsusid pärast LPS-i esile ka muutusi DC-stimuleerivates molekulides. Tähelepanuväärselt on Mito-DC-l LPS-stimulatsiooniga ja ilma selleta oluliselt kõrgem kaasstimuleerivate antigeeni esitlemismolekulide (CD80, CD{8}} ja CD40), MHCII ja PDL1 ekspressioonitase võrreldes Veh-DC-ga (joonis 6D). Lisaks oli Mito-DC-del PDL1 ekspressioonitase kõrgem kui Veh-DC-del; siiski oli neil ka PDL1/CD86 suhe pärast LPS-i stimuleerimist võrreldes LPS-iga töödeldud Veh-DC-dega (andmeid pole näidatud). Mito-DC-l oli LPS-indutseeritud Tnfa geeniekspressioon oluliselt nüristunud, kuid suurem Il6 ja Il10 geeniekspressioon võrreldes Veh-DC-ga ning TNF-i ja IL10 madalamad valgukontsentratsioonid, kuid säilitas kõrgema IL6 taseme võrreldes LPS-iga töödeldud Veh-DC-ga (joonis 6E). –H). Teised geenid, mida teadaolevalt reguleerivad mitokondrid (autofagia [Beclin, Atg7, Atg9, Lc3b ja Lamp2] või põletik [Il1b, Il12p40, Tlr4, Nos2, Hif1a ja Ho1]), reguleeriti osaliselt pärast LPS-i stimuleerimist (täiendav materjalide tabel S3). Veh-DC ja Mito-DC töödeldi LPS-ga 6 ja 24 tundi. Mõõdeti suhtelisi muutusi mitokondriaalses kompleksis. LPS-iga ja ilma selleta töödeldud Mito-DC-l on oluliselt kõrgem mitokondriaalsete komplekside IV, II ja I valgu tase ning oluliselt madalam komplekside V ja III tase võrreldes Veh-DC-dega (joonis 6I). Mitokondriaalsete komplekside suhtelise valgu ekspressiooni poolkvantitatiivne analüüs GAPDH suhtes (joonis 6J). Täispikad blotid on esitatud täiendavate figuuridena (täiendavad materjali joonised S4–S7).
Joonis 6. Mitokondritega laetud DC-del (Mito-DC) on pärast LPS-i stimuleerimist suurem mitokondriaalne funktsioon ja immunogeensus võrreldes Veh-DC-dega. Seitse päeva vanad Veh-DC-d ja neid inkubeeriti 10 µg/mL HEK293 mitokondritega üks päev enne töötlemist 100 ng/mL LPS-iga veel 24 tundi või jäeti stimuleerimata ( Veh). (A) 24 tundi pärast mitokondrite lisamist külvati DC-d Seahorse XF-24e analüsaatorisse, stimuleeriti 24 tundi LPS-iga ja ilma ning hapnikutarbimise kiirus (OCR) määrati järjestikuste oligomütsiiniga töötlemise käigus (1). ), FCCP (2) ja antimütsiin A/rotenoon (3). (B) Basaalse OCR-i ja ATP tootmise kvantifitseerimine. (C) Pgc1a ja Tfam mRNA tasemed Veh-DC-s ja Mito-DC-s, mida töödeldi 100 ng/ml LPS-ga või jäeti 24 tunniks stimuleerimata. (D) MHCII, kaasstimuleerivate molekulide (CD40/80/86) ja PDL1 ekspressiooni voolutsütomeetriline analüüs määrati LPS-stimulatsiooniga ja ilma. (E) IL10, IL6 ja TNF ELISA Veh-DC-st ja Mito-DC-st, mida töödeldi 100 ng/ml LPS-iga 24 tundi. Tnfa, Il6 ja Il10 (F-H) mRNA tasemed Veh-DC-s ja Mito-DC-s, mida töödeldi 100 ng/ml LPS-ga või jäeti 24 tunniks stimuleerimata. Andmed tähistavad keskmisi ± SEM, * p väiksem või võrdne 0,05, ** p väiksem või võrdne 0,01 ja *** p väiksem või võrdne 0,001, ühesuunaline ANOVA, millele järgneb Tukey järeltest. Andmed esindavad kolme korduse keskmisi ± SEM.
Mito-DC kaitsete allogeenne BMDC ülekanneNeerudisheemilisest vigastusest Pool miljonit DC-d süstiti 1 päev enne kahepoolsetneerudIRI Mito-DC allogeenide (BALB/C BMDC→C57BL/6 hiired) ülekandeuuringute jaoks. Uuringu kavandi skeem (joonis 7A). Kontrollina süstiti hiirtele 1x PBS-i rakuvaba (NC) kontrollina. Võrreldes Veh-DC-ga töödeldud hiirtega, kaitsesid Mito-DC-ga töödeldud hiired märkimisväärseltneerudvigastusest (joonis 7B). Morfoloogilised muutused (joonis 7C, D) olid paralleelsed funktsionaalsete uuringutega. Mito-DC-dega ravitud hiirtel on madalamneerudKim1 mRNA tasemed [Veh-DC 0.04 ± 0.02 vs Mito-DC 0.02 ± 0.01], Ngal [Veh-DC 0.57 ± 0.3 vs Mito-DC 0.39 ± {{29} }.20] ja Tnfa [Veh-DC 0,037 ± 0,02 vs Mito-DC 0,0028 ± 0,0013] võrreldes Veh-DC-ga ravitud hiirtega. Allogeense ülekande uuringutes vähenes Mito-DC-ga ravitud hiirtel TUNEL-i apoptoos võrreldes Veh-DC-ga ravitud hiirtega (Veh-DC 16,7 ± 8,2 vs Mito-DC 3,0 ± 1,2).
Arutelu Käesolevas uuringus näitasime kaitsetneerudIRI, mis on indutseeritud rapamütsiiniga töödeldud DC-de adoptiivse ülekandega (kas üks või mitu korda), reguleerib alternatiivselt alalisvoolu funktsiooni, mis sõltub mitokondrite dünaamika suhtelistest muutustest. Nii ühe- kui ka mitmekordne ravi rapamütsiiniga indutseerib vähenenud immunogeenseid (madalamad tsütokiinid ja kaasstimuleerivad molekulid) DC-sid. Rapa-M-DC-de või Rapa-S-DC-de ülekandmine kaitsebneerudisheemilise reperfusioonikahjustuse tõttu, mis näitab, et rapamütsiiniga modifitseeritud DC-de immunogeenne seisund kutsub esile kaitse. Lisaks kaitseb ka Veh-DC ülekandmine, millel oli mitokondrite arvu mööduv tõusneerudIRI-st (joonis 8A–D)). Nendest uuringutest võime järeldada, et vähem immunogeensete DC-de süstimine on IRI-vastase kaitse esilekutsumisel keskne protsess, mida saab saavutada farmakoloogilise raviga (rapamütsiin) või tervete eksogeensete mitokondrite ülekandmisega. Nagu varem teatatud [31] ja meie RNAseqi uuringutes kinnitati, ei ole rapamütsiiniga moduleeritud DC-dega seotud selget tolerogeenset allkirja. Kuigi rapamütsiini DC-d näitavad pärast LPS-i stimuleerimist geenides mõningaid olulisi muutusi võrreldes vehiikli DC-dega, piirdusid need RapaM-DC-dega, millel on madalam tsütokiinide vahendatud signaaliülekanne ja tsütokiinide tootmine (TNF-i signaalimine NF-kB ja IFN-i produktsiooni kaudu), mis on mõlema puhul kriitilise tähtsusega. kaasasündinud ja adaptiivsed immuunvastused. Nagu varem teatati ja meie uuringus kinnitati, tuvastati IL-10 signaaliülekanne peamise rajana, mis erines rapamütsiiniga töödeldud DC-des, mille FDR oli 5,87 × 10 4 (täiendav materjali joonis S1), mis on iseloomulik tsütokiin. tolerogeense signatuuri kohta DC-des.
Ajalooliselt on tolerogeensed DC-d (Tol-DC) identifitseeritud küpsemishäiretega või poolküpsetena, kaasstimuleerivate ainete (CD80, CD86, CD40) madala ekspressiooniga, suurenenud IL10 tootmisega, millega kaasneb madal IL12 ja IFN sekretsioon. , väiksem võime T-rakke praimida ja potentsiaal indutseerida Treg pärast põletikulist stimulatsiooni [32, 33]. Regulatiivseid või tolerogeenseid DC-sid saab in vitro eristada, kasutades immunosupressante või ühendeid, nagu FTY720 [18] või rapamütsiini (praegune uuring), või põletikuvastaseid tsütokiine nagu IL10 [34] või geneetilise modifikatsiooni abil.
Dendriitrakkude roll ägedas neerukahjustuses (AKI)Kuigi erinevate vigastuste ennetamiseks või raviks on tehtud suuri farmakoloogilisi edusamme, pole AKI jaoks ühtegi saadaval, seega on see endiselt suur tervisekoormus [35]. Lisaks seostatakse mittespetsiifiliste immunosupressiivsete ravimitega vahendatud allografti äratõukereaktsiooni või autoimmuunhaiguse ennetamiseks või vähendamiseks ebasoodsaid kõrvaltoimeid. Seega on eeliseks immuunrakutüübi, näiteks DC-de kasutamine, mis võivad sihtida kaasasündinud ja adaptiivseid immuunvastuseid. Lisaks on DC-d olulised rakud immuunsuse või tolerantsuse seisukohalt ning uuritud on mõtet kasutada ex vivo reguleerivaid või talutavaid DC-sid vähi, autoimmuunhaiguste ja siirdamise rakupõhises ravis [36]. Farmakoloogilised (FTY720 [18]) või bioloogilised strateegiad (geneetiliselt muundatud) kutsuvad esile regulatoorseid või tolerogeenseid DC-sid (Tol-DC) [37], mis on kas küpsemiskindlad või madalama küpsemistasemega või alternatiivselt aktiveeritud, mis lõppkokkuvõttes väljendavad madalat MHC I taset. või MHC II ja kaasstimuleerivad molekulid nagu CD40, CD80 ja CD{12}}. Kasutades CD11c-DTR transgeenseid hiiri, oleme varem avaldanud uuringud, mis näitasid, et DC-de ammendumine difteeriatoksiiniga kaitses hiirt märkimisväärseltneerudisheemia reperfusioonikahjustusest (IRI) [7, 38] ja vastupidi, süvenes annusest sõltuv alalisvoolu arvu suurenemineneerukahjustus[7], mis viitab sellele, et DC-d võivad mängida olulist rolli AKI reguleerimisel. Väärib märkimist, et AKI-s määrab kasutatav AKI mudel (tsisplatiini või isheemiat kasutav keemiaravi) DC-de rolli immunoloogiliste reaktsioonide muutmisel. Tsisplatiini poolt indutseeritud AKI korral põhjustab alalisvoolu ablatsioon kas transgeensete hiirte või liposomaalse klodronaadi süstimise teel rohkem vigastusi, kuna selles mudelis on DC-dest toodetud IL-10 lõppkokkuvõttes vajalik nefrotoksiliste kahjustuste summutamiseks [39, 40].
Rapamütsiin: põletik, immuunrakud, isheemia reperfusioonikahjustus (IRI)Varem avaldatud uuringud on näidanud rapamütsiini kaitsvat rolli AKI mudelites, kasutades IRI uuringuid, mis hõlmasid NKT-rakkude infifiltratsiooni ja funktsiooni reguleerimist, parandades seeläbi.neerukahjustus[41], selles uuringus raviti hiiri suukaudselt kolm korda rapamütsiiniga 24 tundi, 1 tund enne isheemiat ja 12 tundi pärast isheemiat. Krooniline suukaudne annustamine hiirtele üks päev enneneerudIRI ja iga päev pärast seda (kuni 7 päeva) andsid tulemuseks kõrgemadneerukahjustuspärssimise tõttuneeru-tubulaarsete rakkude proliferatsioon 1 ja 3 päeva pärast isheemiat [42]. See oli ilmne nagu ühepoolse ureetra obstruktsiooni (UUO) hiiremudelis, kus ravi rapamütsiiniga paranes.neerudfifibroosi, pärssides otseselt mTOR signaaliülekannet müofifibroblastides ja interstitsiaalsetes makrofaagides [43]. Need uuringud näitavad, et rapamütsiinil võib olla vastupidine toime erinevatel ägedatel ja kroonilistel juhtudelneerudmudelid. Erinevad uuringud on aga teatanud rapamütsiini kahjulikust rollist IRI loommudelites. Rapamütsiini (4 mg/päevas) suukaudne manustamine 7 päeva jooksul Yorkshire'i sigadele kahjustas pärgarteri oklusiooni mudelis endoteelist sõltuvat vasorelaksatsiooni ja suurendas müokardi nekroosi [44]. Kuid hiirtel kutsus äge ravi rapamütsiiniga (üks tund enne isheemiat, intraperitoneaalne süstimine) esile südamekaitse, reguleerides JAK2-STAT3 signaaliülekannet, et kaitsta müokardiinfarkti eest [45]. Olenevalt manustamisviisist (sondiga, subkutaanne või intraperitoneaalne), annustamisest (0,1–6 mg/kg/päevas), ajastusest (varajane või hilinenud) [46] ja kasutatava mudeli tüübist (süda [47]). , maks [48] võineerud[41,49]), rapamütsiin on osutunud kaitsvaks [47] või mitte kaitsvaks [50].
Rakuteraapia ja rapamütsiinHiire BMDC-de või inimese CD14 pluss monotsüütide paljundamine, mida me peame krooniliseks, indutseeris DC-des alternatiivse kaitsva või reguleeriva fenotüübi, mis reguleeris nii kaasasündinud kui ka adaptiivseid immuunvastuseid. Surmava transplantaat-peremehe vastu haiguse korral olid rapamütsiiniga genereeritud DC-d vähendanud MHC II ja kaasstimuleerivaid molekule, kuid neil oli suurem IL12 populatsioon, mis tootis pärast LPS-i stimuleerimist. Need IL12 tootvad Rapa-M-DC suurendasid alloreaktiivset T-rakkude apoptoosi, mehhanismi, mis hõlmas IFN-i [51]. Samamoodi tekitasid rapamütsiini juuresolekul paljundatud CD14 pluss monotsüüdid ka kõrgemat IL12p70 ja IL27 taset, mis reguleerisid NK-rakkude funktsiooni, muutes seega allogeenseid T-raku vastuseid IFN-i kaudu [52]. sisseneerud,rapamütsiiniga töödeldud Tregide ülekandmine oli märkimisväärselt alla surunud T-rakkude, müeloidrakkude ja müofibroblastide vastuseid, mille tulemuseks oli paranenud äge ja krooniline reaktsioonneeruhaigusvõrreldes hiirte otsese raviga rapamütsiiniga [53]. Samamoodi paranes rapamütsiiniga töödeldud müeloidist pärinevate supressorrakkude (MDSC) ülekandmine hiirteleneerufunktsioonvähenenud histoloogiliste kahjustustega ja immuunrakkude infifiltratsiooniga [54]. Need uuringud näitavad, et rakuteraapia, mis hõlmab rakkude töötlemist rapamütsiiniga enne süstimist, väldib kahjulikke kõrvaltoimeid, mis võivad olla seotud süsteemse rapamütsiinraviga. Lisaks oleme testinud metformiini või selliste ühendite nagu 5-aminoimidasool-4-karboksamiid-1- -4- ribofuranosiid (AICAR) kasutamist regulatiivse fenotüübi esilekutsumiseks hiirte DC-des, et testida nende rolli muutumises.neerudIRI. Sarnaselt rapamütsiiniga (Rapa-S-DC) kasutatavale doseerimisstrateegiale ravisime BMDC-sid 7. päeval koos LPS-iga väikeste metformiini (1 mM) või AICAR-i (1 mM) annustega. Süstisime üks päev enne süsteemselt 0,5 x 106 metformiin-DC-d või AICAR-DC-dneerudIRI. Hiired, keda raviti kas metformiin-DC-ga või AICAR-DC-ga, olid märkimisväärselt kaitstud võrreldes kas NC- või Veh-DC-ga ravitud hiirtega (avaldamata tähelepanekud, Bajwa labor). Seega võivad mitmed ravimid või ühendid, mis kutsuvad esile metaboolseid muutusi või aktiveerivad AMPK rada, olla väärt testimist kas üksi või kombinatsioonis. Väärib märkimist, et ravimite või ühendite (metformiin või AICAR) mitme kombinatsiooni kasutamine, mis võiks potentsiaalselt täiendada rapamütsiini kaitsvat toimet, tuleb nende kasutamise hindamisel BMDC-des veel uurida. Vähirakkudes suurendab AICARi kombineerimine rapamütsiiniga rapamütsiini efektiivsust mTORC2 edasisel pärssimisel, et indutseerida apoptoosi [55]. T-rakkudes on metformiini ja rapamütsiini kombineeritud kasutamist testitud ka potentsiaalse metaboolse kontrollpunkti regulaatorina T-rakkude funktsiooni mõjutamiseks [56]. Seega tuleks neid kombineeritud ravimeetodeid tulevikus testida tolerogeensete või regulatiivsete BMDC-dega kui metaboolsete kontrollpunktide potentsiaalsete otseste või kaudsete regulaatoritega.
Rapamütsiin: mitokondrite roll dendriitrakkudes ja makrofaagidesDC ja makrofaagide funktsioone reguleerib mitokondriaalne metabolism. 1. tüüpi makrofaagidel [57, 58] ja immunogeensetel DC-del (TLR-vahendatud aktivatsioon) on metaboolne üleminek, mille käigus mitokondriaalset oksüdatiivset fosforüülimist inhibeerib endogeenselt sünteesitud lämmastikoksiid (NO) ja pühendumus kõrgetele aeroobsetele glükolüütilistele kiirustele [59]. DC-de või makrofaagide aktiveerimine mitme TLR-i agonisti (LPS või CpG) poolt põhjustab glükolüüsi kiiret suurenemist, millele järgneb OXPHOS-i ja mitokondriaalse membraani potentsiaali vähenemine [59–61]. Mitokondrite mõningast rolli on demonstreeritud in vitro D-vitamiiniga töödeldud DC-dega; need DC-d on suurendanud OXPHOS-i, mitokondriaalset massi ja mROS-i tootmist [62], meie hiljutine uuring, milles kasutati FTY720 [18], näitas sarnaseid muutusi DC-s (kõrgem OXPHOS ja väiksem immunogeensus), on näidatud, et äge ravi rapamütsiiniga pikendab raku eluiga. DC-d, mis sõltusid mitokondriaalse funktsiooni [10] säilimisest NO pärssimise kaudu. Vastupidiselt DC-de eluea pikenemisele teatasid samad rühmad ka, et äge või lühiajaline kokkupuude rapamütsiiniga DC-des muudab need ka antigeenispetsiifiliste CD8 pluss T-rakkude tugevateks aktivaatoriteks, suurendades seega B16 melanoomi kontrolli hiirte vaktsineerimisel [63]. Inimese monotsüütidest pärinevate DC-de akuutne ravi (90 minutit) rapamütsiiniga pärsib LPS-i indutseeritud immunostimuleerivaid molekule ja allostimuleerivat potentsiaali, mis hõlmas töödeldud DCS-i võimetust suurendada NF-KB signaaliülekannet [64]. Makrofaagides pärsib rapamütsiin IL1 ja IL tootmist{20}}pärast LPS-i stimuleerimist, protsess, mis hõlmab ka mitokondriaalse ROS-i (mtROS) vähendamist, inhibeerides otseselt NLRP3 põletikulise-p38 MAPK-NF-KB radu [65]. Hiirte ja inimeste rapamütsiiniga konditsioneeritud DC (Rapa-DC) käitub erinevalt, võrreldes hiire Rapa-DC-ga, on inimese Rapa-DC osutunud osaliselt resistentseks küpsemise suhtes pärast põletikku soodustavaid tsütokiine ning neil on heterogeensus efektor-T-rakkude laienemise reguleerimisel ja funktsioon [66]. Macedo et al. [67].
Meie praegused leiud näitavad, et ühel või mitmel rapamütsiiniga töödeldud DC-l on pärast LPS-i stimuleerimist vähenenud immunogeenne ja immunostimuleeriv fenotüüp. Nende DC-de ülekandmine kaitsebneerudIRI-st. Rapamütsiin reguleerib alternatiivselt mitokondrite dünaamikat; ainult mitmekordne ravi kutsub esile suurema mitokondrite arvu. Need andmed viitavad sellele, et alalisvoolu mitokondrite dünaamika (kõrgem mitokondrite sisaldus) koos rapamütsiini poolt indutseeritud vähem immunogeense fenotüübiga kaitsevad ühiseltneerudon keemiline vigastus. Kuigi veelgi huvitavam on see, et meie andmed eksogeensete mitokondritega töödeldud DC-de kohta näitavad, et suurem mitokondrite arv võib pärast LPS-i stimuleerimist ületada DC-de immunogeensema seisundi, et kaitsta kaneerudIRI-st. Huvitav on kinnitada, kas DC-de suurem mitokondrite arv muudab T-rakkude vastuseid, DC-del on võime muuta immuunvastust, nagu meie eelmine uuring näitas. Meie esialgsed andmed näitavad, et allogeensete T-rakkude proliferatsiooni uuringutes pärsivad suurema mitokondrite arvuga DC-d CD4 T-rakkude proliferatsiooni segalümfotsüütide reaktsioonides (MLR, andmeid pole näidatud). Praegu on ebaselge, kas suurema mitokondrite arvuga DC-d võivad esile kutsuda Tregi vastuse, mis võib kaitsta positiivseltneerudIRI-st. Need on meie järgmiste uuringute keskmes.
Järeldused Kokkuvõttes oleme näidanud, et BMDC-d saavad reguleeridaneerukahjustusmehhanismi abil, mis hõlmab mitokondrite biogeneesi kas mitme rapamütsiiniga töötlemise või mitokondrite arvu eksogeense suurendamise teel eksogeensete mitokondrite abil. Me järeldame, et reguleerivad DC-d (suurema mitokondrite arvuga DC-d) võivad olla kasulikudneerudIRI, samuti muude põletikuliste seisundite korral, nagu siirdamine ja autoimmuunhaigused vigastuste vältimiseks või raviks.
