Eelkonditsioneerimisega aktiveeritud AKT kontrollib neuronaalset tolerantsust isheemia suhtes MDM2-p53 raja kauduⅡ

3. Arutelu

Meie tulemused näitavad, et PI3K / AKT signaaliraja IPC-vahendatud aktiveerimine käivitab neuronaalse IT, kontrollides MDM2–p53 kompleksi primaarsetes kortikaalsetes neuronites. Esmalt kinnitasime eelkonditsioneerimise efektiivsust neuroprotektsiooni [33, 39–41] osas, kasutades valideeritud IPC eksperimentaalset mudelit.

Klõpsake Neuron'i cistanche tubulosa kõrvaltoimete kuvamiseks

Leidsime, et eksperimentaalne IPC, mis oli indutseeritud lühikese (20-minutise) hapniku- ja glükoosipuudusest (OGD), millele järgnes 2-tunnine taasoksügeniseerimine, andis tulemuseks neuroprotektsiooni, mida näitab nii neuronaalse apoptoosi kui ka pikaajalisest indutseeritud kaspaasi -3 aktivatsiooni vältimine. OGD (90 min), millele järgnes 4 h reoksüdeerimine (OGD/R). Näitame, et IPC vähendab kaspaasi{5}} aktivatsiooni kortikaalsetes neuronites, mis korreleerub väiksema apoptoosiga pärast järgnevat ja raskemat isheemilist insuldi.

Pro- ja antiapoptootiliste signaalide tasakaal on oluline neuronite ellujäämise tagamiseks pärast isheemiat [3, 33, 38, 42–44]. Kuigi selliste sündmuste olulisust on näidatud nii hemorraagilise kui ka isheemilise in vivo insuldi mudelites [43,45], ei ole neid signaaliradu reguleerivaid mehhanisme isheemilise tolerantsuse kontekstis veel täielikult mõistetud. Antiapoptootilise AKT ja sellega seotud radade rolli on põhjalikult uuritud vähirakkudes [46,47] ja ajukoes [38,48]; seni on aga AKT/MDM2–p53 signaaliraja roll IPC-vahendatud neuronite tolerantsuses isheemilise kahjustuse vastu endiselt tabamatu.

Siin avastasime, et IPC poolt põhjustatud PI3K/AKT signaaliraja aktiveerimine soodustab MDM2 fosforüülimist Ser166 juures, mis käivitab selle tuuma translokatsiooni ja valgu stabiliseerumise, vältides p53-indutseeritud apoptoosi kaspaasi-3 aktiveerimise kaudu. pärast isheemiat. AKT aktiveerimine fosforüülimise kaudu soodustab neuronite ellujäämist [24, 49] ja võib aidata kaasa IT indutseerimisele [25, 50]. Meie tulemused näitavad, et AKT valgu suhteline arvukus ei muutu isheemiliste või eelkonditsioneerivate stiimulite korral. Huvitaval kombel leidsime, et AKT varajane PI3K-vahendatud fosforüülimine Ser473 juures takistab isheemiast põhjustatud p53 stabiliseerumist eelkonditsioneeritud neuronites.

Toime ei olnud tingitud p53 mRNA tasemete muutustest [33, 34, 44], vaid p53 valgu taseme langusest, mis oli tingitud IPC-st enne OGD/R-i. Kuna MDM2 on p53 stabiliseerimise peamine regulaator ja on ka AKT otsene sihtmärk, osutavad meie tulemused AKT / MDM2 – p53 signaaliraja rollile neuronaalses tolerantsuses isheemia suhtes. MDM2 mRNA suureneb kiiresti pärast OGD-d [34], kuid MDM2 aktiivsust kontrollivad peamiselt translatsioonijärgsed modifikatsioonid, eriti fosforüülimine [51]. Sellega hästi kokku leppides leidsime, et pärast IPC-d fosforüülimisega aktiveerituna fosforüülib AKT omakorda MDM2 jäägis Ser166, mis asub tuuma lokaliseerimissignaali lähedal [52], ja see efekt säilib ka pärast OGD/R vigastust.

Meie tulemused näitavad, et MDM2 fosforüülimine Ser166 juures on piisav, et avaldada IPC-vahendatud neuroprotektiivset toimet p53 destabiliseerimise kaudu. Seega tuvastasime siin AKT / MDM2 – p53 raja ajast sõltuva aktiveerimise pärast isheemilist vigastust ja tõepoolest näitame, et IPC-aktiveeritud AKT vallandas ektoopilise MDM2 tuuma translokatsiooni, samuti endogeense valgu stabiliseerimise.

Veelgi enam, AKT jääb aktiivseks tuumas, kus PI3K võib samuti migreeruda vastusena oksüdatiivsele stressile ja seejärel võtta arvesse AKT fosforüülimist [53]. AKT või AKT knockdowni PI3K-vahendatud fosforüülimise inhibeerimine soodustab MDM2 valgu säilimist tsütoplasmas ja takistab MDM2 Ser166 fosforüülimist, samuti IPC-vahendatud neuroprotektsiooni isheemiast põhjustatud neuronaalse apoptoosi vastu. Vastupidi, näitasime, et aktiivne AKT seondub tuuma MDM2 valguga.

Selle tulemusena soodustab aktiivne AKT nii MDM2 fosforüülimist kui ka selle tuuma stabiliseerimist, mis aitab kaasa IPC-vahendatud neuroprotektsioonile. Meie tulemused näitavad, et IPC-ga soodustatud neuroprotektsioon sõltus PI3K-vahendatud AKT aktivatsioonist, mis fosforüülis MDM2 Ser166 juures, soodustades MDM2 tuuma akumulatsiooni pärast isheemilist solvamist.

Seega kaotas PI3K / AKT pärssimine wortmanniini poolt või AKT ammendumine siRNA poolt IPC-ga soodustatud neuroprotektsiooni, mis viis p53 stabiliseerumiseni ja sellele järgneva neuronaalse apoptoosini pärast isheemiat. Seega aitavad meie tulemused selgitada AKT-MDM2 raja IPC-sõltuva aktiveerimise olulist rolli neuronite ellujäämisel isheemilise kahjustuse vastu.

Valk p53 osaleb neuronaalse surma/ellujäämise kontrollis, mis määrab prognoosi insuldihaigetel [34, 42, 54], samuti TIA patsientidel [3]. P53 stabiliseerimine seab ohtu eelkonditsioneerimise vahendatud neuroprotektsiooni isheemia/reperfusioonikahjustuse tekkeks [33]. MDM2–p53 interaktsioon on seetõttu selles kontekstis neuronite ellujäämise jaoks kriitiline [34] ja IPC-vahendatud isheemilise kahjustuse vastase tolerantsuse jaoks [33].

Thus, the control of such interaction will also have an impact on stroke outcomes. In this context, we recently found that a single-nucleotide polymorphism (SNP) 309T>MDM2 promootoris olev G määrab MDM2 ekspressiooni ja omakorda moduleerib insuldi all kannatavate patsientide taastumist [34].

Lisaks täheldasime, et Tp53 geen SNP (rs1042522) moduleerib mitokondriaalset p53 stabiliseerumist ja neuronaalset tolerantsust isheemia suhtes, ennustades samal ajal patsientide funktsionaalset taastumist, kellel on enne insulti TIA [3]. Seetõttu on p53 apoptootiliste radade kontroll IPC neuroprotektiivse toime tagamiseks hädavajalik.

Need tulemused pakuvad uuringule translatiivset lähenemisviisi, mida saaks tulevikus patsientide hüvanguks rakendada, ja need kujutavad endast PI3K / AKT-MDM2-p53 signaalirada kui isheemilise insuldi eelkonditsioneerimise soodustatud IT-strateegiate olulist sihtmärki. Kokkuvõttes näitame, et IPC-ga täiustatud PI3K / AKT signaalirada soodustab MDM2 fosforüülimist Ser166-s, mis viib MDM2 tuuma translokatsioonini ja selle stabiliseerumiseni, mis käivitab neuronaalse IT-i, soodustades p53 destabiliseerimist ja järgnevat isheemilise insuldi indutseeritud apoptootilise surma inaktiveerimist.

Meie tulemused toovad esile AKT varajase aktiveerimise võimalikud eelised IPC-vahendatud neuronaalses tolerantsuses, mis reguleerib MDM2–p53 apoptootilist rada isheemilise kahjustuse korral. Need leiud toovad esile võimaluse mõista mehhanisme, mis reguleerivad neuronaalset AKT-MDM2-p53 signaaliülekande rada, et töötada välja uudsed neuroprotektiivsed strateegiad IT-ga seotud häirete jaoks.

4. Materjalid ja meetodid

4.1. Kortikaalsete neuronite esmased kultuurid

Neuronaalsed kultuurid valmistati C57Bl/6J või p53-null (Tp53−/−, B6.129S2, The Jackson Laboratory) hiire embrüo (14.5E) ajukoortest. Neuronid külvati tihedusega 1,8 × 105 rakku/cm2 Neurobasali söötmes, millele oli lisatud 2 protsenti B27 ja 2 mM glutamiini (Invitrogen, Madrid, Hispaania) ja inkubeeriti temperatuuril 37 ◦C niisutatud 5 protsenti CO2- sisaldavas atmosfääris [ 55].

4.2. Hapniku glükoosipuuduse ja eelkonditsioneerimise mudelid

Pärast 9–1{{10}} päeva in vitro (DIV) puutusid neuronid kokku hapniku- ja glükoosipuudusega (OGD), inkubeerides rakke temperatuuril 37 ◦C 90 minutit inkubaatoris. varustatud õhulukuga ja pidevalt gaasistatud 95 protsendi N2/5 protsendi CO2-ga. Inkubatsioonikeskkond (puhverdatud Hanksi lahus ilma glükoosita: 5,26 mM KCl, 0,43 mM KH2PO4, 132,4 mM NaCl, 4,09 mM NaHC03, 0,33 mM Na2HPO4, 2 mM CaCl2 ja pH 9, 20 mM HEPES-ga, 20 mM 7EP4. /5 protsenti CO2 30 min. Nendes tingimustes oli hapniku kontsentratsioon inkubatsioonikeskkonnas 6,7 ± 0,5 µM, mõõdetuna Clarki tüüpi hapnikuelektroodiga [56,57].

Kui näidatud, viidi neuronid kokku isheemilise eelkonditsioneerimisega (IPC; lühike OGD 20 minutit, millele järgnes 2-tunnine reoksüdeerimine) enne järgnevat pikaajalist isheemiat (OGD, 90 min) ja 4-tunnist reoksügeenimist (IPC pluss OGD/R) (joonis S1B) ). Paralleelselt inkubeeriti neuroneid normoksias (Nx) 37 °C juures niisutatud atmosfääris, mis sisaldas 95 protsenti õhku/5 protsenti CO2 või isheemilist eelkonditsioneerimist (IPC). Kui näidatud, inkubeeriti neuroneid 30 minutit enne IPC-d puhverdatud Hanksi lahuses (pH 7,4) wortmanniini (100 nmol/L) puudumisel või juuresolekul, nagu eelnevalt kirjeldatud [19].

4.3. Rakkude transfektsioonid

Neuronid (8 DIV) või HEK-293T-rakud transfekteeriti plasmiidvektoriga, mis ekspresseeris YFP-märgistatud Mdm2 inimese MDM2 promootorilt. MDM2p/Mdm2-YFP kinkis Uri Alon & Galit Lahav (Addgene plasmiid # 53962, Watertown, MA, USA) [58]. Vajadusel kasutati samades tingimustes kontrollina tühja vektorit (pYFP). Plasmiidi transfektsioon viidi läbi kasutades Lipofectamine® LTX (Invitrogen, Carlsbad, MA, USA) vastavalt tootja juhistele. Rakud transfekteeriti 1,5 µg/µL plasmiidvektoritega ja kasutati 24 tunni pärast.

AKT knockdown 6 DIV neuronis saavutati transfektsiooniga väikeste segavate kaheahelaliste ribonukleotiididega (siRNA). Sihitud järjestused olid järgmised: 50–CUCAAGUACUCAUUCCAGAtt–30, antisenss: 5 0–UCUGGAAUGAGUACUUGAGgg–30 (hiir, s62216, vastab nukleotiididele 1006–1025, GenBanki registreerimisnumber NM{{9]}. Negatiivse kontrollina kasutasime Silencer™ Select Negative Control No. 1 siRNA (siControl). Kõik siRNA-d osteti firmadelt Ambion®, Invitrogen® ja Thermo Fischer Scientific (Offenbach, Saksamaa). Valgu hävitamise astme järgi hinnati siRNA transfektsiooni efektiivsuseks 3 päeva pärast transfektsiooni 70–80 protsenti. Vaigistamiskatsete jaoks transfekteeriti neuronid siRNA-ga (10 nM), kasutades Lipofectamine® RNAiMAX-i (Invitrogen), järgides tootja juhiseid. Neuroneid inkubeeriti enne nende kasutamist 72 tundi Neurobasali söötmes.

4.4. Apoptootiliste rakkude surma voolutsütomeetriline tuvastamine

Neuronid eraldati plaatidelt ettevaatlikult, kasutades 1 mM EDTA tetranaatriumsoola PBS-is (pH 7,4) ja värviti anneksiin V/APC ja 7-AAD-ga, viidi läbi täpselt nii, nagu eelnevalt kirjeldatud [55].

4.5. Kaspaasi-3 aktiivsusanalüüs

Kaspaas{0}} aktiivsust hinnati rakulüsaatides [33] ja vastavalt tootja juhistele, kasutades SIGMA fluorimeetrilise analüüsi komplekti CASP3F ja emissioonil lainepikkusel 405 nm. Meetod põhineb fluorestseeruva 7-amino4-metüülkumariini (AMC) fragmendi vabanemisel. AMC kontsentratsioon arvutatakse AMC standardi abil.

4.6. Immunoblotid ja kaasimmunosadestamise analüüs

Neuronid lüüsiti puhvris, mis sisaldas 1% SDS, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 12,5 mM Na2HPO4 ja 1% Triton X-100 (NP40: 1% NP40, EDTA diK pluss 5 mM, Tris pH{13). }} mM, NaCl 135 mM ja 10 protsenti glütserooli), millele on lisatud fosfataasi inhibiitorid (1 mM Na3VO4 ja 50 mM NaF) ja proteaasi inhibiitorid (100 mM fenüülmetüülsulfonüülfluoriid, 50 µg/mL anti-papaiini, 50 µg/mL pestatina, 50 µg/ml µg/mL amastatiini, 50 µg/mL leupeptiini, 50 µg/mL bestatiini ja 50 µg/mL sojaoa trüpsiini inhibiitorit), hoiti jääl 30 minutit ja keedeti 5 minutit. Lüüsitud ekstraktide alikvoodid töödeldi SDS polüakrüülamiidgeeliga (MiniProtean®, Bio-Rad) ja blotiti antikehadega öö läbi temperatuuril 4 °C. Kasutatud antikehad olid anti-AKT (9272), anti-p(Ser473)AKT (9271), anti-lõhustatud kaspaas-3 (Asp175, 9661) (Cell Signaling, Danvers, MA, USA), anti-p53 ( 554157, BD Biosciences), anti-MDM2 (2A10, ab-16895), anti- (Ser166)MDM2 (ab131355), anti-GFP (ab290; tuvastab ka YFP) (Abcam, Cambridge, UK), anti-LAMIN B (sc-374015, Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Saksamaa) ja antiGAPDH (Ambion, Cambridge, UK) üleöö temperatuuril 4 ◦C. Pärast mädarõika peroksidaasiga konjugeeritud kitse küülikuvastase IgG-ga (Pierce, Thermo Scientific) või kitse hiirevastase IgG-ga (Bio-Rad) inkubeerimist inkubeeriti membraane vahetult enne Kodakiga kokkupuudet 5 minutit täiustatud kemoluminestsentsiga SuperSignal West Dura (Pierce). XAR-5 filmi 1 kuni 5 minutit ja autoradiogramme skaneeriti. Riba intensiivsused kvantifitseeriti ImageJ 1.48v tarkvara abil, nagu eelnevalt kirjeldatud [60].

Kaasimmunosadestamise testi jaoks lüüsiti neuronid jääkülmas puhvris, mis sisaldas 50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% NP-40), millele oli lisatud ülalkirjeldatud fosfataasi inhibiitoreid. Pärast prahi puhastamist tsentrifuugimisega inkubeeriti neuronite lüsaate (100 mg) 1 mg antikehaga 24 tundi temperatuuril 4 °C, millele järgnes 10 ml valgu A-agaroosi lisamine (GE Healthcare Life Sciences) 2 tundi temperatuuril 4 °C. ◦C. Immunosademeid pesti põhjalikult lüüsipuhvriga ja lahutati SDS-PAGE abil ja immunoblotiti näidatud antikehadega [61]. Valgu suhteline arvukus on näidatud joonisel S1. Täisblotid ja geeliskaneeringud on toodud joonisel S3.

4.7. Immunotsütokeemia ja pildianalüüs

Neuroneid kasvatati klaasist katteklaasidel ja fikseeriti 4% (mass/maht, PBS-s) paraformaldehüüdiga 30 minutit ja immunovärviti küüliku anti-fosfoAKT-ga (Ser473; 9271; Cell Signaling, MA, USA), hiire anti-MDM2 (2A10, ab-16895), hiire anti-MAP2 (1:500; M#1406, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) [55], hiire anti-p53 (1:200; 554157, BD Pharmingen , San Diego, CA, USA) ja anti-GFP (1:1000; ab290; valideeritud ka YFP tuvastamiseks). Immunomärgistamine tuvastati sekundaarsete küüliku-IgG-Cy3- või hiire-IgG-Cy2-vastaste antikehade abil (1:500; Jackson ImmunoResearch. Cambridge, UK).

Tuumad värviti 40 6-diamidino-2 fenüülindooliga (DAPI; D9542, Sigma-Aldrich). Katteklaasid pesti, paigaldati slaididele SlowFade valguse tuhmumisvastase reagendiga (Invitrogen) ja uuriti mikroskoobiga (Nikon Inverted microscope Eclipse Ti-E, (NY, USA), mis oli varustatud 40-kordse objektiiviga, eeltsentreeritud kiudvalgustiga Nikon Intensilight C-HGFI ja mustvalge laenguga ühendatud seadmega digikaamera Hamamatsu ORCAER või skaneeriv laserkonfokaalne mikroskoop ("Spinning Disk" Roper Scientific Olympus IX81, Tokyo, Jaapan) kolme laseriga 405, 491 ja 561 nm, varustatud 40×, 63× ja 100× PL Apo õlikümblusobjektiiviga kõrge eraldusvõimega pildistamiseks ja seadme digikaamera Evolve Photometrics jaoks.

Kõik mikroskoobi sätted määrati fluorestseeruvate kujutiste kogumiseks alla küllastuse ja neid hoiti kõigi katses tehtud piltide puhul konstantsena. Pilte analüüsiti ImageJ 1.48v tarkvaraga (National Institutes of Health). P(Ser473)AKT pluss ja p53 pluss neuronite protsent ning p(Ser473)AKT ja p53 valgu fluorestsentsi maksimaalse intensiivsuse kvantifitseerimine on näidatud joonisel S2A. MDM2-GFP-ga transfekteeritud neuronites arvutati MDM2-GFP nukleotsütoplasmaatiline jaotus tuuma keskmise fluorestsentsi ja endogeense MDM2 tsütoplasmaatilise keskmise fluorestsentsi suhtena, mõõdetuna 24 neuronis (kuus neuroni kohta seisund neljas erinevas neuronaalses kultuuris) (joonis S2B) [62].

Endogeense MDM2 värvimise ja pSer473AKT maksimaalse tuumafluorestsentsi intensiivsuse kvantifitseerimiseks mõõdeti 40 neuronit (10 neuronit seisundi kohta neljas erinevas kultuuris) (joonis S2C), nagu eelnevalt kirjeldatud [44]. Joonisel 5B näidatud tüüpilistes ristlõike intensiivsuse profiilides kvantifitseeriti iga tingimuse all näidatud p(Ser473)AKT ja MDM2 protsent tuuma keskmise fluorestsentsina. Kõigil juhtudel tuvastati tuumad DAPI värvimisega. Maksimaalne tuuma MDM2 fluorestsentsi intensiivsus wortmanniini või siAkt-ga töödeldud neuronites on näidatud joonisel S2D.

4.8. Statistiline analüüs

Eksperimentaalseid tulemusi hinnati ühesuunalise dispersioonanalüüsiga, millele järgnes Bonferroni post hoc test, mida kasutati väärtuste võrdlemiseks mitme rühma vahel. Tulemused on väljendatud keskmistena ± SEM. Kahe väärtusrühma võrdlemiseks kasutati Studenti t-testi. Kõigil juhtudel peeti p < 0.05 oluliseks (* p < 0,05 versus Nx; # p<0.05 versus OGD). Statistical analyses were performed using SPSS Statistics 24.0 for Macintosh (IBM).

Kuidas Cistanche neuroneid kaitseb?

Mõned tõendid viitavad sellele, et Cistanche võib kaitsta neuroneid, vähendades apoptoosi (programmeeritud rakusurma) ja soodustades neuronite ellujäämist. Apoptoos on loomulik protsess, mis toimub kehas kahjustatud või soovimatute rakkude eemaldamiseks, kuid see võib olla kahjulik, kui seda esineb liigselt või sobimatult. Laboratoorsetes uuringutes on leitud, et Cistanche pärsib apoptoosi ja see toime võib aidata kaitsta neuroneid kahjustuste eest.

Lisaks sisaldab Cistanche mitmeid bioaktiivseid ühendeid, millel on tõestatud neuroprotektiivne toime. Näiteks sisaldab see ehhinakosiidi, mis on näidanud, et see kaitseb neuroneid oksüdatiivse stressi ja põletiku eest. See sisaldab ka akteosiidi, millel on leitud olevat põletikuvastased ja antioksüdantsed omadused.

Viited

1. Emberson, J.; Lees, KR; Lyden, P.; Blackwell, L.; Albers, G.; Bluhmki, E.; Brott, T.; Cohen, G.; Davis, S.; Donnan, G.; et al. Ravi hilinemise, vanuse ja insuldi raskusastme mõju alteplaasiga intravenoosse trombolüüsi mõjudele ägeda isheemilise insuldi korral: Randomiseeritud uuringute üksikute patsientide andmete metaanalüüs. Lancet 2014, 384, 1929–1935. [CrossRef]

2. Wang, W.-W.; Chen, D.-Z.; Zhao, M.; Yang, X.-F.; Gong, D.-R. Varasematel mööduvatel isheemilistel rünnakutel võib isheemilise insuldi patsientidel olla neuroprotektiivne toime. Arch. Med. Sci. 2017, 5, 1057–1061. [CrossRef] [PubMed]

3. Ramos-Araque, ME; Rodriguez, C.; Vecino, R.; Garcia, EK; Alfonso, MDL; Barba, MS; Colàs-Campàs, L.; Purroy, F.; Arenillas, JF; Almeida, A.; et al. Neuronaalse isheemilise tolerantsi tingib Tp53 Arg72Pro polümorfism. Tõlk. Stroke Res. 2019, 10, 204–215. [CrossRef] [PubMed]

4. Iadecola, C.; Anrather, J. Insuldi uurimine ristteel: ajult juhiste küsimine. Nat. Neurosci. 2011, 14, 1363–1368. [CrossRef] [PubMed]

5. Zhao, C.; Jiang, M.; Zhang, L.; Hu, Y.; Hu, Z.; Zhang, M.; Qi, J.; Su, A.; Lou, N.; Xian, X.; et al. Peroksisoomi proliferaatoriga aktiveeritud gamma retseptor osaleb isheemilise eelkonditsioneerimise poolt in vivo ja in vitro gliaalglutamaadi transporteri kaudu indutseeritud aju isheemilise tolerantsuse omandamisel. J. Neurochem. 2019, 151, 608–625. [CrossRef]

6. Rodriguez, C.; Agulla, J.; Delgado-Esteban, M. Aju ümberfookustamine: uued lähenemisviisid isheemilise vigastuse vastases neuroprotektsioonis. Neurochem. Res. 2021, 46, 51–63. [CrossRef] [PubMed] 7. Stenzel-Poore, parlamendiliige; Stevens, SL; Xiong, Z.; Lessov, NS; Harrington, AC; Mori, M.; Meller, R.; Rosenzweig, HL; Tobar, E.; Shaw, ET; et al. Isheemilise eelkonditsioneerimise mõju genoomsele vastusele ajuisheemiale: sarnasus neuroprotektiivsete strateegiatega talveunes ja hüpoksiat taluvates seisundites. Lancet 2003, 362, 1028–1037. [CrossRef]

8. Gidday, JM Tserebraalne eelkonditsioneerimine ja isheemiline tolerantsus. Nat. Rev. Neurosci. 2006, 7, 437–448. [CrossRef] [PubMed]

9. Stetler, RA; Lekk, R.; Gan, Y.; Li, P.; Zhang, F.; Hu, X.; Jing, Z.; Chen, J.; Zigmond, MJ; Gao, Y. Eelkonditsioneerimine pakub neuroprotektsiooni kesknärvisüsteemi haiguste mudelites: paradigmad ja kliiniline tähtsus. Prog. Neurobiol. 2014, 114, 58–83. [CrossRef] [PubMed]

10. Koch, S.; Della Morte, D.; Dave, KR; Sacco, RL; Perez-Pinzon, AM biomarkerid isheemilise eelkonditsioneerimise jaoks: reageerijate leidmine. Br. J. Pharmacol. 2014, 34, 933–941. [CrossRef]

11. La Russa, D.; Frisina, M.; Secondo, A.; Bagetta, G.; Amantea, D. Tserebraalses poes käitatava kaltsiumi sisenemist reguleeriva faktori (SARAF) ja perifeerse orai1 modulatsioon pärast fokaalset ajuisheemiat ja eelkonditsioneerimist hiirtel. Neuroscience 2020, 441, 8–21. [CrossRef]

12. Sisalli, MJ; Annunziato, L.; Scorziello, A. Uudsed rakulised mehhanismid neuroprotektsiooniks isheemilise eelkonditsioneerimise korral: vaade organellide seest. Ees. Neurol. 2015, 6, 115. [CrossRef]

13. Durukan, A.; Tatlisumak, T. Eelkonditsioneerimisest põhjustatud isheemiline tolerants: aken endogeensesse ülekandesse tserebroprotektsiooni jaoks. Exp. Tõlk. Stroke Med. 2010, 2, 2. [CrossRef]

14. Broughton, BR; Reutens, D.; Sobey, CG; Sims, K.; Politei, J.; Banikazemi, M.; Lee, P. Apoptootilised mehhanismid pärast ajuisheemiat. Stroke 2009, 40, 788–794. [CrossRef]

15. Zhao, H.; Sapolsky, RM; Steinberg, GK Phosphoinositide{1}}Kinaasi/Akt ellujäämissignaalide rajad on seotud neuronite ellujäämisega pärast insulti. Mol. Neurobiol. 2006, 34, 249–270. [CrossRef]

16. Uzdensky, AB Apoptoosi reguleerimine penumbras pärast isheemilist insulti: pro- ja antiapoptootiliste valkude ekspressioon. Apoptosis 2019, 24, 687–702. [CrossRef] [PubMed]

17. Fukunaga, K.; Kawano, T. Akt on aju isheemilise insuldi signaaliülekandeteraapia molekulaarne sihtmärk. J. Pharmacol. Sci. 2003, 92, 317–327. [CrossRef] [PubMed]

18. Zhao, EY; Efendizade, A.; Cai, L.; Ding, Y. Akt (valgukinaas B) ja proteiinkinaas C roll isheemia-reperfusioonikahjustuses. Neurol. Res. 2016, 38, 301–308. [CrossRef] [PubMed]

19. Delgado-Esteban, M.; Martín-Zanca, D.; Andres-Martin, L.; Almeida, A.; Bolanos, JP PTEN-i inhibeerimine peroksünitriti poolt aktiveerib fosfoinositiidi-3-kinaasi/Akt neuroprotektiivse signaaliraja. J. Neurochem. 2007, 102, 194–205. [CrossRef]

20. Manning, BD; Toker, A. AKT/PKB signaalimine: võrgus navigeerimine. Cell 2017, 169, 381–405. [CrossRef] [PubMed]

21. Diez, H.; Garrido, JJ; Wandosell, F. Akt iso vormide spetsiifilised rollid apoptoosis ja aksonite kasvu reguleerimises neuronites. PLoS ONE 2012, 7, e32715. [CrossRef]

22. Santi, SA; Lee, H. Akt isovormid esinevad erinevates subtsellulaarsetes kohtades. Olen. J. Physiol. Physiol. 2010, 298, C580–C591. [CrossRef]

23. Yang, C.; Talukder, MH; Varadharaj, S.; Velayutham, M.; Zweier, JL Varajane isheemiline eelkonditsioneerimine nõuab eNOS-i Akt- ja PKA-vahendatud aktiveerimist seriin1176 fosforüülimise kaudu. Kardiovaskulaarne. Res. 2012, 97, 33–43. [CrossRef] [PubMed]

24. Ouyang, Y.-B.; Tan, Y.; Comb, M.; Liu, C.-L.; Martone, MINA; Siesjö, BK; Hu, B.-R. Ellujäämist ja surma soodustavad sündmused pärast mööduvat ajuisheemiat: Akt fosforüülimine, tsütokroom C vabanemine ja kaspaasitaoliste proteaaside aktiveerimine. Br. J. Pharmacol. 1999, 19, 1126–1135. [CrossRef] [PubMed]

25. Li, S.; Hafeez, A.; Noorulla, F.; Geng, X.; Shao, G.; Ren, C.; Lu, G.; Zhao, H.; Ding, Y.; Ji, X. Neuroprotektsiooni eelkonditsioneerimine: hüpoksiast isheemiani. Prog. Neurobiol. 2017, 157, 79–91. [CrossRef] [PubMed]

26. Mayo, LD; Donner, DB Fosfatidüülinositooli 3-kinaasi/Akt rada soodustab Mdm2 translokatsiooni tsütoplasmast tuuma. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001, 98, 11598–11603. [CrossRef]

27. Ashcroft, M.; Ludwig, RL; Woods, DB; Copeland, TD; Weber, HO; Macrae, EJ; Vousden, KH HDM2 fosforüülimine Akt. Onkogeen 2002, 21, 1955–1962. [CrossRef]

28. Zhou, BP; Liao, J.; Xia, W. HER-2/neu kutsub esile p53 ubikvitinatsiooni Akt-vahendatud MDM2 fosforüülimise kaudu. Nat. Cell Biol. 2001, 3, 973–982. [CrossRef]

29. Grossman, SR; Perez, M.; Kung, AL; Joseph, M.; Mansur, C.; Xiao, Z.-X.; Kumar, S.; Howley, P.; Livingston, DM p300/MDM2 kompleksid osalevad MDM{4}}vahendatud p53 lagunemises. Mol. Cell 1998, 2, 405–415. [CrossRef]

30. Toth, A.; Nickson, P.; Qin, LL; Erhardt, P. Kardiomüotsüütide ellujäämise ja hüpertroofia diferentsiaalne regulatsioon MDM2, an E3 ubikvitiini ligaasiga. J. Biol. Chem. 2006, 281, 3679–3689. [CrossRef]

31. Hausenloy, DJ; Tsang, A.; Mocanu, MM; Yellon, DM Isheemiline eelkonditsioneerimine kaitseb, aktiveerides prosurvival kinaase reperfusiooni ajal. Olen. J. Physiol. Circ. Physiol. 2005, 288, H971–H976. [CrossRef] [PubMed]

32. Mocanu, MM; Yellon, DM p53 allareguleerimine: uus molekulaarne mehhanism, mis on seotud isheemilise eelkonditsioneerimisega. FEBS Lett. 2003, 555, 302–306. [CrossRef]

33. Vecino, R.; Burguete, MC; Jover-Mengual, T.; Agulla, J.; Bobo-Jiménez, V.; Salom, JB; Almeida, A.; Delgado-Esteban, M. MDM2-p53 rada on seotud eelkonditsioneerimisest põhjustatud neuronite tolerantsusega isheemia suhtes. Sci. Rep. 2018, 8, 1610. [CrossRef] [PubMed]

34. Rodriguez, C.; Ramos-Araque, M.E.; Domínguez-Martínez, M.; Sobrino, T.; Sánchez-Morán, I.; Agulla, J.; Delgado-Esteban, M.; Gómez-Sánchez, J.C.; Bolaños, J.P.; Castillo, J.; et al. Single-Nucleotide Polymorphism 309T>G määrab MDM2 promootoris funktsionaalse tulemuse pärast insulti. Stroke 2018, 49, 2437–2444. [CrossRef]

35. Feng, J.; Park, J.; Cron, P.; Hess, D.; Hemmings, BA PKB/Akt hüdrofoobse motiivi Ser-473 kinaasi tuvastamine DNA-st sõltuva proteiinkinaasina. J. Biol. Chem. 2004, 279, 41189–41196. [CrossRef]

36. Lai, TW; Zhang, S.; Wang, YT Eksitotoksilisus ja insult: neuroprotektsiooni uudsete sihtmärkide tuvastamine. Prog. Neurobiol. 2014, 115, 157–188. [CrossRef] [PubMed]

37. Constantino, LC; Binder, LB; Vandresen-Filho, S.; Viola, GG; Ludka, FK; Lopes, MW; Leal, RB; Tasca, CI Fosfatidüülinositooli-3 kinaasi raja roll NMDA eelkonditsioneerimisel: erinevad mehhanismid krampide ja kinoliinhappe poolt indutseeritud hipokampuse neuronaalse degeneratsiooni jaoks. Neurotox. Res. 2018, 34, 452–462. [CrossRef]

38. Xie, R.; Cheng, M.; Li, M.; Xiong, X.; Daadi, M.; Sapolsky, RM; Zhao, H. Akt Isovormid kaitsevad erinevalt insuldist põhjustatud neuronaalsete vigastuste eest, reguleerides mTOR-i tegevusi. Br. J. Pharmacol. 2013, 33, 1875–1885. [CrossRef]

39. Soriano, FX; Papadia, S.; Hofmann, F.; Hardingham, NR; Bading, H.; Hardingham, GE NMDA eelkonditsioneeritavad annused soodustavad neuroprotektsiooni, suurendades neuronite erutuvust. J. Neurosci. 2006, 26, 4509–4518. [CrossRef]

40. Grabb, MC; Choi, DW isheemiline tolerants hiire ajukoore rakukultuuris: NMDA retseptorite kriitiline roll. J. Neurosci. 1999, 19, 1657–1662. [CrossRef]

41. Chen, M.; Lu, T.-J.; Chen, X.-J.; Zhou, Y.; Chen, Q.; Feng, X.-Y.; Xu, L.; Duan, W.-H.; Xiong, Z.-Q. NMDA retseptori alatüüpide erinevad rollid isheemilises neuronaalsete rakkude surmas ja isheemilises taluvuses. Stroke 2008, 39, 3042–3048. [CrossRef]

42. Gomez-Sánchez, JC; Esteban, MD; Rodriguez-Hernandez, I.; Sobrino, T.; De La Ossa, NP; Reverte, S.; Bolaños, JP; GonzalezSarmiento, R.; Castillo, J.; Almeida, A. Inimese Tp53 Arg72Pro polümorfism selgitab erinevaid funktsionaalseid prognoose insuldi korral. J. Exp. Med. 2011, 208, 429–437. [CrossRef]

43. Xu, W.; Gao, L.; Li, T.; Zheng, J.; Shao, A.; Zhang, J. Mesencephalic astrocyte-Derived Neurotrophic Factor (MANF) kaitseb neuronaalse apoptoosi eest Akt/MDM2/p53 signaaliraja aktiveerimise kaudu intratserebraalse hemorraagia rotimudelis. Ees. Mol. Neurosci. 2018, 11, 176. [CrossRef] [PubMed]

44. Sánchez-Morán, I.; Rodríguez, C.; Lapresa, R.; Agulla, J.; Sobrino, T.; Castillo, J.; Bolaños, JP; Almeida, A. Nuclear WRAP53 soodustab neuronite ellujäämist ja funktsionaalset taastumist pärast insulti. Sci. Adv. 2020, 6, eabc5702. [CrossRef]

45. Burmistrova, O.; Olias-Arjona, A.; Lapresa, R.; Jimenez-Blasco, D.; Eremejeva, T.; Šišov, D.; Romanov, S.; Zakurdajeva, K.; Almeida, A.; Fedichev, PO; et al. PFKFB3 sihtimine leevendab hiirtel ajuisheemia-reperfusioonikahjustust. Sci. Vabariik 2019, 9, 1–13. [CrossRef]

46. ​​Tu, Y.; Kim, E.; Gao, Y.; Rankin, GO; Li, B.; Chen, YC Theaflaviin-3, 30 -gallaat indutseerib tsisplatiiniresistentsete munasarjavähi A2780/CP70 rakkudes Akt/MDM2/p53 raja kaudu apoptoosi ja G2 rakutsükli peatamise. Int. J. Oncol. 2016, 48, 2657–2665. [CrossRef] [PubMed]

47. Wan, W.; Hou, Y.; Wang, K.; Cheng, Y.; Pu, X.; Jah, X. LXR-623-indutseeritud pikk mittekodeeriv RNA LINC01125 pärsib rinnavähirakkude proliferatsiooni PTEN/AKT/p53 signaaliraja kaudu. Cell Death Dis. 2019, 10, 248. [CrossRef] [PubMed]

48. Tao, J.; Cui, Y.; Duan, Y.; Zhang, N.; Wang, C.; Zhang, F. Puerarin leevendab ajuisheemia in vivo mudelis liikumis- ja kognitiivseid puudujääke ning hipokampuse neuronaalseid kahjustusi PI3K/Akt1/GSK-3 signaaliraja kaudu. Oncotarget 2017, 8, 106283–106295. [CrossRef] [PubMed]

49. Janelidze, S.; Hu, B.-R.; Siesjö, P.; Siesjö, BK Akt1 (PKB) ja p70S6K muutused mööduva fokaalse isheemia korral. Neurobiol. Dis. 2001, 8, 147–154. [CrossRef] [PubMed]

50. Pignataro, G.; Boscia, F.; Esposito, E.; Sirabella, R.; Cuomo, O.; Vinciguerra, A.; Di Renzo, G.; Annunziato, L. NCX1 ja NCX3: kaks uut mõjurit hilinenud eelkonditsioneerimisele ajuisheemia korral. Neurobiol. Dis. 2012, 45, 616–623. [CrossRef]

51. Li, J.; Kurokawa, M. MDM2 stabiilsuse reguleerimine pärast DNA kahjustust. J. Cell. Physiol. 2015, 230, 2318–2327. [CrossRef]

52. Olson, DC; Marechal, V.; Momand, J.; Chen, J.; Romocki, C.; Levine, AJ Mitme mdm-2 valgu ja mdm-2-p53 valgukomplekside identifitseerimine ja iseloomustamine. Oncogene 1993, 8, 2353–2360. [PubMed]

53. Uranga, RM; Katz, S.; Salvador, GA Tõhustatud fosfatidüülinositooli 3-kinaasi (PI3K)/Akt signaalimisel on rauast põhjustatud oksüdatiivsele stressile avatud hipokampuse neuronites pleiotroopsed sihtmärgid. J. Biol. Chem. 2013, 288, 19773–19784. [CrossRef] [PubMed]

54. Almeida, A.; Sánchez-Morán, I.; Rodríguez, C. Mitokondriaal-tuuma p53 kaubitsemine kontrollib neuronite tundlikkust insuldi korral. IUBMB Life 2021, 73, 582–591. [CrossRef] [PubMed]

55. Delgado-Esteban, M.; Garcia-Higuera, I.; Maestre, C.; Moreno, S.; Almeida, A. APC/C-Cdh1 koordineerib neurogeneesi ja kortikaalset suurust arengu ajal. Nat. Commun. 2013, 4, 2879. [CrossRef] [PubMed]

56. Constantino, LC NMDA retseptorite roll ajuresistentsuse arendamisel eel- ja järelkonditsioneerimise kaudu. Vananemine Dis. 2014, 5, 430–441. [CrossRef]

57. Almeida, A.; Esteban, MD; Bolaños, JP; Medina, JM Hapniku- ja glükoosipuudus kutsub esile mitokondriaalse düsfunktsiooni ja oksüdatiivse stressi neuronites, kuid mitte primaarses kultuuris astrotsüütides. J. Neurochem. 2002, 81, 207–217. [CrossRef]

58. Lahav, G.; Rosenfeld, N.; Sigal, A.; Geva-Zatorsky, N.; Levine, AJ; Elowitz, MB; Alon, U. P53-Mdm2 tagasisideahela dünaamika üksikutes lahtrites. Nat. Genet. 2004, 36, 147–150. [CrossRef]

59. Li, J.; Karaplis, AC; Huang, DC; Siegel, PM; Camirand, A.; Yang, XF; Muller, WJ; Kremer, R. PTHrP soodustab rinnavähi teket, progresseerumist ja metastaase hiirtel ning on potentsiaalne terapeutiline sihtmärk. J. Clin. Uurige. 2011, 121, 4655–4669. [CrossRef]

60. Maestre, C.; Esteban, MD; Gomez-Sánchez, JC; Bolaños, JP; Almeida, A. Cdk5 fosforüleerib Cdh1 ja moduleerib tsükliin B1 stabiilsust eksitotoksilisuses. EMBO J. 2008, 27, 2736–2745. [CrossRef]

61. De Tudela, MV-P.; Esteban, MD; Maestre, C.; Bobo-Jiménez, V.; Jiménez-Blasco, D.; Vecino, R.; Bolaños, JP; Almeida, A. Bcl-xL-ATP süntaasi interaktsiooni reguleerimine mitokondriaalse tsükliin B1-tsüklonist sõltuva kinaasi-1 poolt määrab neuronite ellujäämise. J. Neurosci. 2015, 35, 9287–9301. [CrossRef] [PubMed]

62. Bobo-Jiménez, V.; Esteban, MD; Angibaud, J.; Sánchez-Morán, I.; de la Fuente, A.; Yajeya, J.; Nägerl, UV; Castillo, J.; Bolaños, JP; Almeida, A. APC/CCdh1-Rock2 rada kontrollib dendriitide terviklikkust ja mälu. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2017, 114, 4513–4518. [CrossRef] [PubMed]