Feruulhappe-fosfolipiidide kompleksi valmistamine lahustuvuse, lahustuvuse ja B16F10 raku melanogeneesi inhibeerimise aktiivsuse parandamiseks

Abstraktne

Taust

Feruulhape(FA; 4-hüdroksü-3-metoksükaneelhape) sisaldub paljudes toiduainetes, sealhulgas nisus, riisis, odras, kaeras, tsitrusviljades ja tomatites [1]. On näidatud, et FA pakub märkimisväärset nahakaitset UV-indutseeritud oksüdatiivse stressi eest [2]. See taastab hiirte nahakasvajate kroonilise UVB-indutseeritud oksüdatiivse kahjustuse, moduleerides vaskulaarse endoteeli kasvufaktori (VEGF), indutseeritava lämmastikoksiidi süntaasi (iNOS), tuumori nekroosifaktori (TNF)- ja interleukiini (IL) ekspressiooni{{7} } [3]. Samuti moduleerib see muteerunud p53, Bcl{10}} ja Baxi ekspressiooni UVB-indutseeritud hiirte nahakasvajate korral [4]. Mitmed uuringud on näidanud, et FA pärsib tsütotoksiliste ja põletikuga seotud ensüümide [5] ja maatriksi metalloproteinaaside (MMP) ekspressiooni ning nõrgendab kollageenikiudude lagunemist [6].

Asjakohaste uuringute kohaseltcistancheon tavaline ravimtaim, mida tuntakse kui "imerohi, mis pikendab eluiga". Selle põhikomponent ontsistanosiid, millel on erinevad toimed, nagu antioksüdant, põletikuvastane ja immuunfunktsiooni edendav toime. Mehhanism vahelcistanchejanaha valgendaminepeitub tsistanche glükosiidide antioksüdantses toimes. Inimese nahas sisalduv melaniini toodetakse türosiini oksüdeerumisel, mida katalüüsib türosinaas ja oksüdatsioonireaktsioon eeldab hapniku osalemist, mistõttu kehas olevad hapnikuvabad radikaalid muutuvad oluliseks melaniini tootmist mõjutavaks teguriks.Cistanchesisaldab tsistanosiidi, mis on antioksüdant ja võib vähendada vabade radikaalide teket organismis, pärssides seega melaniini tootmist.

Lisaks on tsistanche funktsioon ka kollageeni tootmise soodustamise funktsioon, mis võib suurendada naha elastsust ja läiget ning aidata parandada kahjustatud naharakke. Cistanche fenüületanoolglükosiididel on türosinaasi aktiivsust märkimisväärne allareguleeriv toime ning mõju türosinaasile on konkureeriv ja pöörduv inhibeerimine, mis võib anda teadusliku aluse Cistanche valgendavate koostisosade väljatöötamiseks ja kasutamiseks. Seetõttu on tsistansil naha valgendamisel võtmeroll. See võib pärssida melaniini tootmist, et vähendada värvimuutust ja tuhmust; ja soodustab kollageeni tootmist, et parandada naha elastsust ja sära. Tänu cistanche'i nende mõjude laialdasele tunnustamisele on paljud nahka valgendavad tooted hakanud lisama taimseid koostisosi, nagu Cistanche, et rahuldada tarbijate nõudlust, suurendades seeläbi Cistanche'i kaubanduslikku väärtust.nahka valgendavad tooted. Kokkuvõtlikult võib öelda, et cistanche roll innaha valgendamineon ülioluline. Selle antioksüdantne toime ja kollageeni tootv toime võivad vähendada värvimuutust ja tuhmust, parandada naha elastsust ja läiget ning saavutada seeläbi valgendava efekti. Samuti näitab Cistanche laialdane kasutamine nahka valgendavates toodetes, et selle rolli kaubanduslikus väärtuses ei saa alahinnata.

Valgendamiseks klõpsake valikul Cistanche

Küsi lisa:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Fosfolipiidkomplekse kasutatakse laialdaselt farmaatsiatööstuses. Neil on hea läbilaskvus ja ohutus ning neile pööratakse üha enam tähelepanu kosmeetikatoodetes kasutamiseks. Kuna fosfolipiidid on biofunktsionaalsed pindaktiivsed ained, millel on head solubiliseerivad omadused, saab neid kasutada vähemlahustuvate ravimite kandesüsteemidena [7], mis parandavad transdermaalset läbitungimist ja paikselt manustatavate ravimite kumulatiivset läbitungimiskiirust [8]. Ravimite transdermaalne läbitungimine hõlmab lahustumist, jaotumist ja difusiooni nahka. Seda protsessi mõjutavad füüsikalised ja keemilised omadused, eriti manustatava ravimi õli-vesi jaotuskoefitsient [9].

meetodid

Materjalid

Rakukultuur

FA-PC valmistamine lahusti aurustamisega

Feruulhappe ja fosfolipiidide optimaalse vahekorra sõelumine

FA ja fosfolipiidid molaarsuhetes 2:1, 1:1, 1:2, 1:3 ja 1:4 lisati 100 ml ümarapõhjalistesse kolbidesse ja lahustati veevabas etanoolis (FA, 2,0 mg/ml). Segu segati pidevalt 40 kraadi juures 1 tund ja seejärel eemaldati veevaba etanool pöördaurustiga. Kuivatatud FA-PC kompleksid pandi 24 tunniks eksikaatorisse.

FA-PC valmistamise optimaalse reaktsioonitemperatuuri sõelumine

FA-PC ettevalmistamise optimaalse reaktsiooniaja skriinimine

FA optimaalse kontsentratsiooni sõelumine

FA-PC iseloomustus

Diferentsiaalne skaneeriv kalorimeetria (DSC)

Lahustuvus ja õli-vesi jaotuskoefitsient

Lahustuvus

Pulbrilise FA ja FA-PC lahustuvuse määramiseks lisati 1 0.0 ml [10] veele või n-oktanoolile proovide liig ja loksutati seejärel 3 tundi pöördalusel. 37 kraadi juures. Lahustumatu FA eemaldamiseks tsentrifuugiti segusid kiirusel 15, 000 p/min 10 minutit. Seejärel filtriti supernatandid läbi 0,45 µm membraanide. Seejärel lahjendati filtraadid kümnekordselt metanooliga ja FA sisaldus määrati UV-spektrofotomeetriga (UV-3150; Shimadzu; Jaapan).

Valmistati FA ja FA-PC proovid (10 ml) veega küllastunud n-oktanoolis ja loksutati. Igale proovile lisati n-oktanooliga küllastunud vett (10 ml) ja segunevat vedelikku loksutati 24 tundi. Seejärel lasti proovidel kihistamiseks seista. FA kontsentratsioon igas faasis määrati UV-spektrofotomeetria abil (UV-3150; Shimadzu; Jaapan). Analüüsid viidi läbi kolmes eksemplaris.

In vitro difusioon

In vitro difusiooniuuringud viidi läbi Franzi difusioonirakkudega (TK-20A; Shanghai Xie Kai Financial Information Service Co., Ltd.; Hiina). Lisaks kasutasime Strat-M® membraane, mis on sünteetilised membraanid, millel on difusiooniomadused, mis korreleeruvad tihedamalt inimese nahaga kui loomanaha mudelid [11]. Membraanid kinnitati vertikaalsete difusioonirakkude doonor- ja vastuvõtjakambrite vahele ning vastuvõtjakambrid täideti fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS; pH 7, 4), et lahustada FA või FA-PC ja tagada neeldumistingimused.

Kromatograafiline eraldamine viidi läbi, kasutades Agilent 1260LC-seeria süsteemi (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA), mis oli varustatud online-vaakumdegasaatori, kvaternaarse pumba, automaatse proovivõtturi, termostaadiga kolonni sektsiooni ja dioodide massiivi tuvastamisega (DAD). ). Kasutati Agilent Technologies ChemStationi vedelikkromatograafia tarkvara (LC; B.{14}}2.01) ja HPLC eraldamine viidi läbi kolonni Eclipse plus-C18 (4,6 × 250 mm, 5 μm) abil. Detekteerimise lainepikkus oli 0,05 protsenti äädikhapet (A) ja metanooli (B) (40:60, maht/maht). Voolukiirus oli 1,0 ml/min. Kolonni temperatuur määrati 30 kraadile. Tehti kumulatiivsed parandused, et teha kindlaks iga ajaintervalli jooksul vabanenud FA kogus. Kõik mõõtmised viidi läbi kolmes korduses ja membraanist läbi imbunud kumulatiivse FA protsent ( Q protsent) kanti aja funktsioonina.

Melanogeneesi pärssimine

B16F10 rakkude elujõulisuse test

Rakkude elujõulisust ja rakkude proliferatsiooni hinnati {{0}}(4,5-dimetüültiasool-2-üül)-2,5-difenüültetrasooliumbromiidi (MTT) abil. analüüs [2]. B16F10 rakke töödeldi eelnevalt FA ja FA-PC kontsentratsioonidega 0,25, 0.5, 1.0, 2,0 ja 4,0 mg/ml. Pärast 48-tunnist inkubeerimist lisati MTT lahus (lõppkontsentratsioon: 5 mg/ml) ja rakke inkubeeriti 3 tundi 37 °C juures. Lõpuks mõõdeti iga proovi neeldumine mikroplaadilugejaga 570 nm juures, et saada elujõuliste rakkude protsent.

Melaniini sisalduse mõõtmine

Melaniini sisaldust mõõdeti vastavalt eelnevalt kirjeldatule [6] mõningate muudatustega. B16F10 melanoomirakud külvati (2 × 105 rakku süvendi kohta 3 ml söötmes) kuue süvendiga kultuuriplaatidele ja inkubeeriti üleöö, et võimaldada rakkudel kleepuda. Töötlemise lõpus pesti rakke PBS-ga ja lüüsiti 10% dimetüülsulfoksiidi (DMSO) sisaldava 1 M NaOH-ga 30 minutit temperatuuril 80 °C. Neeldumist (optiline tihedus; OD) mõõdeti 475 nm juures, kasutades mikroplaadilugejat. Melaniini sisaldus arvutati järgmise valemi abil:

Andmete analüüs

Iga ravitud rühma ja kontrollrühma keskmiste mõõtmiste erinevuste statistiline olulisus määrati Dunnetti t-testi abil. P väärtused<0.05 were considered statistically significant.

Tulemused ja arutlus

FA-PC optimaalne ettevalmistus

FA-PC lahustuvus ja õli-vesi jaotuskoefitsient

Tabelis 1 on näidatud FA, PM ja FA-PC lahustuvus vees ja n-oktanoolis. FA-PC lahustus vees ja n-oktanoolis (vastavalt 1,68 ja 7,77 mg/ml) hästi ning FA-PC lahustuvus n-oktanoolis leiti olevat oluliselt kõrgem kui FA-l (1,34 mg/mL). .

Lipofiilsust mõõdetakse tavaliselt jaotustegurina (P) kahe segunematu faasi vahel. Tavaliselt väljendatakse seda log P-na. Määrati FA ja FA-PC näivad jaotuskoefitsiendid n-oktanooli/vee süsteemis. Tulemused näitasid, et FA-PC (1,21) log P oli kõrgem kui FA (0,99), mõõdetuna pH väärtusel 5.0. Veidi suurenenud log P oli seotud FA-PC märkimisväärselt paranenud n-oktanooli lahustuvusega võrreldes FA lahustumisega. FA-PC suurenenud lahustuvus n-oktanoolis võib olla seletatav FA-PC amorfsete omadustega. Kuna lipofiilsus ja läbilaskvus on omavahel hästi seotud, viitavad need tulemused sellele, et FA transdermaalset läbilaskvust saab parandada, kui seda kasutada fosfolipiidide kompleksina.

DSC 

DSC on usaldusväärne meetod ravimite ja abiainete ühilduvuse skriinimiseks ning annab maksimaalset teavet ravimite ja abiainete võimalike koostoimete kohta [10]. Interaktsiooni olemasolu võib järeldada endotermiliste piikide kõrvaldamise, uute piikide ilmnemise, piigi kuju ja alguse muutuste, piigi temperatuuri/sulamistemperatuuri ning suhtelise pindala või entalpia põhjal. Joonisel 1 on näidatud FA (joonis 1a), PC (joonis 1b), PM (joonis 1c) ja FA–PC (joonis 1d) DSC termogrammid. Puhta FA termilisel kõveral on tüüpiline terav endotermiline sulamistemperatuur umbes 172,7 kraadi juures, mis näitab selle veevaba ja kristallilist olekut, samas kui fosfolipiididel on väike endotermiline tipp 231,7–248,6 kraadi juures. PM DSC kõver, mis koosneb FA ja fosfolipiidide termoprofiilidest, ei näita olulistmuutused, välja arvatud väike nihe kõrgemale temperatuurile (175,9 kraadi), mis näitab, et komponentide vahel puudub interaktsioon. FA-PC-l on üks peamine tipp 158,2 kraadi juures, miserineb FA tipust, mis näitab interaktsiooni FA ja PC vahel. Meie tulemused näitavad, et interaktsiooni ja/või amorfiseerumise astmed on erinevadsegusid või komplekse võib saada sõltuvalt nende valmistamismeetodist ja see on seotud lahustuvuse erinevustega.

FTIR

FTIR-spektroskoopia võib kinnitada FA-PC moodustumist, võrreldes FA-PC spektrit puhta FA spektriga. Joonisel 2 on näidatud FA, PC, PM ja FA-PC FTIR spektrid. FA-spekter (joonis 2a) näitab iseloomulikku hüdroksüülrühma venitusriba 3436 cm-1 juures. See kõik muutub spektrites FA-PC, PM ja fosfolipiidid laiaks singletiks (joonis 2b-d). FA-spektril (joonis 2a) on iseloomulikud piigid 1620 cm-1 (C=C venitus) ja 1450 cm-1 (C=C aromaatse tsükli venitamine). FA-PC spektris (joonis 2b) ei ole need kaks piiki nähtavad, tõenäoliselt nõrgenemise või eemaldamise või fosfolipiidimolekuli varjestuse tõttu.

FA spektril (joonis 2a) on iseloomulikud küllastumata karboksüülrühma piigid 1691 cm-1 (C=O venitamine) ja 1664 cm-1 (C=C venitamine). FA-PC spektris (joonis 2b) need kaks piiki ei ole nähtavad, tõenäoliselt FA negatiivse karboksüüllaengu ja fosfolipiidide positiivse lämmastiku laengu vahel tekkivate atraktiivsete jõudude tõttu. Fosfolipiidide spekter (joonis 2d) on saavutanud haripunkti 1733 cm-1 (C=O venitus), 1238 cm-1 (P=O venitus) ja 1087 cm-1 (P-O). –C venitamine). The

SEM

FA, PC, PM ja FA-PC pinnamorfoloogiaid uuriti SEM-i abil (joonis 3). Joonisel 3c on FA kristalne, peaaegu ristkülikukujuline, samas kui FA-PC osakesed (joonis 3a) on ebakorrapärase kujuga ja sileda pinnaga. FA-PC omab oluliselt erinevat kuju ja pinna topograafiat võrreldes FA ja PC omaga (joonis 3b). Tõenäoliselt on see tingitud FA täielikust segunemisest arvutis. PM-skaneerimisel (joonis 3d) on nii FA kui ka fosfolipiidid kergesti eristatavad.

In vitro difusiooniuuringud

Hiljuti võeti sünteetiline Strat-M® membraan kasutusele inimnaha in vitro difusiooniuuringute asendajana [11]. Strat-M® membraan koosneb kahest polüeetersulfooni kihist, mis on difusioonikindlad. Polüeetersulfooni kihid asuvad ühe polüolefiinikihi peal, mis on avatum ja hajusam. Seda sünteetilist membraani iseloomustab väike partiidevaheline varieeruvus, pakkudes seega ühtsemaid andmeid. Lisaks on näidatud, et Strat-M® membraanide difusiooniandmed korreleeruvad hästi inimese naha difusiooniandmetega [11].

Et hinnata PC mõju FA in vitro difusiooniomadustele, joonistati FA ja FA-PC protsent Q aja suhtes. Käesoleva artikli tulemused näitasid suundumust, et fosfolipiidid suurendasid märkimisväärselt FA läbitungimist Strat-M® membraani. Lisaks püsis FA-PC Strat-M® membraanil kauem kui FA (joonis 4). Seetõttu võib fosfolipiidide lisamine FA-sse pikendada selle viibimisaega sarvkihis ja muuta see naha läbilaskmiseks sobivamaks. Mis puudutab läbitungimisaega, siis kuigi on teatatud, et Strat-M® membraanil on hea korrelatsioon inimese naha omaga [11], on sellel ka tekstuurilisi erinevusi võrreldes inimese nahaga. Läbilaskvusaegade mõjuteguriteks võivad olla lahusti, ühendite kontsentratsioon, pH väärtus jne. Tulevases analüüsis tuleks teha rohkem katseid.

Melanogeneesi pärssimine

FA-PC mõju melaniini sünteesile

Kirjanduse andmetel võib FA pärssida raku türosinaasi aktiivsust ja melanogeneesi B16F10 melanoomirakkudes raku valkude c-kit ja ERK1/2 allareguleerimise kaudu [12]. Käesolevas uuringus vähendas FA-PC testitud kontsentratsioonidel 0,25, 0,5 ja 1,0 mg/ml melaniini sisaldust B16F1{{10}} rakkudes ilmsemalt kui FA (tabel 2). Seega tegime kindlaks, et FA-PC on melaniini sünteesi pärssimisel B16F10 rakkudes tõhusam kui FA.

Järeldus

Autorite kaastööd

LL ja LY on andnud olulise panuse andmete väljatöötamisse ja kavandamisse või hankimisse või andmete analüüsisse ja tõlgendamisse; XY ja WX on osalenud käsikirja koostamises või selle olulise intellektuaalse sisu jaoks kriitilise läbivaatamises; ning ZJ ja DY on avaldatava versiooni lõplikult heaks kiitnud. Kõik autorid lugesid lõpliku käsikirja läbi ja kiitsid selle heaks.

Tänuavaldused

Seda tööd toetas Hiina riiklik loodusteaduste sihtasutus (31501402).

Konkureerivad huvid

Autorid kinnitavad, et neil puuduvad konkureerivad huvid.

Saabunud: 27. detsember 2016 Vastu võetud: 14. märts 2017

Avaldatud Internetis: 22. märts 2017

Viited