Osa 2: DHHC21 puudulikkus nõrgendab neerufunktsiooni häireid septilise vigastuse ajal

Võtke ühendusttina.xiang@wecistanche.com

Arutelu

Käesolevas töös kirjeldame DHHC21 kui uudset neeruperfusiooni ja -funktsiooni regulaatorit septilise vigastuse ajal. Meie uued leiud näitavad: (1) Zdhhc21devde? hiirtel on pärast septilist vigastust parem neerufunktsioon ja väiksem neerukahjustus kui WT hiirtel;(2)DHHC21 funktsionaalne puudulikkus säilitab neerukoe perfusiooni, hapniku küllastumise ja RBF-i septilise vigastuse korral;(3)DHHC21-katalüüsitud alAR-palmitoüülimine on vajalik alAR-i signaaliraja aktiveerimiseks ja alAR-indutseeritud neeruarterite ahenemiseks. See uuring annab uue mehaanilise ülevaate neerude perfusiooni ja funktsiooni reguleerimisest septilise vigastuse ajal. Soovitame, et DHHC21 funktsionaalne puudulikkus avaldaks kaitsetneerufunktsioonseptilise vigastuse korral ja DHHC21 inhibeerimine võib olla terapeutiline strateegia selle vastu võitlemiseksneerufunktsiooni häireseptilise vigastuse ajal.

Cistanche tubulosa ekstrakti eeliste saamiseks klõpsake siin

Neerukoe hüpoperfusioon/hüpoksia on üks peamisi neerufunktsiooni häire põhjuseid septilise vigastuse ajal3-5. Avastasime hiirtel neerude hüpoperfusiooni pärast CLP-d, mida tõendas kogu hemoglobiini nõrgenenud MSOT-signaali intensiivsus, neerukoe hapnikuküllastuse vähenemine ja RBF vähenemine pärast septilist vigastust. Kooskõlas meie leidudega on RBF vähenemist täheldatud nii neerukahjustusega sepsisepatsientidel kui ka septilise vigastuse suurte loomade mudelitel 7,10l1. Väärib märkimist, et mitmed uuringud näitavad, et neerufunktsiooni häired võivad areneda sepsiseloomadel, kellel ei ole muutusi muutunud. või isegi suurenenud RBF334. Neid vastuolulisi leide võib seostada erinevate loommudelite ja verevoolu mõõtmiseks kasutatud meetoditega. Näiteks kuigi tavaliselt on kasutatud CLP-indutseeritud polümikroobset septilist kahjustust, kasutatakse mõnes uuringus Escherichia coli35 intravenoosset süstimist.

Valkude palmitoüülimist on hiljuti teatatud kui uudset valgu funktsiooni regulaatorit, mis osaleb paljude haiguste patogeneesis ja progresseerumises. Schmidt et al.3637 tuvastasid selle esmakordselt kui uut tüüpi translatsioonijärgset modifikatsiooni. DHHC perekonna avastamine on sellest ajast alates soodustanud selle välja kiiret laienemist38,39. Palmitoüülimise ja PAT-de rollidest on teatatud paljudes füsioloogilistes ja patoloogilistes seisundites, sealhulgas lipiidide metabolismis,vähk, südame-veresoonkonna haigusedja neuroloogilised häired23,0,4. Kuigi palmitoüülimise seotusest polütsüstilise neeruhaiguse ja neeruvähiga on varem teatatud23, on PAT-de funktsionaalset rolli uurides tehtud väga vähe uuringuid.neeruhaigused, eriti neerufunktsiooni häirete korral septilise vigastuse ajal. Meie teadmiste kohaselt oleme esimesed, kes uurivad DHHC2l rolli neerufunktsiooni häiretes septilise vigastuse korral. Meie tulemused näitavad, et DHHC21 inhibeerimine päästab suuresti neerufunktsiooni ja säilitab neerude struktuuri septilise vigastuse korral.

Meie uuring, milles kasutati Zdhhc21dp/d4? hiired näitavad, et DHHC21 funktsionaalse puudulikkuse kasulik mõju neerufunktsioonile on tingitud selle võimest parandada neerukoe perfusiooni septilise vigastuse ajal. Põhitingimustes ei ilmne Zdhhc21ewaeP hiirtel soola/vee tasakaaluhäire ega neerude struktuurse/funktsionaalse kahjustuse märke5. Kuid DHHC21 funktsiooni kadu pärsib septilise vigastuse põhjustatud RBF-i, neerude perfusiooni ja neerude hapnikuga küllastumise vähenemist. Neerude liigsest vasokonstriktsioonist põhjustatud suurenenud neerude veresoonte resistentsust peetakse neerukoe perfusiooni kahjustuse peamiseks põhjuseks septilise vigastuse korral6.9. Meie tulemused näitavad alAR-i osalust septilise vigastuse põhjustatud neerukoe hüpoperfusiooni vahendamises, mida tõendab alAR-i palmitoüülimise suurenemine ja alAR-i signaaliraja aktiveerimine septilise vigastuse korral. Kuid DHHC21 funktsionaalne puudulikkus pärsib alAR-palmitoüülimist ja põhjustab alAR-i nüri võimet aktiveerida oma allavoolu efektorit ja vahendada fenüülefriini poolt põhjustatud vasokonstriktsiooni neeruarterites.

"DHHC21 poolt alAR-i funktsiooni reguleerimise aluseks olev molekulaarne mehhanism on veel täielikult välja selgitamata. DHHC21 funktsiooni kadumisest põhjustatud alAR-funktsiooni defekti võib seostada alAR-i konformatsioonilise muutusega. Paljud GPCR-id tuginevad sobivaks palmitoüülimiseks. rakusisene konformatsioon, GPCR-ide C-otsa sabades olev palmitaat sisestatakse plasmamembraani, et luua neljas rakusisene silmus, mis on oluline GPCR-de interaktsiooniks nende partnervalkudega ja GPCR-signaalide levikuks17, 4. Eelmine uuring on näidanud, et Albari palmitoüülimine toimub ka selle C-terminaalses piirkonnas44. Seetõttu võib DHHC21-vahendatud lAR-i palmitoüülimise puudumine muuta alAR-i rakusisest konformatsiooni, blokeerides seega lAR-i signaalide levimise. Seda saab toetada meie tulemused näitavad, et alAR-i aktiveerimise allavoolu signaaliülekande ERK aktiveerimine on inhibeeritud Zdhhc21devider hiirtel, kellele tehti sept. ic vigastus. Kuid alAR-i karboksüülterminali DHHC{11}}reguleeritud topoloogiat tuleb röntgenkristallograafia abil täiendavalt kinnitada.

Veel üks meie uuringu uudne aspekt on MSOT-i kasutamine neerude perfusiooni ja funktsiooni hindamiseks septilise vigastuse ajal. MSOT-st on teatatud kui sildivaba meetodit erinevate organite perfusiooni mõõtmiseks ja usaldusväärse pilditehnikana neerufunktsiooni määramiseks2832,45. Võrreldes Doppleri voolumõõturiga, mis ei võimalda mikroveresoonte visualiseerimist45, genereerib MSOT suure ruumilise eraldusvõimega pilte 150 um juures, pakkudes samal ajal kvantitatiivset hinnangut neeru mikrovaskulatuuri perfusiooni olekule. Vees lahustuv IRDye800CW on ohutu märgistusaine neerukliirensi mõõtmiseks ja see ei põhjusta toksilisust juba 20 mg/kg annuse korral. IRDye800CW kahefaasiline liikumine, mida me täheldasime, on kooskõlas varem avaldatud uuringutega. Meie MSOT-salvestised näitavad sepsise neerude suuremat Tmax-i viivitust, mis viitab neerukliirensi kahjustusele. Nefropaatiauuring näitab, et MSOTis tuvastatud neerufunktsiooni kahjustus korreleerus oluliselt glomerulaarse histoloogilise kahjustusega30. Meie andmed, mis on kooskõlas varasemate väljaannetega, viitavad sellele, et MSOT on minimaalselt invasiivne ja usaldusväärne meetod neerude perfusiooni ja funktsiooni jälgimiseks.

Praegu pole DHHC{0}}spetsiifilisi inhibiitoreid saadaval. Kõige sagedamini kasutatav PAT-inhibiitor on 2-BP, millel on laialdane mõju mitmele DHHC-le ja mis häirib ka rasvhapete metabolismi47. Seega oleks paljulubav suund väikeste molekulidega inhibiitorite väljatöötamine, mis on suunatud spetsiifiliselt DHHC21-le. Samuti väärib märkimist, et alAR pole DHHC21 ainus substraat. Hiljuti on tuvastatud mitmeid teisi DHHC21 substraate, sealhulgas trombotsüütide endoteelirakkude adhesioonimolekul (PFCA M-1), östrogeeniretseptori kaveoliin-1, endoteeli lämmastikoksiidi süntaas (eNOS), Fyn, superoksiidi dismutaas (SOD{{). 8}}) ja PLCB122, 41, 4s, 49, kuigi väljaspool käesoleva uuringu ulatust, ei saa me välistada võimalust, et need substraadid võivad septilise vigastuse ajal mõjutada ka neerufunktsiooni.

Kokkuvõtteks võib öelda, et käesolev uuring näitab esimest korda, et DHHC21 mängib olulist rolli neerude perfusiooni reguleerimisel septilise vigastuse ajal mehhanismide kaudu, mis hõlmavad alAR palmitoüülimist ja alAR-vahendatud vasokonstriktsiooni. Lisaks avaldab DHHC21 inhibeerimine septilise vigastuse ajal neerufunktsiooni kaitsvat toimet.

materjalid ja meetodid

Reaktiivid. Kõik reaktiivid on loetletud täiendavas tabelis S1.

Loomad. Zdhhc21depher hiired ja nende metsikut tüüpi kontrollhiired (B6C3Fe) osteti ettevõttest Jackson Laboratory. Zdhhc21dephe genotüüp? hiired kinnitati sekveneerimisega (Genewiz, Inc., NJ, USA). Sekveneerimiseks kasutatud praimerid olid: AGCTGACTGAAGGGCACC (edasi) ja AAAACCTGTAACGCATTTCCA (tagurpidi)23. Loomi peeti 12/12-h valguse/pimeduse tsüklis ning neil oli vaba juurdepääs toidule ja veele. Selles uuringus kasutati mõlemast soost hiiri (16-20 nädalat). Kõik loomkatsed on heaks kiitnud Lõuna-Florida ülikooli institutsionaalne loomade hooldamise ja kasutamise komitee ning need vastavad NIH labori hooldamise ja kasutamise juhendile.

Umbsoole ligeerimine ja punktsioon. Hiired anesteseeriti isofluraaniga (3% induktsioon ja 1% hooldus). Raseeritud kõhupiirkonda tehti keskjoone sisselõige ja pimesool eemaldati, ligeeriti tihedalt 5 mm ileotsekaalklapi all ja perforeeriti kaks korda 20-mõõturnõelaga ligeerimispunktist distaalselt. Igast torkeavast pressiti välja 1 mm väljaheiteid. Seejärel asetati pimesool ümber ja kõht suleti kahes kihis. Umbsoole kuivamise vältimiseks manustati paikselt 37 C Ringeri laktaadilahust. Seejärel manustati hiirtele vedeliku elustamiseks subkutaanselt 37-kraadist 0,9% soolalahust. Valuvaigistamiseks anti operatsioonieelne annus 0.5-1,5 mg/kg Buprenorphine Sustained-Release'i. Näidishiirtele tehti sama kirurgiline protseduur, kuid ilma umbsoole ligeerimise ja punktsioonita50,51.

Multispektraalne optoakustiline tomograafia. IRDye800CW neerude kaudu eritumise hindamine. Hiired anesteseeriti isofluraani abil ja depileeriti torso piirkonnas. Hiirte kujutised tehti Altera Medical MSOT Imaging Systemiga (München, Saksamaa) mitmel lainepikkusel: 700,730,760,775,785, 800,850 nm kiirusega 10 kaadrit sekundis. Hiired asetati hoidikusse lamavasse asendisse ja liigutati mööda horisontaalset lineaarset staadiumi, et asetada neerud fikseeritud asetusega nõgusa muunduri peale. Pärast algtaseme registreerimist süstiti intravenoosselt 10 sekundi jooksul 60 nmol RDve800CW, mis oli lahustatud 100 ul 0,9% soolalahuses. Pildid rekonstrueeriti tagasiprojektsiooni valemi abil ja töödeldi multispektraalanalüüsiga. Huvipakkuvad piirkonnad (ROI) joonistati ümber neerukoore ja medulla/vaagna piirkonna ning kujutati MSOT-signaali ajalisi muutusi ROI-des.

Measurement of renal perfusion. Mice were prepared for MSOT imaging utilizing the same procedures mentioned above. Mouse respiration was closely monitored throughout the entire procedure. Images were reconstructed and spectral unmixing was performed. ROIs were drawn around the entire right kidney region. Mean pixel intensities of oxygenated hemoglobin (HbO,) and deoxygenated hemoglobin (Hb) were acquired. Total hemoglobin (HbT=HbO,+ Hb) and oxygen saturation (So=HbO, /HbT) were then calculated>2.

Neeru histopatoloogia. Neerud fikseeriti, lõigati mööda sagitaaltasandit ja töödeldi parafiini kinnistamiseks. Sektsioonid (5 μm) deparafineeriti, rehüdreeriti ja oksüdeeriti perioodilise happega 8 minutit toatemperatuuril (RT), millele järgnes inkubeerimine Schiffi lahusega 25 minutit. Seejärel värviti lõigud hematoksüliiniga. Pildid jäädvustati Keyence BZ-X710 (Itasca, IL, USA) abil. Neerude struktuurset kahjustust hinnati järgmiste tunnuste põhjal: glomerulaarne anomaalia, proksimaalse tuubuli harja piiri kadumine, vakuolatsioon, tuubuli epiteeli laienemine, torurakkude eraldumine/nekroos ja neutrofiilide infiltratsioon. Iga funktsiooni hinnati raskusastme alusel skaalal 0-5.

Kreatiniini ja vere uurea lämmastiku mõõtmine. Hiire veri koguti südame punktsiooniga 24 tundi pärast septilist vigastust. Plasma genereeriti, tsentrifuugides verd 2500 g juures 15 minutit toatemperatuuril. Kreatiniini mõõtmine: plasma deproteiniseeriti, kasutades 10-kDa spin kolonni; seejärel mõõdeti kreatiniini taset filtraadis Creatinine Assay Kit abil. Vere uurea lämmastiku (BUN) tase määrati uurea lämmastiku kolorimeetrilise tuvastamise komplekti abil, järgides tootja juhiseid.

RBF ja MAP mõõtmine. Hiired anesteseeriti isofluraani abil. Vererõhuandur kanüüliti unearterisse. Kõhupiirkonda tehti keskjoone sisselõige, millele järgnes vasakpoolne põiki sisselõige, et paljastada neeruarter. RBF-i mõõdeti ultraheli transiidiaja voolumõõturiga (TS-420; Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA). Pärast voolusondi asetamist avatud neeruarteri ümber lasti hiirtel stabiliseerida vähemalt 30 minutit. RBF ja MAP salvestati samaaegselt, kasutades PowerLabi (AD Instruments, Colorado Springs, CO, USA). Andmeid analüüsiti tarkvara LabChart Pro versiooni 7 abil4,55

Vaigu abil püüdmine. Neeruarterid koguti ja lüüsiti lüüsipuhvris (100 mM HEPES.25 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 μM palmostatiin B, proteaasi inhibiitorid, pH 7,4）22, 56. Koelüsaate inkubeeriti blokeeriva puhvriga (100 mM HEPES.1 mM EDTA, 2,5% SDS, 6 ul/ml MMTS, pH 7,4) 50 °C juures 30 minutit pideva keerisega segades. Pärast külma atsetooniga sadestamist valke sadestati tsentrifuugimisega 5000 g juures 30 minutit ja pesti viis korda 70% külma atsetooniga Valgupelletid resuspendeeriti sidumispuhvris (100 mM HEPES, 1,0% SDS, 1 mM EDTA, pH 7,4).Valgu kontsentratsioon määrati ja normaliseeriti rühmade vahel. . Iga valguproov jagati kaheks võrdseks osaks, millest igaüks sai sama koguse isopropüülsefaroosi 6B helmeid, igasse ossa lisati vastavalt hüdroksvamiini (0,2 M, pH 7,4) ja NaCl (0,2 M). Pärast 4-tunnist inkubeerimist toatemperatuuril pideva pöörlemise korral elueeriti palmitoüülitud valgud 50 mM DTT-ga 1 × proovipuhvris ja koguti SDS-PAGE jaoks.

Western blotting. Palmitoüülitud lAR mõõtmine. RAC-st kogutud proovid laaditi 4-20 protsendilisele Tris-Glycine geelile ja kanti pärast elektroforeesi nitrotselluloosmembraanile. Pärast 1-tunnist blokeerimist toatemperatuuril sondeeriti alAR-i küüliku anti-lAR primaarse antikehaga (1:500) üleöö temperatuuril 4 °C. Pärast kolmekordset pesemist TBST-ga inkubeeriti membraani IRDye800CW eesli küülikuvastase sekundaarse antikehaga (1:20, 000) 45 minutit toatemperatuuril.

ERK fosforüülimise mõõtmine. Neeruarterid lüüsiti proteaasi ja fosfataasi inhibiitoreid sisaldavas 1 × RIPA-s. Membraan sondeeriti küüliku anti-ERK (1:1000) ja hiire anti-fosforüülitud ERK (1:1000) antikehadega. Sekundaarseks inkubeerimiseks kasutati eesli hiirevastaseid IRDye800CW ja küülikuvastaseid eesli IRDye680RD antikehi (1:20 000). Membraanid pildistati ja analüüsiti Li-COR Odyssey CLx abil.

Vasoreaktiivsuse hindamine traatmüograafi abil. Hiire neeruarterid. Neeruarterid (läbimõõduga {{0}} μm) isoleeriti WT ja Zdhhc21dp/de hiirtelt ning sukeldati jääkülma hapnikuga varustatud (95% O/5% CO) füsioloogilisesse soolalahusesse (PSS,13{). {47}} mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,18 mM KH, PO, 1,17 mM MgSO.7H,O, 14,9 mM NaHCO, 5,5 mM glükoosi, 0,026 mM EDTA ja 1,6 mM CaCl, pH 7,4 (V-segment). 2 mm pikkused) paigaldati traatmüograafi kambrile (Living Systems Instrumentation, VT, USA) kahe volframtraadi (läbimõõt 30 um) vahele. Isomeetriline pinge registreeriti Living Systemsi signaali konditsioneeri (MYO-SC-1) abil koos LabScribe v4 iWorksi tarkvaraga. Pärast 30-minutilist tasakaalustamist 37 kraadi Cin PSS juures viidi läbi normaliseerimisprotseduur, et määrata optimaalne siseümbermõõt L, =0,9 × L(Lo=sisemine ümbermõõt, mis vastab transmuraalsele rõhule 100 mmHg) . Järgmisena testiti anuma elujõulisust 60 mMKSS-iga (74,7 mM NaCl, 60 mM KCl, 1,18 mM KH, PO,1,17 mM MgSO.7H, O, 14,9 mM NaHCO, 5,5 mM glükoosi, 0,026 mM EDTA, 1,6 pHM). 7.4).Arterid, mis KPSS-ile ei reageerinud, visati kõrvale. Artereid töödeldi fenüülefriini suurenevate kontsentratsioonidega (10 nM{55}} μM). Seejärel hinnati endoteeli terviklikkust, kasutades atsetüülkoliini (10 μM). Kontsentratsiooni-vastuse kõverad koostati.

Väikesed arterid inimese neerudest. Inimese tervetest elujõulistest neerudest lõigati välja väikesed arterid (läbimõõt ~1000 um), mis lükati siirdamisoperatsiooni jaoks tagasi. Anuma segmendid (pikkusega ~ 2 mm) paigaldati traadi müograafikambri I-varrastele (läbimõõt 250 um). Sarnased tasakaalustamis- ja normaliseerimisprotseduurid viidi läbi ka inimese arteritega. Järgmisena inkubeeriti artereid vehiikli kontrolliga (0,02 protsenti DMSO-d PSS-s) 1 tund. Seejärel testiti anumate elujõulisust 60 mM KPSS-iga ja töödeldi kasvavate kontsentratsioonidega fenüülefriiniga (10 nM{9}} uM). Pärast mahapesemist inkubeeriti veresooni 1 tund 2-BP-ga (100 uM); veresoone elujõulisust testiti seejärel uuesti 60 mM KPSS-iga 100 uM 2-BP-ga. Väikesed arterid, mille vastus KPSS-ile puudus või vähenes, jäeti kõrvale. Artereid nakatati seejärel samade kontsentratsioonidega fenüülefriini ja seejärel atsetüülkoliiniga (10 uM). Kontsentratsiooni-vastuse kõverad vehiikuliga kontrollitud või 2-BP-ga töödeldud arteritest koostati ja võrreldi.

Immunofluorestsents. Inimese neeruarterid fikseeriti 10 protsendilises formaliinis 48 tunniks, parafiiniga ja lõigati. Seejärel slaidid deparafiiniti, rehüdreeriti ja permeabiliseeriti PBS-iga, mis sisaldas 0,05 protsenti Triton X-1002. Pärast blokeerimist märgistati slaidid küüliku anti-DHHC21 ja kitse anti-lAR antikehadega (1:100) üleöö temperatuuril 4 °C. Pärast pesemist inkubeeriti sekundaarseid antikehasid eesli küülikuvastase Alexa Fluor 488 ja eesli anti-lAR-i Alexaga. Fluor 568 (1:500). Pärast paigaldamist ProLong Diamond paigaldusmeediumiga DAPI-ga pildistati slaidid Leica SP8 spektraalse inverteeritud laserskaneeriva konfokaalse mikroskoobiga.

Statistiline analüüs. Üksikasjalik teave (nt testi nimi, post-hoc test, n väärtus, alfa tase, p-väärtus) iga statistilise testi kohta on loetletud täiendavas tabelis S2. Kõik andmed vastavad normaaljaotuse eeldusele. Normaalsuse test viidi läbi Shapiro-Wilki testi abil, mille alfa tase oli 0.05. Kahe rühma võrdlusi analüüsiti Studenti t-testiga (kahe sabaga) ja kolme või enamat rühma võrreldi ühesuunalise ANOVA abil Tukey post-hoc analüüsiga. Traadi müograafi kõverate võrdlus viidi läbi, kasutades kahesuunalist ANOVA.p<0.05 was="" used="" for="" statistical="" significance.="" all="" statistical="" analyses="" were="" performed="" using="" graphpad="" prism="" 7.0d="" (san="" diego,="" ca,="" usa).="" the="" actual="" values="" for="" all="" quantification="" results="" are="" listed="" in="" supplementary="" table="">