Osa 1 Fibroblastide heterogeensus ja tertsiaarsed lümfoidkoed neerudes

Kontakt: ali.ma@wecistanche.com

Abstraktne

Fibroblastid asuvad erinevates organites ja toetavad kudede struktuuri ja homöostaasi füsioloogilistes tingimustes. Fibroblastide fenotüübilised muutused on aluseks erinevate patoloogiliste seisundite, sealhulgas elundifibroosi tekkele. Hiljutised edusammud üherakulises bioloogias on näidanud, et fibroblastid hõlmavad heterogeenseid alampopulatsioone, millel on erinevad fenotüübid, mis avaldavad kontekstist sõltuval viisil peremeesorganitele nii kasulikku kui ka kahjulikku mõju. Aastalneerud, provotseerivad püsivate fibroblastide fenotüübilised muutused tavalised patoloogilised seisundidkrooniline neeruhaigus(CKD), nagu neeruaneemia ja peritubulaarne kapillaaride kaotus. Lisaks eakatel vigastatutelneerud, pakuvad fibroblastid funktsionaalset ja struktuurset tuge tertsiaarsetele lümfoidkudedele (TLT), mis toimivad erinevates kliinilistes kontekstides omandatud immuunreaktsioonide ektoopilise kohana. TLT-d on tihedalt seotud vananemise ja kroonilise neeruhaiguse progresseerumisega ning TLT-de arengustaadiumid peegeldavad neerukahjustuse raskust. Selles ülevaates kirjeldame praegust arusaama fibroblastide heterogeensusest nii füsioloogilistes kui ka patoloogilistes tingimustes, pöörates erilist tähelepanu fibroblastide panusele TLT moodustumiselneerud. Fibroblastide heterogeensete omaduste dissekteerimine annab paljutõotava ravivõimaluse fibroblastidega seotud patoloogiliste seisundite, sealhulgas TLT moodustumise jaoks.

MÄRKSÕNADkroonilineneerudhaigus, fibroblast, fibroos, müofibroblast, tertsiaarne lümfoidkude

Klõpsake sellekscistanche tubulosa annus neeruhaiguste korral

1|SISSEJUHATUS

Varem põhines raku tuvastamine koes hoolika mikroskoopilise vaatluse all morfoloogilisel väljanägemisel. Molekulaarbioloogia edusammud viisid iga rakutüübi spetsiifiliste molekulaarsete markerite avastamiseni, mida saab kasutada rakkude klassifitseerimiseks, ja see aitas oluliselt kaasa erinevate bioloogiliste mehhanismide uurimisele. Hiljutised edusammud üherakulise multi-oomika analüüsis on paljastanud rakupopulatsioonide heterogeensed omadused enneolematu eraldusvõimega ja on dramaatiliselt rekonstrueerinud meie arusaama bioloogilistest nähtustest. Iga rakukategooria hõlmab erinevaid alampopulatsioone, millel on erinevad funktsioonid, mis iseloomustavad koespetsiifilist mikrokeskkonda nii füsioloogilises kui ka patoloogilises kontekstis. Fibroblastide uurimisvaldkond pole erand ja kogunenud on tohutult palju tõendeid, mis viitavad nende heterogeensetele omadustele.

Fibroblastid on spindlikujulised rakud, mis paiknevad erinevate elundite interstitsiaalsetes ruumides ja kus nad sünteesivad rakuvälise maatriksi (ECM) korrastamiseks ja elundite homöostaasi säilitamiseks mitmeid struktuurseid valke, nagu kollageenid ja fibronektiinid. , mängivad fibroblastid koos teiste residentrakkudega elundispetsiifilisi rolle. Näiteks residendist fibroblastide alampopulatsioonneerudtoodab erütropoetiini (EPO), mis on peamine erütropoeesi regulaator. Hiljutised uuringud on näidanud, et erinevate organite fibroblastidel on kõrge funktsionaalne heterogeensus. Patoloogilistes tingimustes tekivad fibroblastide dramaatilised fenotüübilised muutused, mis aitavad oluliselt kaasa elundi düsfunktsiooni arengule. Fibroblastid diferentseeruvad müofibroblastideks ja soodustavad elundifibroosi progresseerumist, mis on vigastusjärgse kohanemisvõimetu paranemise ilming.2 Neerudes mängivad fibroblastid ülitähtsat rolli nende arengus ja progresseerumiseskrooniline neeruhaigus(CKD), mille haigestumus ja suremus on kogu maailmas kõrge isegi kaasajal.3 Fibroblastid põhjustavad mitmeid kroonilise neeruhaigusega seotud patoloogilisi seisundeid, nagu neerufibroos ja neeruaneemia, olenemata kroonilise neeruhaiguse etioloogiast. Lisaks mängivad fibroblastid kontekstist sõltuval viisil ka mitmekülgset rolli. Näiteks vananenud vigastatud neerudes mängivad fibroblastid ülitähtsat rolli tertsiaarse lümfoidkoe (TLT) moodustumisel. See on kroonilisest põletikust põhjustatud indutseeritav ektoopiline lümfoidkoe.4 Fibroblastide individuaalsete omaduste selgitamine selgitab fibroblastidega seotud tekkemehhanisme. patoloogilised seisundid ja hõlbustavad tõhusate ravimite väljatöötamist.

Selles ülevaates kirjeldame kõigepealt fibroblastide heterogeensust selle päritolu ja funktsiooni osas füsioloogilistes tingimustes. Seejärel arutame fibroblastide funktsionaalset heterogeensust erinevates patoloogilistes tingimustes, sealhulgas elundifibroosis, ja nende koostoimeid teiste rakutüüpide ja ümbritseva mikrokeskkonnaga. Erilist rõhku pannakse residentidele fibroblastideleneerudja nende mõju CKD progresseerumisele. Lõpuks arutatakse fibroblastide panust TLT moodustumisse ja selle kliinilist tähtsust.

2|FIBROBLASTIDE OMADUSED

2.1|Fibroblastide omadused ja funktsioonid füsioloogilistes tingimustes

Fibroblastid identifitseeritakse üldiselt nende morfoloogia, lokaliseerimise ja tüüpiliste markerite ekspressioonide, nagu PDGFR ja CD73, järgi.1 Need markerid ei ole aga fibroblastide suhtes absoluutselt spetsiifilised, seega puudub markerite teiste rakuliinide jaoks (nt CD45 hematopoeetiliste rakkude jaoks). ) kasutatakse sageli fibroblastide tuvastamiseks. Füsioloogilistes tingimustes aitavad fibroblastid säilitada normaalset koestruktuuri, toetades ECM-i käivet. Lisaks nendele funktsioonidele mängivad residendist fibroblastid ka koespetsiifilisi rolle. Näiteks südames, kus fibroblastid moodustavad suurima rakupopulatsiooni, tunnetavad fibroblastid mehaanilist venitust ja interakteeruvad müotsüütidega vaheühenduse kaudu, mis võimaldab sobivat elektrijuhtivust ja säilitab normaalse südamefunktsiooni.⁵Lisaks põhjustab fibroblastide ammendumine luuüdis ja skeletilihastes aneemiat ja kahheksiat, 6 mis viitab nende tähtsusele normaalses koe homöostaasis erinevates organites.

Theneerudon ainulaadne organ, kuna mitut tüüpi rakud asuvad üksteise lähedal ja toimivad harmooniliselt, et täita neeruspetsiifilisi rolle, nagu jääkainete eemaldamine ja kehavedelike tasakaalu säilitamine. Fibroblastid pakuvad struktuurset tuge nefronitele, neeru põhilisele funktsionaalsele üksusele ja neil on otsene interaktsioon teiste neerurakkudega, näiteks proksimaalsete tubulaarrakkudega.7 Neerus paiknevate fibroblastide spetsiifilise funktsioonina on teatud fibroblastide alampopulatsioonid sügavas ajukoores ja välimine medulla toodab vastusena hüpoksiale EPO-d, mis stimuleerib erütropoeesi luuüdis.8 EPO-d tootvatel rakkudel on neuronitaoline dendriitne morfoloogia ja nad ekspresseerivad neuronaalseid markereid, nagu mikrotuubulitega seotud valk 2 (MAP2) ja neurofilament light polüpeptiid (NFL) .8 Huvitaval kombel toodavad raskelt aneemilistes tingimustes peaaegu kõik fibroblastid, sealhulgas väliskoores olevad fibroblastid, EPO-d, mis viitab fibroblastide funktsiooni suurele plastilisusele.9 EPO-d tootvate rakkude lokaliseerimine on teravas kontrastis teiste hematopoeetiliste kasvufaktoritega. nt granulotsüütide kolooniaid stimuleerivad tegurid, mis sünteesitakse nende sihtrakkude läheduses ja lõbus parakriinsel viisil. Selle lahknevuse üks selgitus on see, et füsioloogiline hapniku kontsentratsioon neerudes on madalam kui teistes elundites ja neerude verevool moodustab ligikaudu 20 protsenti südame väljundist, mis muudab neeru ideaalseks bioloogiliseks anduriks hüpoksia korral.10 Neerud võivad ka koheselt tekkida. tuvastada vedeliku olek kõrvutipiirkonnas ja reguleerida ekstratsellulaarset mahtu, reguleerides naatriumi tagasiimendumise kogust. Koos EPO tootmisega saavad neerud seada plasmamahu ja punaste vereliblede massi soodsale tasemele, toimides "kriteerijana".^11,12Lisaks ekspresseerivad neeru medulla fibroblastid COX1 ja COX2, mis on prostaglandiinide (PG) sünteesi võtmeensüümid.¹³ Füsioloogilistes tingimustes on PG-del mitmeid funktsiooneneerud, nagu neerude verevoolu ja reniini vabanemise reguleerimine. Üldiselt aitavad neerudes asuvad fibroblastid säilitada neeru homöostaasi mitme mehhanismi kaudu.

2.2|Fibroblastide päritolu

Fibroblastide arengu päritolu on heterogeenne. Aastalneerud, näitasime varem, et neerukoores ja välimises medullas asuvad fibroblastid pärinevad müeliini nullvalgu (P0)-Cre liiniga märgistatud neeruvälistest rakkudest.¹⁴ Embrüonaalses faasis ekspresseerub P0 närviharja rakkudel.¹⁵ P0-Cre liiniga märgistatud rakud migreeruvad närviharjalt embrüonaalsesseneerudembrüonaalsel päeval 13,5 ja paiknevad koos neeru väliskapsli ja kusejuhaga. Täiskasvanu puhulneerud, P0-Cre liiniga märgistatud rakke on täheldatud neerude interstitsiumis ja need ekspresseerivad fibroblastide markereid, nagu PDGFR ja CD73. Huvitaval kombel on suurem osa EPO-d tootvatest fibroblastidest ka P0-Cre-ga märgistatud, mis on kooskõlas nende ülalkirjeldatud neuronilaadsete fenotüüpide tunnustega.⁸ Neid tulemusi toetab ka tähelepanek, et primitiivse erütropoeesi peamiseks EPO allikaks on neuraalsed ja närviharja rakud.¹⁶

Seevastu neeru sisemise medulla residendist fibroblastid märgistab Wnt4-Cre,¹⁷ illustreerib fibroblastide päritolu piirkondlikku heterogeensustneerud. Neerude arengus täheldatakse Wnt4 ekspressiooni kogunevates nefronites ja medullaarses stroomas.18,19 Wnt4 reguleerib medullaarsete stroomarakkude diferentseerumist silelihasrakkudeks,²⁰ samuti mesenhümaal-epiteliaalne üleminek ja tubulogenees.19 Tõepoolest, Wnt4 ammendumine nõrgendab silelihase aktiini (SMA) ekspressiooni medullaarsetes stroomarakkudes.²⁰

Seoses fibroblastide erineva päritoluga neerukoores ja medullas on teatatud ka mitmetest fenotüüpsetest erinevustest kortikaalsete ja medullaarsete fibroblastide vahel. Näiteks kui kortikaalsed fibroblastid ekspresseerivad ekto-5'-nukleotidaasi (5'NT), siis enamik medullaarseid fibroblaste seda ei tee.²¹ Ultrastrukturaalses analüüsis on kortikaalsetel fibroblastidel kalduvus avaldada dendriitstruktuuri, et suhelda külgnevate rakkudega, samas kui medullaarsed fibroblastid sisaldavad lipiiditilku. 7,22 Huvitaval kombel esinevad need lipiiditilgad ka aneemiliste rottide kortikaalsetes fibroblastides.neerud.²¹ Tulevased uuringud on vajalikud, et teha kindlaks, kas need fenotüübilised erinevused on seotud kortikaalsete ja medullaarsete fibroblastide funktsionaalsete erinevustega.

2,3|Peritsüüdid ja fibroblastid

Peritsüüdid on seinarakud, mis ümbritsevad veresoonte endoteelirakke ja kontrollivad mikrotsirkulatsiooni. Traditsiooniliselt määratletakse peritsüüte peamiselt nende anatoomilise asukoha, morfoloogia ja tüüpilise markerite ekspressiooni järgi.²³ Peritsüüdid jagavad ühiseid tunnuseid elavate fibroblastidega, nagu nende mesenhümaalne päritolu ja morfoloogia. Peritsüüdid ekspresseerivad samu rakulisi markereid nagu residendist fibroblastid, näiteks PDGFR . Kuigi peritsüütide (nt NG{0}}) tuvastamiseks on kasutatud mitmeid markereid, ei ole need peritsüütide suhtes absoluutselt spetsiifilised ja puudub kindel marker, mis peritsüüte täielikult fibroblastidest eristaks. Tõepoolest, neeruperitsüütide jälgimise efektiivsus NG-2 abil on suhteliselt madal.24 Kuigi erinevused anatoomilises lokalisatsioonis füsioloogilistes tingimustes aitavad osaliselt peritsüüte residentidest fibroblastidest eristada, paiknevad mõned residendist fibroblastid ka perivaskulaarses piirkonnas. ("perivaskulaarsed fibroblastid"), mistõttu peritsüütide ja fibroblastide eristamine anatoomilise lokaliseerimise järgi ei ole piisav.

Nagu fibroblastid, on peritsüütide päritolu heterogeenne. Kui kesknärvisüsteemi ja harknääre peritsüüdid pärinevad ektodermist pärinevast närviharjast, siis südame ja kopsude peritsüüdid pärinevad mesoteelist.²³ Neerudes pärinevad peritsüüdid FoxD{0}}positiivsetest kortikaalsetest mesenhümaalsetest eellasrakkudest.²⁵ FoxD1 pluss rakud pärinevad algselt Osr1-positiivsetest nefrogeensetest vahepealsetest mesodermi eellasrakkudest embrüonaalses faasis.^26,27FoxD1 pluss rakud toimivad mesenhümaalsete eellasrakkudena ja diferentseeruvad mitmeks rakutüübiks, nagu peritsüüdid, fibroblastid, veresoonte silelihasrakud ja mesangiaalsed rakud.²⁷ Huvitav on see, et FoxD1-Cre liiniga märgistatud stroomarakkude populatsioonid kattuvad suures osas P0-Cre liiniga märgistatud rakkudega, välja arvatud medulla sisemises osas.^14,25,27Seda kinnitab tähelepanek, et embrüonaalses faasis migreeruvad närviharjarakud ekspresseerivad FoxD1,²⁸ja P0-Cre liiniga märgistatud rakud sisenevad embrüonaalsesse kehasseneerudekspresseerivad ajutiselt FoxD1.¹⁴ Järjekindlalt märgistab FoxD1-Cre ka EPO-d tootvaid rakke liini.²⁹ Seega on "fibroblastideks" ja "peritsüüdideks" määratletud rakupopulatsioonide vahel suur kattumine ning sellisena on peritsüüte ja fibroblaste sageli käsitletud tervikuna. Selles ülevaates kasutame terminit "fibroblastid/peritsüüdid", et määratleda rakupopulatsioon, sealhulgas nii fibroblastid kui ka peritsüüdid. FoxD1 pluss mesenhümaalsete eellasrakkude panust müofibroblastide kogumisse ja fibroosi arengusse arutatakse järgmises osas.

Kuigi peritsüüte on olnud raske eristada fibroblastidest, võimaldab hiljutine uuring, milles viidi läbi fibroblastide ja seinarakkude (vaskulaarsete silelihasrakud ja peritsüüdid) scRNAseq lihasorganites, mõista nende erinevusi transkriptsioonitasemel.³⁰ Muhl jt viisid läbi hiire südamest, skeletilihastest, käärsoolest ja põiest saadud rakkude scRNAseq. Kuigi igal rakutüübil on elundist sõltuv transkriptsiooniline heterogeensus, tuvastati 90 geeni alamhulka, mis kattuvad kõigis neljas elundis, mida saab kasutada peritsüütide ja fibroblastide eristamiseks. Kuigi tavalised fibroblasti markerid hõlmavad paljusid ECM-geene (nt Col1a1), CD34 ja PDGFR, hõlmavad seinamaali rakumarkerid Mcamit, Taglni ja Notch3. Kuigi ükski marker üksi ei suuda iga rakutüüpi täielikult määratleda, eristab nende markerite kombinatsioon tõhusalt peritsüüte fibroblastidest. Huvitav on see, et peritsüüdid näitavad fibroblastidega võrreldes elundispetsiifilist lokaliseerimist ja markerite ekspressiooni. Näiteks kuigi käärsoole peritsüüdid paiknevad subepiteliaalsete kapillaarsilmuste tipus koos tugeva PDGFR ja NG -2 ekspressiooniga, kipuvad põie peritsüüdid ekspresseerima hoopis SMA-d. Peritsüütide erinevad transkriptsiooniprofiilid võivad selgitada peritsüütide funktsionaalseid erinevusi erinevate organite vahel.

3|MYOFIBROBL A ST: PÄRITOLU, FUNKTSIOON, HETEROGEENSUS JA SEOTUD PATOLOOGILISED TINGIMUSED

Fibroos on elundi düshomeostaasi viimane levinud ilming ja seda määratletakse kui liigset ECM-i ladestumist koos moonutatud koearhitektuuriga. Fibroosi arengut reguleerib keeruline tasakaal ECM-i sünteesi ja selle lagunemise vahel.31 Kui fibroos on arenenud, on see seotud halva prognoosiga erinevates organites, sealhulgasneerudja seda peetakse elundite funktsiooni languse usaldusväärseks ennustajaks. Neerudes areneb fibroos samaaegselt neeruaneemia ja peritubulaarse kapillaaride kaotusega, mis mõlemad on kroonilise neeruhaiguse tunnused. Fibroosi arengus tekivad müofibroblastid pärast vigastust de novo ning vohavad ja sünteesivad aktiivselt ECM-i komponente (joonis 1).

3.1|Müofibroblastide päritolu

Viimase kümnendi jooksul on müofibroblasti eellasrakkude kandidaatidena välja pakutud mitmeid rakulisi allikaid. Uuringud on näidanud, et suurem osa müofibroblastidest on pärit residentidest fibroblastidest, niineerudja muud organid (nt süda).^14,32,33Aastalneerud, P0-Cre liiniga märgistatud residendist fibroblastid diferentseeruvad pärast vigastust müofibroblastideks, millega kaasneb EPO tootmise vähenemine.¹⁴ Järjekindlalt on müofibroblastid vigastatudneerudon samuti põlvnemismärgiga FoxD1-Cre.²⁵ Neid tulemusi kinnitas järgnev uuring, milles kasutati ühepoolse kusejuha obstruktsiooni (UUO) all olevaid EPO-Cre hiiri, mis on neerufibroosi peamine in vivo eksperimentaalne mudel.⁹ Müofibroblastides aktiveeritakse NFkB ja Smad signaaliülekanne ning need on müofibroblastide fenotüübilise ülemineku ja EPO tootmise vähenemise aluseks. Huvitav on see, et EPO tootmine müofibroblastides taastatakse neuroprotektiivsete ainete, nagu deksametasoon ja neurotrofiinid, manustamisega.¹⁴ või tagurdades UUO,⁹ mis on näide müofibroblastide kõrgest funktsionaalsest plastilisusest.

Erinevalt kortikaalsetest müofibroblastidest pärinevad medullaarsed müofibroblastid Wnt4 pluss residentidest fibroblastidest sisemises medullas.¹⁷ Uuesti tehtud üherakuline transkriptsioonianalüüs toetab ka võimalust, et kortikaalsetel ja medullaarsetel (müo)fibroblastidel võivad olla erinevad fenotüübid. snRNAseq hiirelneerudvigastusmudelid näitasid, et fibroblastide alampopulatsioonid on jaotatud nelja rühma vastavalt nende kortikaalsele või medullaarsele päritolukohale.³⁴ Huvitav on see, et kortikaalsed fibroblastid ekspresseerivad ajutiselt Acta2 ja Col1a1 ainult IRI ägedas faasis, samas kui medullaarsed fibroblastid avaldavad nende müofibroblastimarkerite püsivat ekspressiooni isegi 6 nädalat pärast IRI-d. Need fenotüübilised erinevused kortikaalsete müofibroblastide ja medullaarsete müofibroblastide vahel võivad tuleneda fibroblastide erinevast päritolust, nagu eespool kirjeldatud.

Hiljuti avaldatud põhjalik uuring andis veenvaid tõendeid selle kohta, et suurem osa müofibroblastidest pärineb mitte ainult hiire, vaid ka inimese neerudes asuvatest fibroblastidest/peritsüütidest. Kuppe jt analüüsisid inimese ja hiire fibroosineerudscRNAseq abil väga kõrge eraldusvõimega.35 Enamik müofibroblaste eristatakse fibroblastidest ja peritsüütidest, vähesel määral annavad osa muud rakutüübid, nagu dediferentseerunud proksimaalsed torukujulised rakud. Selles uuringus määratleti müofibroblastid kui rakud, mis ekspresseerivad SMA ekspressiooni asemel kõige rohkem ECM geene, ja selgus, et müofibroblastid märgitakse tõhusamalt periostiiniga (Postn). Huvitaval kombel iseloomustab fibroblastide/peritsüüdi üleminekut müofibroblastideks rakutsükli katkemisega seotud geenide, näiteks aktivaatorvalgu -1 (AP1) varajane ekspressioon. AP1 ekspressioonile järgneb integriinide ja TGF ekspressioon, mis mõlemad on neerufibroosi peamised tõukejõud. Samuti tuvastasid nad Nkd2 küpsete müofibroblastide selektiivse markerina. Nkd2 ekspressioon on positiivses korrelatsioonis Postn ja ECM ekspressiooniga, kuid negatiivselt fibroblastide ja peritsüütidega seotud geenidega. Nkd2 katkestamineneerudorganoidid pärssisid Col1a1 ekspressiooni, mis viitab sellele, et Nkd2 võib mängida rolli fibroosi arengus. Kuigi in vivo on vaja täiendavat valideerimist, on võimalik, et Nkd2 võib olla neerufibroosi terapeutiline sihtmärk.

Kuigi fibroblastide / peritsüütide panus müofibroblastide kogumisse on kõige olulisem, on teatatud ka fibrotsüütide panusest. Fibrotsüüdid on luuüdist pärinevad positiivsete vereloomemarkeritega rakud, mis toodavad kollageeni ja ECM komponente. Fibrotsüüdid migreeruvadneerudkui eelnevalt diferentseeritud kollageeni tootvad rakud ja aitavad kaasa fibroosi arengule neerudes.³⁶ Varased uuringud teatasid vastuolulistest tulemustest fibrotsüütide üldise panuse kohta müofibroblastidesse,^24,37peamiselt transgeensete reporterite usaldusväärsuse erinevuste tõttu. Hiljutised uuringud, milles kasutati parabioosimudeleid ja scRNAseq-i, näitasid, et enamik müofibroblaste pärineb fibroblastidest / peritsüütidest, kuid mitte vereloome liinist pärinevatest rakkudest.³⁸ inimese scRNAseqneerudnäitas ka sarnaseid tulemusi,³⁵ mis viitab sellele, et fibrotsüütide panus müofibroblastide kogumisse on fibroblastide / peritsüütidega võrreldes suhteliselt väike.

Eelmises uuringus väideti, et epiteelirakud transdiferentseeruvad müofibroblastideks epiteeli-mesenhümaalse ülemineku (EMT) teel.³⁹ põhineb peamiselt epiteeli ja mesenhümaalsete markerite kolokalisatsioonil. Üksikasjalikud raku saatuse jälgimise uuringud seadsid kahtluse alla EMT olulise panuse in vivo ja näitasid, et EMT moodustab ainult väikese osa müofibroblastide kogumist, kui see on olemas.^24,25,35Endoteeli-mesenhümaalne üleminek (EndoMT) on veel üks bioloogiline protsess, mille käigus endoteelirakud transdiferentseeruvad müofibroblastideks. Kuigi mõned uuringud on näidanud, et EndoMT soodustab neerufibroosi,^40-42EndoMT panus üldistesse müofibroblastide populatsiooni näib olevat vähem oluline kui fibroblastidel/peritsüüdidel või fibrotsüüdidel.^24,35

3.2|Müofibroblastide ümberdefineerimine

Traditsiooniliselt on müofibroblastid määratletud kui rakud, millel on nii fibroblastide kui ka silelihasrakkude omadused ja mis ekspresseerivad kontraktiilset valku SMA.1 Samas on mitmed uuringud näidanud, et lisaks fibroblastidele on ka müofibroblastidel suur heterogeensus ja SMA on müofibroblastide ebaühtlane marker. . Nagu eelnevalt kirjeldatud, hiljuti läbi viidud fibrootilise scRNAseq analüüsisneerud, määratleti müofibroblastid kui kõige enam ECM-i ekspressiooniga rakud ja SMA asemel kasutati müofibroblastide tuvastamiseks Postni.³⁵Tõepoolest, Sun jt kasutasid Col-EGF / SMA-RFP topeltreporterhiiri ja näitasid, et ainult väike osa kollageeni tootvatest rakkudest ekspresseerib SMA-d neeru- ja kopsufibroosi mudelites.⁴³ Teine uuring näitas ka, et silelihasrakud ja peritsüüdid ekspresseerivad kõrgemat SMA taset kui my-fibroblastid, muutes SMA müofibroblastide ebajärjekindlaks markeriks, vähemalt kopsufibroosi korral.⁴⁴ Huvitaval kombel jaotatakse müofibroblastid scRNAseq abil viieks klastriks ja pseudoaja analüüs viitab sellele, et igaüks neist esindab fibroblastidest fibroblastide ülemineku eri etappe.35 Erinevate fibroblastide alatüüpide funktsionaalse heterogeensuse kinnitamiseks on vaja täiendavat valideerimisuuringut.

3,3|(Müo)fibroblastide funktsionaalne heterogeensus

Patoloogilistes tingimustes omandavad fibroblastid erinevad fenotüübid ja mängivad erinevaid rolle sõltuvalt nende mikrokeskkonnast ja kliinilisest kontekstist. Kopsudes on teatatud residendist fibroblastide suurest funktsionaalsest heterogeensusest, mis soodustab kopsufibroosi erinevate mehhanismide kaudu.{0}} Erinevates anatoomilistes asukohtades (alveolaarsed, adventitsiaalsed ja peribronhiaalsed fibroblastid) on erinevad kopsufibroblastide alampopulatsioonid. ja igaühel neist on scRNAseq-s erinevad transkriptsiooniprofiilid.44 Nende hulgas tuvastati 1 (Cthrc1) sisaldava kollageeni kolmikheeliksi korduse ekspressiooniga ainulaadne suure ECM-i produktsiooniga fibroblastide alampopulatsioon. Cthrc1-positiivsed fibroblastid eristuvad alveolaarsetest fibroblastidest ja neid täheldatakse peamiselt fibroblastilistes fookustes, mis on fibrogeneesi keskne koht. Neil on pärast intratrahheaalset ülekandmist kõrge rände- ja koloniseerimisvõime, mis viitab nende patoloogilistele funktsioonidele. Need tulemused näitavad, et erinevad fibroblastide alampopulatsioonid hõivavad kopsus erinevaid anatoomilisi asukohti ja Cthrc1 tähistab kõrge ECM-i ekspressiooniga kahjulikke fibroblaste. Teises uuringus selgus, et vananenud müofibroblastide fenotüübilised muutused kopsudes on eakate inimeste kopsufibroosi lahutamise nõrgenemise põhjuseks.47 Vanemate müofibroblastide NADPH-oksüdaas 4 (Nox4) ekspressioon on kõrgem, samas kui NFE{10}}seotud faktor 2 (Nrf22) ), mis on antioksüdatiivse stressivastuse peamine regulaator, on alareguleeritud. Redokside tasakaalustamatus Nox4 ja Nrf2 vahel käivitab apoptootiliste ja vananevate fenotüüpide omandamise vananenud fibroblastides, mis soodustab püsivat fibroosi. Tõepoolest, Nox4 aktiivsuse in vivo blokaad siRNA või väikese molekuliga inhibiitori poolt taastab vananenud hiirte fibroosi eraldumise võime, kusjuures müofibroblastides vähenevad vananemis- ja apoptoosivastased fenotüübid.

Unikaalset fibroblastide fenotüüpi on kirjeldatud ka IgG{0}}seotud haiguse (IgG4-RD) puhul, mida iseloomustab IgG4-positiivne plasmarakkude infiltratsioon ja tormikujuline fibroos.48 Kuigi enamik patsiente IgG4-RD allub hästi glükokortikoidravile, oli terapeutilise vastuse põhjus ebaselge. Selgitasime, et glükokortikoidi retseptori (GR) ekspressioon on oluliselt ülesreguleeritud patsientide kahjustatud elundites, nagu submandibulaarsed näärmed, retroperitoneum janeerud.49 Huvitaval kombel ekspresseerub GR peamiselt kahjustatud organi fibroblastidel ja leukotsüütidel, mis osaliselt selgitab, miks glükokortikoidide manustamine nõrgendab IgG4-RD fibroosi arengut. Kuigi fibroblastide panust IgG4-RD arengusse tuleks täiendavalt valideerida, näitavad need tulemused fibroblastide funktsionaalset heterogeensust erinevate patoloogiliste seisundite tekkes.

3,4|Neeru aneemia ja peritubulaarne kapillaaride kaotus: kaks tavalist patoloogilist seisundit, mis on tingitud fibroblastide düsfunktsioonist neerudes

Fibroos on kroonilise neeruhaiguse viimane ühine rada, olenemata selle aluseks olevast etioloogiast. Tõepoolest, fibroosi neerukoores peetakse kroonilise neeruhaiguse neerufunktsiooni häire parimaks histoloogiliseks ennustajaks.50 See on osaliselt tingitud sellest, et fibroos on tihedalt seotud teiste kroonilise neeruhaiguse korral levinud patoloogiliste seisunditega, nagu neeruaneemia ja peritubulaarne kapillaaride kaotus. Mitmed tegurid vallandavad fibroblastide ülemineku müofibroblastideks ja fibroosi arengut neerudes, näiteks proksimaalse tubulaarse vigastuse.51,52 Nagu eelmises peatükis kirjeldatud, diferentseeruvad EPO-d tootvad fibroblastid/peritsüüdid vastusena vigastusele müofibroblastideks, millega kaasneb EPO produktsiooni kadumine. .14,29 EPO tootmine indutseeritakse hüpoksia seisundis ja seda reguleerivad hüpoksiast indutseeritavad tegurid (HIF). Normoksilistes tingimustes hüdroksüülitakse HIF-id kiiresti HIF-prolüülhüdroksülaasi domeeni sisaldavate valkude (PHD) poolt, mis soodustavad HIF-ide proteasomaalset lagunemist. Aastalneerud, Haigekassa aktiveerimine Ph.D. inhibeerimine taastab EPO tootmise müofibroblastides ja PHD{0}}HIF2 telg on peamine regulatsioonikaskaad.53 Huvitaval kombel reguleerib FoxD1-Cre liiniga märgistatud fibroblastide EPO tootmist PHD2 inaktiveerimine, kuid mitte. PHD1 või PHD3 inaktiveerimisega, mis viitab sellele, et EPO tootmist nendes rakkudes reguleerivad ainulaadsed mehhanismid.⁵³ Kuigi praegune standardne neeruaneemia ravi on inimese rekombinantse EPO (rhEPO) manustamine, seostatakse eksogeenset rhEPO manustamist mitmete kõrvaltoimetega, nagu hüpertensioon ja trombootilised sündmused.^54,55Nendest rhEPO puudustest ülesaamiseks on Ph.D. neeruaneemia raviks on välja töötatud ja kasutatud inhibiitorid, mis reguleerivad hüpoksiast põhjustatud geene, sealhulgas EPO.⁵⁶ Kuigi on vaja täiendavaid uuringuid seoses doktorikraadi pikaajaliste kahjulike mõjudega. inhibiitorid, mis on suunatud müofibroblastidele endogeense EPO tootmise esilekutsumiseks, võib olla paljulubav ja soodne terapeutiline strateegia neeruaneemia korral kroonilise neeruhaiguse korral.

Peritubulaarne kapillaaride kadu ja kapillaaride harvestumine arenevad samuti koos fibroosiga ning nende ilmingute aluseks on peritsüütide funktsionaalsed muutused.^57-59Aastalneerud, peritubulaarseid kapillaare ümbritsevad peritsüüdid, mis toetavad kapillaaride struktuuri ja toimivad füsioloogilistes tingimustes. Pärast vigastust eralduvad need peritsüüdid peritubulaarsetest kapillaaridest ja rändavad vigastatud tuubulitesse.^53,60 Selles protsessis kaotavad peritubulaarsed kapillaarid peritsüütide mehaanilise toe, mis viib|201 ARAI jt. kapillaaride regressioon ja harvendamine.^57,58UUO mudelis areneb endoteelirakkude apoptoos ja peritubulaarne kapillaaride kadu koos fibroosi progresseerumisega.⁶¹ Lisaks peritubulaarsed kapillaarid fibrootilisteneerudavaldavad morfoloogilisi kõrvalekaldeid, nagu koobaste moodustumine ja vakuolisatsioon, ning nende läbilaskvus on kõrgem, nagu ilmneb suurenenud ekstravasatsioonis kahe fotoni mikroskoopilise pildistamise korral.⁶² Tõepoolest, peritubulaarsete kapillaaride kadumisest ja harvenemisest põhjustatud neerude verevarustuse vähenemine tuvastatakse kroonilise neeruhaiguse hiiremudelites kontrastainega mikrokompuutertomograafia abil.63 Koos fibroosi tekke ja suhtelise EPO puudulikkusega aitab peritubulaarne kapillaaride kadu kaasa hapnikuvarustuse vähenemisele. neerutuubulid ja interstitium, mis süvendab neerukahjustust ja moodustab kroonilise neeruhaiguse progresseerumise nõiaringi.⁶⁴

4|FIBROBLASTIDE FUNKTSIONAALNE HETEROGEENSUS VÄLJAS FIBROOSI

Hiljutised uuringud, milles kasutati scRNAseq analüüsi, on näidanud fibroblastide fenotüübilist heterogeensust patoloogilistes tingimustes erinevates organites ja seega näidanud fibroblastide mitmekülgseid funktsioone. Fibroblastid ei avalda mitte ainult kahjulikku mõju, vaid neil on ka kasulikud funktsioonid kontekstist sõltuval viisil. Selles jaotises vaatleme praegust arusaamist fibroblastide erinevatest funktsioonidest, välja arvatud fibroosi areng.

4.1|Põletikulised funktsioonid

Fibroblastid soodustavad kudede põletikku mitmes kontekstis.⁶⁵ Näiteks müokardiinfarkti hiiremudelis põhjustavad fibroblastid mitte ainult südamefibroosi, vaid ka lokaalset põletikku, mis halvendab südamefunktsiooni. Pärast müokardiinfarkti reguleerivad südame fibroblastid fibrootilises piirkonnas Sox9,^66,67mis on transkriptsioonifaktor, mis vastutab ECM-i sadestumise eest kondrotsüütides.⁶⁸ Sox9 fibroblastispetsiifiline deletsioon in vivo leevendab südame põletikku ja fibroosi kroonilises faasis pärast müokardiinfarkti, mis põhjustab vasaku vatsakese düsfunktsiooni ja müokardi armistumise paranemist. Südame armkoe RNAseq näitas, et Sox9 deletsioon fibroblastides reguleerib põletikueelseid geene, nagu IL-6, ja kollageeni geene. Imetajate kondrotsüütide ChIPseq näitas, et mõned neist põletikueelsetest geenidest on Sox9-ga otseselt seotud võimendaja kahjustuse juures.69 Ehkki SOX9 ülesreguleerimise ülesvoolu signaale tuleks täiendavalt uurida, viitavad need leiud sellele, et Sox9 südame fibroblastides reguleerib pärast seda nii fibroosi kui ka põletikku. müokardiinfarkti ja seda võib pidada uueks terapeutiliseks sihtmärgiks.

Fibroblastide alampopulatsioonide põletikueelseid fenotüüpe on intensiivselt uuritud ka reumatoidartriidi (RA) korral. Croft jt uurisid taanduva ja püsiva artriidi hiiremudeleid ning avastasid, et fibroblasti aktivatsioonivalk-a (FAPa)-positiivsed fibroblastid akumuleeruvad põletikulisse liigesesse.70 FAPa pluss fibroblastide deletsioon nõrgendab kohalikku põletikku ja liigese deformatsiooni, mis viitab nende patoloogilistele funktsioonidele. Huvitav on see, et FAPa pluss fibroblastid jaotatakse scRNAseq abil kaheks erinevaks alampopulatsiooniks: FAPa pluss THY1 pluss fibroblastid ja FAPa pluss THY1- fibroblastid. FAPa pluss THY1 pluss fibroblastid paiknevad sünoviaalkihis, samas kui FAPa pluss THY1- fibroblastid paiknevad sünoviaalvoodri kihis. Lisaks ruumilisele erinevusele on need fibroblastid funktsionaalselt erinevad; FAPa pluss THY1 pluss fibroblastide omaksvõtt liigesesse kutsub esile raske lokaalse põletiku koos suurenenud leukotsüütide infiltratsiooniga, samas kui FAPa pluss THY1- fibroblastide ülekandmine põhjustab osteoklastide aktiivsuse suurenemist ja liigese deformeerumist ilma põletikku süvendamata. Neid funktsionaalselt erinevaid fibroblaste täheldatakse ka RA-ga inimese liigestes. Tõepoolest, FAPa pluss THY1 pluss fibroblaste leidub RA patsientide liigestes rohkem kui osteoartriidi (OA) patsientide liigestes70, mis näitab nende põletikulist tunnust. Teises uuringus uuriti inimese sünoviaalkudesid RNAseq ja scRNA-seq abil ning tuvastati kolm peamist fibroblastide alamhulka, millel oli selge pinnavalgu ekspressioon.⁷¹ Nende hulgas laienevad Pdpn pluss THY1 pluss CD34− fibroblastid põletikulise sünovia perivaskulaarses tsoonis ja on positiivses korrelatsioonis RA sünoviaalpõletiku raskusastmega. Pdpn pluss THY1 pluss CD34− fibroblastidel on in vitro kõrged migratsiooni- ja proliferatsiooniprofiilid. Huvitav on see, et enamik neist Pdpn pluss THY1 pluss CD34- fibroblastidest ekspresseerivad kadheriini-11, mis on hiire sünoviaalfibroblastide patoloogiliste tunnuste aluseks.72 Samuti on uuritud RA põletikueelsete fibroblastide reguleerimise aluseks olevat mehhanismi. Wei jt näitasid, et Notch3 signaalimine reguleerib THY1 ja sublimeerivate fibroblastide diferentseerumist, mis on RA sünoviaalpõletiku aluseks.73 Notch3 signaaliülekande geneetiline ammendumine või farmakoloogiline blokaad nõrgendab RA hiiremudelis liigesepõletikku ja luude erosiooni. Üldiselt näitavad need leiud, et spetsiifiline põletikuliste fibroblastide sihtimine võib olla paljutõotav ravistrateegia RA korral.

Fibroblastid toimivad ka kaasasündinud immuunrakkudena. Peritsüüdid/fibroblastid ekspresseerivad mitmeid mustrituvastusretseptoreid, näiteks Toll-like retseptoreid (TLR), ja soodustavad kohalikku põletikukaskaadi. Leaf jt avastasid, et neeruperitsüüdid tajuvad vigastatud rakkudest TLR- ja MyD88-sõltuval viisil vabanenud kahjustusega seotud molekulaarmustreid (DAMP-sid).74 Sarnaselt klassikaliste immuunrakkudega aktiveerivad peritsüüdid NLRP3-põletikku, mis viib IL-1 ja IL-18 sekretsioonini. Need leiud näitavad, et peritsüütide / fibroblastide interstitsiaalne lokaliseerimine võimaldab neil koheselt tunda esialgset vigastust ja toimida kohaliku põletiku levitajana. Teise lokaalse põletiku levitamise mehhanismina näitas intravitaalne mikroskoopiline vaatlus, et peritsüüdid muudavad põletiku ajal oma morfoloogiat ja moodustavad külgnevate peritsüütide vahel tühikuid, mis hõlbustab neutrofiilide transmigratsiooni ja roomamist.⁷⁵

Fibroblastid aitavad kaasa ka TLT-de tekkele vananenud vigastatud neerudes.4,76 Sekreteerides homöostaatilisi kemokiine, nagu CXCL13 ja CCL19, värbavad TLT-des asuvad fibroblastid 202|ARAI et al. lümfotsüüdid ja pakuvad TLT jaoks funktsionaalset karkassi, nagu on kirjeldatud järgmises jaotises.

4.2|Kasvaja progresseerumise reguleerimine

Kasvaja mikrokeskkonnas (TME) moodustavad vähiga seotud fibroblastid (CAF) TME stroomas suurimat rakukomponenti ja neil on oluline roll vähi patogeneesis.⁷⁷ CAF-id soodustavad vähi progresseerumist mitme mehhanismi kaudu, nagu ECM-i remodelleerimine ning kasvufaktorite ja põletikueelsete tsütokiinide sekretsioon. CAF-id reguleerivad ka immuunrakkude värbamist ja pärsivad kasvajavastast immuunreaktsiooni.^77,78CAF-idel on suur funktsionaalne ja piirkondlik mitmekesisus sõltuvalt nende elunditest. Näiteks pankrease duktaalse adenokartsinoomi (PDAC) korral tuvastatakse kaks erinevat CAF-i alatüüpi: üks CAF-ide alamhulk asub kasvajarakkude kõrval, kus SMA ekspressioon on kõrgem, samas kui teine ​​​​alarühm asub kasvajarakkudest kaugel ja sekreteerib põletikulisi tsütokiine, nagu näiteks IL-6.⁷⁹Rinnavähi korral liigitatakse CAF-id nende päritolu järgi kolme alampopulatsiooni, millest igaühel on sõltumatud prognostilised võimed.80 Huvitaval kombel on uuringud näidanud, et need heterogeensed CAF-ide alampopulatsioonid võib jagada kaheks funktsionaalselt erinevaks alatüübiks: vähki soodustavad CAF-id (pCAF-id). ) ja vähktõbe piiravad CAF-id (rCAF-id).77,81 RCAF-ide olemasolule viitab tähelepanek, et prolifereeruvate CAF-ide geneetiline ammendumine või funktsionaalne sekkumine ei inhibeeri, vaid pigem soodustab vähi progresseerumist.^82-84Kuigi rCAF-ide spetsiifilist markerit pole veel kindlaks määratud, näitas hiljutine uuring, et PDAC-i rCAF-e iseloomustab Mifflini ekspressioon,⁸⁵mis esmakordselt tuvastati kui glükosüülfosfatidüülinositooliga ankurdatud valk, mis märgib spetsiifiliselt mesenhümaalseid strooma-/tüvirakke.86 PDAC-ga patsientidel on Mefliini ja CAF-ide infiltratsioon positiivses korrelatsioonis soodsate tulemustega. Subkutaanse ksenotransplantaadi hiiremudeli analüüsimisel nõrgendas lentiviiruse poolt indutseeritud Mefliini ülekanne kasvaja stroomarakkudesse kasvaja kasvu ja SMA pluss CAF-i infiltratsiooni. Mifflini knockout hiirte kasvajate stroomas on sirgemad ja laiemad kollageenistruktuurid ning Mifflini ekspressiooni tase inimese PDAC-s on seotud muutunud kollageenistruktuuridega. Arvestades, et vähi progresseerumine on tihedalt seotud maatriksi remodelleerumisega,87 viitavad need leiud sellele, et Meflin pluss CAF-id pärsivad kasvaja progresseerumist, inhibeerides kollageeni remodelleerumist. Kuigi Meflini ja CAF-i arendamise aluseks oleva mehhanismi kohta on vaja täiendavaid uuringuid, võib rCAF-ide reguleerimine olla vähivastases ravis uudne ravistrateegia.

4,3|Regeneratiivsed funktsioonid

Kuigi fibroblastide kahjulik mõju on äratanud uurimishuvi, nagu on kirjeldatud eelmises jaotises, soodustavad fibroblastid ka kudede taastumist vigastustest. Tõepoolest, fibroblastide funktsiooni pärssimine ei pruugi tingimata viia parema tulemuseni. Näiteks takistab Postn pluss müofibroblastide deletsioon südames sobivat armide moodustumist, mis põhjustab vatsakeste rebenemist ja suuremat suremust.³²

Hiljutised uuringud on näidanud, et kudede vigastuse ja parandamise korral avaldab fibroblastide spetsiifiline alampopulatsioon regenereerivat toimet mitmes mehhanismis. Nahas jagunevad fibroblastid lokaliseerimise järgi kahte kategooriasse: papillaarsed fibroblastid dermise ülaosas ja retikulaarsed fibroblastid dermise alumises osas.88 Pärast vigastust värvatakse retikulaarsed fibroblastid kahjustuskohta enne papillaarset fibroblastide migratsiooni ja eritavad armide moodustumise eest vastutavaid kollageene. . Seevastu papillaarsed fibroblastid, mis värvatakse hiljem pärast vigastust, aitavad kaasa juuksefolliikulite taastumisele. Need leiud näitavad, et ruumiliselt ja funktsionaalselt erinevad fibroblastide alatüübid aitavad kaasa naha haavade taastumisele koordineeritult. Hiljutine scRNAseqi analüüs näitas ka, et nahahaavade fibroblastid on väga heterogeensed ja neid saab liigitada kaheteistkümnesse alamklastrisse.89 Pseudoaja ja RNA kiiruse analüüs näitas, et mõned neist klastritest esindavad diferentseerumisseisundeid kontraktiilsete fenotüüpide suhtes, samas kui teised omandavad regeneratiivseid fenotüüpe. Huvitaval kombel on tuvastatud ainulaadne naha fibroblastide alampopulatsioon, mis on spetsialiseerunud kudede parandamisele vigastustest. Pärast nahavigastust tõusevad sidekirmes asuvad fibroblastid, mis on nahka ja selle all olevat jäika struktuuri eraldav želatiinne membraanstruktuur, naha pinnale.90 Vastuseks sügavatele vigastustele suunavad fastsia fibroblastid oma ümbritseva komposiitmaatriksi haava sisse ja moodustavad. ajutine maatriks. Enamik neist "fascia fibroblastidest" on märgistatud märgistusega 1 (En1), mis esmakordselt tuvastati fibrogeensete liinirakkude markerina hiirte seljanahas.⁹¹ Fastsia fibroblastide arvukus haavas on positiivses korrelatsioonis armi sügavusega. Tõepoolest, fastsia fibroblastide geneetiline ammendumine takistab maatriksi juhtimist haavasse ja põhjustab defektsete armistumist. Mitteläbilaskva kile paigaldamine naha alla takistab sidekirme fibroblastide migratsiooni ja põhjustab lahtise armi. Teatatud on ka teise unikaalse fibroblastide alamhulga, adipotsüütide prekursorrakkude (APS) panusest; AP-d interakteeruvad CD301b ja makrofaagidega ja aitavad kaasa naha taastumisele pärast vigastust.⁹² Üldiselt viitavad need leiud sellele, et spetsiifiliste funktsioonidega fibroblastide heterogeensed alampopulatsioonid aitavad kaasa naha taastumisele pärast vigastust.

Neid "regeneratiivseid fibroblaste" täheldatakse kaneerud. Ultramikroskoopiline vaatlus näitas, et müofibroblastid rändavad ümber vigastatud tuubulite ja toetavad neid struktuurselt neerukahjustuse mudelis, mis viitab sellele, et müofibroblastid võivad hõlbustada tubulaarsete rakkude regeneratsiooni.93 Kasutades P0-Cre: DTR hiiri, kellele manustati difteeriatoksiini (DT). kahandab P0-Cre-liiniga märgistatud residentide fibroblaste neerudes, selgus, et fibroblastide ammendumine vigastuse varases faasis nõrgendab tubulite regeneratsiooni ja süvendab neerukahjustust.⁹⁴ Huvitav on see, et vastusena vigastusele reguleerivad fibroblastid retinoehappe sünteesi kiirust piirava ensüümi retinaldehüüddehüdrogenaas 2 (RALDH2) ekspressiooni. Retinoehappe retseptor (RAR) ekspresseerub proksimaalsetes tubulaarsetes rakkudes ja B-kristalliin, RAR-i sihtgeenide produkt, on ülesreguleeritud ainult vigastatud proksimaalsetes torurakkudes. RAR-ide pöördagonist nõrgendab tubulaarsete rakkude proliferatsiooni in vitro. Arvestades, et retinoehapet sekreteerib strooma mesenhüüm embrüonaalsesneerudon hädavajalik kusejuhade arenguks,^95,96need leiud viitavad sellele, et RALDH2 pluss müofibroblastid võivad mängida olulist rolli vigastatud proksimaalsete tuubulite regenereerimisel retinoehappe signaaliülekande kaudu vigastuse varases faasis.