MiR{0}}b2/c kustutamine põhjustab MPTP-indutseeritud Parkinsoni tõvega hiirte kiirendatud vananemist ja neuroprotektsiooni

Abstraktne

Uuringud näitavad seost vananemisega seotud miR{0}}-ide ja Parkinsoni tõve (PD) vahel. Siin näitame, et miR-29-i seerumitasemed 1-metüül-4-fenüül-1,2,3,6-tetrahüdropüridiini (MPTP) poolt indutseeritud PD-s hiirtel ilmnesid dünaamilised muutused. MiR-29b2/c rolli vananemisel ja PD-s uuriti miR-29b2/c geeni knockout hiirte (miR-29b2/c KO) abil. miR-29b2/c KO hiiri iseloomustas metsikut tüüpi (WT) hiirtega võrreldes märgatavalt kergem kaal, küfoos, lihasnõrkus ja ebanormaalne kõnnak. WT-l tekkis ka ilmne dermise paksenemine ja rasvkoe vähenemine. Kuid miR-29b2/c puudus leevendas MPTP-st põhjustatud dopamiinergilise süsteemi kahjustusi ja gliia aktivatsiooni nigrostriataalses rajas ning parandas järelikult MPTP-ga ravitud KO hiirte motoorset funktsiooni. MiR-29b2/c väljatõrjumine inhibeeris põletikuliste faktorite ekspressiooni 1-metüül-4-fenüülpüridiiniumi (MPP pluss )-ga töödeldud primaarsetes segagliia, primaarsete astrotsüütide või LPS-ga töödeldud kultuurides primaarne mikrogliia. Veelgi enam, miR-29b2/c puudulikkus suurendas AMPK aktiivsust, kuid surus alla NF-κB p65 signaaliülekande gliiarakkudes. Meie tulemused näitavad, et miR-29b2/c KO hiirtel on progeeria-sarnane fenotüüp. Vähem aktiveeritud gliiarakud ja allasurutud neuropõletik võivad miR- 29b2/c KO hiirtel esile kutsuda dopamiinergilise neuroprotektsiooni. Kokkuvõttes osaleb miR-29b2/c vananemise reguleerimises ja mängib Parkinsoni tõve puhul kahjulikku rolli.

Märksõnad

MiR-29b2/c; neuroprotektsioon; MPTP-indutseeritud Parkinsoni tõbi;Cistanche eelised.

Hankimiseks klõpsake siinmillised on Cistanche mõjud

Sissejuhatus

Parkinsoni tõbi (PD) on teine ​​kõige sagedasem neurodegeneratiivne haigus, mida iseloomustab dopamiinergiliste neuronite järkjärguline kadumine keskaju substantia nigra par compacta (SNpc) piirkonnas ning suurenenud gliia aktivatsioon ja neuropõletik [1–3]. MikroRNA-d on lühikesed mittekodeerivad RNA molekulid, mis reguleerivad geeniekspressiooni transkriptsioonijärgsel tasemel [4, 5]. MikroRNA-d osalevad närvisüsteemi arengu, neuronite plastilisuse ja neurodegeneratiivsete haiguste reguleerimises. MikroRNA29 perekond (miR- 29) koosneb kahest geeniklastrist: miR-29a/b1 ja miR-29b2/c, mis paiknevad vastavalt 6. kromosoomil ja 1. kromosoomil. hiire genoom. miR-29a ja miR-29c on ainult ühe nukleotiidse erinevusega, samas kui miR-29b1 ja miR-29b2 on järjestuses identsed [6]. miR{20}} osalevad mitmetes bioloogilistes protsessides. Paljud miR{21}}sihtgeenid on katseliselt kontrollitud, sealhulgas Procelli ellujäämisgeenid Bcl-2, Mcl-1, Cdc42 ja p85-; proapoptootilised geenid Puma, Bim, Bak ja Bmf; ja põletikueelsed tsütokiinid IFN- ja IL-12. Perifeerses süsteemis on uuringud näidanud, et miR{28}} on seotud kudede fibroosiga [7–9], ainevahetusega ja immuunregulatsiooniga [10–13].

miR{0}}-id ekspresseeruvad laialdaselt kesknärvisüsteemis ja nende transkriptid eksisteerivad nii neuronites kui ka gliiarakkudes [14, 15]. Üha enam on näidatud seost miR-29-ide ja neuroloogiliste haiguste vahel. miR-29-d osalevad -amüloidi tootmise reguleerimises ja need on AD patsientide ajus alareguleeritud [16, 17]; miR-29 tase väheneb ka Huntingtoni tõve (HD) patsientidel ja HD mudelhiirtel [18, 19], samas kui see suureneb amüotroofse lateraalskleroosiga (ALS) ja ALS-i hiiremudelitega patsientidel [16, 20]. Nii miR-29a/b-1-defitsiidiga hiirtel kui ka allareguleeritud miR-29-i hiirtel on ataksia-sarnane fenotüüp [6, 21]. Seoses miR-29 ekspressiooni mõjuga neuroprotektsioonile ja neuronite surma soodustamisele isheemiliste näriliste mudelite puhul saadi vastupidiseid tulemusi [22, 23]. Varasemates uuringutes täheldasime, et miR{24}}-i tase langes PD-ga patsientide seerumis märkimisväärselt, kusjuures langustrend oli seotud raskema parkinsonismiga [24]. Lisaks korreleerusid miR{26}} tasemed PD patsientide mälu jõudlusega [25]. Jõudsime järeldusele, et miR-29b2/c on tihedalt seotud PD-ga, kuid selle füsioloogilised funktsioonid ja patoloogilised mehhanismid, mis on seotud PD-ga, on suures osas teadmata.

Selles uuringus mõõdeti hiire seerumi miR{0}}-de taset vastuseks MPTP manustamisele kuni 120 päeva pärast süstimist. MiR-29b2/c puuduste mõju perifeersetele kudedele uuriti miR-29b2/c KO hiirte abil. Dopamiinergilise neurotoksiini MPTP-d kasutati täiendavalt PD hiiremudeli esilekutsumiseks. Seejärel uuriti nigrostriataalse dopamiinergilise süsteemi vigastusi, käitumist ja võimalikke mehhanisme. Täheldasime, et miR-29 tasemed hiire seerumis näitasid pärast MPTP manustamist dünaamilisi muutusi. miR- 29b2/c KO hiirtel ilmnes kiirenenud vananemine, millele viitasid kergem kehakaal, rasvkoe vähenemine, küfoos, naha paksenemine, lihasnõrkus ja kõnnaku ebanormaalsus. Kuid miR-29b2/c vaegus põhjustas dopamiinergiliste kahjustuste ja gliia aktivatsiooni leevenemise ning järelikult käitumise paranemise PD-laadse loomamudeli puhul.

Cistanche pillid

Tulemus

1. Progeria-sarnane fenotüüp miR-29b2/c KO hiirtel

miR-29b2/c knockout hiired (miR-29b2/c KO) loodi CRISPR-Cas9 tehnikaga. Geeni sihtimise ja mutantse hiire genotüpiseerimise strateegia on esitatud lisajoonisel 1. Nelja- ja 16- kuu vanustel miR-29b2/c KO hiirtel oli vähenenud kehakaal (joonis 1A). Kolme kuu vanuselt jäid miR-29b2/c KO hiirte omadused muutumatuks, nagu tõestas röntgen-mikrokompuutertomograafia (mikro-CT) skaneerimine (täiendav joonis 2A). 13 kuu vanuste miR-29b2/c KO hiirte ja nende WT vastete vahel ei esinenud erinevusi luu mineraalse tiheduse (BMD), trabeekulite keskmise BMD, trabekulaarse eraldumise, trabekulaarse paksuse ja struktuurse mudeli indeksi (SMI) osas. Täiendav joonis 2B). Hematoksüliini ja eosiini (H&E) värvimise abil leidsime, et 13-kuuse vanuste miR-29b2/c KO hiirte pärisnahk oli paksenenud koos suurenenud ja süvenenud kortsudega (joonis 1B, 1C). Ja küfoos ilmnes 16-kuu vanustel miR-29b2/c KO hiirtel (joonis 1C). miR-29b2/c KO hiirtel oli noores eas (3 kuud vanad) normaalsed rasvkoed (täiendav joonis 2C, 2D). Kõhu rasvkoe (nahaalune rasv ja vistseraalne rasv kokku) ja pruun rasvkude vähenes aga 16 kuu vanuselt miR-29b2/c KO hiirtel WT hiirtega võrreldes järsult (joonis 1D). Lisaks analüüsiti vananemismarkerite p21 ja p53 transkriptsioonitasemeid ajus. Kuuekuulistel miR-29b2/c KO hiirtel suurenesid need märkimisväärselt hipokampuses, kuid mitte ajukoores. p53 ja p16 valgu tase miR-29b2/c-puudulikus hipokampuses ei erinenud WT kontrollidest. Lisaks ei erinenud -galaktosidaasi aktiivsus, mis on teadaolev rakkude vananemise tunnus, kolme kuu vanuste WT ja miR{55}}b2/c KO hiirte ajus.

MiR{0}}b2/c KO hiirte lihasnõrkus ja ebanormaalne kõnnak

Hinnati miR-29b2/c-puudulike hiirte käitumist. Lihaste tugevust mõõdeti traadi riputamise ja võre riputamise testidega. MiR-29b2/c KO hiired saavutasid traadi riputamise testis kontrollhiirtest madalama tulemuse (joonis 2A). Ja langemise latentsusaeg oli miR-29b2/c KO hiirtel järsult lühem, võrreldes võre rippumise testi metsiktüüpi analoogidega (joonis 2B), kuid WT ja miR Rotarodi testi jõudlus{10} }b2/c KO hiired ei erinenud oluliselt (joonis 2C). Loomade kõnnaku tuvastas Catwalk XT analüüsisüsteem. Üllataval kombel olid miR-29b2/c KO hiirte nii kiirus kui ka sammu pikkus kõrgemad kui nende kolleegidel, samas kui sammutsükkel, seismine ja pöördeaeg olid lühemad ning töötsükkel miR{ {15}} b2/c-puudulikud hiired (joonis 2D).

MiR{0}}-de muutused MPTP-indutseeritud PD hiire seerumis

miR{0}} tase langes PD-ga patsientide seerumis võrreldes tervete kontrollidega [24]. Selles uuringus määrati miR-29 tasemed PD hiirte seerumis 3, 30 ja 120 päeva pärast MPTP alaägeda raviskeemi manustamist. miR-29a ja miR-29b tasemed langesid 3 päeva pärast süstimist ja taastusid algväärtustele 30 päeva pärast ning langesid uuesti 120 päeva pärast. MiR-29c tase aga oluliselt ei muutunud (täiendav joonis 5).

Cistanche toidulisandid

miR-29b2/c defitsiit leevendab MPTP-st põhjustatud nigrostriaalseid vigastusi ja motoorseid puudujääke hiirtel

miR-29b2/c knockout hiirtele ja WT pesakonnakaaslastele süstiti PD mudeli esilekutsumiseks MPTP-d. P21, p53 ja Pai1 ekspressioonitasemed nii miR-29b2/c KO hiirte kui ka WT kontrollide juttkehas pärast MPTP manustamist ei muutunud. MPTP kokkupuude põhjustas TH-positiivsete dopamiinergiliste neuronite märkimisväärse vähenemise SNpc-s [F(1, 20)=5.441, P=0.0302] ja TH-positiivsetes närvilõpmetes ehk TH-valkudes [F(1, 20)=10.5, P=0.0041] ning dopamiini, DOPAC ja HVA tasemed juttkehas (joonis 3A–3D). Kuid MPTP-ga töödeldud miR-29b2/c KO hiirte nigrostriataalsed vigastused leevenesid oluliselt võrreldes MPTP-ga töödeldud WT-kontrollidega dopamiinergiliste neuronite arvu, dopamiinergiliste närvilõpmete tiheduse ja striataalse TH-valgu taseme ja dopamiini kontsentratsioon oli oluliselt kõrgem; Lisaks leevenesid märkimisväärselt muutused DOPACi ja DA ning HVA ja DA suhetes [F(1, 19)=12.64, P=0.0021] (joonis 3A–3D). Tavalistel soolalahusega süstitud miR-29b2/c KO hiirtel suurenes 5-HT ja selle metaboliidi 5-HIAA striataalne kontsentratsioon võrreldes nende WT analoogidega ning NE kontsentratsioonid olid lähedased metsiktüüpi ja miR-29b2/c KO hiired (joonis 3D). Hiirte spontaanse vertikaalse aktiivsuse [26, 27] ja lokomotoorse aktiivsuse [28] hindamiseks kasutati kasvatamise ja pooluse teste. Kaks päeva pärast viimast MPTP süsti vähenes WT hiirte kasvatamise sagedus viimase 2 minuti jooksul võrreldes tavaliste soolalahusega töödeldud WT kontrollidega. Sarnased katsed ei näidanud miR- 29b2/c puudulikkuse mõju MPTP-st põhjustatud muutustele kasvatussageduses (joonis 3E). Sarnaselt suurenes WT-hiirtel pärast MPTP manustamist pooluse testis pööramisele ja alla ronimisele kulunud koguaeg, samas kui koguaeg oli tavaliste soolalahusega ja MPTP-ga töödeldud miR-29b2/c KO hiirte vahel lähedane (joonis 3F). .

miR-29b2/c puudulikkus nõrgendab MPTP-indutseeritud gliia aktivatsiooni hiirtel

PD patoloogiaga on seotud gliiarakkude aktivatsioon ja gliiarakkude poolt vahendatud neuropõletik [29]. Astrotsüütide arv suurenes märgatavalt WT hiirte nigrostriataalses rajas, samas kui GFAP pluss astrotsüütide arv suurenes juttkehas, kuid mitte miR-i SNpc [F(1, 8)=5.412, P=0.0484]. -29b2/c KO hiired kolm päeva pärast MPTP süstimist. Nimelt ei erinenud astrotsüütide tihedus MPTP-ga ravitud WT ja miR{10}}b2/c KO hiirte kahes piirkonnas (joonis 4A, 4B). Iba 1 pluss mikrogliia suurenes WT hiirte mustasaines ja nii WT kui ka miR{21} juttkehas [F(1, 8)=12.74, P=0.0073]. }b2/c KO hiired pärast MPTP manustamist. Veelgi enam, miR-29b2/c KO hiirtel vähendas MPTP süstimine oluliselt mikrogliia tihedust (joonis 4C, 4D).

2. MiR-29b2/c puudulikkuse mõju esmaselt kultiveeritud astrotsüütidele

Testimaks, kas miR-29b2/c puudus mõjutas astrotsüütide proliferatsiooni ja migratsiooni, kasutati kriimustustesti. Primaarsed miR-29b2/c KO astrotsüüdid ei näidanud erinevust proliferatsiooni- ja migratsioonivõimes. Primaarsete WT ja miR-29b2/c KO astrotsüütide rakkude elujõulisus algtasemel ei erinenud. Pärast MPP pluss mürgistust oli WT astrotsüütide rakkude elujõulisus kõrgem võrreldes kontrollidega, samas kui mutantsete astrotsüütide elujõulisus ei muutunud [F(1, 18)=5.727, P=0.0278 ]. MPP plussiga töödeldud WT ja miR{13}}b2/c KO astrotsüütides täheldati suurenenud ROS-produkti ja glükoosi omastamist.

Cistanche tubulosa

Mõõdeti neurotroofsete tegurite, põletikuga seotud molekulide, astrotsüütiliste A1 tüüpi ja A2 tüüpi markergeenide ekspressioonitasemeid MPP plussiga töödeldud astrotsüütides. 12 tundi pärast nakatamist oli BDNF-i ekspressioon WT ja miR-29b2/c KO astrotsüütides kõrgem (joonis 5A). TGF- 1 ekspressioonitase oli WT astrotsüütides pärast MPP plussiga kokkupuudet oluliselt ülesreguleeritud, samas kui see oli miR- 29b2/c KO astrotsüütides allareguleeritud, võrreldes metsiktüüpi astrotsüütidega nii algtasemel kui ka pärast seda. joove (joonis 5B). TNF transkripti baastase oli miR-29b2/c KO astrotsüütides madalam kui WT astrotsüütides. Pärast 12-tunnist ravi suurenesid IL-1, IL-6 ja COX-2 ekspressioonitasemed oluliselt WT ja miR-29b2/c astrotsüütides, samas kui TNF transkriptis oli kõrgem ainult WT astrotsüütides ning IL-1, TNF ja COX-2 transkriptid vähenesid miR-29b2/c KO astrotsüütide rakkudes võrreldes metsiktüüpi analoogidega (joonis 5C) . A1 marker H2-T23 ja A2 marker CD14 olid PBS-ga töödeldud miR- 29b2/c KO astrotsüütides WT kontrollidega võrreldes märgatavalt madalamad. Pärast 12-tunnist töötlemist olid A1 markerid H2-D1, Ggta1 ja C3 ning A2 markerid Clcf1 ja S100 10 ülesreguleeritud nii WT kui ka miR-29b2/c KO astrotsüütides; H2-T23 suurenes ainult WT astrotsüütides; Gbp2 ja CD14 ei muutunud kahes astrotsüütide genotüübis. Veelgi enam, H2-T23, H2-D1 ja CD14 transkriptid olid miR-29b2/c KO astrotsüütides WT kontrollidega võrreldes allareguleeritud (joonis 5D, 5E). 12 tundi ja 24 tundi pärast töötlemist ei muutunud AMPK valkude ja fosforüülitud-AMPK valkude tase WT astrotsüütides, samas kui 24 tundi pärast MPP pluss nakatamist vähenes AMPK valgu tase miR-29b2/ c KO astrotsüütides ja p-AMPK ja AMPK suhe mutantsetes astrotsüütides suurenes võrreldes WT astrotsüütide ja PBS-ga töödeldud mutantsete astrotsüütidega (joonis 5F). Lisaks kasutati WT ja miR-29b2/c KO hiirte primaarsete astrotsüütide stimuleerimiseks PBS-i või LPS-iga töödeldud BV2 rakkude konditsioneeritud söödet (lühikene nimetus CM ja LCM). Kuigi p-AMPK valgu ekspressioon ei muutunud pärast 12-tunnist LCM-i töötlemist, oli see miR-29b2/c KO astrotsüütides oluliselt kõrgem kui WT astrotsüütides. Me täheldasime, et pAMPK valgud suurenesid mõlemas astrotsüütide genotüübis pärast 24 LCM-i töötlemist. LCM-i stimuleerimine suurendas märkimisväärselt COX- 2 valkude ekspressiooni [F(2, 18)=10.29, P=0.0010], kuid COX-2 valgu taset miR-29b2/c KO astrotsüütide arv vähenes võrreldes WT astrotsüütidega (joonis 5G). Nitritite kontsentratsioon LCM-iga töödeldud miR-29b2/c KO astrotsüütides oli samuti oluliselt madalam võrreldes LCM-ga töödeldud WT astrotsüütidega [F(2, 30)=17, P<0.0001] (Figure 5H). Further, the expression of senescence marker genes was evaluated. 12 h-treatment of MPP+ increased p53 transcript levels in both WT and miR- 29b2/c KO astrocytes. p19 and Pai1 transcripts were elevated only in WT astrocytes, and Pai1 expression levels in miR-29b2/c KO astrocytes were decreased compared to WT astrocytes after the treatment. Moreover, Bcl-2, Bax protein levels, and the ratio of Bcl-2 to Bax did not change in WT and miR-29b2/c KO astrocytes.

3. MiR-29b2/c puudulikkuse mõju esmaselt kultiveeritud mikrogliiale

MiR-29b2/c-puuduliku mikrogliia reaktsiooni mõõtmiseks põletikulistele stiimulitele kasutati LPS-i. BDNF ekspressioonitase oli algtasemel madalam miR-29b2/c KO mikrogliia puhul. Neli ja kaheksa tundi pärast LPS-ravi oli IL-1, IL-6, TNF ja COX-2 transkriptide hulk ülesreguleeritud, samas kui IGF-1 ekspressioon vähenes WT-s. ja miR-29b2/c KO mikrogliiarakkudes vähenes BDNF ekspressioon ainult WT mikrogliia korral [F(2, 27)=41.5, P<0.0001]. IL-10 transcript increased in WT and miR-29b2/c KO microglia [F(2, 27) = 3.753, P=0.0365], and TGF-β1 transcript decreased in WT microglia at eight hours after the LPS challenge. BDNF and TGF-β1 transcripts were not changed in miR-29b2/c KO microglia. In addition, IL-6 transcripts were significantly reduced in miR-29b2/c KO microglia after the challenge compared to WT controls, IGF-1 and IL-10 transcripts were markedly higher in miR-29b2/c KO microglia after four and eight hours of intoxication, respectively (Figure 6A–6C). At baseline, the p-AMPK protein level and pAMPK to AMPK ratio were dramatically elevated in miR-29b2/c KO microglia when compared with WT microglia. 24 h after the treatment of LPS, p-AMPK level [F(1, 17) = 5.066, P=0.0379] and the ratio [F(1, 17) = 5.537, P=0.0309] were elevated only in WT microglia (Figure 6D). At one hour after the treatment, the phosphorylated-NF-κB p65 (p-p65) proteins and pp65 to p65 ratio, but not p65 proteins, increased in wildtype and miR-29b2/c KO microglial cells, yet the ratio decreased modestly in miR-29b2/c KO microglial cells when compared with WT microglia (p=0.071) (Figure 6E). The expression of COX-2 was enhanced in the two genotypes of microglial cells; whereas, the level of COX-2 in mutant microglia decreased when compared with WT controls after 24 h-treatment of LPS [F(1, 17) = 5.33, P=0.0338] (Figure 6D). Nitrite product was induced by the treatment of LPS in both genotypes of microglia, however, it was dramatically lower in miR- 29b2/c KO microglia at baseline and after the treatment of LPS [F(1, 20) = 14.03, P=0.0013] (Figure 6F).

Arutelu

MiR-29 pereliikmete ekspressioon on mitmes koes ülesreguleeritud, kui inimesed vananevad [30–32]. Meie ja teiste labori tööd on näidanud seost miR{3}}-i ja Parkinsoni tõve vahel [33]. Käesolevas uuringus uuriti miR- 29b2/c rolli vananemises ja Parkinsoni tõves. miR{7}} avaldavad sõltuvalt kudedest, liigist ja arengufaasist vananemist soodustavat ja tõkestavat toimet. Leidsime, et 3-kuustel miR-29b2/c KO hiirtel oli normaalne luustik ja rasvkude ning 4-kuustel miR- 29b2/c KO hiirtel näitasid oma WT-kaaslasega võrreldes kergemat kehakaalu, mis on kooskõlas teiste uuringutega [11, 34]. 3-kuuse vanuste miR- 29b2/c KO hiirte puhul tuvastati lihasnõrkus ja ebastabiilne kõnnak. Kolmeteistkümne kuu vanustel miR-29b2/c KO hiirtel ilmnes pärisnaha paksenemine. Neil oli aga reieluu normaalne peenstruktuur. Kehakaal vähenes 16-kuu vanustel miR-29b2/c KO hiirtel. Selles vanuses oli miR-29b2/c KO hiirtel vähem kõhurasva ja pruuni rasva ning neil oli ilmne küfoos. miR-29-id osalevad p53-vahendatud rakutsükli peatamises [35, 36] ja p16/Rb-põhises raku vananemises [37]. Kuid rakkude vananemine ei olnud miR-29b2/c KO hiire ajus ilmne. Seega, kuigi miR-29b2/c aitab kaasa vananemise reguleerimisele, võivad selle rollid perifeersetes kudedes ja ajus olla erinevad.

PD-ga patsientidel oli miR{0}}-de seerumitasemed tervete kontrollidega võrreldes alareguleeritud [24]. Siin leidsime, et miR-29 ekspressioon PD hiire seerumis kõikus 3 kuni 120 päeva pärast MPTP manustamist. miR{5}} on ajus rohkesti [6, 30]. GEO profiili läbides leiti, et miR-29c ekspressioon on PD-patsientide substantia nigras ülesreguleeritud (p=0.0059, Mann-Whitney testiga), pealegi miR{{12 }}c ekspressioon ülemises eesmises gyruses ei erinenud (p=0.47, Student-T-testi järgi), võrreldes kontrollsubjektidega (täiendav joonis 10). Siin provotseeriti miR-29b2/c KO hiiri MPTP-ga, et kutsuda esile PD-sarnased vigastused. Mutantsetel hiirtel ilmnesid nigrostriataalse dopamiinergilise süsteemi kergemad vigastused ja kergem gliia aktivatsioon ning seejärel teatud määral käitumuslik resistentsus. Seega on miR-29b2/c-l PD patoloogias kahjulik roll. Me täheldasime, et MPTP-indutseeritud hiire PD mudelis ei muutunud p21, p53 ja Pai1 transkriptide striataalsed tasemed, mis viitab sellele, et raku vananemine ei pruugi toimuda. Vananemist peetakse PD tekke kõrge riskiteguriks [38], kuid vananemisega seotud muutused ajus, eriti dopamiinergilises süsteemis, võivad olla olulisemad tegurid.

WT ja miR{0}}b2/c KO hiirte primaarset gliat kultiveeriti, et uurida selle aluseks olevaid mehhanisme. MPP pluss ravi suurendas GDNF ekspressiooni ja vähendas IL-1 ekspressiooni miR-29b2/c-puuduliku segaglia korral. MPP pluss suurendas ka põletikueelsete geenide ekspressiooni WT astrotsüütides, kuid mitte miR- 29b2/c-puudulikes astrotsüütides. Samuti tootsid mutantsed astrotsüüdid pärast LPS-iga töödeldud BV2 rakkude konditsioneeritud söötmega kokkupuudet vähem NO-d võrreldes WT astrotsüütidega. Primaarses mikrogliia kultuuris olid LPS-ga töödeldud WT kontrollidega võrreldes põletikuvastase tsütokiini IL-10 ja neurotroofse faktori IGF-1 transkriptid märgatavalt kõrgemad ning põletikku soodustava tsütokiini IL{ transkriptid. {15}} vähenes LPS-ga töödeldud miR-29b2/c KO mikrogliia korral. NO tase vähenes miR-29b2/c KO mikroglia puhul algtasemel ja pärast LPS-i mürgistust. Uuringud on näidanud, et miR{20}}-id ja paljud prognoositud sihtgeenid on seotud metaboolsete protsessidega [34, 39–41]. Olulise regulaatorina on tõestatud, et AMPK on aktiveeritud PD-s kaitsev [42]. AMPK aktiveerimine stimuleerib Sirtuin 1 ja pärsib kaudselt NF-κB aktivatsiooni ja allavoolu põletikulisi sihtgeene [43]. Täheldasime, et LCM-ga töödeldud ja MPP pluss-töödeldud miR- 29b2/c KO astrotsüütides oli fosforüülitud-AMPK valgu tase ja p-AMPK ja AMPK suhe ülesreguleeritud. COX-2 valgu tase langes LCM-ga töödeldud mutantsetes astrotsüütides võrreldes WT astrotsüütidega. Algtasemel oli AMPK aktiivsus miR-29b2/c KO mikrogliia korral kõrgem. COX-2 valgu kogus vähenes oluliselt miR-29b2/c KO mikrogliia puhul võrreldes WT kontrollidega pärast LPS-i ravi. LPS-ravi ajal oli p-p65 ja p65 suhe mutantses mikroglias veidi alla reguleeritud, mis viitab leevendatud NF-KB signaalirajale. Meie tulemused näitavad, et suurenenud AMPK aktiivsus ja vähenenud põletikuline reaktsioon glias kaitsevad miR-29b2/c KO hiirte nigrostriataalset rada (joonis 6G). Kokkuvõttes mängib miR-29b2/c olulist rolli nigrostriataalse dopamiinergilise süsteemi vananemises ja kahjustustes.

Viited

1. Braak H, Del Tredici K. Kutsutud artikkel: Närvisüsteemi patoloogia sporaadilise Parkinsoni tõve korral. Neuroloogia. 2008; 70:1916–25.

2. Wang Q, Liu Y, Zhou J. Parkinsoni tõve neuroinflammatsioon ja selle potentsiaal terapeutilise sihtmärgina. Transl Neurodegener. 2015; 4:19.

3. Wang Z, Dong H, Wang J, Huang Y, Zhang X, Tang Y, Li Q, Liu Z, Ma Y, Tong J, Huang L, Fei J, Yu M jt. NF-κB c-Rel prosurvival ja põletikuvastased rollid Parkinsoni tõve mudelites. Redox Biol. 2020; 30:101427.

4. Zhu S, Wu H, Wu F, Nie D, Sheng S, Mo YY. MicroRNA- 21 on suunatud kasvaja supressorgeenidele invasiooni ja metastaaside korral. Cell Res. 2008; 18:350–59.

5. Qiu L, Zhang W, Tan EK, Zeng L. MikroRNA-de funktsiooni ja regulatsiooni dešifreerimine Alzheimeri tõve ja Parkinsoni tõve korral. ACS Chem Neurosci. 2014; 5:884–94.

6. Papadopoulou AS, Serneels L, Achsel T, Mandemakers W, Callaerts-Vegh Z, Dooley J, Lau P, Ayoubi T, Radaelli E, Spinazzi M, Neumann M, Hébert SS, Silahtaroglu A jt. MiR-29a/b-1 klastri puudulikkus põhjustab hiirtel ataktilisi tunnuseid ja väikeaju muutusi. Neurobiol Dis. 2015; 73:275–88.

7. Hyun J, Choi SS, Diehl AM, Jung Y. Hedgehog signalisatsiooni ja mikroRNA-29 potentsiaalne roll IKK-puuduliku hiire maksafibroosis. J Mol Histol. 2014; 45:103–12.

8. Qin W, Chung AC, Huang XR, Meng XM, Hui DS, Yu CM, Sung JJ, Lan HY. TGF- /Smad3 signaalimine soodustab neerufibroosi, inhibeerides miR-29. J Am Soc Nephrol. 2011; 22:1462–74.

9. Xiao J, Meng XM, Huang XR, Chung AC, Feng YL, Hui DS, Yu CM, Sung JJ, Lan HY. miR-29 inhibeerib hiirtel bleomütsiini poolt indutseeritud kopsufibroosi. Mol Ther. 2012; 20:1251–60.

10. Steiner DF, Thomas MF, Hu JK, Yang Z, Babiarz JE, Allen CD, Matloubian M, Blelloch R, Ansel KM. MicroRNA-29 reguleerib T-kasti transkriptsioonifaktoreid ja interferooni tootmist T-abistajarakkudes. Immuunsus. 2011; 35: 169-81.

11. Dooley J, Garcia-Perez JE, Sreenivasan J, Schlenner SM, Vangoitsenhoven R, Papadopoulou AS, Tian L, Schonefeldt S, Serneels L, Deroose C, Staats KA, Van der Schueren B, De Strooper B jt. MikroRNA-29 perekond määrab tasakaalu homöostaatilise ja patoloogilise glükoosikäsitluse vahel diabeedi ja rasvumise korral. Diabeet. 2016; 65:53–61.

12. Adoro S, Cubillos-Ruiz JR, Chen X, Deruaz M, Vrbanac VD, Song M, Park S, Murooka TT, Dudek TE, Luster AD, Tager AM, Streeck H, Bowman B jt. IL-21 indutseerib CD4 T-rakkudes viirusevastase mikroRNA-29, et piirata HIV-1-nakkust. Nat Commun. 2015; 6:7562.

13. Ma F, Xu S, Liu X, Zhang Q, Xu X, Liu M, Hua M, Li N, Yao H, Cao X. MikroRNA miR-29 kontrollib kaasasündinud ja adaptiivseid immuunvastuseid rakusisese bakteriaalse infektsiooni korral suunates interferooni- . Nat Immunol. 2011; 12:861–69.

14. Jovičić A, Roshan R, Moisoi N, Pradervand S, Moser R, Pillai B, Luthi-Carter R. Närvirakutüübispetsiifiliste miRNA-de põhjalikud ekspressioonianalüüsid tuvastavad neuronaalsete fenotüüpide spetsifikatsiooni ja säilitamise uued määrajad. J Neurosci. 2013; 33:5127–37.

15. Ouyang YB, Xu L, Lu Y, Sun X, Yue S, Xiong XX, Giffard RG. Astrotsüütidega rikastatud miR-29a on suunatud PUMA-le ja vähendab neuronite haavatavust eesajuisheemia suhtes. Glia. 2013; 61:1784–94.

16. Shioya M, Obayashi S, Tabunoki H, Arima K, Saito Y, Ishida T, Satoh J. Hälbiv mikroRNA ekspressioon neurodegeneratiivsete haiguste ajus: miR-29a vähenenud Alzheimeri tõve ajus on suunatud neuronite navigaatorile 3. Neuropathol Appl Neurobiol. 2010; 36:320–30.

17. Hébert SS, Horré K, Nicolaï L, Papadopoulou AS, Mandemakers W, Silahtaroglu AN, Kauppinen S, Delacourte A, De Strooper B. MikroRNA klastri miR-29a/b-1 kadumine juhuslikult Alzheimeri tõbi korreleerub suurenenud BACE1 / beeta-sekretaasi ekspressiooniga. Proc Natl Acad Sci USA. 2008; 105:6415–20.

18. Johnson R, Zuccato C, Belyaev ND, külalis-DJ, Cattaneo E, Buckley NJ. MikroRNA-l põhinev geeni düsregulatsiooni rada Huntingtoni tõve korral. Neurobiol Dis. 2008; 29:438–45.

19. Packer AN, Xing Y, Harper SQ, Jones L, Davidson BL. Bifunktsionaalne mikroRNA miR-9/miR-9* reguleerib REST-i ja COREST-i ning on Huntingtoni tõve korral allareguleeritud. J Neurosci. 2008; 28:14341–46.

20. Nolan K, Mitchem MR, Jimenez-Mateos EM, Henshall DC, Concannon CG, Prehn JH. MikroRNA-29a suurenenud ekspressioon ALS-i hiirtel: selle inhibeerimise funktsionaalne analüüs. J Mol Neurosci. 2014; 53:231–41.

21. Roshan R, Shridhar S, Sarangdhar MA, Banik A, Chawla M, Garg M, Singh VP, Pillai B. MiR-29 ajuspetsiifiline knockdown põhjustab hiirtel neuronaalse rakusurma ja ataksia. RNA. 2014; 20:1287–97.

22. Khanna S, Rink C, Ghoorkhanian R, Gnyawali S, Heigel M, Wijesinghe DS, Chalfant CE, Chan YC, Banerjee J, Huang Y, Roy S, Sen CK. MiR-29b kadumine pärast ägedat isheemilist insuldi soodustab närvirakkude surma ja infarkti suurust. J Cereb Blood Flow Metab. 2013; 33:1197–206.

23. Shi G, Liu Y, Liu T, Yan W, Liu X, Wang Y, Shi J, Jia L. Ülereguleeritud miR-29b soodustab neuronaalsete rakkude surma, pärssides Bcl2L2 pärast isheemilist ajukahjustust. Exp Brain Res. 2012; 216:225–30.

24. Bai X, Tang Y, Yu M, Wu L, Liu F, Ni J, Wang Z, Wang J, Fei J, Wang W, Huang F, Wang J. Vereseerumi mikroRNA 29 perekonna alareguleerimine Parkinsoni tõvega patsientidel . Sci Rep. 2017; 7:5411.

25. Han L, Tang Y, Bai X, Liang X, Fan Y, Shen Y, Huang F, Wang J. Seerumi mikroRNA-29 perekonna seos kognitiivsete häiretega Parkinsoni tõve korral. Vananemine (Albany NY). 2020; 12:13518–28.

26. Chinta SJ, Woods G, Demaria M, Rane A, Zou Y, McQuade A, Rajagopalan S, Limbad C, Madden DT, Campisi J, Andersen JK. Rakkude vananemist indutseerib keskkonna neurotoksiin Paraquat ja see aitab kaasa Parkinsoni tõvega seotud neuropatoloogiale. Rakkude Vabariik 2018; 22:930–40.

27. Willard AM, Bouchard RS, Gittis AH. Motoorse defitsiidi diferentsiaalne lagunemine hiirte dopamiini järkjärgulise ammendumise ajal 6-hüdroksüdopamiiniga. Neuroteadus. 2015; 301:254–67.

28. Kam TI, Mao X, Park H, Chou SC, Karuppagounder SS, Umanah GE, Yun SP, Brahmachari S, Panicker N, Chen R, Andrabi SA, Qi C, Poirier GG jt. Polü(ADP-riboos) põhjustab Parkinsoni tõve korral patoloogilist sünukleiini neurodegeneratsiooni. Teadus. 2018; 362:eaat8407.

29. Huang D, Xu J, Wang J, Tong J, Bai X, Li H, Wang Z, Huang Y, Wu Y, Yu M, Huang F. Dynamic Changes in the Nigrostriat Pathway in the MPTP Mouse Model of Parkinson's Disease. Parkinsoni tõbi. 2017; 2017: 9349487.

30. Ugalde AP, Ramsay AJ, de la Rosa J, Varela I, Mariño G, Cadiñanos J, Lu J, Freije JM, López-Otín C. Vananemine ja krooniline DNA kahjustuse reaktsioon aktiveerivad regulatsiooniraja, mis hõlmab miR{{2} } ja lk53. EMBO J. 2011; 30:2219–32.

31. Hu Z, Klein JD, Mitch WE, Zhang L, Martinez I, Wang XH. MikroRNA-29 indutseerib vananeva lihase rakkude vananemist mitme signaaliülekande kaudu. Vananemine (Albany NY). 2014; 6:160–75.

32. Fenn AM, Smith KM, Lovett-Racke AE, Guerau-deArellano M, Whitacre CC, Godbout JP. Suurenenud mikroRNA 29b vananenud ajus korreleerub insuliinitaolise kasvufaktori -1 ja fraktalkiini ligandi vähenemisega. Neurobiol vananemine. 2013; 34:2748–58.

33. Wang R, Yang Y, Wang H, He Y, Li C. MiR-29c kaitseb Parkinsoni tõve mudelis põletiku ja apoptoosi eest in vivo ja in vitro, sihtides SP1. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2020; 47:372–82.

34. Caravia XM, Fanjul V, Oliver E, Roiz-Valle D, Morán- Álvarez A, Desdín-Micó G, Mittelbrunn M, Cabo R, Vega JA, Rodríguez F, Fueyo A, Gómez M, LoboGonzález M jt. MikroRNA-29/PGC1 regulaatortelg on südamefunktsiooni metaboolse kontrolli jaoks kriitilise tähtsusega. PLoS Biol. 2018; 16:e2006247.

35. Varela I, Cadiñanos J, Pendás AM, Gutiérrez-Fernández A, Folgueras AR, Sánchez LM, Zhou Z, Rodríguez FJ, Stewart CL, Vega JA, Tryggvason K, Freije JM, LópezOtín C. Accelerated deficient in Zmpste2ficient proteaas on seotud p53 signaali aktiveerimisega. Loodus. 2005; 437:564–68.

36. Park SY, Lee JH, Ha M, Nam JW, Kim VN. miR-29 miRNA-d aktiveerivad p53, sihtides p85 alfat ja CDC42. Nat Struct Mol Biol. 2009; 16:23–29.

37. Martinez I, Cazalla D, Almstead LL, Steitz JA, DiMaio D. miR-29 ja miR-30 reguleerivad B-Myb ekspressiooni raku vananemise ajal. Proc Natl Acad Sci USA. 2011; 108:522–27.

38. Collier TJ, Kanaan NM, Kordower JH. Vananemine ja Parkinsoni tõbi: sama mündi erinevad küljed? Mov Disord. 2017; 32:983–90.

39. Massart J, Sjögren RJ, Lundell LS, Mudry JM, Franck N, O'Gorman DJ, Egan B, Zierath JR, Krook A. Muutunud miR- 29 Ekspressioon 2. tüüpi diabeedi korral mõjutab glükoosi ja lipiidide metabolismi skeletis Lihas. Diabeet. 2017; 66:1807–18.

40. Dooley J, Lagou V, Garcia-Perez JE, Himmelreich U, Liston A. miR-29a-puudus ei muuda hiire pankrease atsinaarkartsinoomi kulgu. Oncotarget. 2017; 8:26911–17.

41. Kwon JJ, Factora TD, Dey S, Kota J. Süstemaatiline ülevaade miR-29 kohta vähist. Mol Ther Oncolytics. 2018; 12:173–94.

42. Lu M, Su C, Qiao C, Bian Y, Ding J, Hu G. Metformiin takistab dopamiinergiliste neuronite surma MPTP/PI-indutseeritud hiiremudelis Parkinsoni tõve autofagia ja mitokondriaalse ROS-i kliirensi kaudu. Int J Neuropsychopharmacol. 2016; 19:pyw047.

43. Salminen A, Hyttinen JM, Kaarniranta K. AMP-aktiveeritud proteiinkinaas inhibeerib NF-κB signaalimist ja põletikku: mõju tervisele ja elueale. J Mol Med (Berl). 2011; 89:667–76.

Xiaochen Bai 1,2, Xiaoshuang Zhang 1, Rong Fang 1, Jinghui Wang 1, Yuanyuan Ma 1, Zhaolin Liu 1, Hongtian Dong 1, Qing Li 1, Jingyu Ge 1, Mei Yu 1, Jian Fei 3,4, Ruilin Sun 4, Fang Huang 1

1. Translatiivse neuroteaduse osakond, Shanghai Jing'ani piirkonna keskushaigla, meditsiinilise neurobioloogia riiklik võtmelabor ja MOE piirialade ajuteaduse keskus, Fudani ülikooli ajuteaduse instituudid, Shanghai 200032, Hiina

2. Taastusravi osakond, Shanghai Jiao Tongi ülikooli kuues rahvahaigla, Shanghai 200233, Hiina

3. Bioteaduste ja tehnoloogia kool, Tongji ülikool, Shanghai 200092, Hiina

4. Shanghai mudelorganismide inseneriuuringute keskus, Shanghai mudelorganismide keskus, INC, Shanghai 201203, Hiina