Ishige Okamurae'st eraldatud isokloroglütsiin A pärsib -MSH poolt indutseeritud melanogeneesi: in vitro ja in vivo, 1. osa

Abstraktne:Ishige Okamurast (IO) eraldatud difloretohüdroksükarmalool (DPHC) näitas potentsiaalset valgendavat toimet UV-B-kiirguse vastu. Siiski ei ole IO komponente ja nende molekulaarset mehhanismi melanotsüüte stimuleeriva hormooni (-MSH) vastu veel uuritud. Seega oli selle uuringu eesmärk uurida pruunvetikatest IO eraldatud florotaniini Ishophloroglucin A (IPA) ja selle toorekstrakti (IOE) inhibeerivat toimet melanogeneesis in vivo -MSH-indutseeritud sebrakala mudelis ja B16F10 melanoomirakkudes. in vitro. Florotaniinide molekulaarsed dokkimisuuringud viidi läbi, et teha kindlaks nende inhibeeriv toime ja selgitada välja nende interaktsioonirežiim türosinaasiga, melanogeneesiga seotud glükoproteiiniga. Lisaks vähenesid morfoloogilised muutused ja melaniinisisaldus -MSH-indutseeritud sebrakala mudelis pärast IPA- ja IOE-ravi. Lisaks näitas Western blot, et IPA reguleeris rakuvälise valgu ekspressiooni -MSH-stimuleeritud B16F10 rakkudes. Seega viitavad need tulemused sellele, et IOE-st eraldatud IPA-l on potentsiaali kasutada farmaatsia- ja kosmeetikatööstuses.

Asjakohaste uuringute kohaseltcistancheon tavaline ravimtaim, mida tuntakse kui "imerohi, mis pikendab eluiga". Selle põhikomponent ontsistanosiid, millel on erinevad mõjud naguantioksüdant, põletikuvastane ja immuunfunktsiooni edendamine. Tsistanche ja naha valgendamise vaheline mehhanism seisneb cistanche glükosiidide antioksüdantses toimes.Melaniininimese nahas toodetakse türosiini oksüdeerumisel, mida katalüüsib türosinaas. Oksüdatsioonireaktsioon nõuab hapniku osalemist, mistõttu kehas olevad hapnikuvabad radikaalid muutuvad oluliseks melaniini tootmist mõjutavaks teguriks. Tistanche sisaldab tsistanosiidi, mis on antioksüdant ja võib vähendada vabade radikaalide teket organismis, seegamelaniini tootmise pärssimine.

1. Sissejuhatus

Merevetikad on pälvinud tohutut tähelepanu funktsionaalse toidu-, kosmeetika- ja farmaatsiatööstuses, kuna nad kasutavad bioaktiivseid ühendeid, nagu florotaniinid, fukoidaanid, polüsahhariidid ja valgud [1–7]. Eelmise uuringu kohaselt skriiniti Ishige Okamurae (IO) türosinaasi aktiivsust pärssivat toimet [8]. Kuigi selle florotanniini, difloretohüdroksükarmalooli (DPHC) hinnati UV-B kiirguse poolt indutseeritud melanogeneesivastase toime suhtes in vitro mudelis [8], ei tehtud täiendavaid uuringuid DPHC ja melanogeneesiga seotud valkude vahelise koostoime selgitamiseks. Selles uuringus hinnati uudse polüfenoolühendi Ishophloroglucin A (IPA) [9] molekulaarse dokkimise uuringus selle koostoimet türosinaasiga võrreldes DPHC omaga.

Valgendamiseks klõpsake Organic Cistanche Tubulosa

Küsi lisa:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Molekulaarne dokkimine on tõhus arvutusmeetod, et ennustada teadaoleva kolmemõõtmelise struktuuriga valgu või retseptori aktiivses kohas olevate väikeste molekulide või ligandide potentsiaalset seondumisviisi, et uurida nende interaktsioonimustreid või ravimite kavandamist [10–12]. Varasemad uuringud on teatanud türosinaasi ensüümi interaktsioonikohast ja energiaväärtusest, nagu on uuritud molekulaarse dokkimisuuringutega [13,14]. Funktsionaalselt on türosinaas kiirust piirav ensüüm, mis katalüüsib suhteliselt aeglast reaktsioonikiirust signaaliülekande rajal ja mängib keskset rolli melaniini biosünteesis spetsiaalsetes organellides, mida nimetatakse melanosoomideks ja mida sünteesivad spetsiifiliselt melanotsüütilised rakud [15]. Seega on in silico molekulaarsete dokkimissimulatsioonide abil modelleeritud türosinaasi ensümaatiline aktiivsus olnud naha hüperpigmenteerunud häirete vältimiseks inhibiitorite uurimise sihtmärk. Selle põhjal on katse- ja arvutusvaldkondades türosinaasi inhibiitoritena laialdaselt uuritud paljusid fenoolseid ühendeid või inhibiitoreid, millel on metalli kelaatimise võime [16].

Melaniin moduleerib peamiselt nahavärvi ja toimib kaitsva pigmendina, kui nahk puutub kokku UV-kiirgusega [17]. UV-kiirgusega kokkupuude põhjustab melanotsüüte stimuleeriva hormooni (-MSH) vabanemist naha keratinotsüütidest ja melanotsüütidest, et kutsuda esile melaniini süntees ja seejärel kaitsta nahka päikesekiirguse kahjulike mõjude eest [18]. Pikaajaline kokkupuude UV-kiirgusega kutsub aga esile olulise melaniini sünteesi -MSH poolt, mille tulemuseks on nahakahjustused, nagu tedretähnid, päikeselaigud ja mustad laigud epidermises, mis põhjustab DNA fotokahjustusi ja nahavähki [19]. Pärast seda on laialdaselt uuritud -MSH manustamist melanotsüütidesse, et kutsuda esile märkimisväärseid muutusi melanoomi melanogeneesi türosinaasi aktiivsuses [20].

Sebrakaladel on nahavärvi erinevusi nagu inimestel. Need on loommudel, mida kasutatakse inimese nahavärvi geneetilise päritolu mõistmiseks, mis ühendab põhilise mudelorganismi bioloogia inimese geneetikaga [21]. Lisaks võimaldavad sebrakala gastrula ventraalsetes ja külgmistes piirkondades olevad pigmendid ning nende läbipaistvus vastsete staadiumis lihtsalt jälgida pigmentatsiooniprotsessi, andes võimaluse töötada välja elujõulised mudelid melanotsüütide arengu defektidest tulenevate naharakkude häirete mõistmiseks [22– 24].

Melaniini süntees toimub mitmete melanogeneesiga seotud valkude, nagu türosinaas, mikroftalmiaga seotud transkriptsioonifaktor (MITF), türosinaasiga seotud valk-1 (Trp-2) ja türosinaasiga seotud valk{ {6}} (Trp-1) [15]. Selle uuringu eesmärk oli uurida IPA ja IO toorekstrakti (IOE) inhibeerivat toimet türosinaasi aktiivsusele ja melanogeneesile -MSH-indutseeritud sebrakala rakkudele in vivo ja B16F10 melanoomirakkudele in vitro, et hinnata nende potentsiaalset kasutamist naha pigmentatsiooni ja melanoomi ravis. .

2. Tulemused

2.1. Molekulaarse dokkimise uuring

Viidi läbi dokkimismeetod, et simuleerida kaubandusliku türosinaasi ensüümi seondumist IPA, DPHC ja arbutiiniga [25]. IPA, DPHC või arbutiini seondumisviisid seente türosinaasiga on esitatud joonisel 1A–C. Nagu on näidatud türosinaas-IPA kompleksi (joonis 1A), türosinaas-DPHC (joonis 1B) ja türosinaas-arbutiini (joonis 1C) 3D diagrammil, kuigi IPA, DPHC ja arbutiin on dokitud aktiivse saidi türosinaasiga. IPA kompleks näitas suurimat sidumispinda. Lisaks, nagu on näidatud 2D diagrammil, näitas türosinaasi-IPA kompleks rohkem koostoimeid türosinaasi erinevate aminohapetega, võrreldes kas türosinaas-DPHC või türosinaas-arbutiiniga. Seitsmel benseenitsüklil (1., 2., 3., 8., 9., 12. ja 16.) ja nende hapnikuaatomitel on π–π interaktsioonid histidiin60, metioniin61, lüsiin157, glutamaadi158, proliin160, arginiin26 ja valliiniga018. . Täpsemalt, 16. benseenitsükkel kombineeriti aktiivse saidi peamiste aminohapetega Histidine60 ja Histidine204. Lisaks interakteerusid paljud IPA hapnikuaatomid vesiniksidemete kaudu glutamaadi158, proliini160, aspartaadi167, metioniini184, fenüülalaniini197, asparagiini199, glutamiini202, asparagiin205 ja arginiiniga209. Lisaks arvutati dokkimisanalüüsi tulemuste põhjal, et kogu sidumisenergia ja CDOCKER-i interaktsioonienergia, kasutades DS 3.0 CDOCKER-i interaktsioonienergia programmi (joonis 1D), olid järgmised: interaktsioonienergia türosinaasiga: Ishophloroglucin A (IPA): − 152,154 kcal/mol, difloretohüdroksükarmalool (DPHC): –65,5221 kcal/mol ja arbutiin: –33,6835 kcal/mol ning sidumisenergia türosinaasiga: Ishophloroglucin A (IPA): –546,504 kcal/mol (difluoroksükarmalool/mol, -7 HCcarphoretho, -7) /mol ja arbutiin: −79,0913 kcal/mol.

2.2. Melanogeensete inhibiitorite mõju sebrakala vastsete melaniini sünteesile

Selle uuringu eesmärk oli teha kindlaks, kas IPA ja IOE võivad in vivo inhibeerida sebrakala vastsete melanogeneesi. Meie eelmises uuringus ei näidanud IPA ja IOE sebrakala vastsete puhul toksilisust [26]. Töötlesime sebrakala vastseid sebrakalaga (0.05, 0,15 ja 0,5 nM) ja IOE-ga (3, 10 ja 30 µg/mL) ), et määrata nende melaniinisisaldus. Inhibeeriva toime hindamiseks mõõtsime sebrakala ekstraktide melaniini kogusisaldust. Sebrakala melaniini fenotüübilist mõju täheldati nende keha pigmentatsiooni analüüsimisel mikroskoobi all toatemperatuuril. Pinnapealne melaniinisisaldus vähenes oluliselt sihtinhibiitorite erinevate kontsentratsioonide tõttu (joonis 2). Töötlemine 3 nM -MSH-ga suurendas oluliselt sebrakala melaniinisisaldust võrreldes töötlemata rühmaga. IPA (0,5 nM) ja IOE (30 µg/ml) kõrgeimad kontsentratsioonid vähendasid melaniini üldsisaldust vastavalt peaaegu 28,56 protsenti ja 30,36 protsenti, millel oli sarnane toime kui arbutiiniga (200 µM) ravitud rühmal (joonis 2A, B).

2.3. IPA ja IOE mõju melaniini sünteesile B16F10 rakkudes

IPA ja IOE tsütotoksilist toimet B16F10 rakkudele mõõdeti MTT abil (3-(4,5-dimetüültiasool-2-üül)-2,{{ 7}}difenüültetrasooliumbromiidi) analüüs. Algselt uurisime IPA ja IOE tsütotoksilist toimet B16F10 rakkudele, mida töödeldi erinevate kontsentratsioonidega ilma -MSH stimulatsioonita. IPA (0,15, 0,5, 1,5 ja 5 nM) ei näidanud B16F10 rakkudele olulist tsütotoksilisust, samas kui IOE (1, 3, 10 ja 30 µg/ml) tsütotoksilisust ei näidanud (joonis 3A, B). Edasistes uuringutes kasutati toksilisuseta IPA ja IOE kontsentratsioone.

Uurisime, kas melaniini inhibeerimise mõju IPA või IOE ravist in vivo oli pöörduv ilma -MSH stimulatsioonita B16F10 rakkudes. Melaniinisisaldus vähenes oluliselt pärast ravi IPA-ga (5 nM) või IOE-ga (30 µg/ml) võrreldes kontrollrühmaga (joonis 3C, D). Need tulemused näitasid, et IPA ja IOE inhibeerisid melaniini sünteesi ilma -MSH-stimulatsioonita B16F10 rakkudes, aidates seega kaasa selle melanogeneesivastasele toimele.

2.4. IPA ja IOE mõju türosinaasi aktiivsusele ja melaniini sünteesile -MSH-stimuleeritud B16F10 rakkudes

Seetõttu inkubeeriti IPA (0,5, 1,5 ja 5 nM) ja IOE (3, 10 ja 30 µg/ml) annuseid B16F10 melanoomirakkudega, et määrata nende bioaktiivsus raku türosinaasi aktiivsuses ja -MSH-s. - vahendatud melanogenees.

-MSH ja arbutiini kontsentratsioonid määrati nende tsütotoksilisuse ja melaniini tootmise tulemuste põhjal B16F10 rakkudes (joonis S2A – D). Elulemusmäära andmete analüüsimisel kasutati edasistes katsetes 1 nM -MSH-d ja 100 uM arbutiini.

Mis puutub raku türosinaasi aktiivsusse, siis kuigi 1, 5 nM IPA inhibeeriv toime oli suhteliselt madalam kui positiivses kontrollis kujutatud, erines kontsentratsioon peaaegu 10 korda, kusjuures arbutiini kõrgem kontsentratsioon oli 100 uM (joonis 4A). IOE vähendas türosinaasi aktiivsust väikese kõikumisega erinevate kontsentratsioonide mõjude vahel võrreldes -MSH-ga töödeldud rühmaga (joonis 4B). Mis puudutab -MSH-vahendatud melanogeneesi, siis 1,5 ja 5 nM IPA-ga töödeldud rühmades täheldati melaniinisisalduse olulist vähenemist (joonis 4C). Lisaks inhibeeris 30 µg/ml IOE pigmentatsiooni punktini, mis sarnanes tühja rühmaga (joonis 4D). Need tulemused viitavad sellele, et IPA ja IOE vähendasid türosinaasi aktiivsust ja et see inhibeeriv toime võib põhjustada raku melaniini sünteesi vähenemist B16F10 rakkudes.

2.5. IPA ja IOE mõju MSH-stimuleeritud B16F10 rakkude molekulaarmehhanismile

Nende melanogeneesi inhibeeriva toime eest vastutava mehhanismi selgitamiseks määrasime kindlaks IPA ja IOE mõju melaniini sünteesis osalevate signaalmolekulide ekspressioonitasemetele (joonis 5). ERK (ekstratsellulaarne signaaliga reguleeritud kinaas), JNK (Jun N-terminaalne kinaas) ja p38 kuuluvad mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaasi (MAPK) rakusisese signaaliülekande kaskaadi [27, 28]. Nagu on näidatud joonisel 5A, B, paranes ERK fosforüülimine IPA-raviga, samas kui JNK fosforüülimine vähenes veidi pärast töötlemist IPA-ga (1,5 ja 5 nM) või IOE-ga (30 µg/ml). Lisaks, nagu on näidatud joonisel 5C, tõusid p-p38 tasemed -MSH-stimuleeritud rühmades tugevalt, ligikaudu 80 protsenti võrreldes kontrollrühmaga. Peale selle oli pärast töötlemist IPA, IOE või arbutiiniga p38 fosforüülimine veidi alla surutud. Need leiud viitavad sellele, et IPA ja IOE melanogeensed inhibeerivad toimed võivad olla seotud JNK ja p38 MAPK signaaliradadega.

Küsi lisa: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501