Trombotsüütide inhibeerimine hoiab ära NLRP3 põletikulise aktivatsiooni ja sepsisest põhjustatud neerukahjustuse

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Marivee Borges-Rodriguez jt

Abstraktne:

Trombotsüüdid, tromboosi rakulised vahendajad, aktiveeruvad sepsise ajal ja neid tunnustatakse üha enam immuunvastuse vahendajatena. Trombotsüütide aktivatsioon on sepsisepatsientidel oluliselt suurenenud võrreldes intensiivraviosakonna kontrollpatsientidega. Vaatamata sellele korrelatsioonile jääb aktiveeritud trombotsüütide roll sepsise patofüsioloogiale kaasaaitamisel ebaselgeks. Varem demonstreerisime NOD-sarnase retseptori valgu 3 põletikulise (NLRP3) põletikulise aktivatsiooni sepsisest põhjustatud trombotsüütides umbsoole ligeerimise punktsiooniga (CLP) rottidelt. Aktiveeritud trombotsüüdid olid seotud suurenenud kopsuturse ja glomerulaarkahjustusega CLP vs SHAM kontrollides. Selles uuringus uurisime, kas trombotsüütide aktivatsiooni pärssimine nõrgendab vastusena CLP-le NLRP3 aktivatsiooni ning neeru- ja kopsukahjustusi. Kõhu sepsise esilekutsumiseks viidi läbi CLP isastel ja emastel Sprague Dawley (SD) rottidel (n=10/rühm) ja kontrollidena kasutati SHAM-rotte. CLPloomade alamrühma raviti trombotsüütide aktivatsiooni pärssimiseks klopidogreeliga (10 mg/kg/päevas, CLP pluss CLOP). 72 tundi pärast CLP-d hinnati trombotsüütide aktivatsiooni ja NLRP3 põletikukoostumist, IL-1 ja IL-18 mõõdeti plasmas ning kudesid, neeru- ja kopsupatoloogiat ning neerufunktsiooni. Aktiveeritud trombotsüütide arv oli võltsravi korral 7,8 ± 3,6 protsenti, CLP puhul 22 ± 6 protsenti ja vähenes oluliselt 14,5 ± 0,6 protsendini CLP pluss CLOP puhul (n=8–10/rühm, p < 0,05)="" .="" nlrp3="" põletikukoost="" inhibeeriti="" clp="" pluss="" clop="" loomade="" trombotsüütides="" vs.="" clp.="" clopidogreelravi="" korral="" vähenes="" plasma="" ja="" neerude="" il-1="" ja="" il-18="" oluline="" tõus="" vastusena="" clp-le.="" clp="" pluss="" clop="" võrreldes="" clp-ga="" paranes="" neerukahjustus,="" kuid="" mitte="" kopsu="" histoloogia="" või="" neerufunktsioon.="" need="" andmed="" näitavad,="" et="" aktiveeritud="" trombotsüüdid="" võivad="" kaasa="" aidata="" sepsisest="" põhjustatud="" neerukahjustusele,="" võib-olla="" nlrp3="" aktivatsiooni="" kaudu="" trombotsüütides.="" trombotsüüdid="" võivad="" olla="" septiliste="" patsientide="" neerukahjustuse="" vähendamise="" terapeutiliseks="">

Märksõnad:sepsis; NLRP3; trombotsüüdid; klopidogreel; mitme organi vigastus; endoteeli aktiveerimine;põletik

cistanche tubolosa ekstrakt: põletikuvastane

1. Sissejuhatus

Sepsis on eluohtlik düsreguleeritud peremeesorganismi põletikuline reaktsioon nakkustekitajale [1] ja üks peamisi surmapõhjuseid maailmas. Vähemalt 1,7 miljonil täiskasvanul Ameerikas areneb sepsis ja peaaegu 270,{5}} ameeriklast sureb igal aastal sepsise tagajärjel [2]. Sepsis põhjustab mitme organi düsfunktsiooni, sealhulgas ägeda kopsukahjustuse (ALI) [3],ägeneerudvigastus(AKI) [4,5], muu hulgas hematoloogiline ja kesknärvisüsteemi düsfunktsioon. Sepsisega seotud organite arvu suurenemine on seotud suurenenud suremusega [6]. Praegused raviviisid keskenduvad toetavale ravile; suremus jääb siiski kõrgeks. On teatatud, et ligikaudu 35–50 protsenti haiglas toimunud surmajuhtumitest on tingitud sepsisest [7]. Ülioluline on tuvastada terapeutiline sihtmärk, mis võib parandada sepsisest tingitud suremust.

Trombotsüütidel on lisaks hemostaasis ja tromboosile oma roll immuunsuses [8, 9]. Trombotsütopeeniat täheldatakse sageli sepsise korral ja arvatakse, et see tekib trombotsüütide aktivatsiooni ja tarbimise tõttu; selle roll haigusprotsessis jääb siiski ebaselgeks. Trombotsütopeeniat seostatakse (mitme elundipuudulikkuse) MOF-i tekkega ja 90-päevasuremuse suurenemisega [10–14]. Trombotsüüdid võivad olla sepsise põletikulise reaktsiooni lahutamatu osa. Potentsiaalne mehhanism, mille abil trombotsüüdid võivad kaasa aidata mitme organi vigastusele, on NOD-sarnase retseptori valgu 3 põletikulise (NLRP3) aktiveerimine. NLRP3 on tsütosoolne immuunsignalisatsiooniretseptor, mis viib kaspaasi -1 vahendatud lõhustumiseni ja IL-1B ja IL-18 aktiveerimiseni ning on seotud põletikuliste haigusprotsesside, nagu astma, patogeneesiga [15 ], Parkinsoni tõbi [16], põletikuline soolehaigus [17] ja sepsis [18]. On näidatud, et NLRP3 põletikulise koostu inhibeerimine kaitseb sepsisest põhjustatud elundikahjustuste eest [19–23]. Oleme varem näidanud, et NLRP3 põletik aktiveerub trombotsüütides vastusena umbsoole ligeerimis-punktsioonile (CLP) ja on 72-tunnise CLP roti mudelis seotud polümikroobse sepsise vastusena mitme elundi vigastusega. Käesolevas uuringus oletasime, et trombotsüütide aktiveerimise blokeerimine klopidogreeli (CLOP) abil vähendaks vastusena polümikroobsele sepsisele NLRP3 põletikulise aktivatsiooni ning neeru- ja kopsukahjustusi.

cistanche flavonoidid: põletikuvastane

2. Tulemused

2.1. Plaadi aktiveerimine ja NLRP3 põletikukoost

Voolutsütomeetria abil määrasime trombotsüütide aktiveerimise protsendi rühmade vahel. Leidsime, et trombotsüütide aktivatsioon suurenes CLP-rottidel 22 ± 6 protsenti võrreldes SHAM-iga 7,8 ± 3,6 protsenti (p < 0.{{10}}5)="" ja="" nõrgenes="" clp-s.="" pluss="" clop="" rotid="" 14,5="" ±="" 0,6="" protsenti="" (p="">< 0,05,="" joonis="" 1).="" nlrp3="" põletikulist="" moodustumist="" trombotsüütides="" hinnati,="" visualiseerides="" immunotsütokeemia="" abil="" nlrp3="" kooslokaliseerumist="" apoptoosiga="" seotud="" täpitaolise="" valguga="" (asc)="" (joonis="" 2).="" põletikuliste="" komponentide="" kaaslokaliseerimine="" clp-trombotsüütides="" oli="" 83="" korda="" suurem="" kui="" võltsitud="" trombotsüütidega="" (joonis="" 2c).="" lisaks="" vähenes="" clp="" pluss="" clop="" trombotsüütides="" võrreldes="" clp-ga="" põletiku="">

2.2. Põletikuga seotud tsütokiinid

NLRP3 aktiveerimine toob kaasa põletikueelsete tsütokiinide IL-1 ja IL-18 vabanemise nende aktiivseteks vormideks. Mõõtsime mõlemat tsütokiini plasmas,kopsujaneerudhomogeneeribSHAM, CLP ja CLP pluss CLOP ELISA kaudu. Plasma IL{{0}} suurenes märkimisväärselt 9 ± 21 pg/mL-lt võltsravi korral 77 ± 31 pg/ml-ni CLP-s (p < {{10}}.0="" 5,="" joonis="" 3a).="" klopidogreeli="" manustamine="" näitas="" plasma="" il-1="" 48="" ±="" 38="" pg/ml="" vähenemist;="" vähenemine="" ei="" olnud="" aga="" clp-ga="" võrreldes="" statistiliselt="" oluline="" (p="">< 0.05="" vs.="" võlts).="" samamoodi="" oli="" neerude="" il-1="" kõrgenenud="" clp-s="" 4="" ±="" 3="" pg/mg,="" võrreldes="" võltsiga="" 2,5="" ±="" 0,9="" pg/mg="" (p="">< 0,05,="" joonis="" 3b).="" ravi="" klopidogreeliga="" vähendas="" oluliselt="" neerude="" il-1="" 1,8="" ±="" 0,8="" pg/mg-ni="" (p="">< 0,05).="" kopsudes="" suurenes="" il-1="" märkimisväärselt="" 70="" ±="" 16="" pg/mg="" näidises="" 106="" ±="" 36="" pg/mg="" clp-s="" (p="">< 0,05)="" ja="" ei="" erinenud="" oluliselt="" klopidogreeli="" saanud="" loomadel="" (80="" ±="" 23="" pg).="" g,="" joonis="">

Plasma IL{{0}} ei olnud SHAM-rottidel tuvastatav; keskmine plasma IL-18 oli aga CLP-s 26 ± 6 pg/ml. Oluline on see, et klopidogreeli manustamine vähendas plasma IL-18 taset (12 ± 9 pg/ml; p < 0.{{20}}5,="" joonis="" 3d).="" sarnaselt="" oli="" neerude="" il{{10}}="" kõrgenenud="" clp-s="" (396="" ±="" 65="" pg/mg)="" võrreldes="" võltsraviga="" (317="" ±="" 73="" pg/mg;="" p="">< 0,05).="" ravi="" klopidogreeliga="" vähendas="" neerude="" il-18="" väärtuseni="" 214="" ±="" 70="" pg/mg="" (p="">< 0,05,="" joonis="" 3e).="" kopsudes="" tõusis="" il-18="" märkimisväärselt="" 704="" ±="" 219="" pg/mg-lt="" näidises="" 999="" ±="" 158="" pg/mg-ni="" clp-s="" (p="">< 0,05)="" ja="" püsis="" kõrgendatud="" klopidogreeliga="" ravitud="" loomadel="" 1014="" ±="" 235="" pg/mg.="" p="">< 0,05="" vs.="" võlts,="" joonis="">

2.3. Endoteeli aktiveerimine

Mõõtsime ELISA abil angiopoetiini {{0}} ja endokaani plasmatasemeid endoteeli aktivatsiooni markeritena Sham, CLP ja CLP pluss CLOP rühmades. Plasma endokaan tõusis märkimisväärselt 1234 ± 327 pg/mL-lt võltsis kuni 1978 ± 306 pg/ml CLP-s (p < {{20}},05="" vs.="" võlts).="" klopidogreeliga="" ravitud="" clp-rottidel="" vähenes="" endokaan="" oluliselt="" tasemeni="" 1521="" ±="" 283="" pg/ml="" (p="">< 0,05="" vs.="" clp,="" joonis="" 4a).="" sarnased="" tulemused="" saadi="" angiopoetiini-2="" puhul.="" angiopoetiini-2="" tase="" tõusis="" märkimisväärselt="" 5603="" ±="" 2142="" pg/ml="" näidises="" kuni="" 56="" 767="" ±="" 40,000="" pg/ml="" clp-s="" (p="">< 0,05="" vs.="" võlts)="" ja="" vähenes="" oluliselt="" klopidogreeliga="" ravitud="" rottidel.="" 22="" 486="" ±="" 13="" 616="" pg/ml="" (p="">< 0,05="" vs.="" clp,="" joonis="">

2.4. Kopsukahjustus

Iga rühma kopsude histoloogiline analüüs näitas neutrofiilide infiltratsiooni olulist suurenemist CLP-rottide keskmise skooriga {{0}},6 ± 0,2 võrreldes skooriga {{6} },10 ± {{10}},10 võltsrottidel (p < 0.05).="" samuti="" täheldasime,="" et="" klopidogreeli="" manustamine="" clp-rottidele="" ei="" muutnud="" neutrofiilide="" infiltratsiooni="" (skoor="" 0,5="" ±="" 0,4,="" joonis="" 5a).="" sarnased="" tulemused="" saadi="" alveoolide="" seina="" paksuse="" puhul,="" kus="" clp="" suurenes="" oluliselt="" keskmise="" paksusega="" 1,2="" ±="" 0,1="" µm,="" võrreldes="" sham-rottide="" 0,8="" ±="" 0,3="" µm="" (p="">< 0,05).="" klopidogreeli="" manustamine="" clp-rottidele="" ei="" parandanud="" alveoolide="" seina="" paksust="" (joonis="">

2.5. Neerukahjustus

Nagu oleme varem avaldanud, vähenes GFR oluliselt tasemelt 2,1 ± 0,8 ml/min/100 g, kuid Sham-rottidel kuni {{10}} 0,7 ± 0,2 ml/min/100 g, kuid CLP rottidel (p < 0,05).="" klopidogreeli="" manustamine="" näitas="" paranenud="" gfr-i="" väärtuseni="" 1,3="" ±="" 0,5="" ml/min/100="" g,="" kuid="" võrreldes="" clp-ga,="" see="" ei="" olnud="" siiski="" statistiliselt="" oluline="" (joonis="" 6a).="" histoloogiline="" analüüs="" näitas="" clp="" rühmas="" suurenenud="" glomerulaarkahjustusi="" võrreldes="" shamiga.="" klopidogreelravi="" parandas="" oluliselt="" glomerulaarkahjustusi="" clp-loomadel="" (joonis="">

cistanche kasu tervisele: parem neerufunktsioon

3. Arutelu

Sepsis on reguleerimata immuunvastus nakkustekitajale, mida sageli seostatakse mitme organi puudulikkusega ja mille suremus on kõrge. On vaja kindlaks teha uudne ravi, mis võib moduleerida põletikulist vastust ja vähendada suremust. Trombotsüütidel on väidetavalt roll immunomodulatsioonis. Loomulikult on koagulatsioonikaskaad ja trombotsüütide aktiveerimine olnud uurimise olulisel kohal. Antikoagulandi endogeense ensüümi C-valgu manustamist on seostatud raske sepsisega patsientide elulemuse paranemisega [24]. Jaapanis hõlmavad sepsise juhised ajastatud antitrombiini manustamist DIC-ga septilistel patsientidel ja on näidanud paremaid tulemusi [25]. See viitab sellele, et trombotsüütide aktivatsiooni pärssimine võib parandada sepsise tulemusi. Põletikuline reaktsioon sepsise ajal on kindlasti keeruline ja võib hõlmata rohkem kui ühte rada. Varem avaldasime, et CLP polümikroobse sepsise mudeli trombotsüütidel on suurenenud trombotsüütide NLRP3 kokkupanek/aktivatsioon ning neid seostati kopsu- ja neerukahjustusega [26]. Selles uuringus püüdsime määrata trombotsüütide inhibeerimise rolli põletikulises vastuses samas mudelis, kasutades P2Y12 inhibiitorit Clopidogrel.

Nagu varem avaldatud, suurenes trombotsüütide aktivatsioon vastusena polümikroobsele sepsisele CLP mudelis võrreldes Sham-rottidega. Leidsime, et klopidogreeli manustamine vähendas trombotsüütide aktivatsiooni CLP-rottidel ja huvitaval kombel täheldati ka NLRP3 põletikulise moodustumise vähenemist trombotsüütides. Võrreldes CLP-rühmaga, leidsime ka trendi tsirkuleeriva IL-1B ja IL-18 vähenemises klopidogreeliga ravitud loomade plasmas. Varem avaldatud uuringus teatasime, et NLRP3 põletiku otsene pärssimine MCC950-ga põhjustas plasmas IL-1B ja IL-18 vähenemise [27]. See viitab sellele, et trombotsüütide aktivatsiooni pärssimine klopidogreeliga ja põletikuliste tsütokiinide vähenemine selles sepsise mudelis on osaliselt vahendatud NLRP3 mehhanismide kaudu. Seetõttu tuleb NLRP3 poolt trombotsüütides vahendatud põletikuliste radade selgemaks määratlemiseks läbi viia täiendavad uuringud.

Multi-organ failure (MOF) occurs frequently in sepsis. Previously published studies reported that in mice, the CLP model caused significant pulmonary damage; and depletion of platelets reduced CLP-induced edema and neutrophil recruitment in the bronchoalveolar space by >60 protsenti [28]. Oleme varem avaldanud, et trombotsüütide suurenenud aktivatsioon oli seotud mitme organi düsfunktsiooni ja vigastustega CLP rotimudelis [26]. Meie andmed näitavad IL-1 ja IL-18 olulist vähenemistneerudklopidogreeliga ravitud loomadest. Ägeda neerupuudulikkuse ja sepsise kombinatsiooni seostatakse 70-protsendilise suremusega, võrreldes ainult ägeda neerupuudulikkusega patsientide suremusega 45 protsenti [29]. Glomerulaarfiltratsiooni kiirus (GFR) on näitajaneerudfunktsioonija väheneb koos suurenenud neerukahjustusega. Klopidogreelravi parandas CLP-rottide neerukahjustust, mis viitab sellele, et trombotsüütide aktivatsioon võib mängida rolli sepsisest põhjustatud AKI tekkes.

cistanche ekstrakti eelised: parandab neerufunktsiooni

Kooskõlas selle rolliga MOF-i põhjustamisel on ALI ja ägeda respiratoorse distressi sündroomi (ARDS) tekkimine sepsisehaigetel tavaline ja põhjustab sageli selles patsientide populatsioonis mehaanilise ventilatsiooni vajadust. Tõendid näitavad, et trombotsüütide aktivatsioon mängib olulist rolli MOF-i tekkes septilistel patsientidel [8,30]. Varasemad uuringud on seda toetanud, vähendades neutrofiilide infiltratsiooni CLP-indutseeritud septiliste hiirte kopsudes pärast trombotsüütide ammendumist [28]. Lisaks on Liverani et al. teatasid, et klopidogreeliga eeltöödeldud hiired olid resistentsed sepsisest põhjustatud ALI suhtes [31]. Kuid käesolev uuring ei suutnud näidata olulisi tõendeid IL- 1 vähenemise, neutrofiilide infiltratsiooni või alveolaarseina paksuse vähenemise kohta kopsudes. See võib olla tingitud erineva loomaliigi kasutamisest, klopidogreeli annusest ja muudest erinevustest katse ülesehituses.

Kapillaaride lekkimine on sepsise silmapaistev tunnus. Valgud, nagu vaskulaarne kasvufaktor angiopoietiin-2, soodustavad teadaolevalt põletikku, endoteeli düsfunktsiooni ja on seotud sepsisehaigete suurenenud haiglasuremusega [32]. Endokaan on veel üks endoteelirakkude düsfunktsiooni marker ja seda on seostatud haiguse tõsiduse ja septiliste patsientide tulemustega [33]. Samuti leidsime, et need endoteeli aktivatsiooni ja düsfunktsiooni markerid olid CLP mudelis kõrgemad ja klopidogreeli ravirühmas vähenesid. Samamoodi täheldasime klopidogreeliga ravitud rühmas GFR-i kerget, kuid ebaolulist suurenemist. See viitab sellele, et trombotsüütide aktiveerimisel on teatav moduleeriv toime põletikulisele vastusele sepsisele.

Selles uuringus ei toonud trombotsüütide aktivatsiooni pärssimine kaasa olulist elundite funktsiooni paranemist. Võimalik, et valitud annus 10 mg/kg/päevas oli piisav trombotsüütide aktivatsiooni, NLRP3 aktivatsiooni, tsütokiinide ja endoteeli aktivatsiooni markerite nõrgendamiseks, kuid see ei tähendanud kopsukahjustuse nõrgenemist ega neerufunktsiooni paranemist. Liverani et al. varem kasutati metsiktüüpi ja P2Y12 knock-out hiirtel algannust 30/mg/kg/päevas, mis tähendas sepsisest põhjustatud kopsukahjustuse pärssimist [31]. Samas uuringus manustati klopidogreeli enne sepsise esilekutsumist. See oluline erinevus võib seletada meie uuringus täheldatud kopsu- või neerufunktsiooni olulise paranemise puudumist.

Kuigi käesolev uuring viitab trombotsüütide aktiveerimise rollile põletikule ja endoteeli aktiveerimisele vastuseks sepsisele, tuleb siiski märkida, et on piiranguid. Esiteks, kuigi mõõdeti endoteeli aktivatsiooni markereid, on endoteeli funktsiooni hindamiseks õigustatud täiendavad katsed. Lisaks ei kontrollitud selles uuringus teiste trombotsüütidest pärinevate tegurite mõju. Seega on endiselt vastamata küsimusi selle kohta, kuidas trombotsüüdid aitavad kaasa sepsisest põhjustatud patoloogiale ja elundipuudulikkusele.

Klopidogreeli roll sepsise suremuse vähendamisel on olnud vastuoluline, kuna on teatatud ARDS-i ja mehaanilise ventilatsiooni esinemissageduse vähenemisest, kuid mitte suremuse vähenemisest [34]. Vaja on teha täiendavaid uuringuid, et teha kindlaks täpne mehhanism, mille abil trombotsüüdid soodustavad sepsise elundite vigastusi ja talitlushäireid. See uuring toetab trombotsüütide kui septiliste patsientide terapeutilise sihtmärgi edasist uurimist.

cistanche tubolosa kasu tervisele: parandab neerufunktsiooni

4. Materjalid ja meetodid

4.1. Loomad

Kasutati Envigost (Indianapolis, IN, USA) ostetud emaseid ja isaseid Sprague Dawley rotte. Kõik selles uuringus läbiviidud katseprotseduurid olid kooskõlas riiklike tervishoiuinstituutide juhistega loomade kasutamise ja hooldamise kohta. Kõik protokollid kiitis heaks Mississippi ülikooli meditsiinikeskuse institutsionaalne loomade hooldamise ja kasutamise komitee. Loomade hooldamine ja käitlemine oli kooskõlas riiklike tervishoiuinstituutide juhistega loomade eetilise kohtlemise kohta.

4.2. Umbsoole ligeerimine ja punktsioon

Kõik meie in vivo katsed viidi läbi 12- kuni 13-nädalaste isaste ja emaste rottidega, kes kaalusid ligikaudu 225–325 g. Loomad jagati juhuslikult kahte rühma: võltsoperatsiooni rühm (SHAM, n=10) ja umbsoole ligeerimise punktsioonirühm (CLP, n=10). Isofluraananesteesia all viidi CLP-operatsioon läbi rottide alarühmal, et kutsuda esile kõhu polümikroobne sepsis, nagu oleme eelnevalt kirjeldanud [26, 27]. Vahetult pärast elustamisoperatsiooni süstiti subkutaanselt eelkuumutatud soolalahust (20 ml/kg, 37 ◦C). Näidisopereeritud loomadele tehti sama kirurgiline protseduur ilma pimesoole ligeerimise või punktsioonita. Rotid pandi pärast operatsiooni tagasi puuridesse ning toitu ja vett anti ad libitum. 24 tundi pärast CLP-d avati eelnev sisselõige uuesti ja nekrootiline pimesool lõigati hoolikalt välja. Kõhuõõnde pesti 10 ml sooja steriilse soolalahusega. Kõhulõige suleti taas kihiti. Loomadele manustati iga päev laia toimespektriga antibiootikumi (Naxcel 5 mg/kg) ja analgeesia saavutati buprenorfiini SR-ga (1,2 mg/kg) 72-tunnise katseperioodi jooksul. Trombotsüütide agregatsioon blokeeriti klopidogreeli igapäevase manustamisega (10 mg/kg/päevas) 3 päeva jooksul CLP-rottide alarühmas (CLP pluss CLOP; n=12) söögitoru sondi kaudu 3 päeva jooksul. Protokolli lõpus ohverdati loomad sügava anesteesia all. Edasiseks analüüsiks koguti veri ja kuded.

4.3. Trombotsüütide isoleerimine

Arteriaalne veri võeti happe-tsitraadi-dekstroosi vakutainer-tuubidesse ja tsentrifuugiti 200 × g juures 20 minutit, et saada trombotsüütide rikas plasma. Trombotsüütiderikas plasma (PRP) segati võrdse koguse HEP puhvriga (140 mmol/L NaCl, 2,7 mmol/L KCl, 3,8 mmol/L HEPES, 5 mmol/L EGTA, pH 7,4), mis sisaldas 1 uM PGE1. Seda segu tsentrifuugiti seejärel 100 × g juures 20 minutit, et sadestada ülejäänud RBC ja WBC, milles 40 µl supernatanti kasutati trombotsüütide loendamiseks. Seejärel tsentrifuugiti PRP-d kiirusel 800 × g 20 minutit, supernatant visati ära ja pellet resuspendeeriti Tyrode'i puhvris (134 mmol/L NaCl, 12 mmol/L NaHC03, 2,9 mmol/L KCl, 0,34 mmol/l Na2HPO4,1). mmol/L MgCl2, 10 mmol/L HEPES), mis sisaldab 5 mmol/L glükoosi ja 3 mg/ml BSA.

4.4. Voolutsütomeetria

Värskelt eraldatud trombotsüüdid (106) resuspendeeriti 50 ui Tyrode'i puhvris. Trombotsüüte inkubeeriti (RT 30 minutit) fluorestseiini isotiotsüanaadiga (FITC) konjugeeritud hiirevastase CD41 (kloon MWReg30, BioLegend, San Diego, CA, USA) ja allofükotsüaniiniga (APC) konjugeeritud hiire/roti vastase vastase CD41-ga (Clon R62P). {9}}, Biolegend). Värava kohta saadi vähemalt 10,{11}} sündmust MACsQuant Analyzer 10 abil (Miltenyi Biotec, Auburn, CA, USA) ja analüüsiti FlowLogici tarkvara abil (Innovation, Sydney, Austraalia). Trombotsüüdid eristati anti-CD41 spetsiifilise seondumise ja iseloomuliku edasi- ja külghajumise poolest. Trombotsüüdid, mis värvusid CD41 ja CD62P suhtes positiivselt, nimetati aktiveeritud trombotsüütideks.

4.5. Konfokaalne ja valgusmikroskoopia

Trombotsüütidel (107) võlts- või CLP-rottidelt või LPS-iga või ilma selleta stimuleeritud vereliistakutel lasti kleepuda permanoks-slaididele (Lab-Tek, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Kleepunud rakud fikseeriti 10-protsendilises formaliinis 30 minutit, pesti 3 korda PBS-iga 10 minutit toatemperatuuril ja permeabiliseeriti jääkülma 100-protsendilise metanooliga 10 minutit. Slaidid blokeeriti PBS-is 10% kitse ja küüliku seerumiga 1 tund, pesti ja inkubeeriti küüliku anti-NLRP3 antikehaga (NBP2-12446, Novus Biologicals, Littleton, CO, USA) 2 tundi toatemperatuuril. Seejärel slaidid pesti ja inkubeeriti küülikuvastase Alexa Fluor 488-ga (A11070, Thermo FisherScientifific) 1 tund toatemperatuuril. Objektiklaase pesti uuesti ja inkubeeriti Alexa Fluor{19}}konjugeeritud küüliku ASC-vastase antikehaga (NBP1-78977AF647, Novus Biologicals) 1 tund toatemperatuuril. Kontrolle töödeldi identselt, välja arvatud primaarsete antikehade väljajätmine. Preparaadid paigaldati Cytoseal 60-sse (Thermo Fisher Scientific) ja analüüsiti Nikon C1 (Nikon Inc., Melville, NY, USA) konfokaalse skaneeriva mikroskoobiga. Pildid jäädvustati Nikon Eclipse 55i mikroskoobiga, mis oli varustatud Nikon-Fi1 värvikaameraga (Nikon), ja analüüsiti tarkvara NIS-Elements D 3.0 abil.

4.6. Endoteeli aktivatsiooni ja tsütokiinide biomarkerite kvantifitseerimine

Angiopoetiini-2 (MANG20, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) ja Endokani-1 (MBS039900, MyBioSource, San Diego, CA, USA) taset plasmas mõõdeti ELISA abil endoteeli düsfunktsiooni markeritena. tootja protokollile. Plasma,neerud, ja kopsu IL-1 (RLB00, R&D Systems) ja IL-18 (ab213909, Abcam, Boston, MA, USA) kvantifitseeriti ELISA meetodil vastavalt tootja protokollile.Neerudja kopsulüsaadid valmistati BioPlex Cell Lysis Kitiga (171304011, BioRad, Hercules, CA, USA) vastavalt tootja protokollile.

4.7. Kopsukahjustuse hindamine

Histological evaluation was performed on the lungs via hematoxylin and eosin (H&E)staining. A lung lobe was formalin-fixed. The tissue was subsequently paraffin-embedded and 5-µm sections were stained with (H&E). Sections were evaluated for neutrophil infiltration into the alveolar space. Five sections were scored in a blinded fashion on a scale of0–2 with 0 representing o neutrophils in the alveolar space, 1 representing 1–5 neutrophils in the alveolar space, and 2 representing >5 neutrofiili alveolaarruumis. Pildid jäädvustati Nikon Eclipse 55i mikroskoobiga, mis oli varustatud Nikon DS-Fi1 värvikaameraga (Nikon Inc.) 40X, kasutades NIS-Elements D 3.{10}} tarkvara. Alveoolide seina paksust mõõdeti tarkvara NIS-Elements D 3.0 abil. Andmed normaliseeriti võltsväärtustele.

4.8. Neeru glomerulaarse kahjustuse hindamine

Neerudwere collected, weighed, and fixed in a 10% buffered formalin solution. Paraffin sections (3 µm) were prepared and stained with Periodic acid-Schiff to assess the degree of glomerular injury on approximately 30 images per section, per rat. Thirtyglomeruli per section were scored in a blinded fashion on a 0–4 scale with 0 representing a normal glomerulus, 1 representing a 25% loss, 2 representing a 50% loss, 3 representing a 75% loss, and 4 representing >75 protsenti kapillaaride kadu kimp. Pildid jäädvustati sama mikroskoobi, kaamera ja tarkvaraga, nagu eelnevalt mainitud.

4.9. Neerufunktsiooni mõõtmine

CLP-protseduuri ajal sisestati kateeter kägiveeni ja välistati nahaaluselt kaela tagaosas. Kateetrit loputati hepariniseeritud soolalahusega iga päev kuni kolmepäevase protokolli lõpuni. Protokolli viimasel päeval tehti rottidele lühike isofluraananesteesia, et panna kokku NIC-Neeru seade (MediBeacon; Mannheim, Saksamaa), mis koosneb kahest valgusdioodist, mis ergastavad FITC sinistriini lainepikkusel 480 nm, fotodioodi, mis kiirgab valgust 531 nm, mikroprotsessor ja aku. See seade kinnitati roti tagaküljele, kasutades kahepoolset kleepuvat plaastrit (MediBeacon), ja kinnitati näriliste jopega roti tagakülje raseeritud piirkonna külge. Rottidel lasti 15 minutit taastuda eraldi puurides ja registreeriti algtaseme mõõtmine. Pärast algtaseme mõõtmist manustati kaelaveeni kaudu FITC-sinistriini boolussüst (5 mg/100 g kehamassi kohta; FTC-FS001, MediBeacon), millele järgnes steriilse soolalahuse boolussüst. Kahe tunni jooksul pärast boolussüsti mõõdeti FITC-sinistriini eritumise kineetikat transkutaanselt ja seda kasutati FITC-sinistriini eliminatsiooni poolväärtusaja (t1/2) arvutamiseks, kasutades MDPLab hindamistarkvaraga ühekambrilist mudelit. (MediBeacon), et arvutada GFR valideeritud empiiriliselt tuletatud teisendusteguri alusel [35,36].

cistanche ülevaade: parandab neerufunktsiooni

4.10. Statistiline analüüs

Võimsuse analüüs teeb kindlaks, et n 10–12 loomast rühma kohta saavutaks võimsuse (1- ) 0,80 ja 1. tüüpi vea tõenäosuse ( ) 0,05, et tuvastada vähemalt 5–10-protsendine erinevus trombotsüütide aktivatsioonis võlts- ja CLP-rottide vahel. Kõik andmed on väljendatud keskmisena ± SD. Kõiki andmeid kontrolliti D'Agostino-Pearsoni normaalsustesti abil, et need oleksid Gaussi jaotusega kooskõlas. Statistilised analüüsid viidi läbi ühesuunalise ANOVA abil, kasutades post hoc analüüsina Tukey mitme võrdluse testi. Väärtust p < 0,05="" peeti="" statistiliselt="">

Autori kaastööd:

Kontseptualiseerimine, CAS, JMW ja DCC; metoodika, JMW ja D.CC; valideerimine, OKT, JMW ja DCC; formaalne analüüs, MB-R., CAS, OKT, JMW ja D.CC; uurimine, MB-R., CAS, OKT, RWT, CHB, CAG, GAT, JMW ja DCC; ressursid, JMW ja DCC; andmete kureerimine, MB-R., CAS ja DCC; kirjutamine – esialgse mustandi ettevalmistamine, MB-R. ja CAS; kirjutamine – ülevaatamine ja toimetamine, MB-R., CAS, OKT, RWT, CHB, CAG, GAT, JMW ja DCC; visualiseerimine, MB-R., CAS, JMW ja DCC; järelevalve, OKT ja DCC; projektihaldus, DCC; rahastamise omandamine, DCC Kõik autorid on käsikirja avaldatud versiooni läbi lugenud ja sellega nõustunud.

Rahastamine:

Selles väljaandes kirjeldatud uuringuid toetas riiklike tervishoiuinstituutide riiklik üldmeditsiiniteaduste instituut auhinnanumbrite P20GM104357 ja P30GM103328 all. Seda uuringut rahastasid riiklike tervishoiuinstituutide riiklik südame-kopsu- ja vereinstituut auhinnanumbritega F31HL149257 (OKT), R00HL130456 (DCC) ja R01HL151407 (DCC) ning riiklik diabeedi ja seedesüsteemi instituut. jaNeerHaigusedRiiklike Tervishoiuinstituutide (National Institutes of Health Institute) auhinnanumbriga R01DK109133 (JMW) Sisu eest vastutavad ainult autorid ja see ei pruugi esindada riiklike tervishoiuinstituutide ametlikke seisukohti.

Institutsioonilise ülevaatenõukogu avaldus:

Kõik selles uuringus läbi viidud eksperimentaalsed protseduurid viidi läbi vastavalt riiklike tervishoiuinstituutide juhistele loomade kasutamise ja hooldamise kohta. Kõik protokollid kiitis heaks Mississippi ülikooli meditsiinikeskuse institutsionaalne loomade hooldamise ja kasutamise komitee (protokoll 1487A, kinnitatud 07.02.2019). Loomade hooldamine ja käitlemine oli kooskõlas riiklike tervishoiuinstituutide juhistega loomade eetilise kohtlemise kohta.

Andmete kättesaadavuse avaldus:

Kõik esitatud tulemusi toetavad andmed on esitatud käsikirjas ja on vabalt kättesaadavad.

Huvide konfliktid:

Autorid ei väljenda huvide konflikti.

Viited

1. Greco, E.; Lupia, E.; Bosco, O.; Vizio, B.; Montrucchio, G. Trombotsüüdid ja mitme elundi rike sepsises. Int. J. Mol. Sci. 2017, 18, 2200.
2. Rhee, C.; Dantes, R.; Epstein, L.; Murphy, DJ; Seymour, CW; Iwashyna, TJ; Kadri, SS; Angus, DC; Danner, RL; Fiore, AE; et al. Sepsise esinemissagedus ja suundumused USA haiglates, kasutades kliinilisi ja väiteid andmeid, 2009–2014. JAMA 2017, 318, 1241–1249.
3. Kim, WY; Hong, SB sepsis ja äge respiratoorse distressi sündroom: hiljutine värskendus. Tuberc. Hingake. Dis. (Soul) 2016, 79, 53–57.
4. Alobaidi, R.; Basu, RK; Goldstein, SL; Bagshaw, SM Sepsisega seotud äge neerukahjustus. Semin. Nephrol. 2015, 35, 2–11.
5. Umbro, I.; Gentile, G.; Tinti, F.; Muresan, P.; Mitterhofer, AP Hiljutised edusammud sepsisest põhjustatud ägeda neerukahjustuse patofüsioloogia ja biomarkerite vallas. J. Infect. 2016, 72, 131–142.
6. Bilevicius, E.; Dragosavac, D.; Dragosavac, S.; Araujo, S.; Falcao, AL; Terzi, RG Mitme organi puudulikkus septilistel patsientidel. Braz. J. Infect. Dis. 2001, 5, 103–110.
7. Liu, V.; Escobar, GJ; Greene, JD; Soule, J.; Whippy, A.; Angus, DC; Iwashyna, TJ Haigla surmajuhtumid sepsisega patsientidel kahest sõltumatust kohordist. JAMA 2014, 312, 90–92.
8. Katz, JN; Kolappa, KP; Becker, RC Lisaks tromboosile: mitmekülgsed trombotsüüdid kriitiliste haiguste korral. Rind 2011, 139, 658–668.
9. Smyth, SS; McEver, RP; Weyrich, AS; Morrell, CN; Hoffman, MR; Arepally, GM; prantsuse, PA; Dauerman, HL; Becker, RC; Trombotsüütide kollokvium, P. Trombotsüütide funktsioonid väljaspool hemostaasi. J. Thromb. Haemost. 2009, 7, 1759–1766.
10. de Stoppelaar, SF; van 't Veer, C.; van der Poll, T. Trombotsüütide roll sepsises. Tromb. Haemost. 2014, 112, 666–677.
11. Navaz, M.; Dickfeld, T.; Bogner, C.; Fateh-Moghadam, S.; Neumann, FJ Trombotsüütide funktsioon septilistes mitme organi düsfunktsiooni sündroomides. Intensiivravi Med. 1997, 23, 379–385.
12. Layios, N.; Delierneux, C.; Hego, A.; Huart, J.; Gosset, C.; Lecut, C.; Maes, N.; Geurts, P.; Joly, A.; Lancellotti, P.; et al. Sepsise ennustamine kriitiliselt haigetel patsientidel trombotsüütide aktivatsioonimarkerite järgi intensiivraviosakonna vastuvõtul: perspektiivne pilootuuring. Intensiivravi Med. Exp. 2017, 5, 32.
13. Russwurm, S.; Vickers, J.; Meier-Hellmann, A.; Spangenberg, P.; Bredle, D.; Reinhart, K.; Losche, W. Trombotsüütide ja leukotsüütide aktivatsioon on korrelatsioonis septilise elundi düsfunktsiooni raskusastmega. Šokk 2002, 17, 263–268.
14. Vanderschueren, S.; De Weerdt, A.; Malbrain, M.; Vankersschaever, D.; Frans, E.; Wilmer, A.; Bobbaers, H. Trombotsütopeenia ja prognoos intensiivravis. Crit. Care Med. 2000, 28, 1871–1876.
15. Theofanis, E.; Semitekolou, M.; Morianos, I.; Sanitas, K.; Xanthou, G. NLRP3 põletikulise aktivatsiooni sihtimine raske astma korral. J. Clin. Med. 2019, 8, 1615.
16. Haque, MINA; Akther, M.; Jakaria, M.; Kim, IS; Azam, S.; Choi, DK Mikrogliaalse NLRP3 põletiku sihtimine ja selle roll Parkinsoni tõve korral. MOV. Häire. 2020, 35, 20–33.
17. Liu, L.; Dong, Y.; Jah, M.; Jin, S.; Yang, J.; Joosse, MINA; Sun, Y.; Zhang, J.; Lazarev, M.; Brant, SR; et al. NLRP3 põletikulise aktiveerimise patogeenne roll nii hiirte kui ka inimeste põletikulistes soolehaigustes. J. Crohni koliit 2017, 11, 737–750.
18. Danielski, LG; Giustina, AD; Bonfante, S.; Barichello, T.; Petronilho, F. NLRP3 põletik ja selle roll sepsise arengus. Põletik 2020, 43, 24–31.
19. Luo, YP; Jiang, L.; Kang, K.; Fei, DS; Meng, XL; Nan, CC; Pan, SH; Zhao, MR; Zhao, MY Hemin inhibeerib NLRP3 põletikulise aktivatsiooni sepsisest põhjustatud ägeda kopsukahjustuse korral, mis hõlmab heemi oksüdaasi-1. Int. Immunopharmacol. 2014, 20, 24–32.

20. Moon, JS; Lee, S.; Park, MA; Siempos, II; Haslip, M.; Lee, PJ; Yun, M.; Kim, CK; Howrylak, J.; Ryter, SW; et al. UCP2-indutseeritud rasvhapete süntaas soodustab NLRP3 põletikulise aktivatsiooni sepsise ajal. J. Clin. Uurige. 2015, 125, 665–680.

[PubMed]21. Gong, Z.; Zhou, J.; Li, H.; Gao, Y.; Xu, C.; Zhao, S.; Chen, Y.; Cai, W.; Wu, J. Kurkumiin pärsib NLRP3 põletikulist aktivatsiooni ja kaitseb LPS-i indutseeritud septilise šoki eest. Mol. Nutr. Food Res. 2015, 59, 2132–2142.
22. Wang, P.; Huang, J.; Li, Y.; Chang, R.; Wu, H.; Lin, J.; Huang, Z. Eksogeenne süsinikmonooksiid vähendab sepsisest põhjustatud ägedat neerukahjustust ja pärsib NLRP3 põletikulist aktivatsiooni rottidel. Int. J. Mol. Sci. 2015, 16, 20595–20608.
23. Kalbitz, M.; Fattahi, F.; Treiler, JJ; Jajou, L.; Malan, EA; Stone, FS; Huber-Lang, M.; Russell, MW; Ward, PA Komplemendi indutseeritud südame NLRP3 põletikulise aktiveerumine sepsise korral. FASEB J. 2016, 30, 3997–4006.
24. Bernard, GR; Vincent, JL; Laterre, PF; LaRosa, SP; Dhainaut, JF; Lopez-Rodriguez, A.; Steingrub, JS; Garber, GE; Helterbrand, JD; Ely, EW; et al. ja rekombinantne inimese valk CWEiSSsg. Inimese rekombinantse aktiveeritud valgu C efektiivsus ja ohutus raske sepsise korral. N. Ingl. J. Med. 2001, 344, 699–709.
25. Iba, T.; Thachil, J. Antikoagulantravi olevik ja tulevik, kasutades antitrombiini ja trombomoduliini sepsisega seotud dissemineeritud intravaskulaarse koagulatsiooni jaoks: Jaapani perspektiiv. Int. J. Hematol. 2016, 103, 253–261.
26. Cornelius, DC; Baik, CH; Travis, OK; valge, DL; Young, CM; Austin Pierce, W.; Shields, CA; Poudel, B.; Williams, JM NLRP3 põletikuline aktivatsioon trombotsüütides vastusena sepsisele. Physiol. Vabariik 2019, 7, e14073.
27. Cornelius, DC; Travis, OK; Tramel, RW; Borges-Rodriguez, M.; Baik, CH; Greer, M.; Giachelli, CA; Tardo, GA; Williams, JM NLRP3 põletiku inhibeerimine nõrgendab sepsisest põhjustatud trombotsüütide aktivatsiooni ja hoiab ära mitme organi vigastuse umbsoole ligeerimise punktsioonis. PLoS ONE 2020, 15, e0234039.
28. Asaduzzaman, M.; Lavasani, S.; Rahman, M.; Zhang, S.; Braun, OO; Jeppsson, B.; Thorlacius, H. Trombotsüüdid toetavad neutrofiilide kopsu värbamist kõhu sepsise korral. Crit. Care Med. 2009, 37, 1389–1396.
29. Schrier, RW; Wang, W. Äge neerupuudulikkus ja sepsis. N. Ingl. J. Med. 2004, 351, 159–169.
30. Vincent, JL; Yagushi, A.; Pradier, O. Trombotsüütide funktsioon sepsise korral. Crit. Care Med. 2002, 30, S313–S317.
31. Liverani, E.; Rico, MC; Tsygankov, AY; Kilpatrick, LE; Kunapuli, SP P2Y12 retseptor moduleerib sepsisest põhjustatud põletikku. Arter. Tromb. Vasc. Biol. 2016, 36, 961–971. [CrossRef]
32. Siner, JM; Bhandari, V.; Ingle, KM; Elias, JA; Siegel, MD Kõrgenenud seerumi angiopoetiini 2 taset seostatakse tõusuga
suremus sepsisesse. Šokk 2009, 31, 348–353.
33. Scherpereel, A.; Depontieu, F.; Grigoriu, B.; Cavestri, B.; Tsicopoulos, A.; Gentile, T.; Jourdain, M.; Pugin, J.; Tonnel, AB; Lassalle, P. Endocan, uus endoteeli marker inimese sepsises. Crit Care Med. 2006, 34, 532–537.
34. Valerio-Rojas, JC; Jaffer, IJ; Kor, DJ; Gajic, O.; Cartin-Ceba, R. Raske sepsise ja septilise šokiga patsientide tulemused kroonilise trombotsüütidevastase ravi korral: ajalooline kohortuuring. Crit. Care Res. Harjuta. 2013, 2013, 782573.
35. Pill, J.; Issaeva, O.; Wonderer, S.; Sadick, M.; Kranzlin, B.; Fiedler, F.; Klotzer, HM; Kramer, U.; Gretz, N. Fluorestseiiniga märgistatud sinistriini farmakoloogiline profiil ja toksilisus, uus marker GFR-i mõõtmiseks. Naunyn-Schmiedebergi kaar. Pharmacol. 2006, 373, 204–211.
36. Pill, J.; Kraenzlin, B.; Jander, J.; Sattelkau, T.; Sadick, M.; Kloetzer, HM; Deus, C.; Kraemer, U.; Gretz, N. Fluorestseiiniga märgistatud sinistriin kui glomerulaarfiltratsiooni kiiruse marker. Eur. J. Med. Chem. 2005, 40, 1056–1061.