Põletikuliste infiltraatide kvantitatiivne hindamine neerusiirdamise biopsiates, kasutades türamiidi signaali võimendamist ja süvaõpet
Mar 25, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com
Meyke Hermsen1Valeri Volk2Jan Hinrich Bräsen2et al
Abstraktne
Transplantaadi hilinenud funktsioon (DGF) on interstitsiaalse fibroosi ja tubulaarse atroofia (IFTA) väljakujunemise tugev riskitegur neerusiirdamise korral. Põletikuliste infiltraatide kvantitatiivne hindamine DGF-i patsientide neerubiopsiates võib paljastada IFTA arengu ennustavaid markereid. Selles uuringus kombineerisime mitmekordse türamiidi signaali amplifikatsiooni (mTSA) ja konvolutsioonilisi närvivõrke (CNN), et hinnata põletikulist mikrokeskkonda DGF-i patsientide neerubiopsiates (n=22), mis võeti 6 nädalat pärast siirdamist. Patsiendid kihistati IFTA arendamiseks (<10% versus="" ≥10%)="" from="" 6="" weeks="" to="" 6="" months="" post-transplantation,="" based="" on="" a="" histopathological="" assessment="" by="" three="" kidney="" pathologists.="" one="" mtsa="" panel="" was="" developed="" for="" visualization="" of="" capillaries,="" t-="" and="" b-lymphocytes,="" and="" macrophages,="" and="" a="" second="" mtsa="" panel="" for="" t-helper="" cell="" and="" macrophage="" subsets.="" the="" slides="" were="" multi="" spectrally="" imaged="" and="" custom-made="" python="" scripts="" enabled="" conversion="" to="" artificial="" brightfield="" whole-slide="" images="" (wsi).="" we="" used="" an="" existing="" cnn="" for="" the="" detection="" of="" lymphocytes="" with="" cytoplasmatic="" staining="" patterns="" in="" immunohistochemistry="" and="" developed="" two="" new="" cnns="" for="" the="" detection="" of="" macrophages="" and="" nuclear-stained="" lymphocytes.="" f1="" scores="" were="" 0.77="" (nuclear-stained="" lymphocytes),="" 0.81="" (cytoplasmatic-stained="" lymphocytes),="" and="" 0.82="" (macrophages)="" on="" a="" test="" set="" of="" artificial="" brightfield="" wsi.="" the="" cnns="" were="" used="" to="" detect="" inflammatory="" cells,="" after="" which="" we="" assessed="" the="" peritubular="" capillary="" extent,="" cell="" density,="" cell="" ratios,="" and="" cell="" distance="" in="" the="" two="" patient="" groups.="" in="" this="" cohort,="" the="" distance="" of="" macrophages="" to="" other="" immune="" cells="" and="" peritubular="" capillary="" extent="" did="" not="" vary="" significantly="" at="" 6="" weeks="" post-transplantation="" between="" patient="" groups.="" cd163+="" cell="" density="" was="" higher="" in="" patients="" with="" ≥10%="" ifta="" development="" 6="" months="" post-transplantation="" (p="" <="" 0.05).="" cd3+cd8−/cd3+cd8+="" ratios="" were="" higher="" in="" patients="" with=""><10% ifta="" development="" (p="" <="" 0.05).="" we="" observed="" a="" high="" correlation="" between="" cd163+="" and="" cd4+gata3+="" cell="" density="" (r="0.74," p="" <="" 0.001).="" our="" study="" demonstrates="" that="" cnns="" can="" be="" used="" to="" leverage="" reliable,="" quantitative="" results="" from="" mtsa-="" stained,="" multi="" spectrally="" imaged="" slides="" of="" kidney="" transplant="">
Cistanche deserticola hoiab ära neeruhaiguse, proovi saamiseks klõpsake siin
Sissejuhatus
Siiriku hilinenud funktsioon (DGF) pärast neerusiirdamist on multifaktoriaalne ja seotud peamiselt doonori omaduste ja isheemia ajaga. DGF-i kirjeldatakse üldiselt kui dialüüsi vajadust 7 päeva jooksul pärast siirdamist ja see on kroonilise neerutransplantaadi vigastuse tugev riskitegur [1–3]. Kroonilise neerukahjustuse klassikaline komponent on interstitsiaalne fibroos ja tubulaarne atroofia (IFTA). Kuid mitte kõik DGF-i patsiendid ei arene IFTA väljakujunemiseni ning DGF-i ja IFTA vahelist keerulist seost mõistetakse endiselt halvasti. See on esiteks tingitud võimalike põhjuslike sündmuste ja funktsionaalse languse vahelisest viivitusest ning teiseks potentsiaalsete indutseerijate muutuvatest ja keerukatest mõjudest, nagu ravimite äratõukereaktsioon ja kõrvaltoimed [1, 4]. Põletiku ja spetsiifiliste makrofaagide üldist esinemist on paljudes uuringutes kirjeldatud transplantaadi kaotuse ennustajana [5–8]. Siiski ei ole nende aluseks olevad patoloogilised protsessid täielikult mõistetavad ja kõrge põletikutase ei põhjusta alati pikaajalist siiriku kaotust. Keskkonna stiimulite tulemusena omandavad makrofaagid spetsiifilised funktsioonid ja polariseeruvad erinevateks fenotüüpideks. Arvukad uuringud näitavad, et spetsiifilised makrofaagide alatüübid (alternatiivselt aktiveeritud makrofaagid) osalevad kudede ümberkujundamises, kutsudes esile kudede paranemise või fibroosi. Polarisatsioon koe ümberkujunemise (mõnikord profibrootilise) fenotüübi suunas on teadaolevalt sõltuv paljudest keskkonnastiimulitest, muu hulgas T-abistaja lümfotsüütide alatüüpidest [9–11]. T-abistajarakkude populatsioonide hindamine transplantaadis DGF-i ajal näitas, et T-helper 1 alatüüp on levinud, kuid korrelatsioone siiriku tulemuse või IFTA-le progresseerumisega ei ole seni uuritud [12]. Põletikulise mikrokeskkonna põhjalik hindamine, mis keskendub spetsiaalselt makrofaagidele ja T-abistajarakkude alamhulkadele hoolikalt valitud patsiendirühmades, võib anda ülevaate sellest, miks mõned, kuid mitte kõik DGF-i patsiendid edenevad IFTA väljatöötamisega.
Põletikuliste infiltraatide põhjalikku uurimist takistavad aga mitmed (tehnilised) piirangud. Traditsioonilised immunohistokeemia (IHC) ja immunofluorestsentsmeetodid toetavad ainult piiratud arvu rakumarkerite visualiseerimist ühes koeosas. Väikeste väärtuslike koefragmentide, nagu neerubiopsiate, järjestikune lõikamine ei ole soovitav ja rakkudevaheliste suhete tõlgendamine erinevates osades on keeruline. Lisaks kaasneb põletikuliste infiltraatide kvantitatiivsel hindamisel visuaalse hinnanguga märkimisväärne vaatlejatevaheline varieeruvus [13]. Traditsioonilised pilditöötlusmeetodid, nagu pikslite lävi määramine, veelahkme ja morfoloogiapõhine segmenteerimine, tuginevad eelnevatele teadmistele kõigi morfoloogiliste rakkude esitusviiside ja koevärvide intensiivsuse kohta kogu andmekogumis [14–16]. Seetõttu puudub neil meetoditel sageli tugevus bioloogiliste ja tehniliste kujutiste variatsioonide jaoks ning need tõlgivad halvasti uuteks või välisteks andmekogumiteks. Digipatoloogia levik on kiirendanud alternatiivsete meetodite väljatöötamist kogu slaidipiltide (WSI) hindamiseks [17, 18]. Süvaõppe mudelid, täpsemalt konvolutsioonilised närvivõrgud (CNN-id), on osutunud võimeliseks segmenteerima ja tuvastama histopatoloogilistel slaididel asjakohaseid bioloogilisi struktuure [19–23]. Nendel tehnikatel on potentsiaal liikuda subjektiivselt visuaalselt hindamiselt ja traditsiooniliselt pilditöötluselt täpse, objektiivse ja reprodutseeritava rakkude tuvastamise poole.
Selle uuringu eesmärk on välja töötada meetod mitmete põletikuliste rakumarkerite objektiivseks ja kvantitatiivseks hindamiseks, vältides vajadust ulatusliku seeriaslaidi lõikamise järele. Selleks ühendame mitmekordse IHC, mitme spektraalse pildistamise ja süvaõppe mudelid. Nende meetodite rakendatavuse demonstreerimiseks uurime sügava õppimismudelite abil kvantifitseeritud põletikulise mikrokeskkonna seoseid IFTA arenguga DGF-i patsientide jälgimistransplantaadi biopsiates.
cistanche ekstrakt neeruhaiguste raviks
materjalid ja meetodid
Põletikulise mikrokeskkonna hindamiseks DGF-i patsientide neerubiopsiates teostasime 6 nädalat pärast siirdamist võetud seirebiopsiatel multipleksset IHC-d. Patsiendid kihistati IFTA arendamiseks (<10% versus="" ≥10%)="" from="" 6="" weeks="" to="" 6="" months="" post-transplantation,="" based="" on="" a="" histopathological="" assessment="" by="" three="" kidney="" pathologists.="" multiplex="" ihc="" was="" performed="" using="" tyramide="" signal="" amplification="" (mtsa)="" panels.="" one="" mtsa="" panel="" was="" designed="" for="" the="" visualization="" of="" capillaries,="" macrophages,="" and="" t="" and="" b="" lymphocytes="" (panel="" i),="" and="" one="" mtsa="" panel="" for="" the="" visualization="" of="" polarized="" t-helper="" lymphocytes="" and="" macrophages="" (panel="" ii).="" second,="" the="" mtsa="" slides="" were="" multi="" spectrally="" imaged,="" and="" custom-made="" python="" scripts="" were="" used="" to="" convert="" the="" multispectral="" images="" to="" artificial="" brightfield="" ihc="" wsi.="" converting="" the="" slides="" to="" artificial="" ihc="" wsi="" allowed="" for="" the="" application="" of="" an="" existing="" cnn="" for="" the="" detection="" of="" lymphocytes="" in="" ihc="" [22].="" this="" existing="" cnn="" was="" designed="" for="" cytoplasmatic="" lymphocyte="" markers.="" hence,="" a="" second="" and="" third="" cnn="" was="" developed="" in="" this="" study="" for="" the="" quantification="" of="" macrophages="" and="" nuclear="" lymphocyte="" markers="" in="" ihc="" wsi.="" these="" three="" cnns="" were="" subsequently="" used="" to="" quantitatively="" assess="" the="" inflammatory="" infiltrates="" in="" the="" two="" patient="" groups="" and="" to="" study="" the="" correlations="" of="" the="" inflammatory="" microenvironment="" at="" 6="" weeks="" post-transplantation="" with="" the="" development="" of="" ifta="" 6="" months="" after="">
Koeproovid
Kasutasime Hannoveri meditsiinikoolis (Hannover, Saksamaa) neerutransplantaadi retsipientide seirebiopsiaid, mis saadi tulevase seirebiopsiaprogrammi raames. Kaasamise kriteeriumid olid: DGF-i esinemine (määratletud kui<500 ml="" urine="" production="" within="" the="" first="" 24="" h="" after="" transplantation="" and/or="" the="" need="" for="" dialysis="" within="" 7="" days="" post-transplantation),="" absence="" of="" rejection="" in="" any="" of="" the="" surveillance="" biopsies="" or="" biopsies="" for="" cause="" within="" the="" first="" year="" post-transplantation,="" and="" absence="" of="" ifta="" in="" the="" surveillance="" biopsy="" taken="" at="" 6="" weeks="" after="" transplantation="" (based="" on="" the="" pathology="" report="" and="" graded="" according="" to="" the="" banff="" lesion="" grading="" system="" [24]).="" all="" patients="" were="" treated="" with="" dialysis="" because="" of="" no,="" or="" insufficient="" graft="" function,="" variably="" manifested="" by="" (combinations="" of)="" anuria,="" oliguria,="" metabolic="" de-arrangement="" with="" acidosis,="" or="" hyperkalemia.="" none="" of="" the="" patients="" had="" hyperkalemia="" or="" hypervolemia="" alone.="" formalin-fixed,="" paraffin-embedded="" tissue="" (ffpe)="" from="" biopsies="" taken="" 6="" weeks="" and="" 6="" months="" post-transplantation="" was="" collected.="" six="" patients="" did="" not="" undergo="" a="" surveillance="" biopsy="" procedure="" 6="" months="" after="" transplantation.="" instead,="" the="" surveillance="" biopsy="" was="" taken="" at="" 3="" months="" post-transplantation="" was="" included="" (n="3)" or="" the="" nearest="" cases="" with="" sufficient="" cortical="" tissue="" (here="" defined="" as="" ≥4="" glomeruli)="" in="" both="" the="" 6="" weeks="" and="" the="" 6="" months="" biopsy="" were="" included="" in="" the="" study="" (n="24)." one="" case="" was="" excluded="" because="" of="" interstitial="" nephritis="" of="" unknown="" cause="" and="" one="" more="" case="" due="" to="" fixation="" artifacts.="" a="" final="" number="" of="" 22="" patients="" were="" included="" in="" this="" study="" (table="">
IFTA hinnang
Interstitsiaalse fibroosi (ci) ja tubulaarse atroofia (ct) (IFTA) ulatus 6 nädala ja 6 kuu pärast, väljendatuna Banffi kahjustuse hindamissüsteemi [24] abil, saadi patoloogia aruandest. Varaste põletikuliste inflraatide ja IFTA arengu vahelise seose üksikasjalikumaks hindamiseks digiteeriti kõik PAS-värviga slaidid uuesti uurimiseks Pannoramic 25{9}} Flash II digitaalse slaidi skanneriga (3DHistech, Ungari) koos 20-ga. × objektiiv eraldusvõimega 0,24 μm/piksel. Mõlema ajapunkti (6 nädalat ja 6 kuud) PAS WSI hindasid kolm neerupatoloogi IFTA ulatuses (pinna protsent, 10-protsendiliste intervallidega). Patoloogide keskmisi IFTA skoori kasutati lõpliku skoorina, et arvutada IFTA muutus 6 nädala ja 6 kuu vahel pärast siirdamist. Patsiendid kihistati IFTA skoori absoluutse suurenemise järgi 10 protsenti või rohkem (n=13) ja mitte või<10% increase="" of="" ifta="" (n="9)" (table="" 1).="" recipient="" characteristics,="" donor="" characteristics,="" and="" banff="" ci,="" ct,="" ti,="" i,="" and="" i-ifta="" lesion="" scores="" (obtained="" from="" the="" pathology="" report)="" are="" listed="" in="" table="" 1="" for="" both="" patient="" groups.="" significant="" differences="" between="" patient="" groups="" were="" assessed="" using="" the="" independent="" samples="" mann–whitney="" u="" test="" or="" fisher's="" exact="" test="" and="" are="" displayed="" in="" table="">
Lisaks võrreldi Banffi kahjustuste skoore ajapunktide vahel, kasutades Wilcoxoni märgistatud järjestuste testi. See näitas olulisi erinevusi 6 nädala ja 6 kuu biopsiate vahel Banffi kategooriate ti (p=0.017), ci (p=0.004) ja ct (p=0.011) puhul. .
Multipleksne TSA värvimine
Viisime läbi multipleksse IHC, kasutades mTSA-d, et visualiseerida mitut rakumarkerit 6-nädalase biopsia jooksul. Pärast inkubeerimist primaarse ja sekundaarse antikehaga töödeldi kudet fluorestseeruvalt märgistatud türamiidiga. Sekundaarsest antikehast pärinev mädarõika peroksidaas katalüüsib aktiivsete türamiidi radikaalide moodustumist. Türamiidi radikaalid seonduvad kovalentselt antigeeni türosiinijääkidega. See püsiv sidumine võimaldas primaarse-sekundaarse antikeha kompleksi kuumuse tõttu eemaldada, säilitades samal ajal fluorestseeruva türamiidi ladestise [25]. See võimaldas järgnevat järjestikust inkubeerimist sama liigi täiendavate sihtantigeenide vastaste antikehadega.
mTSA viidi läbi kahel järjestikusel slaidil 6-nädalase jälgimisbiopsia põhjal. Töötasime välja kaks mTSA paneeli, et hinnata meie patsientide rühmades põletikulist infiltratsiooni ja peritubulaarset kapillaaride ulatust. I paneel oli olemas anti-CD3, CD4, CD8, CD20, CD68 ja CD34 antikehadest. II paneeli kasutati T-abistajarakkude ja makrofaagide polarisatsiooni uurimiseks, kasutades anti-CD4, Tbet, GATA3, CD68 ja CD163 antikehi. Antikehade spetsifikatsioonid, lahjendused ja värvimisjärjestused on loetletud täiendavas tabelis 1. Kõik objektiklaasid deparafineeriti ksüleenis, dehüdreeriti 95% etanoolis, pesti kraanivees ja keedeti epitoobi otsimiseks 10x lahjendatud trisboraat-EDTA (Trisboraat-EDTA) lahuses. , 0658, VWR Life Sciences, USA) puhver. Pärast jahutamist pesti slaide endogeense peroksidaasi blokeerimiseks 3-protsendilise vesinikperoksidaasi lahusega ja pesti tris-puhverdatud soolapuhvriga, mis sisaldas 0,05 protsenti Tween 20 (822184, Merck KGaA, Saksamaa) (TBS-T). Valgu blokeerimine viidi läbi, kasutades TBS-T koos 1 protsendi veise seerumi albumiiniga (BSA) (mTSA etapp 1). Primaarseid antikehi inkubeeriti 1 tund toatemperatuuril või üleöö temperatuuril neli kraadi Celsiuse järgi (mTSA etapp 2). Pärast pesemist TBS-T-s inkubeeriti slaide HRP-ga konjugeeritud sekundaarse antikehaga (Poly-HRP-GAMs/Rb IgG, VWRKDPVO999HRP, Immunologic, Holland) 30 minutit toatemperatuuril (mTSA etapp 3). Järgmisena viidi läbi TSA, kasutades Opal 7-color Manual IHC Kit (NEL811001KT, Akoya Biosciences, USA) Opal TSA fluorofoore (mTSA etapp 4) (fluorofoorid ja nende vastavad antikehad on loetletud täiendavas tabelis 1). Antikeha-TSA kompleks eemaldati keemistsükliga TBE puhvris (mTSA etapp 5). mTSA samme 1–5 korrati, kuni slaidid olid värvitud kõigi vastava paneeli antikehadega. Slaidid kaeti DAPI-ga fluoromount-G-ga (00-4959-52, Thermo Fisher, USA).
herba cistanche
Mitmekordne TSA valideerimine
Korduvad keemistsüklid võivad mõjutada sihtepitoobi afiinsust. Mõned antikehad näitavad nõrgemat värvimismustrit pärast koe mitmekordset keetmist, teised antikehad vajavad optimaalse värvumise intensiivsuse saavutamiseks rohkem keetmistsükleid ja teisi ei mõjuta see üldse. Hindasime seda mõju kõigi antikehade puhul, kasutades kromogeenset IHC-d FFPE kontrollmandlite koele. Iga testitud antikeha (n=9) kohta lõigati kuus osa (paksus 4 μm). Kõik objektiklaasid deparafineeriti ksüleenis, dehüdreeriti 95-protsendilises etanoolis, pesti kraanivees ja keedeti epitoopide leidmiseks 10x lahjendatud TBE-s (esimene keemistsükkel). Pärast jahutamist säilitati üks slaid iga testitud antikeha kohta fosfaatpuhverdatud soolalahuses (PBS). Ülejäänud slaidid keedeti uuesti. Seda tsüklit korrati viis korda. Seejärel pesti kõiki slaide 3-protsendilises vesinikperoksidaasi lahuses ja seejärel loputati PBS-is. Primaarseid antikehi (täiendav tabel 1) inkubeeriti 1 tund toatemperatuuril. Pärast inkubeerimist pesti slaidid PBS-is. Anti-CD68, Tiibeti ja GATA3 antikehadega värvitud slaidid vajasid täiendavat inkubeerimist antikehade järgse blokeerimisega (PAB) 15 minutit (VWRKDPVB blokeerimine, Immunologic, Holland). Pärast inkubeerimist pesti slaidid PBS-is ja inkubeeriti HRP-ga konjugeeritud sekundaarse antikehaga (järgides PAB VWRKDPVB110HRP, Immunologic, Holland, vt sekundaarsete antikehade täiendavat tabelit 1). Visualiseerimiseks kasutati 3,3'-diaminobensidiini (DAB) (Bright-DAB, VWRKBS04, Immunologic, Holland). Tulemused on visualiseeritud täiendaval joonisel 1. Nende tulemuste põhjal määrasime mTSA katsete jaoks optimaalse antikehade järjestuse, nagu on loetletud täiendavas tabelis 1.
Kui huvipakkuvad epitoobid paiknevad koos, võivad türamiidi ladestused üksteist segada. Selle steerilise inhibeerimise testimiseks kasutasime mandlite kontrollkoe slaide ja värvisime need oma mTSA paneelidega. Antikehade ekspressiooni mTSA-s võrreldi ühevärviliste slaidide ekspressiooniga, mis läbisid sama arvu keemistsüklit. Me ei täheldanud erinevusi värvimismustrites ühe- ja mitmekordse värvimisega slaidide vahel (näited on lisatud paneelilt I, täiendavad joonised 2 ja 3). Kõiki mTSA primaarseid antikehi kasutati samas lahjenduses, mida kasutati kromogeense IHC jaoks. Fluorestsentssignaali intensiivsust optimeeriti TSA lahuse lahjenduste reguleerimisega.
Multiplex TSA pildistamine
Multispektraalne pildistamine viidi läbi Vectra Polaris Imaging Systemiga (CLS143455, Akoya Biosciences, USA) 20x objektiiviga eraldusvõimega 0,49 μm piksli kohta ning kasutades DAPI, FITC, CY3, Texas Red ja Cy5 spektraalkuubikud. Vectra süsteem võimaldab multispektraalseks omandamiseks käsitsi valida piirkondi, mis seejärel süsteemi poolt plaatideks jaotatakse (joonis 1.1). Autofluorestsentsi spektrid ja kõik Opal TSA fluorofoorid salvestati eelnevalt spektraalraamatukogusse, kasutades tarkvara Inform Advanced Image Analysis Software 2.4.6. (Akoya Biosciences, USA). Spektri raamatukogu võimaldas multipleksi paani lagundada mitmeks üksikuks plaadiks, mis esindavad iga fluorofoori panust ("lahti segamine"). Selle tulemuseks olid monokroomsed mitme kanaliga plaadid, kus iga kanal vastas ühele fluorofoorile ja seega ka antikehale (joonis 1.2).
Teisendamine kunstlikule ereda välja IHC-le
Salvestatud koordinaatide põhjal õmmeldi plaadid, et luua kohandatud pythoni skripti abil mitme kanaliga WSI (joonis 1.3). Kanalid, mis esindavad DAPI signaali (IDAPI) ja kanalid, mis esindavad ühte antikeha (IIHC), muudeti vastavalt tehislikuks hematoksüliiniks ja DAB-värvimiseks (joonised 1.4 ja 1.5). Tuginedes teadaolevatele kromaatilisele hematoksüliinile ja DAB Cx-le, Cy koordinaatidele pärast tooni-küllastustiheduse (HSD) teisendust, saadi varasemates uuringutes plekivektorid [26, 27]. Neid plekivektoreid kasutati kunstliku helgevälja IHC puna-rohe-sinise väärtuste arvutamiseks (joonis 1.5):
CR-ga st värvaine valguse neeldumine st spektri punases osas. B ja G väärtused arvutati sarnaselt.
Pildi analüüs
Huvipiirkonnad (ROI)
Huvipakkuvad piirkonnad (ROI) märgiti iga juhtumi puhul kohordis, kasutades automatiseeritud slaidianalüüsi platvormi tarkvara (ASAP; versioon 1.9, saadaval GitHubi avatud lähtekoodiga tarkvarana). Need ROI-d koosnesid kortikaalsest tubulointerstitiumist, jättes seega välja kapsli, glomerulid ja arterid. Kuna neerude subkapsulaarsete piirkondade põletikku peetakse siirdamispatoloogias mittespetsiifiliseks, analüüsiti selle uuringu biopsiaid peamiselt kapslialuse piirkonna (määratletud kui 400 µm kapslist allpool) väljajätmine. Teiseks kordasime analüüse, sealhulgas subkapsulaarset piirkonda. ROI-de visuaalsed näited on lisatud täiendavale joonisele 4.
Lümfotsüütide tuvastamine CNN I
Tehisliku ereda väljaga IHC kujutisi, mis esindavad CD3, CD4, CD8 ja CD20 värvimist, analüüsiti olemasoleva U-Neti arhitektuuriga CNN-i abil [22, 28]. See võrk oli spetsiaalselt loodud tsütoplasmaatiliste lümfotsüütide markerite tuvastamiseks IHC-s. CNN-i jõudlust saab väljendada täpsuse, meeldetuletuse ja F1- skoorina, kus:
CNN saavutas testikomplektis täpsuse {{0}},76, tagasikutsumise 0,79 ja F1-skoori 0,78 mida kasutati originaalpaberis, mis koosneb traditsioonilisest IHC WSI-st. Üksikute positiivsete rakkude tuvastamine nõuab CNN-i väljundi lävitamist, millele järgneb järeltöötlus. Kuna CD3 värvumine mTSA paneelil oli tugevam võrreldes CD4, CD8 ja CD2-ga0, kasutati viimase kolme puhul madalamat objekti tuvastamise läve (0,4) ja algset objekti tuvastamise läve CD3 puhul (0,7). Et hinnata CNN-i jõudlust kunstliku ereda välja IHC WSI-de puhul selles uuringus, kasutati selles uuringus nelja kunstliku heledavälja IHC WSI-d (kahe patsiendi CD8 ja CD20). Punktimärkused (n=1115) loodi ASAP-tarkvara abil. Pärast võrgu rakendamist arvutati CNN-i toimivuse hindamiseks täpsus, meeldetuletus ja F{19}} skoor. Tuvastusi peeti tõeliselt positiivseks, kui need leiti 4 µm (lümfotsüütide keskmine läbimõõt) raadiuses põhitõe annotatsioonist. Kui 4 µm vahemikus leiti kaks tuvastamist, loeti tõeliseks positiivseks ainult annotatsioonile lähim tuvastamine. Seejärel kasutati lümfotsüütide tuvastamise meetodit CNN I kõigi tsütoplasmaatilisi lümfotsüütide markereid (CD3, CD4, CD8 ja CD20) esindavate tehisliku heledavälja IHC WSI analüüsimiseks.
Lümfotsüütide tuvastamine CNN II
Tehisliku valgusvälja IHC WSI analüüs tuuma värvimismustritega (nagu on esitanud T-bet ja GATA3) kanalid, mis esindavad DAPI ja CD4, valiti ühendamiseks ühte WSI-sse (4). Varasemates uuringutes omandatud plekivektoreid kasutati DAPI signaali kunstlikuks värvimiseks siniseks (hematoksüliin) ja CD4 signaali pruuniks (DAB), mille tulemuseks oli kunstlik heleda välja IHC WSI (5).
nõudis uue CNN-i koolitust, valideerimist ja testimist. Sel eesmärgil lõigati üheksa slaidi neerude, mandlite ja pimesoole FFPE kontrollkoest. Need slaidid värviti IHC-ga anti-Tiibeti (kloon 4B1{{10}}, 14-5825-82, Thermo Fisher Scientific, USA) ja anti-GATA3-ga (kloon L50-823, CM -405B, Biocare Medical, Holland) antikehad. Slaidid digiteeriti Pannoramic 250 Flash II digitaalse slaidiskanneriga eraldusvõimega 0,12 μm/piksel. Kaks vaatlejat koostasid ASAP-tarkvara abil erinevates piirkondades 5726 punktimärki. Viie slaidi märkusi kasutati U-Neti arhitektuuri CNN koolitamiseks, kasutades plaastreid suurusega 256 × 256 piksli suurusega 0,49 μm piksli kohta. CNN-i valideerimiseks ja objekti tuvastamise läve (0,4) määramiseks kasutati kahte WSI-d. CNN-i jõudlust traditsioonilisel IHC WSI-l hinnati kahest IHC WSI-st koosneva kinnipeetud testikomplektiga. CNN-i jõudlust kunstliku valgusvälja IHC WSI puhul hinnati sekundaarse testikomplektiga, mis koosnes neljast tehisvalgusvälja IHC WSI-st (Tiibet ja GATA3 kahelt patsiendilt) 1082 punktiga annotatsiooniga. Mõlema testikomplekti toimivuse hindamiseks arvutati täpsus, meeldetuletus ja F{22}}skoor. Tuvastusi peeti tõeliselt positiivseks, kui need leiti 4 µm kaugusel põhitõe annotatsioonist. Kui 4 µm vahemikus leiti kaks tuvastamist, loeti tõeliseks positiivseks ainult annotatsioonile lähim tuvastamine. Seejärel kasutati lümfotsüütide tuvastamise CNN II-d kõigi tuuma (lümfotsüütide) markereid (Tiibet ja GATA3) esindavate tehislike heledavälja IHC WSI-de analüüsimiseks.
Makrofaagide tuvastamine CNN
Erinevalt lümfotsüütide tuvastamisest ei ole üksikute makrofaagide identifitseerimine ühemõtteline. Eriti rühmitatud stseenides võib eeldada märkimisväärset vaatleja varieeruvust. Seetõttu kasutati CD68 pluss ja CD163 pluss makrofaagide tuvastamiseks spetsiaalse kolmanda CNN-i koolitamiseks palju suuremat arvu juhtumeid ja inimeste annotatsioone. Koguti natiivsest ja siirdatud neerukoest IHC-värvitud objektiklaasid (n=111). IHC värvimine viidi läbi anti-CD68 (kloon PG-M1, GA61361-2, Dako Omnis, Taani või kloon KP1, M0876, Dako, Taani) või anti-CD163 (kloon MRQ) abil. -26 või 10D6, NCL-L-CD163, Leica Biosystems, UK) antikeha. IHC slaidid digiteeriti panoraam-250 Flash II digitaalse slaidiskanneriga või Aperio AT2 slaidiskanneriga (Leica Biosystems, Wetzlar, Saksamaa) eraldusvõimega 0,24 või 0 vastavalt 0,25 μm/piksli kohta. Neli vaatlejat koostasid WSI-des 37 709 punktimärki mitme ROI kohta, kasutades makrofaagide annotatsiooni protokolli, milles lepiti kokku pärast esialgseid pilootkatseid. 101 slaidi annotatsioone kasutati YoloV2 arhitektuuri CNN koolitamiseks [29]. Yolo sobib spetsiaalselt tuvastamisülesannete täitmiseks. Seitsmest konvolutsioonilisest kihist koosnevat võrku treeniti 256 × 256 piksliga plaastritel, mis ekstraheeriti eraldusvõimega 0, 98 μm piksli kohta koos 21 μm piirdekastidega (makrofaagide keskmise suuruse alusel). CNN-i valideerimiseks ja objekti tuvastamise läve (0,45) ja mittemaksimaalsete summutusparameetrite (0,05) määramiseks kasutati kümmet WSI-d. CNN-i jõudlust traditsioonilisel IHC WSI-l hinnati kümnest IHC WSI-st koosneva kinnipeetud testikomplektiga. CNN-i jõudlust kunstliku valgusvälja IHC WSI puhul hinnati sekundaarse testikomplektiga, mis koosnes neljast kunstliku valgusvälja IHC WSI-st (CD68 ja CD163 kahelt patsiendilt) 1033 punktiga annotatsiooniga. Mõlema testikomplekti jõudluse hindamiseks arvutati täpsus-, meeldetuletus- ja F1-skoorid. Tuvastusi peeti tõeliselt positiivseks, kui need leiti 21 µm (keskmine makrofaagi läbimõõt) kaugusel põhitõe annotatsioonist. Kui 21 µm ulatuses leiti rohkem tuvastamisi, loeti tõeliseks positiivseks ainult annotatsioonile lähim tuvastamine. Seejärel kasutati makrofaagide tuvastamise CNN-i kõigi makrofaagimarkereid (CD68 ja CD163) esindavate tehislike eredate IHC WSI-de analüüsimiseks.
cistanche tubolosa testosteroon
Topeltpositiivsus
Rakkude positiivsust kahe markeri suhtes (topeltpositiivsus) hinnati, määrates pikslite arvu raku tuvastamise vahel erinevates kanalites. Kui kahe lümfotsüütide tuvastamise vaheline kaugus oli<4 µm,="" the="" cell="" was="" considered="" double-positive.="" for="" macrophages,="" this="" was="" set="" to=""><21µm. this="" was="" used="" to="" assess="" cd3+cd4+,="" cd3+cd8+,="" cd4+tbet+,="" cd4+gata3+,="" and="" cd68+cd163+="">
Rakkude arv arvutati ROI-de sees ja rakkude tihedus põhines rakkude arvul ja annoteeritud ROI pindalal.
Ruumilised suhted
Automaatne rakkude tuvastamine WSI-s võimaldab uurida rakkude vahelisi ruumisuhteid. Keskmine lühim vahemaa määrati (piirkondades, välja arvatud subkapsulaarne piirkond) CD68 pluss rakkude ja CD3 plus , CD3 plus CD8 plus ja CD20 plus rakkude jaoks mõlema patsiendirühma I paneeli WSI-s ning CD163 pluss rakkude ja CD4 vahel. pluss , CD4 pluss Tbet plus ja CD4 pluss GATA3 plus mõlema patsiendirühma WSI-s.
Peritubulaarne kapillaaride ulatus
Peritubulaarse kapillaaride ulatuse hindamiseks analüüsiti Fidžil CD34 kanalit esindavaid segamata WSI-sid (ImageJ versioon 2.0.0, USA, makrod ja pistikprogrammid: "Open and Duplicate", "ASAP" ROI lugeja") [30]. Positiivsed pikslid määrati automaatse lävendi abil ja seejärel väljendati protsendina ROI-s olevate pikslite koguarvust.
Statistiline analüüs
Järgmiste rakupopulatsioonide tihedused arvutati 6-nädalase biopsia käigus: T-lümfotsüüdid (CD3 pluss), tsütotoksilised T-lümfotsüüdid (CD3 pluss CD8 pluss), B-lümfotsüüdid (CD20 pluss), makrofaagid (CD68 pluss, paneelid I ja II), polariseeritud makrofaagid (CD68 pluss CD163 plus , CD163 plus ), T-helper 1 lümfotsüüdid (CD4 pluss Tbet plus ) ja T-helper 2 lümfotsüüdid (CD4 pluss GATA3 plus ). Spearmani korrelatsioonikoefitsiendid arvutati, et hinnata korrelatsiooni olemasolu T-abistaja 1 ja T-abistaja 2 lümfotsüütide tiheduse (CD4 pluss Tbet pluss, CD4 pluss GATA3 pluss) ja polariseeritud makrofaagide tiheduse (kas CD68 pluss CD163 pluss või CD163 pluss) vahel. Vaatlesime CD68 signaali (fluorofoor 540 nm) I paneeli tehislikes CD4 (fluorofoor 520 nm) IHC-des. Seetõttu anname täiendavalt aru CD3 pluss CD8-rakkude rakkude tihedusest. Erinevate IFTA tulemustega patsiendirühmade vaheliste erinevuste hindamiseks esitame rühma kohta rakutiheduse keskmise, minimaalse ja maksimaalse väärtuse. Rakkude tiheduse ja peritubulaarsete kapillaaride ulatuse (määratletud CD{35}}positiivsete pikslite protsendina) olulisi erinevusi rühmade vahel hinnati sõltumatute proovide Mann-Whitney U testi abil. Seda, kas erinevate IFTA tulemustega patsientidel on CD3 pluss CD8-/CD3 pluss CD8 pluss rakkude suhe oluliselt erinev, hinnati sõltumatute proovide t-testi abil. Patsiendirühmade erinevusi CD68 pluss ja CD163 pluss rakkude ruumilistes suhetes teiste immuunrakkudega hinnati olulisuse osas, kasutades sõltumatute proovide jaoks Mann-Whitney U testi.
Tulemused
CNN-põhine IHC-positiivsete rakkude tuvastamine
Olemasolevate CNN-ide rakendamiseks, mis olid algselt välja töötatud ereda välja mikroskoopia jaoks, muudeti mTSA fluorestsentskujutised tehislikeks ereda väljakujutisteks. Näited mTSA-ga värvitud piirkondadest koos nende vastavate tehisliku ereda väljaga IHC kujutistega on toodud joonisel 2. Kunstliku ereda IHC WSI näide on näidatud täiendaval joonisel 4. Mitme eraldusvõimega WSI-sid saab avada ja vaadata digitaalses slaidivaatamises. tarkvara, nagu ASAP ja Aperio ImageScope [v12.4.3.5008]. Nagu on kujutatud joonisel 2, sobis kunstliku ereda väljaga IHC WSI automaatseks analüüsiks CNN-ide poolt, mis olid algselt välja töötatud traditsioonilise IHC WSI jaoks.
Põletikuliste rakkude kvantitatiivseks hindamiseks kasutati kolme CNN-i 6-nädalase mTSA-ga värvitud siirdamisbiopsiates: lümfotsüütide tuvastamiseks tsütoplasmaatilise (CNN I) ja tuuma (CNN II) IHC värvimisega ning makrofaagide tuvastamiseks. Tabelis 2 on näidatud CNN-i jõudlus (täpsus-, meeldetuletus- ja F{3}}skoorid) nii DAB-värvitud IHC WSI-de kui ka kunstliku ereda väljaga IHC WSI-de kinnipidamiskomplektide puhul. CNN-i jõudlus oli tavaliselt sama hea või parem kui eelnevalt kirjeldatud CNN-i algtase (F1-skooriga 0,78), mille jõudlus oli võrreldav kogenud käsitsi vaatlejatega [22] . Kui lümfotsüütide tuvastamine CNN II näitas virtuaalse ereda väljaga piltidel mõnevõrra väiksemat jõudlust võrreldes tegelike DAB-kujutistega (millel CNN koolitati), siis makrofaagide tuvastamisel täheldati CNN-i puhul vastupidist.
Näide edukast automaatsest topeltpositiivsuse hindamisest on toodud joonisel 3.
Erinevate rakutüüpide korrelatsioon
Kõige tugevamat korrelatsiooni täheldati CD4 pluss GATA3 pluss rakutiheduse ja CD163 pluss rakutiheduse vahel (Spearmani koefitsient 0,75, p < 0.001)="" 6-nädalane="" biopsia="" (täiendav="" joonis="" 5a).="" see="" korrelatsioon="" oli="" nõrgem="" cd4="" pluss="" tbet="" pluss="" rakutiheduse="" ja="" cd163="" pluss="" rakutiheduse="" vahel="" (spearmani="" koefitsient="" 0,61,="" p="">< 0.01)="" (täiendav="" joonis="" 5b)="" .="" kui="" piirata="" rakupopulatsiooni="" topeltpositiivsete="" makrofaagidega="" (cd68="" pluss="" cd163="" pluss),="" oli="" spearmani="" korrelatsioonikoefitsient="" cd4="" pluss="" gata3="" pluss="" rakkudega="" 0,65="" (p="">< 0,01)="" ja="" cd4="" puhul="" 0,66="" (p="">< 0,01)="" pluss="" tbet="" pluss="" rakud="" (täiendav="" joonis="" 5c,="" d).="" subkapsulaarse="" piirkonna="" kaasamine="" analüüsidesse="" ei="" muutnud="">
Põletikuliste infiltraatide võrdlusIFTA-le progresseeruvad patsiendid võrreldes mitte-IFTA-ga
6 kuud pärast siirdamist IFTA-le progresseeruvatel patsientidel oli CD163 pluss rakkude tihedus oluliselt suurem 6 nädalat pärast siirdamist võetud biopsiates (mediaan 505 rakku/mm2) võrreldes patsientidega, kellel IFTA-le ei progresseerunud (mediaan 370 rakku/mm2; p=0 .043) (tabel 3). Subkapsulaarse piirkonna kaasamine vähendas seda efekti veidi (p=0.051). Mõlemas paneelis kasutati CD68 ja CD4. mTSA paneeliga I värvitud slaidid näitasid rohkem CD68 positiivsust kui mTSA paneeliga II värvitud slaidid. CD4 rakkude tihedus on mTSA paneelil II suurem kui mTSA paneelil I (tabel 3).
Peritubulaarsete kapillaaride ulatus oli sarnane erinevate IFTA tulemustega DGF-i patsientide 6-nädalaste biopsiate puhul (tabel 3), nii välja arvatud (p=0.74) kui ka (p=0.90) subkapsulaarne piirkond. analüüsist/analüüsis.
CD3 pluss CD8-/CD3 pluss CD8 pluss rakkude suhte hindamine näitas märkimisväärselt suuremat suhet patsientidel, kellel oli<10% ifta="" development="" 6="" months="" post-transplantation="" (ratio="" of="" 17.5)="" than="" in="" patients="" with="" ≥10%="" ifta="" development="" (ratio="" of="" 9.80;="" p="0.043)" (table="">
Keskmine lühim vahemaa CD68 pluss rakkudest CD3 pluss , CD3 pluss CD8 pluss ja CD20 pluss rakkudeni (paneel I) ning CD163 pluss rakkudest CD4 pluss , CD4 pluss Tbet plus ja CD4 pluss GATA3 pluss rakkudeni (paneel II) oli ei erine patsiendirühmade vahel oluliselt. Tulemused on visualiseeritud joonisel 4.
cistanche ekstrakt: parandab neerufunktsiooni ja füüsilist jõudu
Arutelu
Selles uuringus töötasime välja meetodi põletikuliste rakkude infiltraatide täpseks ja objektiivseks kvantifitseerimiseks DGF-iga neerutransplantaadiga patsientide transplantaadi biopsiates, mis väldib neerubiopsia materjali ulatuslikku jadalõikamist. Sel eesmärgil ühendasime multipleksse IHC, türamiidi signaali võimenduse, multispektraalse pildistamise ja kvantifitseerimise CNN-ide abil. Olime esimesed, kes teisendasid plaaditud multispektraalsed andmed üheks kunstlikuks kromogeenseks kujutiseks rakumarkeri kohta, hõlbustades WSI analüüsi ja ereda välja IHC jaoks mõeldud CNN-ide rakendamist. Kavandasime kaks uut CNN-i tuumavärviga lümfotsüütide ja makrofaagide tuvastamiseks ning demonstreerisime traditsioonilisel IHC WSI-l välja töötatud CNN-ide üldistavust tehisliku valgusvälja IHC WSI-ks. Meie meetodi rakendatavust demonstreeriti CNN-de saadud kvantitatiivsete tulemuste abil, et uurida põletikulise mikrokeskkonna korrelatsioone DGF-i patsientide 6-nädalaste biopsiate ja IFTA tekkega 6 kuud pärast siirdamist.
Kasutasime 6 nädalat pärast siirdamist saadud seirebiopsiates immuunrakkude ja peritubulaarsete kapillaaride visualiseerimiseks kaubanduslikult saadavat käsitsi värvimiskomplekti multipleksse IHC jaoks. Mitmekordse värvimise protseduur koosnes mitmest pesemise, inkubeerimise ja kudede keetmise etapist ning hõlmab mitut reaktiivilahust. Seetõttu on meetodi põhjalik valideerimine ja kvaliteedikontroll väga olulised ning soovitatav on kasutada spetsiifilisi antikehi, mis annavad ühtlase värvumise intensiivsuse. Vaatamata läbiviidud valideerimisetappidele nähti mTSA paneelide I ja II slaidide CD4 kanalites makrofaagitaolisi värvimismustreid. CD4 ja CD68 värvimistsükleid ei viidud läbi järjest, seega ei saanud seda nähtust põhjustada CD68 antikeha mittetäielik eemaldamine (täiendav tabel 1). Kuigi on kirjeldatud harvaesinevaid makrofaagide topeltpositiivsuse juhtumeid CD4-ga [31], on usutavam seletus fluorofooride emissioonispektrite läheduses, mida kasutati CD4 (520 nm) ja CD68 (540 nm) visualiseerimiseks. fluorestsentsmikroskoobi FITC-filtri kuubiku abil. See võib põhjustada tugeva CD68 signaali "verejooksu" CD4 kanalisse. Suur osa sellest signaalist jäeti I paneeli analüüsist välja, kuna üldiseks T-abistajarakkude analüüsiks kasutati ainult CD4 pluss rakke, mis olid CD3 suhtes topeltpositiivsed. Sellegipoolest otsustasime kaudselt hinnata ka üldisi T-abistajarakke, kasutades asendusena CD3 pluss CD8−. II paneelis kasutati CD4 ainult koos Tiibeti ja GATA3-ga, mis piiras valepositiivsete tuvastuste kasutamise riski.
II paneelis täheldati madalamat CD68 positiivsust võrreldes I paneeliga. Oletame, et see on CD163-le kuuluva türamiidi ladestumise põhjustatud steerilise inhibeerimise tulemus ("vihmavarjuefekt") [32]. Me täheldasime uuritud kohordis märkimisväärselt rohkem CD163-positiivseid rakke kui mandlite koes, mida kasutati steerilise inhibeerimise kontrollimiseks, mis võib seletada, miks seda efekti valideerimise käigus ei avastatud.
Multipleksset IHC-d on kombineeritud multispektraalse pildistamisega kasvaja mikrokeskkonna uurimiseks mitmetes onkoloogilistes uuringutes ja hiljuti ka neeru allografti äratõukereaktsiooni analüüsimiseks [33–35]. Kõigi markerite panuse eraldamiseks mTSA slaididel pildistatakse lõigud Vectra süsteemi või sarnase multispektraalse seadistusega fluorestsentsmikroskoobiga. Pärast väikese suurendusega ülevaatepildi salvestamist jagab Vectra süsteem koe plaatideks ja skannib paanid automaatselt multispektriliselt. Selle tulemuseks on mitme spektriga pildiplaadid. Kuna üksikute fluorofooride spektrid on eelnevalt salvestatud spektraalsest "teegist" teada, on multipleksi plaadid võimalik lagundada mitmeks üksikuks plaadiks, mis esindavad iga fluorofoori panust ("segamatus"). Enamikus uuringutes analüüsitakse segamata pilte seejärel kaubandusliku tarkvaraga. Paljudel juhtudel ei toeta need programmid WSI analüüsi, neil on raskusi rühmitatud rakkude analüüsimisel ning need ei ole sageli artefaktide ja värvimisvariatsioonide suhtes vastupidavad. Segamata plaatide muutmine tehislikeks heleda välja IHC WSI-deks võimaldas meil rakendada olemasolevat CNN-i, mis on spetsiaalselt loodud lümfotsüütide tuvastamiseks IHC-s [22] (mida nimetatakse lümfotsüütide tuvastamiseks CNN I). See võrk suudab tuvastada üksikuid ja rühmitatud lümfotsüüte suure täpsusega, olles samas vastupidav taustavärvimisele (joonis 2, CD3). Lisaks koolitasime kahte uut CNN-i tuumavärvimismustriga rakkude (Tiibet, GATA3) tuvastamiseks (lümfotsüütide tuvastamine CNN II) ja makrofaagide tuvastamiseks. Makrofaage on nende hajutatud värvimismustri tõttu kurikuulsalt raske tuvastada. Makrofaagide tuvastamise CNN-i koolitati seetõttu nelja erineva eksperdi annotatsioonide abil. Enne annotatsioonide tegemist kavandati mitu koosolekut, kus arutati ja hinnati makrofaagide märkuste tegemise kriteeriume. Selle tulemuseks oli võrk, mis suudab makrofaage tuvastada reprodutseeritaval viisil, olles samas tugev mittespetsiifilise värvimise jaoks (tabel 2, joonis 2 ja täiendav joonis 6). Meile teadaolevalt on see esimene algoritm makrofaagide tuvastamiseks skaneeritud histopatoloogilistes lõikudes. Testisime kõigi kolme võrgu jõudlust testikomplektis, mis koosnes traditsioonilisest IHC WSI-st (sarnane treeningu ajal kasutatavatele) ja teisese testikomplektiga, mis koosnes tehisliku ereda väljaga IHC WSI-st, mis genereeriti mitme spektraalselt salvestatud kujutiste põhjal. Kõik CNN-id näitavad väga head jõudlust esmastes testikomplektides ja sarnaseid F{11}}skoore teisestes testikomplektides. Lümfotsüütide tuvastamise CNN I jõudlusnäitajad arvutati normaalsete kudede, artefaktide ja rakuklastrite põhjal. Teise testikomplekti kunstlik heleda välja IHC ei sisaldanud koeartefakte ja vähem rakuklastreid. See võib seletada selle võrgu üldist paremat jõudlust teises testikomplektis. Makrofaagide tuvastamise CNN-i koolitati ja testiti nelja erineva annotaatori annotatsioonide põhjal. Kuigi annotatsioonikriteeriume arutati eriti, täheldati annotatsioonistiili erinevusi. CNN-i tundlikkus jääb seetõttu ilmselt kuskile annotatsioonistiili äärmuste keskele. Teise testikomplekti annotatsioonid genereeris üks annotaator, mis näib olevat vastavuses CNN-i tundlikkusega.
Kirjeldatud CNN-i kasutamine võimaldas meil enneolematu täpsusega uurida põletikulist infiltraati DGF-iga siirdatud patsientide ainulaadses rangelt valitud varajase seire biopsiate seerias.
Kahjuks tuli mitu proovi analüüsist välja jätta, peamiselt seetõttu, et pärast diagnostilist töötlust ei olnud piisavalt koejääke. Isegi andmekogu piiratud suuruse juures leidsime IFTA väljakujunemiseni arenenud DGF-i patsientide biopsiates oluliselt suurema CD163 pluss rakkude tiheduse, mis on kooskõlas nende rakkude potentsiaalselt soodustava rolliga [11]. Kuigi täheldatud suundumus oli kooskõlas avaldatud andmetega, ei saanud me kinnitada CD68 pluss makrofaagide varase esinemise kahjulikku mõju, mida on varem teatatud teiste neerusiirdamisega patsientide rühmade puhul [7, 36, 37]. Leidsime positiivse korrelatsiooni CD4 pluss GATA3 pluss rakkude ja CD163 pluss rakkude tiheduse vahel, mis võib kinnitada T-helper 2 lümfotsüütide panust profibrootilisse mikrokeskkonda. Kuigi selles uuringus ei avastatud uusi ennustavaid biomarkereid IFTA arenguks DGF-i patsientidel, töötasime edukalt välja meetodid põletikulise infiltraadi täpseks, reprodutseeritavaks ja skaleeritavaks hindamiseks hõredas koes, näiteks siirdamise biopsiad. Need meetodid on väärtuslikud tulevaste kvantitatiivsete uuringute jaoks histopatoloogilise koe põletiku kohta.
Neerupealiste väsimuse leevendamiseks cistanche'iga klõpsake lisateabe saamiseks siin
Andmete kättesaadavus
Koostöötaotlused, mis hõlmavad selles uuringus esitatud andmete kasutamist, võib saata vastavale autorile (jeroen.vanderlaak@radboudumc.nl) või FF-ile (Feuerhake. Friedrich@mh-hannover.de).
Tänuavaldused
Täname Mark Gorrist ja Kiek Verrijpi nõuannete eest mTSA värvimise ja pildistamise kohta, Merijn van Erpi kohandatud ImageJ funktsioonide väljatöötamise eest ning Sophie van den Broeki, Milly van de Warenburgi ja Martijn Ottenit makrofaagide tuvastamise võrgu jaoks põhjatõe loomise eest. Lisaks täname Irina Scheffnerit abi eest kliiniliste andmete kogumisel.
Autorite kaastöödMH, VV, JS, WG, FF, BS, LBH ja JAWML
kujundas uuringu. Patsiendi materjalid ja kliinilised andmed kogusid ja esitasid JS, WG ja FF. FF koordineeris MHH-s tehtud jõupingutusi. JHB, EJS ja JK hindasid IFTA protsendi PAS-i slaidi. MH teostas mTSA värvimised, paneelide I ja II valideerimise ning paneeli I pildistamise ja segamise lahtiühendamise. VV kujutisega ja segamata paneel II. DJG töötas välja meetodid mTSA plaatide teisendamiseks kunstlikuks ereda välja WSI-ks. MH teostas teisendusi. ZS-C töötas välja lümfotsüütide tuvastamise CNN-id ja kirjutas lümfotsüütide kvantifitseerimise skriptid. JL töötas välja makrofaagide tuvastamise CNN-id ja kirjutas makrofaagide kvantifitseerimise skriptid. MH teostas rakkude ja kapillaaride kvantifitseerimise. NSS arvutas rakkude kaugused. MH, BS, LBH ja JAWML analüüsisid andmeid. MH tegi arvud ja koostas paberi. Käsikirja lõplik versioon vaadati üle ja kiideti heaks kõigi autorite poolt.
RahastamineSeda tööd toetas algatus ERACoSysMed (projekt SysMIFTA) Euroopa Liidu raamprogrammi Horisont 2020 raames, mida pakkus ZonMw (grandi nr 9003035004), kaasrahastas Saksamaa Teadus- ja Haridusministeerium (BMBF), grandi nr. . FKZ031L-0085A (SysMIFTA), FKZ01ZX1710A (MicMode-I2T) ja FKZ01ZX1608A (SYSIMIT). JAWML sai nõustamistasusid Philipsilt (Holland) ja toetusi
ContextVision, Philips (Holland) ja Sectra (Rootsi), väljaspool esitatud tööd. JK sai rahalist toetust Hollandi Neerufondilt (projekt DEEPGRAFT, toetus nr 17OKG23).
Eetiliste standardite järgimine
Huvide konfliktAutorid ei deklareeri konkureerivaid huve.
Eetiline kinnitus ja nõusolek osaledaAndmete kogumine ja analüüs viidi läbi patsiendi teadlikul nõusolekul ja Hannoveri meditsiinikooli eetikanõukogu (nr 2765) nõusolekul.
Väljaandja märkusSpringer Nature jääb avaldatud kaartidel ja institutsionaalsete seoste kohta avaldatud jurisdiktsiooninõuete osas neutraalseks.
Avatud juurdepääsSee artikkel on litsentsitud Creative Commons Attribution 4.0 Rahvusvaheline litsents, mis lubab kasutamist, jagamist, kohandamist, levitamist ja reprodutseerimist mis tahes andmekandjal või vormingus, tingimusel et annate originaalautori(te)le asjakohase tunnustuse. ) ja allikas, lisage link Creative Commonsi litsentsile ja märkige, kas muudatusi on tehtud. Selles artiklis olevad pildid või muu kolmanda osapoole materjal sisaldub artikli Creative Commonsi litsentsis, kui materjali krediidilimiidil ei ole märgitud teisiti. Kui materjal ei sisaldu artikli Creative Commonsi litsentsis ja teie kavandatud kasutamine ei ole seadusega lubatud või ületab lubatud kasutust, peate hankima loa otse autoriõiguse omanikult.
Viited
1. Siedlecki A, Iirimaa W, Brennan DC. Siirdamise hilinenud funktsioon neerusiirdamisel. Olen J siirdamine. 2011;11:2279–96.
2. Khalkhali HR, Ghafari A, Hajizadeh E, Kazemnejad A. Transplantaadi pikaajalise kadumise riskifaktorid kroonilise allotransplantaadi düsfunktsiooniga neerutransplantaadi retsipientidel. Exp Clin siirdamine. 2010;8:277–82.
3. Yarlagadda SG, Coca SG, Formica RN, Poggio ED, Parikh CR. Seos siiriku hilinenud funktsiooni ja allografti ning patsiendi ellujäämise vahel: süstemaatiline ülevaade ja metaanalüüs. Nephrol Dial siirdamine. 2009;24:1039–47.
4. Schröppel B, Legendre C. Neerutransplantaadi hilinenud funktsioon: mehhanismist translatsioonini. Kidney Int. 2014;86:251–8.
5. Mengel M, Reeve J, Bunnag S, Einecke G, Jhangri GS, Sis B jt. Täieliku põletiku skoor on parem kui praegune Banffi põletiku skoor, mis võimaldab ennustada neeru allotransplantaatide tulemust ja molekulaarsete häirete astet. Olen J siirdamine. 2009;9:1859–67.
6. Cosio FG, Grande JP, Wadei H, Larson TS, Griffin MD, Stegall
MD. Neeru allotransplantaadi funktsiooni hilisema languse ennustamine varase seire biopsiate põhjal. Olen J siirdamine. 2005;5:2464–72.
7. Toki D, Zhang W, Hor KLM, Liuwantara D, Alexander SI, Yi Z jt. Makrofaagide roll inimese neeru allotransplantaadi fibroosi tekkes esimesel aastal pärast siirdamist. Olen J siirdamine. 2014;14:2126–36.
8. Ikezumi Y, Suzuki T, Yamada T, Hasegawa H, Kaneko U, Hara M jt. Alternatiivselt aktiveeritud makrofaagid kroonilise neeru allotransplantaadi kahjustuse patogeneesis. Pediatr Nephrol. 2015;30:1007–17.
9. Biswas SK, Mantovani A. Makrofaagide plastilisus ja interaktsioon lümfotsüütide alamhulkadega: vähk kui paradigma. Nat Immunol. 2010;11:889–96.
10. Anders HJ, Ryu M. Neerude mikrokeskkonnad ja makrofaagide fenotüübid määravad neerupõletiku ja -fibroosi progresseerumise või taandumise. Kidney Int. 2011;80:915–25.
11. Ordikhani F, Pothula V, Sanchez-Tarjuelo R, Jordan S, Ochando J. Macrophages in organ transplantation. Frontiers Immunol. 2020;11:582939.
12. Loverre A, Divella C, Castellano G, Tataranni T, Zaza G, Rossini M jt. T-abistaja 1, 2 ja 17 raku alamrühmad neerutransplantaadiga patsientidel, kellel on transplantaadi hilinenud funktsioon. Transpl Int. 2011;24:233–42.
13. Klauschen F, Müller KR, Binder A, Bockmayr M, Hägele M, Seegerer P jt. Kasvajat infilteerivate lümfotsüütide hindamine: visuaalsest hindamisest masinõppeni. Seminar Cancer Biol. 2018;52:151–7.
14. Lauren J, Häyry P, Paavonen T. Pildianalüüsil põhinev meetod kroonilise allograftikahjustuse indeksi parameetrite kvantifitseerimiseks. AMPS. 2006;114:440–8.
15. Malpica N, Solórzano CO, de, Vaquero JJ, Santos A, Vallcorba I, García-Sagredo JM jt. Veelahkmealgoritmide rakendamine rühmitatud tuumade segmenteerimiseks. Tsütomeetria. 1997;28:289–97.
16. Lai YK, Rosin PL. Tõhus ringikujuline lävi. IEEE Trans Med pildindus. 2014; 23:992–1001.
17. Litjens G, Kooi T, Ehteshami Bejnordi B, Setio AAA, Ciompi F, Ghafoorian M jt. Küsitlus meditsiinilise pildianalüüsi süvaõppe kohta. Med Image Anal. 2017;42:60–88.
18. Madabhushi A, Lee G. Pildianalüüs ja masinõpe digitaalses patoloogias: väljakutsed ja võimalused. Med Image Anal. 2016;33:170–5.
19. Ehteshami Bejnordi B, Veta M, Diest PJ, van, Ginneken B, van, Karssemeijer N, Litjens G jt. Süvaõppe algoritmide diagnostiline hindamine lümfisõlmede metastaaside tuvastamiseks rinnavähiga naistel. JAMA. 2017;318:2199–210.
20. Hermsen M, Bel T, de, Boer M, den, Steenbergen EJ, Kers J, Florquin S et al. Neerukoe süvaõppepõhine histopatoloogiline hindamine. J Am Soc Nephrol. 2019;30:1968–79.
