1. osa: geraniool leevendab doksorubitsiini poolt vahendatud neerukahjustusi, muutes antioksüdantide seisundit, põletikku ja apoptoosi: NF-kB ja Nrf2/Ho võimalikud rollid-1

Lisateabe saamiseks. kontaktitina.xiang@wecistanche.com

Abstraktne: doksorubitsiini vahendatudneerukahjustuson tõsine probleem vähiravis. Sellest tulenevalt uuriti selles töös geraniooli võimet moduleerida doksorubitsiini poolt indutseeritudneerukahjustuskasutades rotimudelit. Rotid jaotati juhuslikult nelja rühma: kontrollrühmad, doksorubitsiin (20 mg/kg, intraperitoneaalne, ip), doksorubitsiin pluss 100 mg/kg geraniooli ja doksorubitsiin pluss 200 mg/kg geraniooli. Üksik doksorubitsiini süst kutsus esile neerukahjustuse, mida tõendavad muutunud seerumi kreatiniini, vere uurea lämmastiku ja albumiini väärtused; see põhjustas ka histoloogilisi muutusi neerude arhitektuuris. Lisaks suurendas doksorubitsiin lipiidide peroksüdatsiooni, vähendades samal ajal glutatiooni, katalaasi aktiivsust ning glutatioonperoksidaasi ja superoksiidi dismutaasi ekspressiooni. Huvitav on see, et eeltöötlemine geraniooliga päästis doksorubitsiini põhjustatud muutused neerude antioksüdantide parameetrites, ensümaatilises aktiivsuses ning põletikuliste ja apoptoosi vahendavate geenide ja valkude ekspressioonis. Veelgi enam, profülaktiline ravi geraniooliga säilitas enamiku neerude histoloogilistest omadustest annusest sõltuval viisil. Need leiud kinnitavad, et geraniool võib kaitsta doksorubitsiini poolt vahendatud eestneerufunktsiooni häired. Siiski on vaja täiendavaid uuringuid, et selgitada geraniooli kaitsva toime mehhanisme doksorubitsiini poolt vahendatud neerufunktsiooni häirete vastu.

Märksõnad: doksorubitsiin; põletik; oksüdatiivne stress; apoptoos; neerukahjustus; geraniool

1. Sissejuhatus

Antratsükliini vähivastast ravimit doksorubitsiini (Dox) on selle avastamisest alates laialdaselt kasutatud tahkete kasvajate ja hematoloogiliste pahaloomuliste kasvajate vastu. Selle kõige sagedasemate kõrvalnähtude hulgas on nefrotoksilisus, mida kirjeldatakse kui neerufunktsiooni häireid koos vähenenud filtreerimise, reabsorptsiooni ja eritumisega, mis on seotud olulise haigestumuse ja suremuse riskiga. Umbes 60 protsendil keemiaravi saavatest vähipatsientidest tekib nefrotoksilisus, mis piirab Doxi terapeutilist efektiivsust[5,6]. Kuigi põhilised protsessid, mis põhjustavad Doxi-vahendatud nefrotoksilisust, jäävad teadmata, viitab kirjandus, et tõenäolisteks kaasaaitajateks onoksüdatiivne stress, põletikjaapoptoos. Eelkõige näitavad tõendid, et Doxiga seotud vähenemineoksüdatiivne stress, põletikja apoptootilised sündmused võivad aidata vähendada ravimi neerutoksilisust.

Tuumafaktor (erütroidist tuletatud 2) sarnane 2 (Nrf2) on redoks-tundlik transkriptsioonifaktor, millel on antioksüdantsed, põletikuvastased ja tsütoprotektiivsed võimed, mis toetavad raku kaitsesüsteeme. Oksüdatiivse stressi korral vabastab Nrf2 oma tsütoplasma inhibiitori valgu, mis siseneb tuuma ja aktiveerib mitmeid antioksüdantide kaitses osalevaid geene, nagu heemi oksügenaas-1(Ho-1), glutatioonperoksüdaas (GPx), katalaas( CAT) ja superoksiiddismutaas (SOD) [14-19]. On näidatud, et ravi Doxiga vähendab nii Nrf2 mRNA kui ka valgu ekspressiooni ja seega ka allavoolu antioksüdantsete geenide ja valkude ekspressiooni, mis põhjustab neerutoksilisust.

Tuumafaktor-kB (NF-kB) on transkriptsioonifaktor, mis reguleerib paljude põletikuliste geenide ekspressiooni; NF-kB raja keskse näitajana, mida aktiveerivad reaktiivsed hapniku liigid (ROS), võib see vallandada põletikulise reaktsiooni ja sellest tuleneva koekahjustuse [8, 22, 23]. Paljud uuringud on teatanud, et Dox põhjustab põletikku ja suurendab põletikueelsete tsütokiinide tootmist, nagu interleukiin-6(IL-6), interleukiin-1 beeta (L-1), ja kasvaja nekroosifaktor-alfa (TNF-)[11,13]. Lisaks on näidatud, et suurenenud ROS-i tootmine pärast Doxi-vahendatud neerukahjustust mängib võtmerolli sisemise apoptootilise raja aktiveerimisel mitokondriaalse ebastabiilsuse kaudu. Selle raja võtmetegurid on mitokondritega seotud valgud Bax ja Bcl-2; Bcl-2 ja Baxi tasakaalustatud suhe takistab apoptoosi, samas kui tasakaalustamatus suurendab membraani läbilaskvust ja tsütokroom c lekkimist tsütosooli, mis aktiveerib kaspaasi-9(Casp-9) ja kaspaasi{ {21}} (Casp-3). Selline aktiveerimine põhjustab üldiselt DNA fragmenteerumist ja rakusurma.

Väga huvitav on kemoterapeutiliste ravimite kliinilise kasutamise maksimeerimine, minimeerides samal ajal nende negatiivseid mõjusid. Sellest tulenevalt on tehtud uuringuid, et uurida erinevate ainete kasutamist koos Doxiga, et leevendada selle kahjulikke mõjusid [13, 30, 31]. Taimeekstrakte ja nende bioaktiivseid koostisosi on pikka aega tunnustatud nende võime tõttu vähendada ravimite vahendatud toksilisust. Geraniool on atsükliline monoterpeenalkohol, mida leidub peaaegu kõigis eeterlikes õlides, näiteks ingveri, roosi, apelsini, lavendli ja sidruni õlides [32,33]. Paljud uuringud on näidanud, et geranioolil on mitmesuguseid kasulikke omadusi, nagu haavandivastane, vähivastane [35], antidepressant [36], põletikuvastane [33] ja lisaks võib see leevendada diabeetilist nefropaatiat [37]. .

Meie teadmiste kohaselt puudub praegu spetsiifiline teave geraniooli ennetava toime kohta Doxi-vahendatud nefrotoksilisuse vastu. Seetõttu uurisime geraniooli toimeid ja tõenäolisi toimemehhanisme Doxi poolt põhjustatud vigastustele Wistari rottide neerudes NF-kB ja Nrf2/Ho-1 signaaliradade kaudu.

2. Materjal ja meetodid

2.1.Loomad

Isased Wistari rotid hangiti Saudi Araabiast Riyadhis asuvast King Saudi ülikooli (KSU) loomahoolduskeskusest. Loomi peeti kontrollitud tingimustes, näiteks toatemperatuuril (25 ± 1 kraadi) 12-tunnise valguse/pimeduse tsükliga ning neil oli piiramatu juurdepääs veele ja standardsele dieedile, nagu on lubanud KSU kohalik institutsiooniline õppeeetika komitee. (REC) autoriseerimisnumbri KSU-SE-19-122 all.

2.2. Eksperimentaalne disain

Selle uurimise käigus uuriti kokku 32 isast Wistari rotti, kes kaalusid 190-210 g, jaotati nelja rühma. Rottidele anti enne uuringut nädal aega keskkonnaga kohanemiseks. Vehiiklirühm, tuntud ka kui kontrollrühm, koosnes rottidest, kellele manustati suukaudselt tavalist soolalahust. II rühm koosnes rottidest, kellele manustati Doxi (20 mg/kg ip üksikannus) 17. päeval [11]. Rühma ⅢI ja IV rottidele anti profülaktilised geraniooli annused (suukaudselt) vastavalt 100 ja 200 mg/kg 18 päeva jooksul ning 17. päeval manustati samuti Doxi (20 mg/kg, ip). 18. päeval rotid surmati, kasutades kontrollitud keskkonnas ketamiini/ksülasiini kombinatsiooni. Veri koguti ja seerum eraldati ning mõlemad neerud eemaldati ja külmutati kohe vedelas lämmastikus. Külmutatud kudedega viidi läbi biokeemilised, geeni- ja valguekspressiooni testid. Histoloogiliseks uurimiseks pesti neerukoe proove PBS-is ja säilitati seejärel 4-protsendilises formaldehüüdi lahuses. Kogu uurimise ajal ei ilmnenud katselooma stressi ega surma märke.

2.3. Neerufunktsiooni markerite määramine

Seerumi eraldamiseks surmamise ajal kogutud verest tsentrifuugiti vereproove 10 minutit 2000 x g juures eeljahutatud tsentrifuugis. Saadud seerumit analüüsiti seejärel albumiini, vere uurea lämmastiku (BUN) ja kreatiniini kvantifitseerimiseks. Väärtusedneerufunktsioonmarkerid arvutati, kasutades Siemens Autoanalyzer Dimension RXL MAXTM, Siemens, Washington, DC, USA.

2.4. Lipiidide peroksüdatsiooni hindamine

Lipiidide peroksüdatsiooni hinnati neerukudedes, nagu on eelnevalt kirjeldanud Ohkawa jt, väikeste muudatustega.

2.5. Vähendatud glutatiooni kvantifitseerimine

Redutseeritud glutatiooni (GSH) taset neerude postmitokondriaalses supernatandis (PMS) mõõdeti Sedlaki ja Lindsay kirjeldatud meetodil, väikeste muudatustega.

2.6. Katalaasi aktiivsuse kvantifitseerimine

CAT aktiivsus neerude PMS-is määrati Claiborne'i kirjeldatud meetodil, väikeste muudatustega.

2.7. Geeniekspressiooni analüüs (RT-qPCR)

TRIzolTMreagenti (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) kasutati kogu RNA eraldamiseks neerukudedest vastavalt tootja juhistele. Ekstraheeritud RNA proovide puhtus ja kogus määrati spektrofotomeetriga NanoDropTM 8000 (Thermo Scientific, USA). Eraldatud RNA pöördtranskribeeriti seejärel cDNA-ks, kasutades cDNA Synthesis SuperMixi (Bimake, Houston, TX, USA) ja geeniekspressioon kvantifitseeriti seadmega Applied Biosystems 7500 Fast Real- SYBR Green Master Mix (Bimake, Houston, TX, USA). Aja PCR süsteem. Seejärel kasutati AACt-meetodit erinevate geenide suhtelise ekspressiooni määramiseks rühmade vahel, kusjuures majapidamisgeenina kasutati GAPDH-d. Tabelis 1 on loetletud selles uuringus kasutatud praimerijärjestused (IDT, Leuven, Belgia).

2.8. Immunoblotanalüüs

Western blot analüüs viidi läbi nii, nagu on kirjeldanud Alasmari et al. [41]. Lühidalt, eraldatud valgud (30-50 ug) elektroforeesiti SDS-PAGE geelidel ja kanti seejärel PVDF membraanidele. Pärast 60-minutilist blokeerimist 5% rasvavaba kuiva piimaga sondeeriti blotte üleöö 4 kraadi juures selektiivsete primaarsete antikehadega (Ho-1, Nrf2, TNF-, I6, NF-kB-p65, lõhustatud kaspaas{{ 14}}, Bcl-2, Bax ja GAPDH, lahjendus 1:1000). Seejärel pesti membraane, seejärel inkubeeriti 60 minutit toatemperatuuril sobivate HRP-ga konjugeeritud sekundaarsete antikehadega (lahjendus: 1:5000). Valkude olemasolu tuvastamiseks membraanil kasutati ECL-reaktiivikomplekti ja geelkuvamisseadmeid (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

2.9.Histopatoloogilised uuringud

Neerukuded fikseeriti 4-protsendilises formaldehüüdis, seejärel töödeldi parafiini lõikamiseks ja värvimiseks. Mikrotoomi kasutati parafiinilõikude lõikamiseks paksusega 3 μm. Seejärel töödeldi lõigatud sektsioone vaha eemaldamiseks ja värviti histopatoloogiliseks uuringuks hematoksüliini ja eosiini (H&E) värviga. Neeru histoloogilised kujutised saadi DP72 kaameraga, mis oli ühendatud Olympus BX mikroskoobiga.

2.10.Andmete analüüs

Andmeid analüüsiti arvutipõhise programmiga Graph Pad Prism 5 (San Diego, CA, USA) ning tulemused on esitatud keskmiste ja standardhälvetena (keskmine±SD). Rühmadevahelisi erinevusi hinnati ühesuunalise ANOVA abil, millele järgnes Tukey võrdlustest, kusjuures p-väärtus oli väiksem kui 0,05, mis näitab statistilist olulisust (p).<>