Podotsüüdi vigastus Tlr8 ja selle endogeense ligandi MiR-21 vahelise interaktsiooni tõttu ummistunud ja selle kõrvalseeruvas neerus

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

cistanche erektsioonihäired seotud neerudega

Kuigi krooniline neeruhaigus on täiskasvanutel levinud, on obstruktiivset nefropaatiat (ON) teatatud nii noortel kui ka eakatel patsientidel. ON-is on tubulointerstitsiaalseid kahjustusi (TIL) laialdaselt uuritud, kuid glomerulaarseid kahjustusi (GL-id) on suures osas tähelepanuta jäetud. Siin näitame uudset mehhanismi, mis on aluseks GL-i arengule ON-is noortel ja vanadel hiirtel. TIL-id arenevad varem kui GL-id põletikuliste rakkude infiltratsiooni tõttu tubulointerstitiumis, kuid GL-id arenevad pärast Toll-sarnase retseptori 8 (Tlr8) aktiveerimist, kuigi glomerulitesse infiltreeruvad põletikulised rakud puuduvad. TLR8 ja interleukiin 1 beeta (IL1b) valgud kolokaliseeruvad vähendavate podotsüütide funktsioonimarkeritega (PFM), mis näitab TLR8 signaaliülekande aktiveerimist vigastatud podotsüütides. Lisaks olid Tlr8 endogeense ligandi miR-21 glomerulaar- ja seerumitasemed ON hiiremudelis kõrgemad kui võltskontrollis. Tlr8 glomerulaarne ekspressioon korreleerub positiivselt miR-21 ja allavoolu tsütokiinidega Il1b ja Il6 ning negatiivselt PFM-idega (Nphs1 ja Synpo). Näitame ka TLR8 ja IL1b valkude kolokaliseerumist PFM-ide vähendamisega nii takistatud kui katagatisneerudnoortest ja vanadest hiirtest. Lisaks näitasid in vitro uuringutulemused Tlr8 ja selle allavoolu tsütokiinide kõrgemat ekspressiooni ummistunud glomerulites.neerudpärast ravi miR- 21 mimiciga kui kontrollrühmas. Kokkuvõtteks võib öelda, et Tlr8 üleekspressioon võib olla usutav mehhanism GL-i arengu aluseks ON-is podotsüütide vigastuse kaudu.

Märksõnad: krooniline neeruhaigus,obstruktiivne nefropaatia, podotsüüt, TLR8, obstruktiivne ja külgne neer

SISSEJUHATUS

Krooniline neeruhaigus (CKD), mis on suur rahvatervise probleem, on levinud 8–13 protsendil elanikkonnast (1). Vananeva ühiskonna tõttu esineb see sageli vanematel inimestel. Obstruktiivne nefropaatia (ON) pakub arstidele suurt huvi, kuna seda on teatatud erinevatest vanuserühmadest pärit patsientidel. ON on erinevalt teistest krooniliste neeruhaigustest ravitav ja pöörduv (2, 3). Lastel esineb seda ühel 1500 noorest inimesest ja selle levimus on arenenud riikides koguni 1–5 protsenti (4, 5). Täiskasvanutel on ON-i levimus 5 inimesel 1000-st kuni 5-ni 10 000-st. Lisaks on kroonilise ühepoolse ON levimus ligikaudu 0,5 protsenti, samas kui ägeda ühepoolse ja kroonilise kahepoolse ON levimus on ligikaudu 0,1 protsenti (4–7).

ON võib põhjustada ägedat neerukahjustust või kroonilist neeruhaigust, millega kaasneb neerufunktsiooni progresseeruv langus ja muutused neerustruktuurides, mis kestavad üle 3 kuu (8, 9). Ühepoolne kusejuha obstruktsioon (UUO) on laialdaselt kasutatav strateegia kroonilise ON-i uurimiseks. ON-i UUO neerus iseloomustab hüpertroofia, hüdronefroos, põletikuliste rakkude värbamine interstitsiaalses piirkonnas, tubulaarsete rakkude surm hüpoksiast ja kollageeni ladestumine tubulointerstitiumis, millele järgneb tubulointerstitsiaalse fibroosi (TF) areng (10).

TF on lõppstaadiumis neeruhaiguse oluline tunnus ja progresseeruva neerukahjustuse peamine tegur (11). TF-i on ON-mudelites põhjalikult uuritud, kuid andmeid glomerulaarkahjustuste, eriti vere-uriinibarjääri (BUB) kõrvalekallete kohta on vähe (8, 9, 12). Lisaks on uuringutes uuritud tubulointerstitsiaalseid kahjustusi (TIL-sid) külgneerudes ühepoolse ON-i korral, kuid glomerulaarsed kahjustused (GL-id) on suures osas tähelepanuta jäetud (12). Mitmed aruanded on näidanud peritubulaarsete kapillaaride osalust TIL-ide progresseerumisel eksperimentaalses ON-is (13, 14). Kuid glomerulus ja glomerulaarne kapillaar voolavad vastavalt nefroni ja peritubulaarsete kapillaaride torukujulistesse segmentidesse. Seetõttu soovitame, et glomerulonefriit võib mõjutada ka tubulointerstitiumi. Meie varasemad uuringud on rõhutanud glomerulaarsete sisemiste rakkude, peamiselt podotsüütide, vigastuste panust GL-sse ja sellele järgnenud TIL-i arengut autoimmuunhaiguse hiiremudelis, mis on tingitud erinevate Toll-like retseptorite (TLR) üleekspressioonist (15–18).

Glomerulaarne kapillaaride endoteel ja podotsüüdid on olulised väravavahid, mis sisaldavad BUB-sid. Nende kahe epiteeli vahel puutuvad podotsüüdid pidevalt kokku ohusignaalidega, sealhulgas TLR ligandid, nagu ohuga seotud molekulaarmustrid (DAMP) või patogeeniga seotud molekulaarmustrid (PAMP), tänu nende ainulaadsele lokaliseerimisele glomerulites (15). Seetõttu arvatakse, et podotsüütide ja nende endogeensete ligandide vaheline interaktsioon aitab kaasa podotsüütide vigastustele mittenakkuslikes tingimustes. Käesolevas uuringus keskendusime GL-i arengule nii noorte kui ka vanade hiirte ummistunud ja kaasneerudes, kuna ON-i leidub sageli nii noortel kui ka vanematel inimestel. Selgitasime, et GL töötati välja ON-is podotsüütide vigastuse tõttu Tlr8 üleekspressiooni kaudu noorte ja vanade hiirte nii ummistunud kui ka külgmiste neerude podotsüütides.

MATERJALID JA MEETODID

Eetiline avaldus ja katseloomade pidamised Kõik katseloomadega tehtud katsed kiitis heaks Hokkaido ülikooli veterinaarmeditsiiniteaduskonna institutsionaalne loomade hooldamise ja kasutamise komitee (kinnitusnr 16- 0124). Autorid järgisid Hokkaido ülikooli veterinaarmeditsiini teaduskonna laboriloomade hooldamise ja kasutamise heakskiidetud juhendit (heakskiidetud Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International). Kuue nädala vanused C57BL/6N hiired osteti ettevõttelt Japan SLC Inc. (Hamamatsu, Jaapan) ja neid hoiti spetsiifilistes patogeenivabades tingimustes 1:1 hele-pimedas keskkonnas. Katseloomadele anti ad libitum toitu ja joogivett.

Eksperimentaalne disain Kasutasime nii noori (9 nädalat) kui ka vanu (12 kuud) hiiri. Iga vanuserühma (n=4) hiirtele tehti kas võltsoperatsioon (kontrollrühm) või UUO (2, 7, 11 ja 21 päeva), et luua ON-mudeli neer, nagu on kirjeldatud meie eelmises uuringus. (13).

Proovi ettevalmistamine Hiired anesteseeriti sügavalt anesteetikumide seguga, nagu eelnevalt kirjeldatud (16) ja eutaniseeriti emakakaela dislokatsiooniga. Vereproovid koguti seerumimarkerite analüüsimiseks reiearteri kaudu. Nii UUO kui ka külgneerud koguti ja lõigati õhukesteks viiludeks. Neerulõigud fikseeriti vastavalt 10% neutraalse puhverformaliini (NBF), 4% paraformaldehüüdi (PFA) ja 2,5% glutaaraldehüüdiga (GTA) histopatoloogiliste, immunohistokeemiliste ja elektronmikroskoopiliste uuringute jaoks.

Immunohistokeemia ja immunofluorestsents NBF-ga fikseeritud parafiiniplokid lõigati 2 mm paksuseks ja värviti neeru histopatoloogia uurimiseks perioodilise happega Schiff-hematoksüliiniga (PAS-H). Rakumarkerite immuuntuvastus viidi läbi nagu varem teatatud (16) B-rakkude (B220), T-rakkude (CD3), kapillaaride endoteeli (CD31), IL1b, makrofaagide (Iba1), podotsüütide (podotsiin ja sünaptopodiin) ja TLR8 jaoks. Värvimistingimused on loetletud tabelis 1.

Histoplanimeetria PAS-H ja immunovärvitud neerulõigud muudeti virtuaalseteks slaidideks, kasutades Nano Zoomer 2.0 RS (Hamamatsu Photonics Co., Ltd.; Hamamatsu, Jaapan). Positiivsed rakud loendati juhuslikult valitud 20 glomeruli või 20 koldest tubulointerstitiumist 400-kordse suurendusega, kasutades tarkvara NDP.view2 (Hamamatsu Photonics Co., Ltd.). 20 glomeruli kujutised PAS-H-ga värvitud lõikudest jäädvustati ka 400-kordselt igalt hiirelt, kasutades kõik-ühes fluorestsentsmikroskoopi BZ-X710 (Keyence, Osaka, Jaapan). Glomerulaarne mesangiaalne piirkond ja suurus mõõdeti tehtud piltidest, kasutades BZ-X analüsaatorit (Keyence).

Glomeruluse eraldamine RNA ekstraheerimiseks ja kultiveerimiseks Glomerulid fiktiivselt opereeritud ja UUO neerudest eraldati vastavalt eelnevalt kirjeldatule (16). Lühidalt, hiired anesteseeriti sügavalt ja perfuseeriti läbi vasaku vatsakese 40 ml Hanki tasakaalustatud soolalahusega (HBSS), mis sisaldas Dynabeadsi (8 × 107; Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Neer lõigati välja

ja haki väikesteks tükkideks. Seejärel seediti rakke kollagenaas A-ga (1 mg/ml; Roche, Basel, Šveits) ja desoksüribonukleaas I-ga (100 U/ml; Life Technologies) HBSS-s 37 kraadi juures 30 minutit. Seeditud kude sisaldav suspensioon suruti lameda nuia abil õrnalt läbi 100- mm rakusõela (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ, USA). Saadud rakususpensiooni tsentrifuugiti 200 x g juures 5 minutit ja rakusade resuspendeeriti 2 ml HBSS-s. Dynabeadsi sisaldavad glomerulid koguti magnetosakeste kontsentraatoriga (Life Technologies) ja kasutati RNA eraldamiseks.

Pöördtranskriptsioon ja reaalajas PCRKogu RNA eraldati glomerulitest, kasutades RNeasy komplekti (Qiagen, Hilden, Saksamaa). cDNA sünteesiti kogu RNA-st pöördtranskriptsiooniga, kasutades ReverTra Ace pöördtranskriptaasi ensüümi (Toyobo, Osaka, Jaapan) ja juhuslikke dT praimereid (Promega). cDNA-d kasutati reaalajas PCR-is koos Brilliant III SYBR Green QPCR põhisegu ja Mx3000P-ga (Agilent Technologies, La Jolla, CA, USA). Glomerulaarse geeni ekspressioon normaliseeriti Actb ekspressiooniks. Kasutatud praimerite paarid on näidatud tabelis 2.

Pöördtranskriptsioon ja TaqManil põhinev reaalajas PCRKogu RNA, sealhulgas mikroRNA (miRNA) eraldatud glomerulites, eraldati miRNeasy komplekti (Qiagen) abil. Kogu RNA pöördtranskribeerimiseks kasutati miRNA-spetsiifilisi tüviahela RT praimereid, pöördtranskriptaasi, pöördtranskriptsioonipuhvrit, dNTP-sid ja RNaasi inhibiitorit vastavalt tootja juhistele (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Saadud cDNA-ga viidi läbi reaalajas PCR, kasutades miR-21- spetsiifilisi TaqMani praimereid ja spetsiifilisi sonde (Applied Biosystems), TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) ja Mx3000P (Agilent Technologies).

Isoleeritud glumeruli in vitro ravi miimikagaGlomeruli isoleeriti võltsoperatsioonist ja UUO-stneerudpärast 11-päevast obstruktsiooni. Roswell Parki memoriaalinstituudi-1640 (RPMI-1640) sööde (Fujifilm Wako, Jaapan), mis sisaldas 300 glomeruli, jaotati 96-kaevu kultuuriplaadi igasse süvendisse (TPP, Trasadingen, Šveits) ja töödeldi PBS-i, negatiivse kontrolli ja miR-21-i miimikaga (UAG CUU AUC AGA CUG AUG UUG A) (Bioneer, Daejeon, Lõuna-Korea) 1 pmol/µL 4 tundi 37 kraadi juures 5% CO2-ga. Tlr8 ja selle allavoolu tsütokiinide ekspressiooni mõõdeti nii, nagu on kirjeldatud eelmises jaotises.

Skaneeriv elektronmikroskoopiaRutiinseks skaneerivaks elektronmikroskoopiaks (SEM), väikeneerud viiludfikseeriti 2,5-protsendilise GTA-ga 4 tundi ja järelfikseeriti 1-protsendilise osmiumtetroksiidiga 1 tund, millele järgnes 1-tunnine töötlemine 1-protsendilise parkhappega. Seejärel fikseeriti proove 1-protsendilise osmiumtetroksiidiga 1 tund ja töödeldi 0,5-protsendilise ja 1-protsendilise parkhappega vastavalt 10 minutit ja 1 tund.Neerviiluddehüdreeriti kasvava alkoholiga, viidi üle 3-metüülbutüülatsetaadisse ja lõpuks kuivatati HCP-2 kriitilise punkti kuivatis (Hitachi, Tokyo, Jaapan). Proovid allutati ioonpihustamisele ja seejärel uuriti S-4100 skaneeriva elektronmikroskoobi all kiirendatud pingel 12 kV.

Statistiline analüüsVäärtused on väljendatud keskmisena ± standardviga (se). Tulemusi analüüsiti statistiliselt mitteparameetrilise Mann-Whitney U-testi abil (P < 0.05).="" kolme="" või="" enama="" populatsiooni="" võrdlemiseks="" kasutati="" kruskal-wallise="" testi="" ja="" kui="" olulisi="" erinevusi="" täheldati="" (p="">< 0,05),="" viidi="" läbi="" mitu="" võrdlust,="" kasutades="" scheffe="" meetodit.="" kahe="" parameetri="" vahelist="" korrelatsiooni="" analüüsiti="" spearmani="" auaste="" korrelatsioonikordaja="" testiga="" (p=""><>

TULEMUSED

TIL-id ja GL-id noorte hiirte ummistunud neerudesEsmalt uurisime TIL-e ja GL-sid fiktiivselt opereeritud ja UUO neerudes noortel hiirtel, kes olid erinevatel ajaperioodidel obstruktsiooni all. Kui fiktiivselt opereeritud neerudel oli normaalne tubulointerstitium (joonis 1A), siis ummistunud neerudel pärast 2-päevast UUO-d ilmnesid TIL-id ja neid iseloomustas tuubulite laienemine; mõned torukesed sisaldasid ka kuseteede kipsi. Sellised kahjustused suurenesid obstruktsiooni edenedes (joonis 1A). GL-sid, peamiselt glomeruloskleroosi, täheldati hilises staadiumis 21 päeva pärast UUO-d ja neid iseloomustas perioodilise happe-Schiffi (PAS) positiivsete materjalide sadestumine. Glomerulaarstruktuur oli normaalne nii võltsitud kui ka varajases UUO neerudes (2, 7 ja 11 päeva) (joonis 1B). Glomerulaarrakkude arv kaldus suurenema kuni -11 päevani pärast obstruktsiooni ja vähenema päeval-21 UUO neerudes (joonis 1C). Glomerulaarne mesangiaalne akumulatsioon kippus 7 päeva pärast obstruktsiooni suurenema (joonis 1D).

puudus UUO neerude glomerulite keskel 21 päeva pärast obstruktsiooni (joonis 1F). Polümeraasi ahelreaktsioon näitas PFM-ide (Nphs1 ja Synpo) olulist vähenemist UUO neerudes 21 päeva pärast obstruktsiooni (joonis 1G). Lisaks näitas SEM-analüüs võltsoperatsiooniga neerudes normaalseid podotsüütide jalaprotsesse (PFP); siiski teatati UUO neerudes PFP tuhmumisest ja mikrovillilaadsetest struktuuridest 21 päeva pärast obstruktsiooni (joonis 1H). Need tulemused koos viitavad podotsüütide kahjustuse esinemisele ummistunud neerus 21 päeva pärast obstruktsiooni.

Ummistunud neerus puuduvad infifiltreeruvad immuunrakud. Oleme varem näidanud, et podotsüütide kahjustus korreleerub infifiltreeruvate immuunrakkudega glomerulites (13, 16, 18). Seetõttu uurisime nii B- ja T-rakkude kui ka makrofaagide infifiltratsiooni valeopereeritud ja UUO neerude TIL-ides ja GL-des (joonis 2). UUO neerude TIL-ides täheldati kõigil päevadel pärast obstruktsiooni arvukalt infifiltreeruvaid B-, T-rakke ja makrofaage, kuid nii võltsitud kui ka UUO neerude glomerulites neid peaaegu polnud või oli vähe (joonised 2A–E). B-, T-rakkude ja makrofaagide arv oli glomerulites väga väike (andmeid pole näidatud), kuid märkimisväärselt suurem

2-, 7-, 11- ja 21-päevaste neerude tubulointerstitium võrreldes valeneeru omaga (joonis 2F). Seetõttu võivad infiltreeruvad immuunrakud aidata kaasa TIL-ide tekkele ummistunud neerus. GL arenguga võivad aga olla seotud ka muud tegurid.

TLR perekonna erinevate liikmete ja allavoolu tsütokiinide ekspressioon noorte hiirte võltsoperatsiooniga ja obstruktiivne neerudes Varasemad uuringud on näidanud erinevate TLR-ide kõrgemat ekspressiooni haigete neerude podotsüütides (15, 16, 19, 20). Huvitaval kombel näitasid meie andmed Tlr8 ja Tlr9 märkimisväärselt kõrgemat ekspressiooni UUO 21-päevarühmast eraldatud glomerulites kui võltsrühma glomerulites (joonis 3A). Lisaks uurisime TLR-i perekonnaliikmete allavoolu tsütokiinide ekspressiooni võlts- ja UUO 21-päevarühmade glomerulites ning leidsime nii interleukiin 1 beetat (Il1b) kui ka interleukiin 6 kodeerivate geenide ekspressiooni olulise ülesreguleerimise. (Il6) UUO rühmas võrreldes võltsrühma omaga (joonis 3B).

TLR8 kaaslokaliseeritud PFM-iga Kuna Tlr8 ja Tlr9 ekspressioon oli ummistunud neerust eraldatud glomerulites kõrge, uurisime nende lokaliseerimist immunofluorestsentsvärvimisega. TLR8 valku ei tuvastatud valeopereeritud neerudes (joonis 4A), kuid see kolokaliseeriti UUO neerus PFM sünaptopodiiniga (joonis 4B). Lisaks ei õnnestunud meil tuvastada TLR9 valgu ekspressiooni neerudes ei võltsoperatsiooniga või UUO hiirtelt (andmeid pole näidatud).

IL1b tootmine noorte hiirte obstruktiivne neerus olevatest podotsüütidest Nagu on näidatud joonisel 3B, oli glomerulaarse Il1b (TLR perekonna allavoolu tsütokiin) ekspressioon UUO neerus 21. päeval oluliselt kõrgem kui valeneeru oma. Seetõttu uurisime immunofluorestsentsvärvimisega IL1b allikat UUO neerude glomerulites. IL1b valgu ekspressiooni ei tuvastatud valeneerude glomerulites, kuid seda täheldati UUO neerude glomerulites (joonised 4C, D). Lisaks kolokaliseeriti IL1b PFM podotsiiniga (joonis 4D).

aastal UUOneerud21 päevaga kui võltsitudneerud.Seetõttu uurisime immunofluorestsentsvärvimisega IL1b allikat UUO neerude glomerulites. IL1b valgu ekspressiooni võltsitud glomerulites ei tuvastatudneerudkuid seda täheldati UUO glomerulitesneerud(Joonised 4C, D). Lisaks kolokaliseeriti IL1b PFM podotsiiniga (joonis 4D).

Oletatava endogeense Tlr8 ligandi kõrgem tase ON mudelhiirtel Eelmine uuring näitas, et miR-21 toimib TLR8 ligandina (21). Seetõttu võrdlesime nii miR-21 glomerulaarset kui ka seerumi taset vale- ja UUO 21-päevarühmade vahel. Huvitav on see, et UUO 21-päevarühmas oli glomerulaarsete miR-21 tase oluliselt kõrgem kui valerühmas (P < 0,05),="" kuid="" seerumi="" mir{="" suurenev="" tendents.="" esimeses="" rühmas="" täheldati="" {10}}="" kui="" teises="" (p="0.06)" (joonis="">

Tlr8 ekspressiooni korrelatsioon selle ligandi miR-21 ja PFM-idega takistatud piirkonnasNeerNagu on näidatud tabelis 3, täheldasime olulist positiivset korrelatsiooni Tlr8 mRNA glomerulaarse ekspressiooni ja selle endogeense ligandi (miR-21) ning allavoolu tsütokiinide Il1b ja Il6 vahel. Teisest küljest ilmnes negatiivne korrelatsioon Tlr8 mRNA ning PFM-ide Nphs1 ja Synpo vahel.

Glomeruli in vitro stimuleerimine miR{{0}} matkimisega aktiveerib Tlr8 ja selle allavoolu tsütokiinide ekspressiooni Tlr8 ekspressioon kaldus suurenema (P=0.06), kuid selle allavoolu tsütokiinid (Ifng ja Il1b) suurenesid võltsitud hiirte glomerulites märkimisväärselt (P < 0,05 ja 0,01).

ravi miR-21 miimikaga, võrreldes PBS-i ja negatiivse kontrolli miimikaga ravitud hiirte glomerulitega (joonis 5A). Siiski ei täheldatud olulist korrelatsiooni Tlr8 ekspressiooni ja selle allavoolu tsütokiinide vahel võltsitud hiirte glomerulites pärast töötlemist miimikaga (tabel 4). Tlr8 ja selle allavoolu tsütokiinide ekspressioon oli UUO glomerulites oluliselt kõrgemneerud, pärast ravi miR-21 jäljendiga kui UUO glomerulitesneerudtöödeldud PBS-i ja negatiivse kontrolli jäljendiga (joonis 5B). Pärast miimikaga töötlemist tuvastati oluline korrelatsioon Tlr8 ekspressiooni ja selle allavoolu tsütokiinide vahel UUO neerude glomerulites, mis viitab Tlr8-vahendatud tuumafaktori kappa B (NF-kB) raja kõrgemale aktivatsioonile ja põletikueelsete tsütokiinide sekretsioon ummistunud neerus (tabel 4).

TLR8 lokaliseerimine ja podotsüütide vigastus noorte hiirte külgneerudesValesti opereeritud neerudel oli normaalne glomerulus, samas kui külgneerudel oli glomerulaarne hüpertroofia, suurenenud glomerulaarrakkude arv ja glomerulaarsete kapillaaride laienemine (joonis 6A). Võltsopereeritud neerude glomerulid olid sünaptopodiini ekspressiooni suhtes positiivsed ja neil puudus TLR8 ekspressioon (joonis 6B). Teisest küljest kaotasid kollateraalsed neerud sünaptopodiini ekspressiooni glomerulite keskel, kuid näitasid TLR8 ekspressiooni piki glomerulaarkiirust (joonis 6C). Lisaks lokaliseeriti TLR8 valk sünaptopodiiniga (joonis 6C). Valesti opereeritud neerud näitasid podotsiini normaalset ekspressiooni, kuid mitte IL1b ekspressiooni glomerulites (joonis 6D). Küll aga kaotasid kollateraalses neerus olevad glomerulid podotsiini ekspressiooni keskel, kuid neil oli IL1b ekspressioon piki glomerulaarkiirust (joonis 6E). Lisaks kolokaliseeriti IL1b valk podotsiiniga (joonis 6E). SEM-analüüs näitas normaalseid PFP-sid võltsoperatsiooniga hiire neerudes, kuid külgneerudes olid nähtavad PFP-d ja mikrovillilaadsed struktuurid (joonis 6F).

TLR8 lokaliseerimine ja podotsüütide vigastus ealiste hiirte ummistunud ja külgmistes neerudesValesti opereeritud neerud näitasid sünaptopodiini normaalset ekspressiooni, kuid nende glomerulites ei ilmnenud TLR8 valgu värvumist (joonis 7A). Huvitav on see, et nii tagatis- kui ka UUO neerud näitasid sünaptopodiini ekspressiooni kadumist glomerulite keskel, kuid säilitasid TLR8 ekspressiooni piki glomerulaarset rete (joonised 7B, C). TLR8 valk kolokaliseeriti sünaptopodiiniga kollateraalses ja UUO neerudes (joonised 7B, C). Valesti opereeritud neerud näitasid sarnaselt normaalset podotsiini ekspressiooni, kuid nende glomerulites puudus IL1b ekspressioon (joonis 7D). Teisest küljest kaotasid nii kollateraalsed kui ka UUO neerud podotsiini ekspressiooni glomerulite keskel, kuid näitasid IL1b ekspressiooni piki glomerulaarset retet (joonised 7E, F). Positiivne värvumine leiti kolokaliseerituna podotsiiniga tagatise ja UUO neerude glomerulites (joonised 7E, F). SEM-uuring näitas normaalseid PFP-sid võltsoperatsiooniga hiire neerudes, PFP-d ja mikrovillilaadseid struktuure nii vanade hiirte kõrval- kui ka UUO neerudes (joonis 7G).

ARUTELUPEAL

levimus on levinud nii väikelastel kui ka eakatel inimestel (4–7). Seetõttu allutasime noortele ja vanadele hiirtele UUO-le, et jäljendada eri vanuserühmade isikute ON-seisundit, ning uurisime TIL-e ja GL-sid. Obstruktsiooniga neeru puhul ilmnes TIL-ide progresseerumine obstruktsiooni varasemas staadiumis (2 päeva); siiski täheldati GL-de progresseerumist koos podotsüütide vigastusega hilisemas etapis. Kaasneer näitas samaaegselt GL-sid ja podotsüütide vigastusi. See tähelepanek näitab, et podotsüütide vigastus esineb nii ummistunud kui ka külgneerudes, kuigi esialgne solvamine võib varieeruda. Meie varasemad uuringud on toonud esile korrelatsiooni podotsüütide vigastuse ja immuunrakkude infiltratsiooni vahel glomerulites (13, 16, 18). Siiski ei täheldatud käesolevas uuringus immuunrakkude infiltratsiooni võltsitud või ummistunud neerude glomerulitesse. Seetõttu kaalusime teiste tegurite kaasamist podotsüütide kahjustusse ummistunud neerus. Hüpoteesisime, et kas vereringest pärinevad või kahjustatud torukujulisest epiteelist tulenevad ohusignaalid (DAMP-id või PAMP-id) võivad ON-is kaasa aidata podotsüütide vigastusele, kuna see paikneb glomerulites. Oluline on see, et DAMP-de ja TLR-ide koostoimel on oluline roll mittenakkuslike haiguste patogeneesis (15). TLR-i perekonna erinevad liikmed ekspresseeritakse raku plasmamembraanil või rakusisestel vesiikulitel (22) ja neid iseloomustatakse kaasasündinud immuunsensoritena, mis tunnevad tõhusalt ära DAMP-e või PAMP-e. Pärast vastavate DAMP-de või PAMP-de aktiveerimist suurendasid TLR-id allavoolu tsütokiinide ekspressiooni NF-kB raja kaudu ja indutseerisid peremeesorganismi kaitsesüsteemi (22). Veelgi enam, DAMP-id edastavad koekahjustuse immuunrakkudele või kohalikele sisemistele rakkudele ja süvendavad sellest tulenevalt koekahjustusi (23–26). Oluline on see, et kõik TLR-id aktiveerivad NF-kB rada, mis kontrollib põletikuliste tsütokiinide geenide massiivi ekspressiooni (27). Lisaks annab TLR-ide aktiveerimine signaali nende allavoolu radadele, et aktiveerida NF-kB, mis vastutab põletiku eest ja on seotud kahjustatud kudede patogeneesiga (28). Shichita et al. näitas endogeensete ligandide ja TLR2 või TLR4 vahelisi patoloogilisi koostoimeid, mis aitavad kaasa isheemilisele ajukahjustusele (25). Varasemad uuringud on näidanud ka TLR-i perekonna liikmete võimet indutseerida neerudes TIL-e (TLR2, 4, 5, 7 ja 11) ja GL-e (TLR1–6, 8 ja 9) (17, 29–33). ). Käesolevas uuringus leidsime podotsüütide kahjustuse ummistunud ja külgmistes neerudes ning selgitasime

TLR perekonna erinevate liikmete rollid, mis võivad kaasa aidata podotsüütide vigastusele (15, 16, 19, 20). Nagu me oletasime, oli Tlr8 ja Tlr9 glomerulaarne ekspressioon UUO neerust eraldatud glomerulites kõrgem kui võltsoperatsiooniga hiirte omades. Veelgi enam, NF-kB rajaga seotud põletikuliste tsütokiinide, sealhulgas Il1b ja Il6, glomerulaarne ekspressioon oli UUO neerus kõrgem 21 päeva pärast obstruktsiooni. Seetõttu jõudsime järeldusele, et TLR-vahendatud NF-KB rada mängib olulist rolli GL patogeneesis obstruktiivses neerus. Erinevalt teistest TLR perekonna liikmetest tuvastatakse TLR8 ja TLR9 rakkude endosoomides. TLR8 tunneb ära mikroorganismide üheahelalised RNA-d ja lühikesed kaheahelalised RNA-d ning aktiveerib mitmete NF-kB-vahendatud tsütokiinide tootmist (22). Teisest küljest tunneb TLR9 ära kaheahelalised DNA-d ja aktiveerib NF-kB raja, et toota allavoolu tsütokiine (16, 34). Selles uuringus tunnustasime ainult TLR8 valgu kolokaliseerumist koos PFM-i sünaptopodiiniga glomerulites. Meie varasemad uuringud on samuti näidanud, et nii TLR8 kui ka TLR9 kolokaliseeruvad PFM-idega ja aktiveerivad NF-KB-vahendatud põletikuliste tsütokiinide tootmist, et kutsuda esile podotsüütide vigastusi (15, 16). Lisaks on teised uuringud näidanud patoloogilist korrelatsiooni TLR-vahendatud radade ja podotsüütide vigastuste vahel in vitro (34, 35). Banas et al. näitas TLR4 koostoimet podotsüütides immuunsüsteemiga GL arengu ajal (35). Seega võivad podotsüüdid kaasa aidata immuunseirele TLR-vahendatud radade kaudu. Selles uuringus näitasime nii TLR8 geeni ekspressiooni kui ka valgu lokaliseerumist ummistunud neeru podotsüütides, samuti allavoolu tsütokiinide kõrgemat ekspressiooni glomerulites. Seetõttu järeldame, et TLR{40}}vahendatud rajad soodustavad GL-i arengut podotsüütide vigastuse kaudu obstrueeritud neerus.

Eelmine uuring näitas, et miR-21, TLR8 endogeenne ligand, võib jõuda ja seonduda TLR8-ga raku endosoomides, kus see võib indutseerida TLR8-vahendatud NFkB raja aktivatsiooni ja põletikueelsete tsütokiinide sekretsiooni. (21). Käesolevas uuringus leidsime UUO neerudes oluliselt kõrgema glomerulaarse miR-21 taseme ja ka seerumi miR-21 taseme tõusu kui võltskontrollides ning näitasime selle korrelatsiooni Tlr8 glomerulaarse ekspressiooniga. . Huvitav on see, et miR-21-i miimikaga töödeldud UUO neerude glomerulites ilmnes Tlr8 ja selle allavoolu tsütokiinide kõrgem ekspressioon võrreldes miR-21 miimikaga ravitud võltsitud hiirte glomerulites, mis näitab endogeense miR-i suuremat kättesaadavust. -21 ummistunud neeru kahjustatud kudedest ja Tlr8 üleekspressiooni aktiveerimine UUO neerudes võrreldes võltsitud kudedega. Üheskoos järeldame, et suurem miR-21 kogus ummistunud neerus jõuab podotsüütide endosoomideni ja kutsub esile NF-kB raja Tlr8-vahendatud aktivatsiooni ja põletikueelsete tsütokiinide sekretsiooni. Need tsütokiinid osalevad omakorda GL arengus podotsüütide vigastuse kaudu.

IL1b on üks olulisi NF-KB-raja allavoolu tsütokiine, mida toodavad haigusseisundite korral peamiselt glomeruli podotsüüdid. Varasemad uuringud on näidanud, et IL1b kutsub esile podotsüütide vigastusi, vähendades PFM-e (36, 37). Käesolevas uuringus näitasime Il1b kõrgemat glomerulaarset ekspressiooni ja selle kolokaliseerumist PFM-idega, mis näitas ekspressiooni vähenemist. Veelgi enam, Il1b glomerulaarne ekspressioon korreleerus Tlr8-ga ja kippus korreleeruma PFM-ide (Nphs1 ja Synpo) ekspressiooniga. Seetõttu näitavad need tulemused, et Tlr8-st allavoolu asuvad tegurid, sealhulgas Il1b ja Il6, võivad PFM-i ekspressiooni vähendamise kaudu põhjustada podotsüütide vigastusi ummistunud neerus.

Noorte hiirte külgneerudes ilmnesid ka GL-d ja PFM-ide kadu. Seda tulemust kinnitas SEM, mis paljastas podotsüütide kahjustuse külgneerus. Samuti leidsime seerumi miR{0}} kõrgema taseme ON hiiremudelis. Lisaks paiknes IL1b valk koos PFM-iga. Need tulemused näitavad, et seerumi miR-21 interakteerub TLR8-ga kollateraalse neeru podotsüütides ja aktiveerib allavoolu tsütokiinide tootmist, mis omakorda vähendab podotsüütide funktsiooni ja podotsüütide vigastusi. Podotsüüdi kahjustusi täheldati ka vanade hiirte ummistunud ja külgmistes neerudes mehhanismi kaudu, mis sarnanes noortel hiirtel täheldatuga.

Kokkuvõtteks (joonis 8) on glomerulaarse miR-21 ekspressioon kõrgem pärast ühepoolset kusejuha obstruktsiooni, kus see interakteerub podotsüütides TLR8-ga ja indutseerib allavoolu tsütokiinide (Il1b ja Il6) tootmist, mis viitab NF-kB raja aktiveerimisele. Tsütokiinide kõrgem tase vähendab PFM-e, mille tulemuseks on podotsüütide vigastus ja sellele järgnev GL-de areng. Kõrgenenud seerumi miR-21 tase aktiveerib TLR8 kollateraalse neeru podotsüütides ja indutseerib podotsüütide vigastuse kaudu GL-sid. Seetõttu näitab see uuring selgelt GL arengut ummistunud ja külgmistes neerudes podotsüütide vigastuse tõttu pärast Tlr8 üleekspressiooni.