1. osa: neerukahjustuse molekul-1 on SARS-CoV potentsiaalne retseptor-2

Lisateabe saamiseks. kontaktitina.xiang@wecistanche.com

COVID{0}} patsientidel esineb kõrge esinemissagedusneerudkõrvalekalded, mis on seotud halva prognoosi ja suremusega. SARS-CoV-2 tuvastamine neerudesCOVID-19patsientidel viitab SARS-CoV-2 neerutropismile. Siiski jääb ebaselgeks, kas SARS-CoV-2 konkreetne sihtmärk neerus on. Siin kasutatakse in silico simulatsiooni, koimmunosadest, fluorestsentsresonantsi energiaülekannet, fluorestseiini isotiotsüanaadi märgistamist ja antagonistpeptiidide ratsionaalset disaini. demonstreerime, et neerukahjustuse molekul -1(KIM1), neerukahjustuse korral oluliselt ülesreguleeritud molekul, seondub SARS-CoV-2 retseptorit siduva domeeniga (RBD) ja hõlbustab selle kinnitumist rakumembraaniga , kus KIM1 immunoglobuliini muutuv lg-sarnane (lg V) domeen mängib selles äratundmises võtmerolli. SARS-CoV{12}} RBD ja KIM1 vahelist koostoimet blokeerib tõhusalt ratsionaalselt kavandatud KIM{14}}tuletatud polüpeptiid AP2. Lisaks viitavad meie tulemused ka interaktsioonidele KIM1 lg V domeeni ja SARS-CoV ja MERS-CoV, kahe raske hingamisteede nakkushaiguse patogeenide RBD vahel. Need leiud näitavad, et KIM1 on SARS-CoV-2 ja teiste koronaviiruste uus retseptor. Teeme ettepaneku, et KIM1 võib seega vahendada ja süvendada SARS-CoV-2 neeruinfektsiooni nõiaringis ning KIM1-d võiks terapeutilise sihtmärgina edasi uurida.

Märksõnad: SARS-CoV-2, COVID-19, neeruhaigused, neerukahjustuse molekul-1, koroonaviirus

Palun klõpsake siin, et teada saada, et tsistanche parandab neerufunktsiooni

Sissejuhatus

Maailma Terviseorganisatsioon on kuulutanud koroonaviiruse 2019. aasta (COVID-19) pandeemiaks (Guan et al., 2020).Raske ägeda respiratoorse sündroomi koroonaviirus 2(SARS-CoV-2), COVID-19 patogeen, kuulub beeta-koronaviiruse perekonda, kuhu kuuluvad ka SARS-CoV ja Lähis-Ida respiratoorse sündroomi koronaviirus (MERS-CoV) (Shahrajabian et al. ,2021). SARS-CoV-2, SARS-CoV ja MERS-CoV on peamiselt suunatud hingamisteede süsteemidele, mis avalduvad peamiselt hingamisteede haigustena (Shahrajabian et al., 2021). Nimelt viitasid teated nakatunud patsientide neerukahjustuse kohta, samuti viirusinfektsiooni tuvastamine neerudes, et need koroonaviirused võivad neerusid otseselt nakatada (Ding et al., 2004; Eckerle et al., 2013; Braun et al., 2020; Su et al., 2020).

Neerukahjustus haiglaravil viibivatel COVID{0}} patsientidel on tavaline ning meie ja teised oleme teatanud selle seostest raske põletiku, halva kliinilise edenemise ja kõrge haiglasisese suremusega (Chen et al., 2020; Hirsch et al., 2020; Pei et al., 2020; Yang jt, 2020). Ägeda haiguse kõrge esinemissagedusneerukahjustus(COVID-19-ga patsientide seas on täheldatud AKI-d (56,9 protsenti) (Fisher et al., 2020). Oluline on see, et nakkusliku SARS-CoV-2 esinemine neerudes on kinnitatud, eriti neeru epiteelirakud ja surmajärgne uuring viitas SARS-CoV-2 neerutropismile, mis tuvastati 72 protsendil AKI-ga COVID{9}} patsientidest neerudes (Braun et al, 2020). COVID{11}}-patsientidel mitme elundiga ilmingud, välja arvatud kopsud, on neerud viiruse suhtes väga haavatavad janeerufunktsiooni häiredon tihedalt seotud kõrge suremusega, kusjuures nende aluseks olevad molekulaarsed mehhanismid jäävad ebaselgeks.

SARS-CoV-2 invasioon saab alguse rakumembraani retseptoritega seondumisest selle piigivalgu kaudu (Shahrajabian et al, 2021). Praegu on neerudes rikastatud angiotensiini konverteeriv ensüüm 2 (ACE2), mis on samuti sihtmärk.

SARS-CoV on ainus hästi äratuntav SARS-CoV-2 retseptor (Shang et al, 2020). Retseptori äratundmise eest vastutav SARS-CoV-2 spike-valk (SARS-CoV-2-S) koosneb alaühikutest S1 ja S2 (joonis 1A) ning S1 retseptorit siduv domeen (RBD) seob ACE2 algatada S2 sulandumist rakumembraaniga ja sellele järgnevat rakku sisenemist (Shang et al., 2020). Hiljuti täheldati SARS-CoV{19}}-ga nakatunud kopsudes ja neerudes ACE2 valgu taseme langust (Nie et al., 2021); seetõttu ei tundu SARS-CoV-2 neerutropism ja sellega seotud neerukahjustus tõenäoliselt seotud ACE2 tasemega. Lisaks teatasime hiljuti, et ACE2 inhibiitorite manustamine ei näidanud seost COVID-i kliiniliste tulemustega{25 }} patsienti (Chen et al., 2020). Arvestades, et viirusrakku sisenemine võib hõlmata mitut transmembraanset retseptorit (Lan et al., 2020), oletame, et SARS-CoV -2 neeruinfektsiooni võivad vahendada täiendavad retseptorid.

Neerukahjustuse molekul{0}}(KIM1) ekspresseerub peamiselt neerudes ja on vigastuse korral drastiliselt ülesreguleeritud vigastatud neeru proksimaalses tuubulis ning mängib olulist rollipõletikinfiltratsioon ja immuunvastused (Rong et al., 2011). Struktuuriliselt koosneb KIM1 immunoglobuliini muutuvast lg-sarnasest (g V) domeenist, mutsiini domeenist, transmembraansest domeenist ja tsütosoolsest domeenist. Nende hulgas on lg V domeen vajalik viiruse sidumiseks ja sisestamiseks, näiteks Ebola ja Dengue viiruste sisenemiseks (Yuan et al., 2015; Dejarnac et al., 2018). Siin uurisime, kas KIM1 on SARS-CoV-2 siduv sihtmärk, mis vahendab selle neeruinvasiooni.

Tulemused

KIM1 ja ACE2 ekspressiooniprofiilid inimese kudedes

Kudedes KIM1 ja ACE2 rikastumise selgitamiseks koguti inimese valgu atlase koeatlase transkriptoomi- ja histoloogiapõhised valguekspressiooni andmed. KIM1 ja ACE mRNA ja valgu arvukusega seotud kümme peamist probleemi on loetletud lisajoonisel S1A-F. Nimelt ekspresseerusid KIM1 ja ACE2 koos neerudes, käärsooles, pärasooles, munandis ja sapipõies (täiendav joonis S1C ja F), mis kõik kuuluvad SARS-CoV sihtorganite hulka{11}}(Cha et al., 2020) , mis viitab KIM1 tihedale korrelatsioonile COVID{14}} ilmingutega.

Molekulaarsed dokkimised näitavad SARS-CoV-2-RBD ja KIM1 lg V vastastikmõju

SARS-CoV-RBD ja SARS-CoV-2-RBD primaarsetel järjestustel on suur sarnasus (62,93 protsenti), kusjuures 9 14-st ACE2-kontaktis olevast jäägist on mõlemas RBD-s konserveerunud (joonis 1B). Võrdluseks on MERS-CoV-RBD, mis tunneb ära DPP4 (Li et al, 2020c), madal sarnasus SARS-CoV-RBD ja SARS-CoV-2-RBD-ga (17,07 protsenti ja 14.{21}} protsenti; joonis 1B).

Kim1 on isheemia-reperfusiooni (I / R) või tsisplatiiniga vigastatud hiirte neerudes drastiliselt ülesreguleeritud, samas kui Ace2-s täheldati ainult kergeid muutusi (joonis 1C). KIM1 neljast domeenist (joonis 1D ja E) vastutab lg V domeen viiruse sidumise eest (Yuan et al, 2015; Dejarnac jt, 2018) ja seega viidi läbi molekulaarne dünaamiline dokkimine, et uurida selle seondumist SARS-CoV-ga {11}}RBD.

SARS-CoV-2-RBD ja KIM1 lg V kompleksi dokkimise ja struktuuriteave on esitatud SARS-CoV-2-RBD kontakti lisajoonistel S1G-I ja S2.Phe338, Val367, Ser371, Phe374 ja Trp436 KIM1 lg V (joonis 2A) Leu54, Phe55, Gln58, Trp112 ja Phe113 (joonis 2A) ning annavad kombineeritud sidumisvaba energia -35,64 kcal/mol (tabel 1; lisatabel S1), mis on sellest madalam SARS CoV-2-RBD ja ACE2 (-50,60 kcal/mol), kuid võrreldav SARS-CoV-RBD ja ACE2 (-38.3 kcal/mol) omaga (Li et al. ,2020c). Kuna ACE2 on tunnistatud SARS-CoV-RBD võtmeretseptoriks (Li et al, 2020c), soovitatakse SARS-CoV -2-RBD ja KIM1 vahelist tugevat koostoimet (tabel 1; täiendav tabel S1). Nimelt viitavad meie andmetel näidatud SARS-CoV-2-RBD erinevad seondumispiirkonnad KIM1 ja ACE2-ga sellele, et KIM1 ja ACE2 võivad sünergistlikult vahendada SARS-CoV-2 invasiooni (joonis 2B).

Kliiniliselt on tuvastatud SARS-CoV-2-S mutatsioonid (täiendav joonis S3 ja tabel S2) ning COVID-19 juhtumid, mis kannavad SARS-CoV-2-S V367F mutatsiooni, mis kontakteeruvad KIM1-ga , on teatatud, kokkuvõtlikult esitatud lisajoonistel S3B ja O (Mercatelli et al., 2020). Molekulaarmehaanika üldistatud sündinud pinnaala (MM-GBSA) analüüs viitab sellele, et V367F mutatsioon suurendab KIM1-ga seondumist (täiendav tabel S1), mis võib olla seotud kliiniliste leidudega, et V367F suurendab SARS-CoV nakkavust-2( Li et al., 2020a; Starr jt, 2020); nende kliiniliste mutatsioonide edasised uuringud on olulised.

SARS-CoV-RBD ja SARS-CoV-2-RBD sihivad KIM1-s sama sidumistaskut

Mikrokiibi andmed näitasid SARS-i patsientidelt pärinevate perifeerse vere mononukleaarsete rakkude Kim1 ekspressiooni suurenemist võrreldes tervete kontrollidega (GSE1739, täiendav joonis S4A; Raghunathan et al., 2005). Arvestades asjaolu, et SARS-CoV-RBD ja SARS-CoV-2-RBD tungivad mõlemad neerudesse (Ding et al., 2004; Braun et al., 2020) ja neil on suur homoloogia (joonis 1B), hindasime seondumist SARS-CoV-RBD potentsiaal koos KIM1-ga (täiendavad joonised S4 ja S5). Jagades KIM1-s sama sidumistaskut (joonisel 2C näidatud kontaktpind), seondub SARS-CoV-RBD KIM1 lg V-ga kombineeritud vaba energiaga -21,59 kcal/mol (täiendavad tabelid S1 ja S3), mis viitab sellele, et suhteliselt madalam afiinsus KIM1 suhtes kui SARS-CoV-2-RBD (-35,64 kcal/mol), samas kui MERS-COV-RBD ja lg V vahel leiti isegi nõrk interaktsioon ({{33). }},12 kcal/mol, lisatabel S1). Seetõttu näitas SARS-CoV-2-RBD suurimat seondumisafiinsust KIM1 suhtes; pealegi jagavad SARS-CoV-RBD ja SARS-CoV-2-RBD lg V domeenil sama sidumistaskut (joonis 2C.

SARS-CoV-2-RBD ja KIM1 Ig V rakusisene interaktsioon

SARS-CoV-2-RBD ja KIM1 vahelise seose kinnitamiseks viidi läbi endogeensed ja eksogeensed koimmunosadestamise (co-IP) testid (joonis 3A–D; täiendav joonis S6A). Eksogeensed viirusvalgud (lipuga märgistatud SARS-CoV-2-S või SARS-CoV-2-RBD) immunosadestati inimese neeru tubulaarsete epiteelirakkude liini HK-2 ja HEK293T rakulüsaatide KIM1-ga. rakud, mis transfekteeriti vastavate plasmiididega (joonis 3B; täiendav joonis S6A), mis näitab KIM1 ja SARS-CoV-2-RBD otsest seondumist. Sarnased tulemused saadi ka fluorestsentsresonantsi energiaülekandega (FRED-põhine test (Karpova ja McNally, 2006), kasutades KIM1-tsüaani fluorestsentsvalku (CFP) ja SARS-CoV-2-RBD-kollast fluorestsentsvalku ( YFP) (joonis 3F-). Konjugeerimata CFP ja YFP kotransfekteeriti negatiivse kontrollina (joonis 3E, F ja ) ning KIM{29}}CFP ja selle ligandi TIM4-YFP vaheline interaktsioon ilmnes samuti kaasatud positiivse kontrollina (joonis 3E, G ja ). Fluorestsentsspektrofotomeetria ja konfokaalse mikroskoopia abil tuvastati KIM{32}}CFP ja SARS-CoV-2-RBD-YFPin HEK293T rakkude kotransfektsiooni tulemuseks tugev FRET-signaal (joonis 3E ja H), mis näitab rakusisest koostoimet KIM1 ja SARS-CoV-2-RBD vahel.

Kuna KIM lg V on viiruse retseptoriga seondumise vahendamisel ülioluline (Yuan et al., 2015; Niu et al., 2018), plasmiidid, mis üleekspresseerivad täispikka KIM1, KIM1 lg V domeeni või kärbitud KIM1 ilma lg V domeenita (Alg V ) kotransfekteeriti vastavalt SARS-CoV-2-RBD-ga stabiilseks KIM1 knockout HK-2 rakuliiniks või HEK293T rakkudeks (joonis 3C ja D; täiendav joonis S6B ja C). KIM1 väljatõrjumine või lg V domeeni kustutamine kaotas seose KIM1 ja SARS-CoV{16}}RBD vahel (joonis 3C ja D). KIM1lg V ja SARS-CoV{20}}RBD vahelist koostoimet kontrolliti ka FRET-põhiste testidega ja

KIM1 △lg V-CFP ja SARS-CoV-2-RBD-YFP-ga kotransfekteeritud rakkudes täheldati ilmset FRET signaali (joonis 3I ja ). Need tulemused koos viitavad sellele, et lg V domeen on KIM1 ja SARS-CoV vahelise interaktsiooni vahendamisel otsustava tähtsusega{8}}.

KIM1 vahendab SARS-CoV-2-RBD rakkude kinnitumist

Järgmisena kasutasime fluorestseiini isotiotsüanaadi (FITC) märgistamist, et jälgida SARS-CoV-2-RBD-d inimese rakkudes. Iga näidatud rühma puhul kaasati hindamisse vähemalt 100 rakku viiest väljast suure võimsusega objektiivi all. Märkasime FITC-SARS-CoV-2-RBD vähem seondumissignaali inimese neerurakkude pinnal, kui KIM1 oli välja kukkunud, samas kui intensiivsemat signaali, kui KIM1 oli üleekspresseeritud (joonis 4A ja B). KIM1 knockout HK-2 rakkudes päästsid täispika KIM1 taastamine ja lg V üleekspresseerimine mõlemad SARS-CoV-2-RBD seondumissignaalid raku pinnal (joonis 4A), mis näitab KIM1 tähtsust. Ig V viiruse kinnitumise vahendamisel. Lisaks nõrgendas KIM1 väljatõrjumine SARS-CoV-2-RBD (täiendav joonis S6D) poolt indutseeritud tsütotoksilisust. Need tulemused koos kinnitavad veelgi lg V domeeni olulist rolli SARS-CoV-2 neerurakkudega seondumise vahendamisel.

KIM{0}}tuletatud peptiid blokeerib SARS-CoV-2-RBD rakkude kinnitumist

Konkurentsivõimeliseks sidumiseks SARS-CoV-2-RBD-ga ja selle interaktsiooni KIM1-ga pärssimiseks kavandasime ratsionaalselt kaks antagonistpeptiidi, mis põhinevad KIM1-s SARS-CoV-2-kontakteeruvatel motiividel (motiiv 1: Leu54, Phe55, Gln58; motiiv 2: Trp112, Phe113; joonis 5A). Peptiid 1 (AP1) jäljendab motiivi 1, samas kui peptiid 2 (AP2) katab mõlemat motiivi, painduva linkerina kasutatakse kolme glütsiini (joonis 5A). Seondumisvaba energia, mis näitab peptiidide ja SARS-CoV-2-RBD vahelist seondumist, on esitatud täiendavas tabelis S1. Mõlemal peptiidil ei ilmnenud selget tsütotoksilisust ja AP2 vähendas SARS-CoV-2-RBD kinnitumist rakupinnale ja kaitses selle tsütotoksilisuse eest (joonis 5B-D). Veelgi enam, AP2 pärssis märkimisväärselt KIM1 ja SARS-CoV-2-RBD vahelist koostoimet, mida näitab FRET-signaal KIM1 ja SARS-CoV-2-RBD vahel pärast AP2-ravi (joonis 5E ja F). AP2 järjestuste või modifikatsioonide optimeerimise teel hiljuti kirjeldatud lähenemisviiside abil saavutatakse tõhustatud SARS-CoV{38}}RBD seondumine ja pikenenud poolestusaeg (Wang et al, 2020). Kuna KIM1 kaitseb AKI eest (Yang et al., 2015), ei mõjuta meie strateegia tõenäoliselt KIM1 kasulikke mõjusid in vivo.

Koroonaviirus on suunatud inimestele: madala immuunsusega inimestele

Inimesed, kellel on nõrk immuunsus: seedetrakti haigused, külmetushaigused, tuul ja külm

Alatervislik populatsioon: nõrk konstitutsioon, alatoitumus, väsimus, isutus, unehäired jne.

Inimesed, kes kasutavad antibiootikume üle: põhjustavad immuunsüsteemi talitlushäireid ja korduvaid infektsioone, lapsed, eakad, immuunpuudulikkusega inimesed, nõrgenenud immuunsuse ilmingud

Immuunsus on organismi enda kaitsemehhanism ja see on organismi võime ära tunda ja kõrvaldada igasugune võõrkeha (viirused, bakterid jne). Kaasaegne immunoloogia usub, et immuunsus on inimkeha füsioloogiline reaktsioon "teiste" tuvastamiseks ja välistamiseks. Madal immuunsus on enamiku haiguste invasioonide algpõhjus.

Kui organismi immuunfunktsioon on düsfunktsionaalne, korduvad külmetushaigused, tonsilliit, astma, bronhiit, kopsupõletik, kõhulahtisus, allergiad ja muud haigused korduvalt ning mitmesugused viirused võivad kergesti rünnata ning põhjustada isegi terve rea kasvajaid ja vähkkasvajaid. , seega ei tohi seda alahinnata. Madal immuunsus.

Cistanche on üks "üheksast suurest surematust ürdist Hiinas". See toniseerib neeru yangi, toidab essentsi ja verd, toidab viit siseorganit, turgutab keskosa ja toidab qi-d ning ravib viit tüve ja seitset vigastust. See on Hiinas kõige sagedamini kasutatav toonikuaare.Cistanchekuulub väärtuslike ravimmaterjalide hulka, mis võivad stimuleerida hüpofüüsi ja neerupealiste koort või omada hormoonitaolist toimet, mis sarnaneb neerupealise koorega ja reguleerib organismi immuunfunktsiooni. Polüsahhariidide sisaldus selle ekstraktiliikides on suhteliselt kõrge ning polüsahhariidkomponentide immuunsüsteemi tugevdav toime on Cistanche deserticola tugevas ja toniseerivas toimes. võib mängida olulist rolli.

Cistanche deserticola ehhinakosiid ja verbaskosiid ei oma mitte ainult kaitsvat toimet ravimite ja kiirguse põhjustatud immuunorganikahjustustele, vaid võivad suurendada ka keha kaitsevõimet. Echinacea ja verbaskosiid võivad suurendada lümfotsüütide transformatsiooni in vivo ja in vitro ning võivad suurendada looduslike tapjarakkude tsütotoksilist aktiivsust.

Cistanche'il on palju funktsioone, näiteks täiustaminepuutumatus, kasvajavastaneainete metabolismi reguleerimine ja keha kohanemisvõime suurendamine.