Metaanalüüsid tuvastavad DNA metüülimise, mis on seotud neerufunktsiooni ja -kahjustusega

edmund.chen@wecistanche.com

Kroonilineneeruhaiguson rahvatervise suur koormus. Kõrgenenud albumiini ja kreatiniini suhe uriinis on näitajaneerukahjustus,ja kasutatakse kroonilise diagnoosimiseks ja staadiumiksneeruhaigus. Laiendada teadmisi regulatiivsete mehhanismide kohtaneerufunktsioonja haigusi, viisime läbi verepõhise epigenoomi hõlmava assotsiatsiooniuuringu hinnangulise glomerulaarfiltratsiooni kiiruse (n=33,605) ja uriini albumiini ja kreatiniini suhte (n=15,068) kohta ning tuvastasime 69 ja seitse CpG saiti, kus DNA metüülimine oli seotud vastava tunnusega. Enamik neist leidudest näitasid järjekindlaid seoseid kroonilise haiguse vastavate kliiniliste tulemusteganeeruhaigusja mõõdukalt suurenenud albuminuuria. DNA metüülimise seosedneerufunktsioon, nagu CpG-d JAZF1, PELI1 ja CHD2 juures, valideeriti aastalneerukude. Metüleerimine PHRF1, LDB2, CSRNP1 ja IRF5 juures näitas põhjuslikku mõjuneerufunktsioon. Rikastamisanalüüsid näitasid hemostaasi ja vererakkude migratsiooniga seotud radu hinnangulise glomerulaarfiltratsiooni kiiruse ning immuunrakkude aktiveerimise ja vastusega uriini albumiini ja kreatiniini suhtega seotud CpG-dele.

Märksõnad:neeruhaigus; neerukahjustus; neerufunktsioon; neerukude; neeru struktuur

kroonilineneeruhaigus(CKD) on suur rahvatervise koormus. See mõjutab rohkem kui 10 protsenti täiskasvanutest kogu maailmas ja rohkem kui 40 protsenti 70-aastastest ja vanematest inimestest1,2. Krooniline neeruhaigus on peamine surmapõhjus kogu maailmas3 ning südame-veresoonkonna haiguste haigestumuse ja suremuse peamine põhjus2, 4, 5. Kroonilise neeruhaiguse all mõistetakse püsivat kõrvalekaldeidneerudstruktuur või funktsioon. TheneerufunktsioonKõige sagedamini kasutatavad mõõdikud on glomerulaarfiltratsiooni kiirus, mida tavaliselt hinnatakse seerumi kreatiniini kontsentratsiooni (eGFR) põhjal, ja uriini albumiini ja kreatiniini suhe (UACR)6. Kõrgendatud UACR on mõõtneerukahjustus, mida kasutatakse CKD7 diagnoosimiseks ja staadiumi määramiseks ning seda seostatakse diabeetilise ja hüpertensiivseganeeruhaigus8. Isegi mõõdukalt kõrgenenud UACR on teistest sõltumatult südame-veresoonkonna haiguste riskitegurneerufunktsioon markers such as eGFR9. Familial aggregation studies of CKD and eGFR revealed a substantial heritable component of up to 54%9–11. Only a small part of this heritability is attributed to classical monogenic diseases. Rather, CKD susceptibility is influenced by DNA sequence variants in many genes, environmental factors, and their interactions. Genome-wide association studies (GWAS) have successfully identified common variants at >400 geneetilist lookust, mis on seotudneerufunktsioon10,12,13. Indeksi variandid teadaolevates eGFR-iga seotud lookustes selgitavad hinnanguliselt 8,9 protsenti eGFR-i dispersioonist12.Hiljutine GWAS-i metaanalüüs eGFR-i integreeritud avatud kromatiini piirkondadest koos väikeste üksikute nukleotiidide polümorfismide (SNP-de) komplektidega10. Selle uuringu tulemused kinnitavad muudetud transkriptsiooniregulatsiooni olulisust kroonilise neeruhaigust soodustava mehhanismina. DNA metüülimise uurimiseks seosesneerufunktsioon, on läbi viidud eGFR ja CKD epigenoomi hõlmavad assotsiatsiooniuuringud (EWAS). Transkriptsiooni võtmeregulaatorina, mida saab hinnata kulutõhusalt ja suure läbilaskevõimega, on DNA metüülimist uuritud CpG saitidel (CpG) ühe aluse eraldusvõimega. Varem viisime läbi EWAS-i, mis hõlmas 4859 täiskasvanut kahest populatsioonipõhisest uuringust, ja tuvastasime eGFR14-ga seotud täisveres 18 valideeritud, erinevalt metüleeritud saiti. Kuigi see uuring näitas teadmisi geenide reguleerimise mehhanismidestneerudfunktsiooni, seletasid seotud CpG-d ainult 1,2 protsenti eGFR-i dispersioonist. Teised varasemad uuringud keskendusid kroonilise neeruhaigusega patsientidele ja/või suhkurtõvega patsientidele või inimese immuunpuudulikkuse viiruse infektsiooniga patsientidele või neid piiras valimi väike suurus, replikatsiooni puudumine, võimalike segajate jaoks puuduv kohandamine või nende kombinatsioon 14–19. Teised uuringud keskendusid diabeetikute DNA metüülimise mustriteleneeruhaigus(DKD) patsiendid 20–22.

CISTANCHE PARANDAB NEERU-/NEERUHAIGUST

Siin viisime läbi EWAS-ineerufunktsioontunnused, et tuvastada täiendavaid CpG-sid, mis on seotud kroonilise neeruhaiguse jaoks potentsiaalselt oluliste geeniregulatsiooni mehhanismidega. Laiendasime endist EWAS-i eGFR-i ja CKD jaoks, suurendades oluliselt valimi suurust 33 605 inimeseni. Lisaks lisasime täiendavate tunnustena UACR-i ja mõõdukalt suurenenud albuminuuria (mikroalbuminuuria). EWAS viidi läbi peamiselt populatsioonipõhistes uuringutes, mis kohandati soo, vanuse, diabeedi, hüpertensiooni, kehamassiindeksi (KMI), suitsetamise staatuse ja valgete vereliblede arvukuse järgi. Me kordasime oma EWAS-i tulemusi eraldi proovides, seostasime CpG saidid geeniekspressiooni tasemetega erinevates kudedes, rakendasime tulemusi kliinilistele tulemustele ning hindasime põhjuslikku seost DNA metüülimise janeerufunktsioon(täiendav joonis 1).

Tulemused

Uuringu valimi omadused. Selles uurimises aitasid 36 uuringut, milles osales kokku 33 605 osalejat, eGFR-i EWAS-i ja 15 068 UACR-i EWAS-i. Nende ühendatud omadused on näidatud tabelis 1 ja üksikute uuringute kirjeldused on esitatud lisaandmetes 1 ja 2.

eGFR-i ja UACR-i EWAS.Uurisime ühingutneerudtunnused DNA metüülimisega veres kuni 441 870 CpG-ga, Illumina MethylationnEPIC BeadChipi ja Illumina HumanMethylation450 BeadChipi massiiviga kaetud CpG-de kattumine, mida kasutati mõõtmiseks kõigis uuringus peale ühe (täiendavad andmed 3). Kõikides uuringutes viidi läbi massiiviandmete puhastamine ja kasutati tsentraalselt väljatöötatud skripteneerudtunnuste väärtused, mis olid hiljem seotud DNA metüülimisega, kasutades kovariaatidega kohandatud lineaarse regressiooni mudeleid, mille sõltuva muutujana metüülimise väärtused olid pärast eelnevalt kindlaksmääratud uuringuprotokolle (vt meetodid). Me täheldasime uuringuspetsiifilises EWAS-is inflatsiooni puudumist või vähest (eGFR keskmine inflatsioon=1.00, UACR keskmine inflatsioon=1.00, 1. ja 2. lisaandmed). Mitme muutujaga kohandatud transetnilises EWAS-is seostati 69 CpG-d märkimisväärselt eGFR-iga ja replitseeriti (joonis 1A, täiendavad andmed 4, vt meetodid), sealhulgas varem teatatud14. Replitseeritud saidid näitasid selget madalama metüülimise mustrit (60 CpG-d, Pbinom=2.2E-10; joonis 1A).

Joonis 1 eGFR ja UACR EWAS tulemused. Chicago graafikud epigenoomi hõlmava assotsiatsiooniuuringu (EWAS) tulemuste kohta hinnangulise glomerulaarfiltratsiooni kiiruse (eGFR) (A) ja uriini albumiini ja kreatiniini suhte (UACR) (B) jaoks, kasutades kombineeritud avastamis- ja replikatsiooniproovi. Saidid on järjestatud nende kromosomaalse positsiooni järgi x-teljel, nende assotsiatsiooni Wald-testi –log10 P-väärtus on esitatud y-teljel. Tunnusega positiivselt korrelatsioonis olevad CpG-d on joonistatud ülemisse ossa, negatiivse korrelatsiooniga saidid alumises osas. Punktiirjooned tähistavad olulisuse taset (P-väärtus < 1,1e-7).="" uued="" replikatsioonisaidid="" on="" värvitud="" oranžiga,="" teadaolevad="" replikatsioonisaidid="" on="" värvitud="" türkiissinisega="" ja="" saidid,="" mis="" olid="" lisaks="" seotud="" vastava="" binaarse="" tunnusega="">neeruhaigus[CKD] / mikroalbuminuuria [MA]) on tähistatud ristiga.

Metaanalüüsis täheldati teadaolevate eGFR-i seoste, sealhulgas cg17944885 (ZNF788,=−1.75E−04, P-väärtus=8.7E−41), cg23597162 (JAZF1) puhul madalaimaid P-väärtusi ,=−1.48E−04, P-väärtus=3.2E−24) ja cg06158227 (ZSCAN29,=−1.08E−04, P-väärtus=8 .7E−20)14, millele järgneb uus leidmine cg20777437 (CDCP2,=−8.28E−05, P väärtus=1.1E−17). Ainuüksi 69 replitseeritud eGFR-iga seotud CpG-d selgitasid 15,7 protsenti eGFR-i variatsioonist 1888 osalejast koosnevas eraldi uuringus (vt meetodid). Kui lisada assotsiatsioonimudelile kõik ühismuutujad (sugu, vanus, diabeet, hüpertensioon, BMI, suitsetamine ja valgete vereliblede osakaal), suurenes eGFR-i seletatud dispersiooni koguosa 36,3 protsendini, kusjuures 2,4 protsenti muutusi omistati 69 CpG-le. sõltumatult teistest ühismuutujatest.

UACR-i trans-etnilises analüüsis olid seitse CpG-d märkimisväärselt seotud ja replitseeritud (joonis 1B, täiendavad andmed 5, vt meetodid). Leidudest cg18181703 (SOCS3,=−2.58E−03, P-väärtus=2.6E−13) ja cg02711608 (SLC1A5,=−1.63 E−03, P-väärtus=9.9E−13) omasid väikseimaid metaanalüüsi seoste P-väärtusi. Kuuel seitsmest CpG-st seostati madalamat metüülimist kõrgema UACR-iga. Replitseeritud saitide arvu tõttu oli binoomtesti võimsus piiratud (6 CpG-d, pbinom=0.13; joonis 1B). Replitseeritud CpG-d selgitasid 3,9 protsenti ja täismudel 14,6 protsenti UACR-i tasemete erinevustest, kusjuures 0,07 protsenti omistati CpG-dele, sõltumata teistest ühismuutujatest.

Replitseeritud EWAS-i ja varem teatatud GWAS-i lookuste kattumine oli väike nii eGFR-i (kattuvus=10 69-st; lisaandmed 4) kui ka UACR-i (kattuvus=1 7-st; lisaandmed 5) puhul. eGFR-i ja UACR-i vahel replitseeritud CpG-d ei kattunud, mis näitab tunnusspetsiifilisi DNA metüülimise profiile veres. Isegi vastavalt eGFR-i ja UACR-i kombineeritud avastamise ja replikatsiooniproovi metaanalüüsi 967 ja 270 sugestiivse seose (P-väärtus <1e-05) hulgas="" kattus="" ainult="" 10="" saiti="" mõlema="" tunnuse="" vahel.="" nende="" metaanalüüside="" üksikasjalikud="" tulemused="" kõigi="" viitavate="" seoste="" kohta="" on="" esitatud="" lisaandmetes="" 6="" (egfr)="" ja="" 7="">Esivanemate heterogeensus ja leidude tugevus. Et hinnata, kas eGFR-i ja UACR-i assotsiatsioonitulemusi võib juhtida konkreetne esivanem, viisime läbi Euroopa esivanemate (EA) ja Aafrika-Ameerika esivanemate (AA) proovide esivanemate kihistunud EWAS-i metaanalüüsi, kasutades nende kahe uuringu tulemusi. rahvused. EA proovides (Negar=23,671; nUACR=9806) AA proovidega (neGFR =) saadud replitseeritud CpG-de assotsiatsioonitulemuste võrdlus

5019; nUACR = 1921) showed similar effect sizes (reGFR = 0.87, rUACR = 0.74). The effect directions of almost all replicated CpGs were concordant between the ancestries (Fig. 2, Supplementary Data 4 and 5). The only exception was the UACR association cg22304262 in SLC1A5 which, however, was not significant in AA (P-value = 0.39, Supplementary Fig. 2). This association, as well as the CpGs at JAZF1 and RPS10P7 for eGFR, showed significant heterogeneity (eGFR: P-value < 0.05/69, UACR: P-value < 0.05/7) between EA and AA association results (Fig. 2, Supplementary Data 4 and 5). The presence of common SNPs (minor allele frequency >{{0}}.05) 69 replitseeritud CpG-s või 50 bp raadiuses, hinnati, et hinnata, kas SNP-de olemasolu võib mõjutada sondi seondumist. Neli sondi asusid ühise SNP lähedal (lisandmed 4; cg10960375-rs113564504; cg11544657-rs2083577; cg01817897-rs142643977; cg06930757-rs112223111), mis aga ei seostatud ühegi GWAS-i tunnusega vastavalt PhenoScanner V2 ressursile (kasutatud 02/12/2021, pGWAS < 5e−8,="" sealhulgas="" puhverserveri="" snp-d="" eur="" r²=""> 0,8)23. See näitab, et tõenäoliselt ei sega EWAS-i tulemusi mingi ühine tunnus, mis teadaolevalt on seotudneerufunktsioonlähedalasuva DNA järjestuse variatsiooni tõttu. Üldiselt leiti, et sondi sisemised SNP-d, mis olid sondi 3'-otsast rohkem kui viis alust, on tühise tagajärjega24.

Seos kroonilise neeruhaiguse ja mikroalbuminuuriaga.69-st eGFR-iga seotud CpG-st seostati 53 ka levinud kroonilise neeruhaigusega 25,609 isiku metaanalüüsis, sealhulgas 2376 juhtu, millel oli järjepidev toimesuund (P-väärtus < 0).="" 05/69;="" 4.="" lisaandmed,="" täiendav="" joonis="" 3a).="" korrelatsioon="" egfr-i="" ja="" ckd-efektide="" vahel="" oli="" kõrge="" (r="–0,93;" joonis="" 3a).="" 551="" kroonilise="" neeruhaigusega="" patsiendist="" koosnevas="" sõltumatus="" kohordis="" vastasid="" 65="" cpg-d="" egfr-i="" metaanalüüsile="" ja="" viis="" kordasid="" (p-väärtus="">< 0,05/69,="" r="0.77;" täiendav="" joonis="" 4,="" lisaandmed="" 4,="" vt="" meetodid).="" samas="" kohordis="" seostati="" egfr-iga="" seotud="" cpg-sid="" cg18194850="" (p-väärtus="1.6E-5)" ja="" cg07242931="" (p-väärtus="2.3E-5)" ka="" ajaga="">neerupuudulikkusvõi ägeneerukahjustus(Täiendavad andmed 8, vt meetodid). Kõik seitse UACR-iga seotud CpG-d olid samuti olulisel määral seotud mikroalbuminuuriaga 7279 isikust koosnevas valimis, sealhulgas 1186 juhtumil, millel oli sama toimesuund kui UACR-il (P-väärtus < 0.05/7,="" r="" {{7}="" },98;="" joonis="" 3b,="" lisaandmed="" 5,="" lisajoonis="">

Korrelatsioon geeniekspressiooniga. Et saada ülevaadet eGFR- ja UACR-iga seotud CpG-de võimalikest funktsionaalsetest mehhanismidest, testisime nende DNA metüülimise tasemete korrelatsiooni cis-s kodeeritud geenide mRNA tasemetega nii täisveres kui ka vere monotsüütides (vt meetodid, täiendavad andmed 9 ). Teadaolevat eGFR-iga seotud cg17944885 kromosoomil 19 ZNF788 lähedal seostati transkriptiga, mida kodeeris 240 kb kauge tsink-sõrme valk 439 (ZNF439, tabel 2). Lisaks seostati cg04864179 metüülimist interferooni reguleeriva faktori 5 (IRF5) juures nii IRF5 poolt kodeeritud mRNA transkriptidega kui ka lähedalasuva transportiiniga 3 (TNPO3) (täiendav joonis 5A). UACR-i seostest näitasid kaks replitseeritud CpG-d cg02711608 ja cg22304262 lahustunud kandjaperekonna 1 liikmes 5 (SLC1A5) olulisi seoseid SLC1A5 mRNA tasemega ja cg23570810 interferoonist indutseeritud transmembraanse valguga1 (selle transmembraanse valguga1) 2). Kõik geeniekspressiooni analüüsi tulemused on esitatud lisaandmetes 9.

Toime neerukoele.Et hinnata, kas täheldatud metüülimise mõju veres väljendubneerukude,rakendasime regressioonimudelit, et testida replitseeritud CpG-de seoseid olulise (valetuvastuse määr (FDR) < 0.05) ja suunaga kooskõlas oleva seose suhtes eGFR-iga janeerudfibroos, vastavalt 506 mikrodissekteeritudneerukudeproovid. Nendes proovidesneerud- replitseeritud eGFR-iga seotud CpG-de koepõhine DNA metüülimine cg23597162 juures JAZF1, cg26099045 lähedal PELI1 ja cg12644285 juures CHD2 olid märkimisväärselt seotud eGFR-iga sama toimesuunaga nagu veres (täiendav joonis 621, pp. . Lisaks sama CpG juures PELI1 ja kuus täiendavat

saidid (cg20146909 LRRC8D juures, cg25767870 FAM46C lähedal, cg16618493 ZBTB7B juures, cg10632966 RPEL1 lähedal, cg01068906 NOD2 juures ja cg032973731 on seotud GDPD-ganeerudkoeproovid järjepidevate (st pöördvõrdeliste) mõjusuundadega (täiendav joonis 6B, tabel 2). Replitseeritud UACR saitidest on DNA metüülimise tasemedneerudcg00008629 kude PTBP3 juures ja cg24859433 IER3 lähedal olid seotud fibroosiga ja neil oli sama toimesuund (täiendav joonis 6D, tabel 2). Kooskõlas EWAS-i leidudega ei leitud UACRaassotsieerunud CpG-de olulist seost eGFR-iga neeruproovi doonorite hulgas (täiendav joonis 6C, lisaandmed 10).

Põhjuslikud mõjud DNA metüülimise janeerufunktsioontunnused. Et hinnata, kasneerufunktsioontunnused mõjutavad põhjuslikult DNA metüülimist või vastupidi, viisime läbi oluliselt seotud CpG-de kahesuunalise kahe proovi Mendeli randomiseerimise (MR) analüüsi. Edasisuunaline MR analüüs näitas, et CpGs cg02304370 (PHRF1), cg04460609 (LDB2), cg00501876 (CSRNP1) ja cg04864179 (IRF5) mõjutavad põhjuslikult eGFR taset (tabel 3). Nende nelja CpG pärilikkuse hinnangud varieerusid kolmes Euroopa esivanemate populatsioonide andmekogumis, kuid olid püsivalt kõrgemad kui keskmine pärilikkus kõigis kolmes uuringus hinnatud kõigi CpG-de puhul: 0,34 (põhjuslik eGFR CpG) vs. 0,16 (HM450K massiiv) Hannoni jt põhjal 25, 0,55 vs. 0,19 Dongeni jt 26 puhul ja 0,51 vs 0,19 McRae jt puhul27. UACR-iga seotud CpG-de puhul ei tuvastatud olulisi põhjuslikke seoseid. Pöörd-MR puhul oli primaarse pöördvariatsiooni meetodi kasutamisel ainus oluline mõju eGFR-il cg23597162-le (JAZF1). Mitme pöörd-MR tundlikkuse analüüsiga ei tuvastatud/täheldatud aga olulisi mõjusid. Üks-ühe väljajätmise analüüsid ei näidanud ühtegi viidet sellele, et MR-i tulemusi võiks juhtida üks SNP. Lisaks välistades SNP-d, mida seostati II tüüpi suhkurtõvega, mis on peamine riskitegurneeruhaigusei toonud kaasa erinevaid leide. Kõigi primaarsete ja tundlikkuse MR-analüüside tulemused on näidatud lisaandmetel 11 ja 12 ning täiendaval joonisel 7. Tundlikkusanalüüsid toetavad oluliste edasiste MR-tulemuste (FDR < 0.05,="" vt="" meetodid)="" esmaseid="" tulemusi.="" suuna="" järjepidevad="" mõjuhinnangud,="" mis="" näitavad="" potentsiaalset="" põhjuslikku="" seost="" dna="" metüülimisest="" egfr-i,="" kuid="" mitte="">

Transkriptsioonifaktori sidumise, histooni märgi ja raja rikastamise analüüsid. Tegime transkriptsioonifaktori sidumissaidi, histooni märgi ja raja rikastamise analüüsid, mis põhinesid 967 CpG-l, mis näitasid sugestiivset seost eGFR-iga (Pväärtus <1e-05; lisaandmed="" 6)="" ja="" 270="" cpg-d,="" mis="" näitasid="" viitavat="" seost="" uacr-iga="" (p-väärtus=""><). 1e-5;="" täiendavad="" andmed="" 7)="" metaanalüüsis,="" et="" maksimeerida="" rikastusanalüüside="" statistilist="" võimsust="" (vt="" meetodid)="" 14="" esiteks="" hindasime,="" kas="" egfr-iga="" seotud="" cpg-d="" on="" eelistatavalt="" kaardistatud="" kromatiinil="" põhineva="" 169="" transkriptsioonifaktori="" (tf)="" sidumissaitidega.="" immunosadestamise="" dna-sekveneerimise="" (chip-seq)="" andmed="" projektist="" encode,="" mis="" koondati="" konsensuskutsega="" 91="" inimese="" rakutüübi="" kohta="" (161="" tf="" rada)="" ja="" mida="" täiendati="">neerudkoepõhised rajad (vt Meetodid). Pärast 169 TF-i korduvat testimist näitasid kaheksa TF-i eGFR-iga seotud CpG-de (FDR < 0.05;="" joonis="" 4a,="" lisaandmed="" 13),="" sealhulgas="" cebpb="" (p-väärtus="1)" ​​olulist="" rikastumist.="" 75e−06,="" ristkudede="" rada)="" ja="" ep300="" (p-väärtus="7.49E−09," ristkudede="" rada).="" see="" on="" kooskõlas="" chu="" et="" al.14="" järeldusega="" siin="" analüüsitud="" 33="" 605="" osalejast="" väiksemas="" 4859="" osaleja="" hulgas.="" uacr-iga="" seotud="" cpg-d="" rikastati="" 56="" tf-i="" sidumissaitidega="" (joonis="" 4b,="" lisaandmed="" 14),="" millel="" on="" tugevaim="" seos="" polr2a="" (p-väärtus="6.93E-19)," fos-i="" (p-väärtus="" {{32)="" suhtes.="" }}.28e−12)="" ja="" ep300="" (p-väärtus="">

Neerfunktsiooniga seotud CpG-sid rikastati laialdaselt mitme histoonimärgise suhtes, kusjuures 195-st histoonimärgise rakutüübi kombinatsioonist 82 olid olulised (FDR q < 0.05)="" egfr="" jaoks="" (joonis="" 4c,="" lisaandmed="" 15)="" ja="" 79="" 195-st.="" uacr="" jaoks="" (joonis="" 4d,="" lisaandmed="" 16).="" histooni="" modifikatsioon="" h3k4me1,="" märk,="" mis="" on="" kontsentreeritud="" aktiivsetele="" ja="" praimitud="" võimendajatele,="" rikastati="" kõigi="" rakutüüpide="" jaoks="" uacr-iga="" seotud="" cpg-de="" jaoks="" ja="" peaaegu="" kõigi="" rakutüüpide="" jaoks="" egfr-iga="" seotud="" cpg-de="" jaoks.="" kui="" uacr-iga="" seotud="" cpg-d="" näitasid="" promootormärgi="" h3k4me3="" rikastumist="" 34="" rakutüübis,="" siis="" ainult="" neljas="">

tüübid näitasid eGFR-iga seotud saitide rikastamist. Seevastu geenikehaga seotud märk H3K36me3 näitas eGFR-iga seotud CpG-de (30 rakutüüpi) palju laiemat rikastumist kui UACR-iga seotud CpG-de (viis rakutüüpi). Erinevalt H3K3me1/3-st ja H3K36me3-st, mis kõik on seotud aktiivsete geenidega (võimendajad, aktiivsed promootorid, aktiivne transkriptsioon), ei olnud H3K9me3 ja H3K27me3, mis on üldiselt seotud konstitutiivse ja fakultatiivse heterokromatiiniga28–31, UACR-i jaoks oluliselt rikastatud. seotud CpG-d mis tahes testitud rakutüübis (joonis 4D, lisaandmed 16). Geenide rikastamine, mis on seotudneerufunktsioon-seotud CpG-sid hinnati geeniontoloogias (GO), Kyoto geenide ja genoomide entsüklopeedias (KEGG) ja Reactome andmebaasides (vt meetodid) 32–35. Märkimisväärset rikastumist täheldati eGFR-i puhul 27 termini (25 GO, üks KEGG, üks reaktsioonivõime; lisaandmed 17, joonis 5A) ja UACR puhul 91 termini (87 GO, neli reaktsioonivõimendit; lisaandmed 18, joonis 5B) puhul (joonis fig. 5B). Valgevereliblede tüübispetsiifilise migratsiooni, mRNA translatsiooni, hemostaasi ja koagulatsiooni ning insuliini vastusega seotud teed näitasid eGFRa-ga seotud CpG-de olulist rikastumist (FDR < 0.05;="" joonis="" 5a).="" uacr-iga="" seotud="" saitide="" madalaima="" rikastamise="" p-väärtusega="" radadel="" domineerisid="" immuunrakkude="" aktiveerimine="" ja="" reaktsioon="" ning="" interferooniga="" seotud="" rajad="" (joonis="" 5b).="" täiendavad="" rikastatud="" teed="" hõlmasid="" valgete="" vereliblede="" migratsiooni,="" nagu="" ka="" egfr-i="" tulemuste="" puhul="" (täiendavad="" andmed="">

Seos teadaolevate EWAS-i seostega teiste tunnustega. Arvestades immuunvastusega seotud radade täheldatud rikastumist, DNA metüülimise tulemusi, sealhulgas CpG-sid interferooni raja geenide lähedal, ja asjaolu, et DNA metüülimise staatust hinnati peamiselt leukotsüütides, hindasime, kas meie leide võivad põhjustada segavad mõjud. immuunvastust või põletiku seisundit. Seega tegime suures EWAS-is replitseeritud CpG-de otsingu kõrge tundliku seerumi C-reaktiivse valgu (CRP) tasemel36. Ainult kaks CpG-d, mis olid seotud ka DNA metüülimise ja eGFR-iganeerukude,cg09610644 BDH1 juures ja cg12644285 CHD2 juures olid CRP-ga seotud saitide hulgas. Seega tundub meie tulemuste üldine segadus CRP hinnangul põletikulise seisundi tõttu ebatõenäoline.

MõnedneerufunktsioonSelles uuringus tuvastatud seotud CpG-d on seotud mitmete muude tunnustega, mis põhinevad avaldatud EWAS-il. 21 eGFR-i saiti seostati vererõhu, alkoholitarbimise, BMI, soo, lahustuva kasvaja nekroosifaktori retseptori 2 ja/või suitsetamise staatusega ning viis UACR-i saiti olid varem seotud alkoholitarbimise, suitsetamise staatuse, KMI, haridustasemega, -glutamüültransferaas, lahustuv tuumori nekroosifaktori retseptor 2, 2. tüüpi suhkurtõbi ja/või mitmed seerumi metaboliidid (tabel 2, lisaandmed 19). Kolm neist CpG-dest (kõik UACR-i saidid) olid seotud enam kui kahe tunnusega, nimelt cg02711608 SLC1A5-s (koos -glutamüültransferaasi, -glutamüültreoniini, BMI, alkoholitarbimisega), cg18181703-ga SOCS3-s (2. tüüpi suhkurtõvega, suitsetamise staatusega, BMI-ga). , lahustuv tuumori nekroosifaktori retseptor 2) ja cg24859433 IER3 lähedal (suitsetamise staatus, haridustase, 4-vinüülfenool_sulfaat). Täiendav joonis 5B illustreerib CpG-d, cg26099045, mis oli korrelatsioonis eGFR-i ja fibroosiganeerukudemeie analüüsis ja lisaks seostatud seksi ja suitsetamisega eelmises EWAS-is. Lõpuks seostati cg17944885 ZNF788 juures ka eGFR-iga DKD patsientide proovis22.

Arutelu

Selles EWAS-isneerufunktsioon, tuvastasime ja kordasime eGFR-iga seotud 69 CpG vere DNA metüülimise tasemeid. Neist 60 kohta varem ei teatatud, nagu ka kõigist seitsmest CpG-st, mis tuvastati seoses UACR-iga. Enamik eGFR-i ja UACR-iga seotud CpG-sid olid samuti märkimisväärselt seotud nende kliiniliste tulemustega, st kroonilise neeruhaiguse ja mikroalbuminuuriaga, ning seetõttu võib neil olla riskirühma kuuluvate isikute kihistumine. Nendele 69 CpG-le omistatud eGFR-i dispersioon oli 2,4 protsenti - kaks korda suurem kui varasemal EWAS14-l ja see on võrreldav GWAS-i poolt avastatud 29 SNP-ga, mis hõlmasid lookuse avastamise jaoks kolm korda suuremat valimit37,38. See viitab sellele, et verest kvantifitseeritud üksikute CpG-de erinev DNA metüülimine selgitab rohkem eGFR-i dispersiooni kui üksikud tavalised SNP-d antud proovi suuruse juures. UACR-i puhul näib, et sarnase arvu tunnustega seotud CpG-de paljastamiseks on vaja suuremaid valimi suurusi võrreldes eGFR-iga. Arvestades, et albumiini ja kreatiniini UACR-i arvutamiseks mõõdetakse uriinis, mitte kreatiniini kvantifitseerimisel seerumis GFR-i hindamiseks, ei ole see erinevus ootamatu ja see on kooskõlas GWAS-i tähelepanekutega nende tunnuste kohta 10, 13. Lisaks näib, et geneetiline varieeruvus mõjutabneerufunktsioontunnused erinevatel radadel kui muutused DNA metüülimises. Seda toetab nii eGFR-i kui ka UACR-i kopeeritud EWAS-i ja GWAS-i saitide väike kattumine.

See EWAS-i metaanalüüs hõlmas valimeid erinevatest populatsioonidest ja rahvustest. Me täheldasime EA indiviidide suurest alamvalimist saadud mõju hinnangute kõrget korrelatsiooni AA indiviididel hinnatud mõjudega (joonis 2). Vaatamata andmete kaasamisele suurel hulgal mitte-EA päritolu isikutelt, võivad transetnilise EWAS-i üldtulemused põhineda EA esivanemate üksikisikute andmetel, mis moodustasid 70 protsenti (eGFR) / 65 protsenti (UACR) meie uuringust (täiendavad andmed 3 ja 4). Selle piirangu lahendamiseks on esivanemate heterogeensuse usaldusväärseks ja üksikasjalikuks hindamiseks vaja tulevasi analüüse, kus on suurenenud mitte-EA proovide osakaal. Võimalust edastada EWAS-ist saadud arusaamu kvantitatiivsete tunnuste kohta enamasti populatsioonipõhistes uuringutes haigust põdevatele isikutele illustreerib tõsiasi, et 69-st eGFR-iga seotud CpG-st 65-st täheldati samas suunas 551 kroonilise neeruhaigusega patsiendist koosnevas rühmas. osutades mehhanismidele, mida saab rakendada paljudes eGFR tasemetes (joonis 3). Enamgi veel,

cg07242931 MAN1C1-s ja cg18194850 SUCLG2-s ei olnud seotud mitte ainult eGFR-iga, vaid ka ennustatud aeganeerupuudulikkusvõi ägeneerukahjustus(Täiendavad andmed 8). Täiendavad tõendid suktsinüül-CoA süntetaasi -subühikut kodeeriva SUCLG2 osaluse kohta neeruhaiguses pakkus välja diabeetikute GWAS.neeruhaigusAmeerika indiaanlastel (SNP=rs4453858, P-väärtus=2E−6)39. Selle geeni geneetiline varieeruvus oli seotud ka suktsinüülkarnitiini (C4DC, SNP=rs115560420, P-väärtus=7E-15)40 tasemega uriinis. C4DC on metaboolne toode trikarboksüülhappe tsüklist, mida katalüüsitakse suktsinüül-CoA süntetaasi ja kõrgema C4DC tasemega veres, mis on seotud madalama eGFR41-ga. Kuid GoDMC (http://www.godmc.org.uk)42 metülatsiooni kvantitatiivsete tunnuste lookuste (meQTL) tulemuste otsimine ei näidanud nende kahe SNP olulist seost cg18194850-ga, mis viitab otsesele seosele nende SNP-de vahel. ja CpG sait.

Kuna DNA metüülimine on geeniekspressiooni peamine regulaator, hindasime tunnustega seotud DNA metüülimiskohtade korrelatsiooni geenide mRNA tasemetega cis-s. Geenid, mille mRNA tase korreleerus oluliseltneerufunktsioonseotud DNA metüülimiskohad olid seotud interferooni radadega (nii eGFR kui ka UACR puhul). Kuigi need leiud nõustuvad UACR-i raja rikastamise tulemustega (joonis 5B, täiendavad andmed 18), on UACRassociated CpG-de ja transkriptsioonitasemete oluliste korrelatsioonide arv üsna madal. See pole üllatav, arvestades selle analüüsi jaoks saadaolevate suhteliselt väikest valimi suurust (1915 inimest) ja transkriptoomika ressursi piiratud ulatust. Huvitav on see, et UACR-i oluliste leidude hulgas olid kaks CpG-d lahustunud kandja perekonna 1 liikmes 5 (SLC1A5) seotud diferentsiaalse geeniekspressiooniga ja ka vererõhuga. DNA metüülimine SLC1A5 juures, mis kodeerib naatriumist sõltuvat neutraalset aminohappe transportijat, võib seetõttu olla täiendav element, mis aitab kaasa teadaolevale korrelatsioonile UACR ja vererõhu vahel.

Märkimisväärseid erinevalt ekspresseeritud transkripte ei kodeerinud alati lähim geen (cg17944885 ZNF788 lähedal) või CpG sait oli korrelatsioonis mitme geeniga cis-s (cg04864179 IRF5-s). Eelkõige on märkimisväärne DNA metüülimise korrelatsioon cg04864179 ja IRF5 transkripti tasemetega. Arvestades selle CpG olulist MR-i tulemust eGFR-iga, võib DNA metüülimine IRF5-s põhjuslikult mõjutada selle geeniekspressiooni vahendatud eGFR-i. Võttes arvesse aluseks olevate geneetiliste ühenduste tunnuste transformatsiooni (vt meetodid), täheldasime, et DNA metüülimise suurenemine kümne standardhälbe võrra põhjustas 3, 2 protsenti kõrgema eGFR-i. Kuigi see hinnanguline mõju on väga väike, toetas vererakkude metülatsioonimustrite põhjuslikku mõju CKD-le ka kokkuvõttepõhine MR koos erineva meQTL-i andmekogumiga hiljutises uuringus, kus põhjuslik mõju oli meie tulemustega kooskõlas . Mitme tunnuse kolokalisatsiooni rakendamisel näitasid nad ka, et selle lookuse geneetilisi mõjusid eGFR-ile vahendas IRF5 metüülimine ja geeniekspressioon veres. Lisaks näidati IRF5 geeniekspressiooni kolokaliseerumist eGFR-iga nii tubulaarsetes kui ka glomerulaarsetes sektsioonides.neerudkude43. Meie uuringus täheldatud põhjusliku mõju tõlgendamisel tuleb siiski meeles pidada, et CpG cg04864179 MR-analüüsid näitasid instrumentide vahel olulist heterogeensust (p < 0,05)="" (täiendavad="" andmed="" 11="" ja="" täiendav="" joonis="" 7).="">

IRF5 kodeerib interferooni reguleeriva faktori (IRF) perekonna liiget. IRF-i perekonnaliikmete rühm sisaldab erineva rolliga transkriptsioonifaktoreid, nagu immuunsüsteemi aktiivsuse moduleerimine, kasv ja diferentseerumine, samuti geeniekspressiooni kontrollimine interferooni vastuseks viirusnakkustele. IRF5 võib mõjutada immuunrakkude vastust. Mitmed uuringud kinnitavad, et muutused IRF5 metüülimises võivad mõjutadaneerufunktsioonimmuunradade kaudu: IRF5 SNP-d on seotud SLE-ga IRF5 ekspressiooni muutuste kaudu vere monotsüütides44–46. SLE on autoimmuunhaigus, mida iseloomustab IFN raja aktivatsioon, mis võib mõjutadaneerudkui luupusnefriit47. IRF5 hüperaktivatsiooni pärssimine SLE hiiremudelis kaitstud luupusnefriidi tekke ja raskusastme eest ning paranenudneerufunktsioonja patoloogia48,49. Kuigi meie EWAS ei keskendunud SLE-patsientide uurimisele, võib IRF5 metüülimise väikest mõju neerudega seotud tulemustele, mis on vähemalt osaliselt vahendatud selle ekspressioonist ja järgnevatest IFN-i radadest, tuvastada kui mõju eGFR-ile üldpopulatsioonis.

CISTANCHE PARANDAB NEERU/NEERU VALU

Mitmed eGFR-iga seotud CpG-d, mille DNA metüülimist kvantifitseeriti vererakkudest, olid samuti seotud eGFR-iga janeerudfibroos, kui DNA metüülimist kvantifitseeritineerudkude, kuigi valimi suurus oli EWAS-i andmekogumiga võrreldes oluliselt väiksem. See viitab sellele, et vähemalt mõnda verest saadud leidu saab teisendada täiendavaks tunnusspetsiifiliseks sihtkoeks. Siin, veri janeerudon kaks peamist tunnusspetsiifilist sihtkudet, kunafunktsiooniselleneerudon vere filtreerimine jäätmete eemaldamiseks. Rikastamise analüüsidneerufunktsioonseotud CpG-d näitasid keskset rolli transkriptsiooni regulatsioonis. Leidsime H3K4me1/3 ja H3K36me3 laialdase rikastamise. H3K4me1/3 on seotud praimitud ja aktiivsete võimendajatega ning aktiivsete promootoritega ning H3K36me3 on tihedalt korrelatsioonis genoomi transkribeeritud piirkondadega50. Transkriptsiooniregulatsiooni rolli toetab veelgi UACR-iga seotud CpG-de tugevaim transkriptsioonifaktori rikastamise signaal, milleks on POLR2A, mis on eukarüootides peamise ensüümi mRNA sünteesimise suurim alaühik.

MR-analüüsidega seotud võimalikud piirangud hõlmavad seda, et kehtivad instrumendid ei olnud kõigi edasise MR-i CpG-de jaoks saadaval. Arvestades, et kõik CpG instrumendid valiti cis-piirkondadest, st samast geneetilisest piirkonnast, on tõenäoline, et kõik CpG instrumendid on kas kehtivad või kehtetud, piirates seega erinevate MR-meetodite arvu, mida saab testimiseks kasutada. tulemuste usaldusväärsus51. Pöörd-MR-i võimsus oli piiratud, kuna SNP-DNA metüülimise seoste hindamiseks oli saadaval väike valim. Suuremad meQTL-uuringud, nagu GoDMC, ei suutnud tehnilistel põhjustel salvestada assotsiatsioonitulemusi kõigi SNP-de jaoks (st üle teatud assotsiatsiooni P-väärtuse piiri) ja ei olnud seetõttu kasutatavad kahe prooviga pöörd-MR jaoks. Seega tuleb ebaolulisi leide tõlgendada ettevaatlikult. Lisaks on põhjusliku mõju suuruse tõlgendamine keeruline, kuna aluseks olevad geneetilised seosed arvutatakse DNA metüülimise tasemete standardhälbe skaalal. Uuringu teine ​​potentsiaalne piirang on see, et eGFR, CKD ja UACR on fenotüübid, mida hinnatakse erinevate alusparameetrite alusel ja millel on mitmefaktoriline mõju. Seega tegime mitmeid analüüse tagamaks, et meie EWAS-i tulemusi ei ajendanud teadaolevad segajad, sealhulgas 2. tüüpi diabeet, mis võib olla DNAm ja DNA vahelise seose potentsiaalne segaja.neerufunktsioon. Esiteks kohandati iga kohordi EWAS-i seoseid segajate jaoks, et eemaldada nende mõju kohordis. Teiseks viidi EWAS läbi igas kohordis eraldi ja seejärel metaanalüüsi, mis vastab nt diabeedi levimuse korrigeerimisele kohortide lõikes. Lõpuks kontrollisime avaldatud diabeedi EWAS-i uuringutes meie replitseeritud CpG-de seoseid. Kõigist meie replitseeritud CpG ühendustest näitas ainult UACR-iga seotud CpG cg18181703 SOCS3-s seost II tüüpi diabeediga. Seda CpG-d seostati ka suitsetamise staatuse, KMI ja lahustuva tuumori nekroosifaktori retseptori 2 tasemega veres. Võttes arvesse, et meie EWAS-i kohandati ka suitsetamise staatuse ja KMI järgi, eeldame, et cg18181703 mõju UACR-ile on tasemel. vähemalt osaliselt sõltumatu 2. tüüpi diabeedist, KMI-st ja suitsetamisest. Kuigi me kontrollisime mitut neist teadaolevatest teguritest, ei saanud muid tegureid, nagu mõõdetud ühismuutujad, analüüsides selgesõnaliselt kohandada ja need võivad tulemusi mõjutada.

Vaja on täiendavaid EWAS-i uuringuid suuremate proovide ja DNA metüülimisega, mis on kvantifitseeritud täiendavatest kudedest, samuti funktsionaalseid analüüse, et laiendada meie teadmisi regulatiivsete mehhanismide kohta.neerufunktsioonning lõpuks parandada haiguse prognoosimist ja ravineerudhaigus. See kehtib konkreetselt UACR-i kohta, arvestades täheldatud oluliste CpG seoste väiksemat arvu. Kokkuvõttes suurendas see suuremahuline EWAS-i metaanalüüs oluliselt eGFR-i ja CKD-ga reprodutseeritavalt seotud CpG-de arvu ning näitas seitse seost UACR-i ja mikroalbuminuuriaga. DNA metüülimine nendes kohtades selgitas suurt osa eGFR-i dispersioonist ja diferentsiaalne metüülimine neljas CpG-s näitas potentsiaalset põhjuslikku seost eGFR-iga. Replitseeritud CpG-de põhjalik iseloomustus kroonilise neeruhaigusega patsientide seasneerukude,diferentsiaalse geeniekspressiooni ning rikastatud radade ja epigeneetiliste märkide jaoks annavad ülevaateneerufunktsioon-seotud transkriptsiooniregulatsioon.

meetodid

Ülevaade.Panime paika koostööl põhineva metaanalüüsi, mis põhineb jaotusandmete mudelil ja kvaliteedikontrolli protseduuridel. Uuringute fenotüübi standardimise maksimeerimiseks koostati analüüsiplaan ja käsurea skript (https://github.com/generic-Freiburg/Skagen-pheno/tree/ckdgen-ewas-pheno), mis esitati kõikidele osalevatele uuringutele ( valdavalt populatsioonipõhised uuringud; lisaandmed 1 ja 2). Automaatselt genereeritud kokkuvõttefaile kontrolliti tsentraalselt. Pärast fenotüübi kinnitamist käivitasid uuringud oma EWAS-i ning laadisid tulemused ja koondatud DNA metüülimise teabe keskserverisse. EWAS-i kvaliteedikontroll viidi läbi kohandatud skriptidega, et hinnata inflatsiooni, positiivseid kontrolle, CpG-sondide jaotust ning võrrelda uuringute vahel efektide suuruste, standardvigade ja P-väärtuste üldist jaotust. Kõik uuringuprotokollid kiitsid heaks vastavad kohalikud eetikakomiteed. Kõik kõikides uuringutes osalejad andsid kirjaliku teadliku nõusoleku.

CISTANCHE PARANDAB neeru-/NEEREDIALÜÜSI

Fenotüübi määratlus.Kreatiniini väärtused, mis saadi Jaffé testiga enne 2009, kalibreeriti, korrutades need 0,9552-ga. Uuringud hindasid GFR-i kroonilisegaNeeruhaigusEpidemioloogiakoostöö (CKD-EPI) võrrand53. eGFR-i winsoriseeriti 15 ja 200 ml min-1 1,73 m2 kohta. CKD määratleti kui eGFR alla 60 ml min-1 1,73 m2 kohta. UACR väärtused, mõõdetuna mg/g, olid enne kõiki analüüse loomulikud logaritmiliselt teisendatud. Mikroalbuminuuria määrati kui 1 UACR > 30 mg/g ja 0 UACR väärtuste < 10="" mg/g="">

DNA metüülimise kvantifitseerimine ja kvaliteedikontroll.DNA metüülimise kvantifitseerimiseks ekstraheeriti perifeersest verest genoomne DNA. DNA metüülimise tasemed kvantifitseeriti, kasutades Infinium MethylationEPIC BeadChip massiivi (EPIC), Illumina Infinium HumanMethylation450K BeadChip massiivi (HM450K) või Illumina Infinium HumanMethylation27 BeadChip massiivi (HM27K). DNA metüülimise andmete eeltöötlemine viidi läbi vastavalt individuaalsetele uuringuprotokollidele, sealhulgas taustakorrektsioon, kvantiilne normaliseerimine, sondi filtreerimine, proovi filtreerimine, SNP sobitamine SNP kontrollsondi asukohtadega, kõrvalekallete filtreerimine ja testitüübi korrigeerimine (täiendavad andmed 3). Metülatsioonitase igas kohas esitati ja analüüsiti väärtusena. SNP-dega kattuvad CpG sondid märgiti ära. Igas uuringus arvutati iga CpG saidi keskmine ja standardhälve ning seda kokkuvõtvat statistikat võrreldi uuringute vahel CpG-de süstemaatiliste erinevuste tuvastamiseks ja jälgiti individuaalsete uuringuanalüütikutega.

Ühismuutujate hindamine.DNA metüülimist ja ühismuutujaid mõõdeti samal külastusel / ajahetkel. Levinud diabeet defineeriti kui tühja kõhu plasma glükoosisisaldus, mis on suurem või võrdne 126 mg/dl, mitte tühja kõhuga plasma glükoos 200 mg/dl või suurem, diabeedi ravi või diabeedidiagnoosi enesearuanne. Levinud hüpertensioon määratleti kui süstoolne vererõhk, mis oli suurem või võrdne 140 mm Hg, diastoolne vererõhk, mis oli suurem või võrdne 90 mm Hg, või hüpertensiooni ravi. Kui mõõdetud vererõhk ei olnud kättesaadav, määratleti hüpertensioon enesest teatamise teel. Praegune suitsetamise staatus määrati enda esitatud teabe abil. KMI (kg/m2) arvutati, kasutades igas uuringus hinnatud kaalu ja pikkuse mõõtmisi. Vanus kaasati assotsiatsioonimudelitesse pideva väärtusena. Pereväliste uuringute populatsiooni struktuuri kohandati geneetiliste põhikomponentidega (PC). Valgevereliblede tüübi proportsioonid hinnati DNA metüülimise põhjal54. Täiendavad tehnilised ühismuutujad hõlmasid juhtsondi PC-sid55, uuringukeskust, töötlemispaketti, massiivi sentrixi ID-d ja sentriksi asukohta.

Statistilised meetodid ja metaanalüüs. Analüüsitud kohtade võrreldava võimsuse tagamiseks kaasati analüüsidesse ainult nii EPIC kui ka HM450K poolt mõõdetud autosomaalsed CpG-d. Igas uuringus viidi läbi lineaarne regressioonanalüüs, mis oli eraldatud esivanemate rühmade kaupa. EWAS-i tulemuste usaldusväärsuse hindamiseks piirdusid analüüsid Euroopa esivanemate üksikisikute uuringute ja alamproovidega. DNA metüülimise väärtused modelleeriti sõltuvate muutujatena, kusjuures tunnuseks olid kas pidevad eGFR või UACR väärtused või binaarsed CKD või mikroalbuminuuria muutujad: DNA metüülimine ~ tunnus pluss sugu pluss vanus pluss geneetilised arvutid pluss valgete vereliblede proportsioonid pluss tehnilised ühismuutujad pluss diabeet pluss hüpertensioon pluss BMI pluss praegune suitsetamine Osalejad vajasid täielikku teavet kõigi muutujate ja uuringu kokkuvõtte statistika kohta ning kaasati ainult siis, kui eGFR/UACR puhul oli saadaval vähemalt 50 osalejat ja CKD/mikroalbuminuuria puhul 50 juhtumit/kontrolli. Iga uuringuspetsiifiline EWAS kohandati enne metaanalüüsi inflatsiooniga BACON-meetodi abil, kui inflatsioonihinnang oli suurem või võrdne ühega (täiendav joonis 8)56. Uuringud jagati avastamiseks ja replikatsiooniks CKDGeni konsortsiumi metaanalüüsi panuse kronoloogilises järjekorras (täiendavad andmed 1 ja 2). Fikseeritud efektiga pöördvariatsiooniga kaalutud metaanalüüs, nagu rakendati R-paketis 'metafor' (versioon 2.1-0), viidi läbi avastusuuringute, replikatsiooniuuringute ning sellest tulenevate avastamise ja replikatsiooni mõjuhinnangute jaoks. CpG-d jäeti välja, kui kas avastamise või replikatsiooni ajal oli saadaval vähem kui pool vastavast valimi suurusest või kui I2 heterogeensuse hinnang oli suurem 95 protsenti. Seotud CpG edukat replikatsiooni defineeriti kui efekti hinnangute ühtlast suunda avastamise (neGFR-i ketas=22,347, nUACR-ketas=11,458) ja replikatsiooni (neGFR-i repl=11,258) vahel. , nUACR repl=3610) metaanalüüs, Bonferroni kohandatud avastuse P-väärtuse olulisus (pdisc)<1.1e−7 (#cpgs="" egfr="441,870," #cpgs="" uacr="441,854)," nominal="" significance="" of="" the="" replication="" p-value="" (prepl)=""><0.05, and="" a="" combined="" discovery="" and="" replication="" p-value="" (pcomb)=""><>

Geeniekspressiooni analüüsid.Mõjudneerufunktsioontunnustega seotud CpG-sid testiti seoste suhtes geeniekspressiooniga veres, kasutades kahte andmekogumit: (1) 1202 MESA uuringus osaleja monotsüütide mRNA tasemed ja (2) 713 indiviidi täisvere mRNA. KORA F4 uuring 57,58. Esimese sammuna viidi läbi CpG metüülimise tasemete otsing MESA uuringu assotsiatsioonitulemustes saadaolevate mRNA tasemetega. Selle otsingu jaoks olid saadaval seostulemused P-väärtusega < 1e{{10}}.="" analüüsi="" kirjeldasid="" üksikasjalikult="" kennedy="" et="" al.59.="" lühidalt="" öeldes="" hinnati="" geeniekspressiooni="" illumina="" humanht-12="" v3.0="" ja="" v4.0="" expression="" beadchips="" abil="" ning="" dna="" metüülimist="" illumina="" hm450k="" massiivi="" abil.="" ekspressiooniväärtused="" normaliseeriti="" dispersiooni="" stabiliseeriva="" teisenduse="" abil.="" 13="" 933="" transkripti="" v3.0="" ja="" v4.0="" massiividest,="" mis="" olid="" vähemalt="" 5="" protsendil="" katsealustest="" oluliselt="" kõrgemal="" taustatasemetest="" (tuvastus="" p-väärtus="">< 0,01).="" assotsiatsioonianalüüsid="" mesa-s="" viidi="" läbi="" lineaarse="" segamudelina,="" kasutades="" sõltuva="" muutujana="" logaritmiliselt="" transformeeritud="" geeniekspressiooni="" väärtusi,="" sõltumatu="" muutujana="" dna="" metüülimise="" beeta="" väärtusi="" koos="" vanuse,="" soo,="" etnilise="" päritolu="" ja="" uurimiskeskusega,="" mis="" lisati="" mudelisse="" ühismuutujatena.="" teine="" assotsiatsioonitest="" viidi="" läbi="" kora="" f4="" andmekogumis.="" replitseeritud="" cpg-de="" metülatsioonitaseme="" seos="" ±500="" kb="" läheduses="" asuvate="" geenide="" geeniekspressioonitasemetega="" arvutati,="" kasutades="" illumina="" human="" ht-12v3="" geeniekspressiooni="" massiivist="" saadud="" log2-transformeeritud="" mrna="" taset.="" geeniekspressiooni="" väärtused="" taandati="" soo="" ja="" vanuse="" järgi="" kohandatud="" dna="" metüülimise="" beeta="" väärtustele.="" enne="" analüüsi="" taandati="" mrna="" ja="" dna="" metüülimise="" tasemetest="" välja="" tehnilised="" tegurid="" ja="" vererakkude="" proportsioonid="" ning="" selle="" jäägid="" kaasati="" lõplikku="" assotsiatsioonimudelisse.="" geeniekspressioonisondide="" annotatsiooni="" ja="" kvaliteedikontrolli="" kontrollid="" põhinesid="" schurmann="" et="" al.60="" esitatud="" tabelil.="" cpg-geeni="" ekspressiooni="" assotsiatsioonid="" veres,="" mis="" olid="" kättesaadavad="" mesa="" tulemustes="" ja="" millel="" oli="" assotsiatsiooni=""><0.05 in="" kora="" f4="" with="" consistent="" effect="" direction="" were="" considered="" as="" significant.="" all="" gene="" expression="" probes="" passed="" the="" annotation-based="" quality="" control="">

DNA metüülimine neerukoes.Analüüsid, kasutades DNA metüülimistneerukudeeGFR-iga ja fibroos viidi läbi, kasutades 506 mikrodissekteeritud andmeidneerukudeproovid Illumina EPIC BeadChipi abil. Neerukoe proovid koguti eraldi ja need erinevad vereproovidest, mida analüüsiti EWAS-i metaanalüüsis. Need proovid koguti tuumori nefrektoomia mõjutamata osadest ja valmistati nii, nagu on kirjeldatud enne punktis 61. Lühidalt, SeSAMe tarkvara62 kasutati eeltöötluse ja kvaliteedikontrolli läbiviimiseks, sealhulgas madala intensiivsusega tuvastamiseks, läbivoolu korrigeerimiseks tausta lahutamisel, mittelineaarse värvi nihke korrigeerimiseks, bisulfiidi muundamise kontroll, beeta väärtuste arvutamine ja leukotsüütide fraktsiooni hindamine. Assotsiatsioonianalüüsiks ekstraheeriti eGFR-i ja UACR-iga seotud CpG-de beetaväärtused ja kliiniline teave. Regressioonimudelit kasutati, et testida lõplike CpG-de DNA metüülimise beeta-eetusi sõltuvate muutujatena vastavalt eGFR-i ja fibroositasemega sõltumatute muutujatena, mis olid kohandatud soo, vanuse, geneetiliste PC-de (1–5), diabeedi staatuse ja hüpertensiooni staatusega. , BMI, massiivi sentriksi ID, sentriksi positsioon ja bisulfiidi konversiooni kontroll ja hinnanguline leukotsüütide fraktsioon.

eGFR-sondide sihipärased uuringud kroonilise neeruhaigusega patsientidel. Üldpopulatsioonist pärit 69 eGFR-iga seotud ja valideeritud CpG seos eGFR-iga Saksa kroonilise haiguse korralNeeruhaigus (GCKD) study was evaluated after correcting for the number of evaluated sites, and statistical significance was defined as Pvalue < 7.2E−4 (0.05/69). The GCKD study is a prospective observational study of patients with CKD63. Briefly, 5217 adult patients under nephrological care provided written informed consent and were enrolled from 2010 to 2012. Inclusion criteria were eGFR between 30 and 60 ml min−1 per 1.73 m2 or an eGFR of >60 ml min−1 per 1.73 m2 with UACR > 300 mg g−1 (or a urinary protein–creatinine ratio of >500 mg g-1). Patsientide jälgimine kliiniliste tulemusnäitajate osas on endiselt pooleli. Uuringu tulemusnäitajad registreeritakse pidevalt standardiseeritud viisil haigla väljakirjutamise kirjade ja surmatunnistuste põhjal ning need hõlmavad neerudega seotud sündmusi ja surma. Uuringu ülesehitust ja värvatud uuringupopulatsiooni on üksikasjalikumalt kirjeldatud varasemates väljaannetes63,64. GCKD uuringu kiitsid heaks kohalikud eetikakomiteed ja see registreeriti riiklikus kliiniliste uuringute registris (DRKS 00003971). 559 kroonilise neeruhaigusega patsiendi alamhulk, mille põhjuseks on süsteemne erütematoosluupus, membraanne nefropaatia, fokaalne segmentaalne glomeruloskleroos või autosoom-dominantne polütsüstiline haigusneeruhaigusvaliti DNA metüülimise kvantifitseerimiseks ja mõõdeti Infinium MethylationEPIC BeadChip massiivi (EPIC) abil. Seostust eGFR-iga hinnati analoogselt põhianalüüsiga (vt Statistilised meetodid ja metaanalüüs), välja arvatud suitsetamise kohandamine, mis oli kodeeritud 0/1/2 mitte kunagi/endiselt/praeguste suitsetajate jaoks. Et hinnata DNA metüülimise seost ajaga kunineerupuudulikkusuuringu sisenemisest alates sobitati Coxi regressioonimudelid iga CpG jaoks ja analoogselt kombineeritud lõpp-punkti jaoksneerupuudulikkusja ägeneerukahjustus.Lisaks DNA metüülimise ennustajale kohandati mudeleid vanuse, soo ja CKD alatüübi järgi. Coxi regressioonimudel annab hinnangu põhjusspetsiifilise ohu suhte (HR) kohta konkureerivate sündmuste, st mis tahes muu surma korral, välja arvatud neerudega seotud surm. Lisaks viidi läbi alajaotusohu analüüsid, et hinnata võimalikke kaudseid mõjusid konkureeriva sündmuse kaudu. Proportsionaalset ohtude eeldust hinnati Schoenfeldi skaala jääkide põhjal. Kahe seotud CpG graafiline hindamine ei näidanud suuri rikkumisi (täiendav joonis 9).

Piirkondlike ühenduste süžeed ja annotatsioon. Täiendava joonise 5 graafikud loodi pakettide "Gviz" 65 ja "rtraclayer" 66 R abil. Graafikule kaasati maksimaalselt 40 saiti 50,{5}} bp kaugusel huvipakkuvast CpG saidist üles- või allavoolu. Kui intervall sisaldas rohkem kui 40 saiti, vähendati joonistatud piirkonda kaugeima saidi kauguseni pluss 10 000 bp. Jaotis RefSeq Genes põhineb UCSC NCBI RefSeq rajal koos geenisümbolitega paketist 'org.Hs.eg.db' R, CpG saarte sektsioon põhineb UCSC CpG saarte rajal, teekaardi chromHMM jaotis põhines Teekaartide 15- olek chromHMM loote mudelneerudepigenoom (Roadmap Epigenome ID: E086)67 ja ühiste SNP-de jaotis põhineb UCSC ühiste SNP-de (151) rajal68. Lõpuks põhineb joonise allosas olev CpG korrelatsioonigraafik KORA F4 uuringu DNA metüülimise proovide andmetel, kasutades Illumina HumanMethylation450 BeadChip massiivi, kusjuures puuduvad saidid on helehalli värvi.

Dispersioon on seletatav DNA metüülimisega.eGFR-iga seotud 69 korduva CpG-ga seletatav fenotüübilise dispersiooni protsent hinnati KORA FF4 uuringu 1888 osaleja andmete põhjal, mis on KORA F4 uuringu seitsmeaastane järelkontroll57,58. KORA FF4 ei kuulunud EWAS-i metaanalüüsi. 988 selgitatud dispersiooni analüüsi kaasatud isikut kattus aga EWAS-i KORA F4 osalejatega. Selles andmekogumis hinnati kõigi CpG-de poolt ühismuutujatest sõltumatult seletatavat dispersiooni kui erinevust baasmudeli R2-s, sealhulgas CpG-d ja ilma. Baasmudel määratleti kuineerudtunnus ~sugu pluss vanus pluss valgete vereliblede proportsioonid pluss diabeet pluss hüpertensioon pluss KMI pluss praegune suitsetamine koosneerudeGFR-i ja UACR-i esindav tunnus. Kahe eGFR-iga seotud CpG (cg06008406, cg20004659) kohta andmed KORA FF4 andmekogumis puuduvad.

Kahesuunaline Mendeli randomiseerimisanalüüs.Edasises MR-is, kasutades paketti „TwoSampleMR” R69, uurisime DNA metüülimise võimalikke põhjuslikke mõjusid replitseeritud CpG-des eGFR-ile ja UACR-ile. MR kasutab geneetilisi instrumente, et minimeerida segavast ja vastupidisest põhjuslikust seosest tulenevat eelarvamust70. Geneetilised instrumendid DNA metüülimiseks (meQTL) olid saadaval vastavalt 47 ja viie CpG jaoks eGFR ja UACR jaoks, nagu GoDMC tuvastas varem kuni 27,75{15}} isikul42. Euroopa esivanemate kokkuvõtte GWAS-i andmeid eGFR10 ja UACR13 kohta kasutati vastavate tulemusandmetena. MeQTL-i kaasamiseks kasutati filtreid (pSNP < 1e-5="" dna="" metüülimisega="" ±="" 500="" kb="" cis-piirkonnas,="" sidemete="" tasakaalustamatus="" r2="">< 0,2="" 1="" mb="" piirkonnas,="" steigeri="" filtreerimine,="" maf=""> 0,05). Tegime pöördvariatsiooniga kaalutud MR-i ja MR-tundlikkuse analüüse (lihtrežiim, kaalutud režiim, kaalutud mediaan ja MR Egger) või triangulatsiooni, hinnates Waldi suhet juhul, kui CpG saidi kohta oli saadaval ainult üks instrument71–73. MR-ist saadud mõjuhinnangud sõltuvad aluseks olevate andmekogumite ühikutest ja vastavad sel juhul loomuliku logaritmiliselt teisendatud eGFR metüülimise taseme ühe standardhälbe muutusele ühiku kohta ja loomuliku logaritmiliselt teisendatud UACR standardhälbele, vastavalt. Pöörd-MR-is uurisime võimalikke põhjuslikke mõjusidneerufunktsioonDNA metüülimise tunnused, kasutades eGFR10 ja UACR13 transetnilise GWAS-i genoomi hõlmavaid olulisi SNP-sid vastavalt eGFR-i ja UACR-i geneetiliste instrumentidena. Tulemusandmete võimsuse maksimeerimiseks teostasime KORA F4 (n=1662) ​​ja FHS (n=3868) uuringute SNP-CpG seoste z-skoori metaanalüüsi. MR-is sisalduva meQTL kombineeritud mõju hinnangud ja nende standardvead hinnati valimi suuruse, alleeli sageduse ja z-skoori järgi. SNP kaasamiseks rakendati filtreid (P-väärtus < 5e-8="">neerudtunnus, ühepoolne P-väärtus < 0.05="" koos="" vere="" uurea="" lämmastikuga="" egfr-i="" instrumentide="" jaoks,="" esivanemate="" heterogeensus="" p-väärtus="" suurem="" või="" võrdne="" kui="" 0.0="" 1,="" steigeri="" filtreerimine,="" maf=""> 0.05). Tegime pöördvariatsiooniga kaalutud MR-i multiplikatiivsete juhuslike efektidega (kuna tunnuse kohta oli saadaval piisavalt palju instrumente erinevatest lookustest)51 ja MR-i tundlikkuse analüüse (lihtrežiim, kaalutud režiim, kaalutud mediaan ja MR Egger)71–73. Täiendava pleiotroopsete variantide tundlikkuse analüüsina jätsime hiljutise GWAS75 käigus välja kokku 35 instrumenti, mis olid seotud II tüüpi suhkurtõvega, sealhulgas 898 130 isikut: üksteist SNP-d, mille P-väärtus oli < 5e-8="" diabeediga,="" ja="" 24="" täiendavat.="" instrumendid,="" mis="" olid="" sellise="" diabeediga="" seotud="" snp-ga="" seotud="" tasakaalutuses="" (r2=""> 0,2 1 Mb piires, 1000 G EUR võrdluspaneel). Ühenduse tasakaalustamatust hinnati LDlink76 kaudu. Pöörd-MR puhul annavad mõjuhinnangud vastavalt loomuliku logaritmiliselt transformeeritud eGFR-i muutuse ühiku kohta ja loomuliku logaritmiliselt transformeeritud UACR-i standardhälbe DNA metüülimise tasemete standardhälbe suhtes. P-väärtuse mitmekordse testimise korrigeerimine vastavalt Benjamini-Hochbergi FDR-ile < 0,="" 05="" rakendati="" neerutunnuse="" kohta="" ning="" päri-="" ja="" tagurpidi="" mr="" jaoks="" eraldi77.="" heterogeensuse="" p-väärtused="" saadi="">

Rikastamise analüüsid.Seotud CpG-de võimalike funktsionaalsete mõjude teavitamiseks hindasime nende CpG-de rikastumist DNaas I või histooni modifikatsiooni saitides (H3K4me1, H3K4me3, H3K9me3, H3K27me3), geenikomplektides, mis põhinevad GO terminitel ja radadel KEGG ja Reactome andmebaasides32. –35. TFBS-i rikastamise analüüsid viidi läbi nagu eelnevalt üksikasjalikult kirjeldatud . Lühidalt, rikastamise testimist hinnati eForge78 abil, kasutades proovide võtmisel permutatsiooni koos geeni- ja CpG saarepiirkonna lokaliseerimisega. Andmed saadi kas projektidest ENCODE (125 proovi) või Roadmap Epigenomics (299 näidist), mis loodi Hotspoti meetodil67,79,80. Sisendina kasutati CpG-sid, mis olid metaanalüüsis vastavalt seotud eGFR-i ja UACR-iga P-väärtusel < 1e−05="" (täiendavad="" andmed="" 6="" ja="" 7)="" ning="" 10,000="" resampling,="" aktiivne="" lähedusfilter="" ja="" fdr="">< 0,05="" peeti="" oluliseks="" (täiendavad="" andmed="" 13="" ja="" 14).="" histooni="" märgi="" rikastamise="" analüüsid="" viidi="" läbi="" analoogselt="" (täiendavad="" andmed="" 15="" ja="" 16).="" geenikomplektide="" või="" radade="" rikastamist="" hinnati="" metüülgsa="" paketi="" ja="" r="" versiooni="" 3.6.181="" abil.="" rikastamise="" katsemeetodiks="" oli="" metüülglm,="" mis="" rakendas="" logistilist="" regressiooni,="" kohandades="" sondide="" arvu="" geeni="" kohta="" ja="" autosomaalset="" tausta,="" mis="" kattub="" 450k="" ja="" epic="" massiividega.="" testiti="" 100–500="" geeniga="" geenikomplekte="" või="" radu="" (vaikesäte).="" arvasime,="" et="" geenikomplekt="" või="" rada="" on="" fdr="">< 0,05="" korral="" oluliselt="" rikastatud,="" korrigeerides="" igas="" andmebaasis="" mitut="" testimist,="" kasutades="" benjamini="" ja="" hochbergi="" meetodit="" (täiendavad="" andmed="" 17="" ja="">