Tuuma antigeeniga reageerivad CD4D T-rakud laienevad aktiivses süsteemses erütematoosluupuses, toodavad efektortsütokiine ja tungivad neerudesse

Kontakt: ali.ma@wecistanche.com

Dimas Abdirama jt

Cistanche DHT neeruhaiguse korral, proovi saamiseks klõpsake siin

Süsteemne luupuserütematooson süsteemne ja kroonilineautoimmuunnehaigusmida iseloomustab tolerantsuse kaotus autoreaktiivsete tuumaantigeenide suhtesCD4DT-rakud, mis on seotud haiguse patogeneesiga. Kuid pärast inimese autoantigeenispetsiifilisuse tuvastamist on nende retseptori spetsiifilisusest väga vähe teadaCD4DT-rakud on olnud äärmiselt keerulised. Siin esitame analüüsiCD4DTuuma antigeenide suhtes reaktiivsed T-rakud, kasutades kahte komplementaarset meetodit: T-raku raamatukogud ja antigeenidele reageerivad T-rakkude rikastamine. Tuuma antigeenispetsiifiliste sagedustegaCD4DT-rakud korreleerusid haiguse tõsidusega. Need autoreaktiivsed T-rakud toodavad efektortsütokiine, nagu interferoon-g, interleukiin-17 ja interleukiin-10. Võrreldes verega olid need rakud aktiivse luupusnefriidiga patsientide uriinis rikastatud, mis viitab põletikulise nefriidi infiltratsioonile.neerud. Seega toetavad need varem tundmatud omadused tuumaantigeenispetsiifiliste CD4D T-rakkude rolli süsteemses erütematoosluupuses.

Süsteemne luupuserütematoos(SLE) on süsteemne ja krooniline autoimmuunhaigus, mida iseloomustab tolerantsuse kaotus tuumaantigeenide suhtes, mis on tingitud bioloogiliste jäätmete, näiteks ribonukleoproteiine ja nukleosoome sisaldava apoptootilise materjali, puudulikust kõrvaldamisest.1 Tuumaantigeenide vastu suunatud autoantikehad on iseloomulikud SLE-le ja tekivad tavaliselt enne ilmset tekkimist. haigus.²Lisaks on autoreaktiivsed CD4 T-rakud seotud SLE patogeneesiga, soodustades autoantikehade tootmist B-rakkude poolt ja levitades otseselt elundikahjustusi põletikulistes sihtorganites.³Kuigi tuumaantigeeniga reaktiivsete T-rakkude tuvastamisest on varem teatatud, on tõendid nende olemasolu kohta siiani ümbermõõdulised ja praegu on ebaselge, kuidas need patogeneesis omavahel toimivad.^4–9Nende rakkude autoimmuunsuses osalemise mõistmine on tõhusa ravi kavandamisel kriitilise tähtsusega.

Autoantigeenispetsiifiliste T-rakkude tuvastamist takistavad nende erakordselt madalad sagedused ringlevas veres.10 Varasemad uuringud inimese naiivsete CD4þ T-rakkude repertuaaride kohta on kasutanud tetrameeril põhinevat tehnoloogiat, et pakkuda tõhusalt täpset teavet T-rakkude vastuste kohta spetsiifilistele antigeeniepitoopidele. ; see meetod nõuab aga eelnevaid teadmisi doonori inimese leukotsüütide antigeeni tüüpide kohta.^11–13Amplifitseeritud polüklonaalsete T-rakkude raamatukogude abil töötati välja alternatiivsed meetodid erinevate antigeenide suhtes reaktiivsete haruldaste T-rakkude populatsioonide samaaegseks tuvastamiseks ja loendamiseks ilma eelnevate teadmisteta inimese leukotsüütide antigeeni tüüpidest.¹⁴ja CD{0}}ekspresseerivate T-rakkude rikastamisega pärast stimuleerimist antigeeniga, mida nimetatakse ARTE-ks (antigeen-reaktiivne T-rakkude rikastamine).¹⁵

CD4þ T-rakud täidavad oma funktsiooni peamiselt tsütokiinide sekretsiooni kaudu antigeense aktiveerimise korral¹⁶ja koepõletiku, näiteks luupusnefriidi (LN) korral, mis on üks SLE kõige tõsisemaid tüsistusi.^17,18

LN-ga patsientide neerubiopsiates esineva T-rakkude repertuaari analüüs näitas, etneerud- infiltreeruvad CD4þ T-rakud, mis näitab antigeenispetsiifiliste T-rakkude kuhjumist põletikusneerud.¹⁹Meie eelmine uuring näitas, et aktiivse LN-ga patsientidel on uriini T-rakud täpse biomarkerina, mis sarnaneb intrarenaalsete rakkude fenotüübiga.^20,21Kuigi need rakud on rikastatud CXC kemokiini retseptori 3 ja CC kemokiini retseptori 5 suhtes, mis ekspresseerivad T-rakke, mis viitavad T-abistajaraku 1 (Th1) rakupopulatsioonile ja sisaldavad CD154þ T-rakke, mis viitab hiljutisele antigeeniga kokkupuutele,^22,23nende antigeenispetsiifilisus tuumaantigeenide suhtes jääb ebaselgeks. Selles uuringus esitame tuumaantigeenidele reageerivate CD4þ T-rakkude analüüsi kokku 17 tervel inimesel.¹² inaktiivse SLE-ga subjekte ja 20 aktiivse SLE-ga subjekti, kasutades T-rakkude raamatukogusid ja ARTE meetodeid, et analüüsida autoreaktiivsete CD4þ T-rakkude sagedusi LN-ga patsientide perifeerses veres ja uriinis ning tsütokiinide tootmist.

TULEMUSED

Tuuma antigeeniga reaktiivsed CD4D T-rakud on laiendatud inaktiivsed SLE-d, mis on määratud T-raku raamatukogu ja ARTE abil

Arvestades suurt teoreetilist tundlikkust haruldaste antigeenispetsiifiliste T-rakkude tuvastamiseks, loodi amplifitseeritud CD4 T-rakkude raamatukogud ja uuriti nende reaktiivsust tuumaantigeenide suhtes. 12 SLE-ga patsiendi ja 6 terve kontrollirühma laiendatud T-rakkude raamatukogusid stimuleeriti kanooniliste tuumaantigeenidega SmD1, RNP70, histooni, Ro ja La antigeeni esitlevate rakkude juuresolekul, millele järgnes raku mõõtmine. proliferatsioon vastusena antigeensele stimulatsioonile (täiendav joonis S1A). Kuna amplifitseeritud T-raku blastid reageerisid antigeenidele erinevalt, kasutati proliferatsiooniläve ja stimulatsiooniindeksi (stimuleeritud rakkude vastus stimuleerimata rakkude suhtes) superantigeeni Staphylococcus enterotoksiin B (SEB) suhtes doonori spetsiifilist z-skoori. ) toimis kaasamise kriteeriumina (täiendav joonis S1B – D). Lisaks tuumaantigeenidele kaasasime transtüretiini kui ebaolulist kontrollautoantigeeni (n ¼ 8 SLE-ga patsienti; n ¼ 5 tervet kontrolli) (joonis 1a). Antigeenispetsiifiliste rakkude tuvastamine valideeriti, vaidlustades seeria positiivse skooriga mikrokultuure vastava antigeeniga ja analüüsides antigeenispetsiifiliste T-rakkude aktivatsioonimarkerite CD154 ja interferooni (IFN)-g ekspressiooni kaastsütomeetria24 abil (täiendav joonis). S1E). Kasutades Poissoni jaotust14, loetleti antigeenispetsiifiliste T-rakkude esinemissagedused. Märkimisväärne on see, et mõnede tuumaantigeeniga reaktiivsete CD4þ T-rakkude mediaansagedus tõusis aktiivse SLE-ga patsientidel võrreldes tervete isikutega (SmD1: P ¼ 1; RNP70: P ¼ 0.{{ 35}}4; histoon: P ¼ 0,35; Ro: P ¼ 0.02; La: P ¼ 0.04 ) ja inaktiivse SLE-ga patsiendid (SmD1: P ¼ 0,79; RNP70: P ¼ 0,04; histoon: P ¼ 0,23; Ro: P ¼ 0,04; La: P ¼ 0,006) (joonis 1b). SLE-ga seotud autoreaktiivsete CD4 T-rakkude koguarv varieerus indiviidide vahel vahemikus 0 kuni 185, 5 rakku 1 miljoni raku kohta, kusjuures kõige sagedamini esines neid aktiivse SLE-ga patsientidel (joonis 1c). Tuuma antigeeniga reaktiivsed CD4 T-rakud olid tuvastatavad kõigil aktiivse SLE-ga patsientidel. Need rakud olid tuvastatavad ka 5-l 6-st inaktiivse SLE-ga patsiendist, samas kui ainult 3-l kuuest tervest kontrollist olid ringlevad autoreaktiivsed T-rakud. Huvitaval kombel näitasid aktiivse SLE-ga patsiendid ka laiemat valikut autoreaktiivseid T-raku vastuseid, kusjuures igal patsiendil oli reaktiivseid T-rakke vähemalt 3 tuumaantigeeni vastu. Võrdluseks, sihtportfell oli inaktiivse SLE-ga ja tervete kontrollidega patsientidel vähem varieeruv. Kokkuvõttes ei ole tsirkuleerivad tuuma antigeeni suhtes reaktiivsed T-rakud SLE jaoks eksklusiivsed, kuid mitteaktiivsed SLE-d, nende arv on suurem ja nende sihtstruktuurid on varieeruvamad.

Kuna autoreaktiivsed T-rakud mängivad rolli autoimmuunvastuste levitamisel, võrdlesime autoreaktiivsete T-rakkude arvu haiguse raskusastmega, mida hinnati SLE haiguse aktiivsuse indeksi (SLEDAI) skoori järgi. Ainult RNP70, Ro ja La suhtes reageerivate CD4þ T-rakkude sagedused korreleerusid positiivselt SLEDAI-ga (RNP70: P ¼ 0.04, r ¼ { {11}},4865; Ro: P ¼ 0,005, r ¼ 0,6299; La: P ¼ 0,01, r ¼ 0,5651) (joonis 1d). Seevastu transtüretiini suhtes reaktiivsete T-rakkude sagedus leiti kõigis kolmes rühmas üsna sarnasel tasemel (joonis 1e), lükates seega kõrvale võimaliku eksperimentaalse eelarvamuse, mis on tingitud üldisest mitteantigeenispetsiifilise T-rakkude hüperreaktiivsuse inaktiivsest SLE-st.

T-raku raamatukogud pakuvad mitmeid eeliseid, sealhulgas suurt tundlikkust väga haruldaste rakkude tuvastamiseks väikeses arvus sisendrakkudes. Kuid see meetod tugineb rakkude laienemisele, mis võib muuta raku koostist ja annab ainult piiratud võimaluse reaktiivsete rakkude fenotüübiliseks iseloomustamiseks. Seetõttu kinnitasime oma tähelepanekud ARTE meetodiga. ARTE-protokoll nõuab suuremaid sisendrakke, mis on eriti keeruline SLE-ga patsientidel, kellel esineb sageli lümfopeenia ja aneemia. Selle piirangu tõttu ja ka reaktiivsete rakkude eeldatava näidu suurendamiseks ühendasime kõik 5 kanoonilist tuumaantigeeni ja kasutasime seda kogumit perifeerse vere mononukleaarsete rakkude (PBMC) stimuleerimiseks enne CD154-ekspresseerivate rakkude (n ¼ 15) rikastamist. SLE-ga patsiendid; n ¼ 6 tervet kontrolli). Pinnamarkerite CD154 ja CD69 kombinatsiooni kasutades saab SLE-ga seotud tuumaantigeenide suhtes reageerivaid T-rakke tuvastada taustpopulatsioonis (joonis 1f). Kuigi CD154 ja CD69 ekspressiooni taustal täheldati kõigil inimestel, oli aktiivse SLE-ga patsientidel oluliselt suurenenud CD154þCD69þ T-rakkude esinemissagedus, kui neid stimuleeriti tuumaantigeenidega võrreldes tauststimulatsiooniga (P ¼ 0).0{ {18}}8), samas kui tervetel inimestel ja inaktiivse SLE-ga patsientidel oli antigeeniga stimuleeritud ja mittestimuleeritud rakkude sagedus sarnane (tervetel inimestel: P ¼ 0,44; inaktiivse SLE-ga patsientidel: P ¼ {{23} }.56) (joonis 1g). Lisaks oli taustsageduste lahutamisel tuumaantigeeniga reaktiivsete T-rakkude sagedus aktiivse haigusega patsientidel kõrgem kui tervetel inimestel ja mitteaktiivse haigusega patsientidel (P ¼ 0.02 ja P vastavalt ¼ 0,11) (joonis 1h). Taust lahutatud tuuma antigeeniga reaktiivsete T-rakkude sagedus korreleerus seega positiivselt haiguse aktiivsusega (P ¼ 0, 004, r ¼ 0, 5978), mis viitab nende potentsiaalsele rollile SLE patogeneesis (joonis 1i). Lisaks näitasid tagasikutsumise antigeeniga Candida albicans MP65 reageerivad CD4þ T-rakud doonoritel sarnaseid sagedusi (joonis 1j), välistades võimaluse, et aktiivse SLE-ga patsientidel võib antigeenireaktiivsete T-rakkude sagedus olla suurem.

Meie T-raku raamatukogu ja ARTE meetodite abil genereeritud andmed näitavad ühiselt autoantigeenispetsiifiliste CD4 T-rakkude laienemist aktiivse SLE-ga patsientidel. Mõlemad meetodid on võrreldavad, nagu näitavad sarnased keskmised stimulatsiooniindeksi väärtused antigeeniga stimuleeritud ja mittestimuleeritud T-raku vastuste vahel (mediaan stimulatsiooniindeks – T-rakkude raamatukogu: 1,857; ARTE: 1,614; P ¼ 0,33), kuigi ARTE tehnika näitas tuumaantigeeniga reaktiivsete CD4 T-rakkude kõrgemaid sagedusi kui T-raku raamatukogu tehnika (joonis 1k).

Tuuma antigeeniga reaktiivsed T-rakud tervetel inimestel on bona fife autoreaktiivsed CD4D T-rakud

Nii T-raku raamatukogu kui ka ARTE tehnikad näitasid autoreaktiivsete T-rakkude tuvastamist tervetel inimestel, mis kujutavad endast inimese autoimmuunsuse arengu võimalikku päritolu.²⁵Kuid nende arv ei erinenud oluliselt taustsagedustest, jättes ebakindlaks, kas terved katsealused peavad tõepoolest ringlema tuuma antigeeni suhtes reaktiivseid CD4 T-rakke. Autoreaktiivsete T-rakkude antigeenispetsiifilisuse selgitamiseks tervetel isikutel genereerisime üksikud T-raku kloonid CD154-CD69-CD4-T-rakkude prekursoritest, mis eraldati tervetelt isikutelt pärast PBMC-de stimuleerimist üksikute tuumaantigeenide ja Aspergillus fumigatus'e lüsaadist saadud kontrollantigeeniga. Märkimisväärne hulk SLE-ga seotud autoantigeenispetsiifilisi T-raku kloone reageeris nende vastavatele antigeenidele pärast antigeeni restimulatsiooni, nagu näitas IFN-g koosekspressioon CD154-ga (spetsiifiliste kloonide arv – Aspergillus fumigatus: 5/5; SmD1: 4/4). 8; RNP70: 3/11; histoon: 5/5; Ro: 4/9; La: 5/7) (täiendav joonis S2A ja B). Veelgi enam, antigeeni vastus (esinduslikult näidatud SmD1 jaoks) oli annusest sõltuv, rõhutades, et tervetel inimestel on tuumaantigeeni suhtes reaktiivsed T-rakud bona fife autoreaktiivsed CD4 T-rakud (täiendav joonis S2C). Seega kinnitasime tuumaantigeeniga reaktiivsete T-rakkude olemasolu tervetel isikutel rakendatud tuvastamismeetodite taustsignaalis.

Tuuma antigeeniga reaktiivsete CD4D T-rakkude tsütokiinide tootmine

Järgmisena uurisime tuumaantigeeniga reaktiivsete CD4 T-rakkude tsütokiinide tootmist. CD154-ekspresseerivad rakud värviti intratsellulaarselt efektortsütokiinide, nagu IFN-g, interleukiin (IL)-17, IL-4 ja IL-10 jaoks pärast stimulatsiooni kogumiga SLE-ga seotud tuumaantigeenid (joonis 2a). IFN-g–, IL-17– ja IL{{10}}-tootvate CD154þCD4þ T-rakkude esinemissagedus suurenes märkimisväärselt aktiivse SLE-ga patsientidel (kõik tsütokiinid: P ¼ {{16} }.004), samas kui IL-4-d tootvate autoreaktiivsete T-rakkude sagedus jäi taustsagedusest eristamatuks (P ¼ 0.125) (joonis 2b) ). Veelgi enam, IFN-g- ja IL{20}}-tootvate autoreaktiivsete T-rakkude absoluutarv oli aktiivse SLE-ga patsientidel suurem kui tervetel inimestel ja mitteaktiivse SLE-ga patsientidel (joonis 2b). Taustsageduste lahutamisel oli aktiivse SLE-ga patsientidel IFN-g- ja IL{23}}-tootvate autoreaktiivsete T-rakkude sagedus oluliselt kõrgem kui tervetel inimestel (IFN-g: P ¼ {{40 }}.003; IL-10: P ¼ 0.004) kui ka IFN-g– , IL-17– ja IL-10– tootvad autoreaktiivseid T-rakke kui inaktiivse SLE-ga patsiendid (IFN-g: P ¼ 0.002; IL{{ 36}}: P ¼ 0,002; IL-10: P ¼ 0,005) (joonis 2c). Lisaks korreleerus IFN-g- ja IL-10-, kuid mitte IL-17- ja IL-4-tootvate tuumaantigeeniga reaktiivsete T-rakkude sagedus haiguse aktiivsusega. Kuid ainult IL-4-d tootvate rakkude esinemissagedus näitas vähem korrelatsiooni haiguse aktiivsusega (IFN-g: P < 0,0001,="" r="" ¼="" 0,7574;="" il-17:="" p="" ¼="" 0,005,="" r="" ¼="" 0,5889;="" il="" -4:="" p="" ¼="" 0,14,="" r="" ¼="" 0,3717;="" il-="" 10:="" p="" ¼="" 0,0004,="" r="" ¼="" 0,6977)="" (joonis="" 2d).="" ifn-g="" tootjate="" sageduse="" järgi="" hinnates="" olid="" antigeeniga="" reaktiivsed="" cd4="" t-rakud="" peamiselt="" th1="" liini.="" seevastu="" il-17,="" aga="" ka="" il-10="" tootjaid="" tuvastati="" ainult="" madalamatel="" sagedustel.26="" võrreldes="" autoantikehade="" tasemetega,="" ei="" olnud="" tsütokiini="" tootvate="" cd4þ="" t-rakkude="" sagedused="" korrelatsioonis="" antikehade="" kontsentratsiooniga.="" kaheahelalise="" dna-ga="" ja="" antinukleaarsete="" antikehade="" seerumi="" tiitriga="" (täiendav="" joonis="" s3a="" ja="" b).="" tuuma="" antigeeniga="" reaktiivsete="" cd4="" t-rakkude="" ja="" autoantikehade="" vahel="" ei="" täheldatud="" muud="" korrelatsiooni,="" välja="" arvatud="" la-reaktiivsed="" cd4="" t-rakud="" la="" autoantikehade="" suhtes="" (täiendav="" joonis="">

Detection of nuclear antigen–reactive CD4D T cells in the urine of patients with active SLE and LN The population of nuclear antigen–reactive Th1 cells is suspected to invade the renal tissue, where they might encounter their almost omnipresent cognate antigen.27 By investigating the T-cell receptor (TCR)-b repertoire of CD4þ T cells isolated from peripheral blood compared with those isolated from the urine of 5 patients with SLE and active LN, we observed oligoclonal skewed TCR repertoires of urine-derived cells (Figure 3a). The cumulative frequency of the 20 most abundant T-cell clones was significantly higher in urine corresponding to a lower diversity index (Supplementary Figure S4A). To test whether these cells also demonstrate reactivity to a set of SLE-associated nuclear antigens, we generated libraries consisting of urinary CD4þ T cells isolated from 3 patients with SLE and active LN (Supplementary Figure S4B). Urinary CD4þ T cells were metabolically and functionally active cells indicated by the ability to proliferate upon stimulation with SEB but with signs of exhaustion shown by a reduced proliferation capacity after polyclonal activation (Supplementary Figure S4C and D). Because of these circumstances, only microcultures with a SEB stimulation index of >4 lisati individuaalse tuumaantigeeni suhtes spetsiifiliste uriini CD4þ T-rakkude loendamiseks. Paralleelselt uriini CD4 T-rakkudega määrati tuumaantigeeniga reaktiivsete CD4 T-rakkude sagedus perifeerses veres, mis võimaldas vastavate sageduste otsest võrdlust samade isikute sees (joonis 3b). Leidsime, et inaktiivne LN, uriini tuumaantigeeniga reaktiivsete CD4 T-rakkude sagedus oli kõrgem kui perifeerses veres. Selle tähelepaneku kinnitamiseks märgistasime 4 aktiivsest LN-doonorist eraldatud uriinirakud karboksüfluorestseiini suktsiinimidüülestriga ja segasime märgistatud rakud doonoriga sobitatud PBMC-dega, et võimaldada antigeenireaktiivsete rakkude otsest võrdlust ühes testis, kasutades ARTE tehnikat. CD154þCD69þ T-rakkude esinemissagedust doonoriga sobitatud uriini- ja perifeerse vererakkude stimuleeritud ja mittestimuleeritud proovides kasutati selleks, et hinnata, kas tuumaantigeeniga reaktiivsed T-rakud on uriiniga rikastatud.neerudstimuleerimisindeksi arvutamisega (joonis 3c). Kuigi uriini T-rakkude raamatukogu ja ARTE meetodid erinesid tuumaantigeenide stimulatsiooni keskmise indeksi poolest (stimulatsiooniindeks – uriini T-rakkude raamatukogu: 17; ARTE: 2,79; P ¼ 0,4) (joonis 3d) , näitas mõlema meetodi perifeersete ja uriini CD4þ T-rakkude autoreaktiivsuse analüüs (kokku n ¼ 7) suurenenud tuumaantigeenispetsiifilise stimulatsiooni indeksit uriinis (P ¼ 0.0156) (joonis 3e). Need tähelepanekud viitavad sellele, et tuuma antigeeni suhtes reaktiivsed CD4 T-rakud tungivad põletikulistesse ja kogunevad sinnaneerud. Seega võib lokaalne koepõletik SLE-s olla antigeenispetsiifiline nähtus ja seda moduleerivad otseselt infiltreeruvad autoreaktiivsed T-rakud.

ARUTELU

Tolerantsuse katkemine tuumaantigeenide suhtes on SLE tunnuseks ja lisaks B-rakkudele arvatakse, et autoreaktiivsed T-rakud mängivad selle patogeneesis keskset rolli. Kuna aga (auto)antigeenispetsiifiliste CD4 T-rakkude tuvastamine kujutab endast autoimmuunsuse uuringutes endiselt suurt väljakutset, on tuumaantigeeniga reaktiivsete CD4 T-rakkude kohta SLE-s siiani vähe teada.

Hiljuti on välja töötatud uudsed meetodid antigeenispetsiifiliste CD4þ T-rakkude tuvastamiseks ja loendamiseks. T-raku raamatukogu lähenemisviis kasutab ära T-rakkude eelnevat polüklonaalset laienemist, et võimaldada haruldaste antigeenispetsiifiliste T-rakukloonide tuvastamist.14 See strateegia pakub kõrget tundlikkust ja võimaldab töötada piiratud hulga rakkudega. Seda tehnikat kasutades suutsime aktiivse SLE-ga patsientidel näidata reaktiivseid T-rakke 5 kanoonilise tuumaantigeeni vastu. Raamatukogupõhise tuvastamise puudusteks on peale selle, et see on töömahukas, see, et ei saa välistada teatud kloonide väljakasvu või kadumist laienemisfaasis ning piiratud võimalused rakkude fenotüübiliseks analüüsiks.

Standardset kaastsütomeetriat piirab tuvastatavate sündmuste arv, mis tavaliselt piirab proovide analüüsi populatsiooniga, mille sagedus on üle {{0}},01 protsenti . Meie vaatlus T-raku raamatukogu abil näitas, et konkreetse autoantigeeni tsirkuleerivate autoreaktiivsete CD4þ T-rakkude sagedus haiguse ägenemisega patsientidel oli w20 rakku miljonis rakus, mis esindab sagedust 0,002 protsenti ; seetõttu on autoantigeenispetsiifiliste CD4 T-rakkude tuvastamine standardse, manipuleerimata kaastsütomeetria abil peaaegu võimatu. Bacher et al. tutvustas CD4þ T-rakkude eelrikastamist, mis reageerivad teatud antigeenidele enne kaastsütomeetriaga omandamist, mida tuntakse ARTE-meetodina.15 Kohandades seda lähenemisviisi tuumaantigeenispetsiifiliste CD4þ T-rakkude tuvastamiseks, saime oma tulemusi kinnitada ja demonstreerida tuumaantigeeniga reaktiivsete CD4 T-rakkude laienemist aktiivses SLE-s. Eelkõige oli transtüretiini ja C. Albicansiga reageerivate T-rakkude sagedus tervete kontrollide ja erineva haigusaktiivsusega SLE-ga patsientide vahel ükskõikne. Seetõttu ei ole autoreaktiivsete T-rakkude täheldatud laienemine tõenäoliselt üldise hüperreaktiivsuse inaktiivse SLE tagajärg, vaid antigeenispetsiifiliste T-rakkude laienemine.

Varasemad aruanded on juba näidanud autoreaktiivsete T-rakkude olemasolu SLE-s, kasutades peamiselt proliferatsiooni, tsütokiinide tootmist või aktiveerimismarkerite ülesreguleerimist, ehkki ilma nende rakkude selge populatsiooni kvantifitseerimiseta.4–6,8 Parimad tõendid selle kohta. Tuuma antigeenispetsiifiliste T-rakkude sagedus on olemas reaktiivsuse osas U1 väikese ribonukleoproteiini vastu, mis on iseloomulik autoantigeeni sihtmärk segatüüpi sidekoehaiguste korral ja mida leidub ainult osal SLE-ga patsientidest. U1 väikesed tuuma ribonukleoproteiiniga reaktiivsed CD4þ T-rakud määrati, kasutades piiravat lahjendust ja ensüümseotud immuunpunkti analüüsi (ELISPOT) ning teatati, et need esinevad sagedusega (40 kuni 250) - 106 T-rakku ja (20 kuni 60). ) vastavalt 106 PBMC-d, 7,9, mis on meie uuringu autoreaktiivsete rakkude sagedusega sarnase suurusega. Oma töös uurisime reaktsioonivõimet mitmete iseloomulike SLE-ga seotud tuumaantigeenide suhtes. Huvitav on see, et kuigi kõigil aktiivse LN-ga patsientidel ilmnes tuumavastaste antigeenide suhtes reaktiivsete CD4þ T-rakkude suurenenud sagedus, erinesid patsiendid nende sihtportfellist ja reaktsioonivõime oli suunatud laiema antigeenide komplekti vastu, võrreldes mitteaktiivse SLE-ga patsientidega. Selle bioloogiline tähtsus on praegu teadmata. Erinevad CD4þ T-rakkude reaktiivsused võivad olla seotud erinevate reaktiivsuste teatud kliiniliste ilmingutega, mis võivad olla haiguse patogeneesi jaoks üleliigsed.

Sarnaselt teiste autoimmuunhaigustega suutsime ka näidata autoreaktiivsete CD4þ T-rakkude olemasolu tervetel inimestel, 28, 29, kuigi palju madalama sagedusega võrreldes aktiivse SLE-ga patsientidega. Neid rakke ei olnud võimalik tuvastada, võrreldes aktiveeritud rakkude arvu koos antigeeni stimulatsiooniga või ilma, isegi selliste ülitundlike tehnikatega nagu T-raku raamatukogud või ARTE meetodid. Üherakulise kloonimisega suutsime siiski näidata, et "taust" signaal sisaldas tõepoolest autoantigeenispetsiifilisi CD4 T-rakke. Millised konkreetsed sündmused toovad kaasa tolerantsuse katkemise ja autoreaktiivsete T-rakkude sageduse suurenemise, jääb spekulatiivseks; sellegipoolest näitavad meie andmed, et autoreaktiivsete kloonide laienemine mängib rolli SLE patogeneesis.

Tsirkuleerivad tuuma antigeeniga reageerivad CD4þ T-rakud toodavad peamiselt IFN-g ja vähemal määral IL-17 ja IL-10. See tsütokiini profiil koos nõrga / puuduva korrelatsiooniga autoantikehade tootmisega viitab sellele, et tuuma antigeeniga reageerivate CD4 T-rakkude roll ei pruugi olla B-rakkude abi ainupakkuja. IFN-g on osutunud LN-i patogeneesis asendamatuks.30,31 Th1-rakud on SLE-s värbanud põletikulises neerukoes,20,32 muutes tuumaantigeeniga reaktiivsed T-rakud esmatähtsaks kandidaadiks tungidaneerud, kus nad kohtaksid oma üldlevinud sugulasautoantigeeni. Kuseteede T-rakke on varem kirjeldatud, et need peegeldavad haiguse aktiivsust ja peegeldavad intrarenaalsete rakkude fenotüüpi LN20,33; seega kasutasime neeru T-rakkude puhverserverina uriini T-rakke. Uriini T-rakud näitasid piiratud TCR-i varieeruvust, mis on kooskõlas vaatlusteganeerudbiopsiad,19,34, mis näitavad teatud T-raku kloonide rikastumist põletikulises neerukoes. Kuseteede T-rakkude hulgas suutsime tuvastada tuuma antigeeniga reaktiivseid T-rakke ja nende sagedus oli rikastatud võrreldes tsirkulatsiooni T-rakkudega. Järelikult tundub tõenäoline, et tuuma antigeeni suhtes reaktiivsed rakud osalevad otseselt kohalike elundikahjustuste levimises.

Kokkuvõttes näitame siin, et tuuma antigeeni suhtes reaktiivsed CD4þ T-rakud on laienenud inaktiivsed SLE-d; need on fenotüüpselt peamiselt IFN-g tootvad Th1 T-rakud ja tungivad põletikulistesse sihtorganitesse, näiteks neerudesse.

MEETODID

Üksikasjalikud meetodid on toodud lisamaterjalis.

Katsealused ning vere- ja uriiniproovid

Vereproovid võeti 17 tervelt isikult, 12 inaktiivse SLE-ga patsiendilt (SLEDAI skoor<10), and="" 20="" patients="" with="" active="" sle="" (sledai="" score="">10). Lisaks võeti uriiniproovid 12 aktiivse SLE ja LN-ga patsiendilt. Kõik katsealused olid andnud oma teadliku nõusoleku, tuginedes Charité – Universitätsmedizin Berlini institutsionaalselt järelevalvenõukogult ja eetikaasutustelt saadud eetilisele heakskiidule (EA 1/342/12, EA 1/098/07 ja 1/036/16). PBMC-d ja uriinirakud valmistati Ficoll-Hypaque'i tihedusgradienti abil.

Antikehad ja kaastsütomeetria

Sõltuvalt katsetest värviti antigeeniga stimuleeritud rakkudel mitmeid pinnamolekule järgmiste monoklonaalsete antikehade erinevates kombinatsioonides: anti-CD3, -CD4, -CD8, -CD14, -CD20, -CD69 ja -CD154; elusate ja surnud rakkude eristamiseks kasutati LIVE/DEAD Aqua komplekti (Life Technologies Ltd., Paisley, UK). Intratsellulaarse raku sektsiooni värvimiseks fikseeriti rakud 2% (maht/maht) paraformaldehüüdiga 15 minutit toatemperatuuril ja permeabiliseeriti BD FACS permeabiliseeriva lahusega 2 (BD Biosciences, San Jose, CA); järgmised antigeenid värviti intratsellulaarselt, kasutades standardset protokolli: CD154, IFN-g, IL-2, IL-4, IL-10 ja IL-17. Proovid saadi BD FACSCanto II ja BD LSRFortessa (BD Biosciences) kaastsütomeetritelt Deutsches Rheuma-Forschungszentrum Berlini voolutsütomeetria põhiseadmest, kasutades BDFACSDiva tarkvara (BD Biosciences). Voolutsütomeetria andmeid analüüsiti FlowJo tarkvara abil (FlowJo v10, Three Star, Ashland, VA).

Antigeeni ja antigeenide kogumi ettevalmistamine

T-raku raamatukogu testis kasutasime CD4þ T-rakkude stimuleerimiseks järgmisi antigeene: 0,5 mg/ml inimese SNRPD1 (SmD1) rekombinantset valku (Biorbyt Ltd., Cambridge, UK), 5{{9 }} ng/ml inimese SNRP70 (RNP70) rekombinantset valku (Abcam Plc., Cambridge, UK), 0,5 mg/ml inimese looduslikku histooni valku (Abcam Plc .), 0,5 mg/ml inimese SS-A/Ro rekombinantset valku (tarvitab Euroimmun AG, Lübeck, Saksamaa), 0,5 mg/ml inimese SS-B/Larekombinantset valku (tarvitab Orgentec DiagnostikaGmbH, Mainz, Saksamaa) , 1 mg/ml SEB-d (Sigma-Aldrich ChemieGmbH, Steinheim, Saksamaa), 1 mg/ml PepTivator Candidaalbicans MP65 (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Saksamaa) ja 0,5 mg/ml inimese transtüretiini rekombinantset valku (ATGen, Seongnam, Lõuna-Korea).

Perifeersed ja kuseteede T-rakkude raamatukogud

The protocol to generate amplified peripheral and urinary T-cell libraries was adopted and adapted as previously described.14 Brieflfly, 200,000 peripheral CD4þ T cells or 500 to 2000 urinary CD4þ T cells were isolated using anti-human CD4 MicroBeads (Miltenyi Biotec GmbH) according to manufacturer's instructions. The purity of CD4þ T-cell fraction was routinely checked using fellow cytometry on the basis of CD3þCD4þ expression, where the purity always reached >99 protsenti ja 70 protsenti kuni 75 protsenti perifeerse vere ja uriiniproovide puhul. Paralleelselt valmistati antigeeni esitlevad rakud, kogudes CD3 rakud PBMC-dest pärast ammendamist anti-inimese CD3 MicroBeadsiga (Miltenyi Biotec GmbH) ja külmsäilitati. Pärast 1–2-nädalast kultiveerimist jaotati amplifitseeritud CD4þ T-rakkude fraktsioonid 96-süvendiplaatidele, sõltuvalt analüüsitavate antigeenide arvust. Enne antigeenidega stimuleerimist puhati rakke vähemalt 4 päeva. Stimuleerimise päeval sulatati antigeeni esitlevad rakud ja jaotati T-rakukultuuri vahekorras vähemalt 1 antigeeni esitlev rakk 100 CD4þ T-raku kohta. Katsetesse kaasati alati CD4þ T-raku raamatukogud negatiivse kontrolli (stimuleerimata rakud) ja positiivse kontrolli (SEB-ga stimuleeritud rakud) jaoks. CD4þ T-rakke stimuleeriti antigeeniga 4 päeva ja proliferatsioon määrati standardse [3H]-tümidiini protokolli abil.

Amplifitseeritud T-raku blastid reageerisid erinevalt antigeenidele, mida kuvas väga heterogeenne stsintillatsiooni CPM; seega oli doonorispetsiifilise z-skoorina määratud proliferatsiooniläve normaliseerimine vajalik. z-skoor arvutati 75. ja 25. protsentiili 5 erinevusena, mis ületab stimuleerimata mikrokultuuride CPM-i mediaan. SEB-ga stimuleeritud mikrokultuuride rakud toimisid positiivse kontrollina. Pange tähele, et mikrokultuurid, mille SEB stimulatsiooni indeks on<5 for="" peripheral="" blood="" samples,="" or="" 4="" for="" urinary="" samples,="" were="" excluded="" because="" it="" indicated="" poor="" cell="" viability.="" enumeration="" of="" the="" precursor="" frequency="" of="" antigen-specific="" cd4þ="" t="" cells="" was="" calculated="" using="" numbers="" of="" negative="" microcultures="" according="" to="" poisson="" distribution="" and="" expressed="" per="" 1="" million="" cells,="" as="" described="" previously.14="" the="" use="" of="" poisson="" distribution="" is="" based="" on="" the="" probability="" that="" at="" least="" 1="" cd4þ="" t="" cell="" is="" present="" in="" a="" single="" microculture="" of="" t-cell="" libraries="" when="" the="" radioactive="" signal="" was="" detected="" after="" antigen-specific="">

Perifeersed ja kuseteede ARTE meetodid

Järgisime protokolli, mis kasutab CD154 MicroBead Kit (Mil-tenyi Biotec GmbH).35 Lühidalt öeldes stimuleeriti rakke 7 tundi antigeenidega ja seejärel märgistati inimese CD{5}-vastaste biotiini antikehade ja biotiinivastaste mikrohelmestega vastavalt. tootja juhistele. Märgistatud rakud laaditi kalibreeritud MS kolonnidesse (Miltenyi Biotec GmbH), et rikastada CD{7}}ekspresseerivaid rakke. Rakkude märgistamine karboksüfluorestseiindiatsetaadi N-suktsiinimidüülestriga (Sigma Aldrich Chemie GmbH) viidi läbi standardprotokolli järgi.

Üherakuliste kloonide genereerimine

Antigeeniga reaktiivsetest rakkudest genereeriti üherakulised kloonid, mida rikastati CD154 ekspressiooniga ARTE protokolli järgi. CD154-ekspresseerivad rakud filtreeriti 30- mm ettevalmistusfiltriga (Miltenyi Biotec GmbH) ja resuspendeeriti. 1 ml 20% (maht/maht) külmas fosfaatpuhverdatud soolalahuses, 0,5% veise seerumi albumiinis ja 2 mM etüleendiamiintetraäädikhappes. Rakud olid üksikud rakud, mis sorteeriti CD154þCD69þ fenotüübi järgi, ja üksikult sorteeritud rakke kultiveeriti 96-süvendplaatide üksikutes süvendites toiterakkude juuresolekul. Rakukultuure hoiti 3 kuni 4 päeva, kuni mitmed kloonid olid nähtavad. Üks päev enne taasstimuleerimist sulatati antigeeni esitlevad rakud ja jaotati T-rakukultuuri vahekorras vähemalt 1 antigeeni esitlev rakk 100 CD4þ T-raku kohta. Rakke stimuleeriti 1 mg/ml antigeeniga ja stimuleerimata kloonid toimisid negatiivse kontrollina.

Järgmise põlvkonna sekveneerimisel põhinev TCR-i repertuaarianalüüs

Genoomne DNA eraldati perifeersetest CD4þ T-rakkudest ja uriinirakkudest, kasutades AllPrep DNA/RNA Micro Kit (Qiagen, Venlo, Holland). Rekombineeritud TCR-b lookust amplifitseeriti vastavalt eelnevalt kirjeldatud protokollile.36 Lugemist töödeldi IMSEQ37 abil ning võrdsed klonotüübid koondati ja analüüsiti edasi.

Statistika

Statistilised testid viidi läbi GraphPad Prism tarkvaraga (Prism 8, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Mitme võrdluse jaoks rakendati Bonferroni korrigeerimist. Sõltumatu ja sõltuva andmekogumiga katsetes kasutati Mann-Whitney U testi ja Wil-Coxoni märgistatud auaste testi. Pärast Bonferroni korrigeerimist mitme võrdluse jaoks korrigeeriti kriitiliste P väärtuste arvutamist, kuna see põhineb kavandatud võrdluste arvul. P väärtused<0.01 were="" considered="" statistically="" significant="" with="" the="" following="" indication:="" *p="" <="" 0.01,="" **p="" <="" 0.005,="" and="" ***p="" <="" 0.0005.="" correlation="" analyses="" were="" performed="" using="" spearman="" rank="" correlations="" by="" showing="" the="" absolute="" sledai="" values="" instead="" of="" ranked="" values="" to="" better="" provide="" an="" understanding="" of="" the="" correlation="" between="" the="" number="" of="" cells="" and="" disease="" activity.="" for="" correlation="" analysis,="" p="" values=""><0.5 were="" considered="" statistically="" significant="" with="" the="" following="" indication:="" *p="" <="" 0.05,="" **p="" <="" 0.01,="" and="" ***p="" <="" 0.001.="" when="" background="" frequencies="" were="" higher="" than="" the="" frequencies="" of="" nuclear="" antigen–reactive="" cd4þ="" t="" cells,="" the="" frequencies="" without="" background="" were="" defined="" as="" zero.="" a="" log(x="" þ="" 1)="" transformation="" was="" applied="" to="" the="" data="" set="" when="" it="" included="" zero="" values.="" supplemental="" patient="" data="" and="" statistical="" data="" are="" available="" in="" supplementary="" tables="" s1="" and="">

TUNNUSTUS

Täname Toralf Kaiserit ja Jenny Kirschi (voolutsütomeetria ja rakusortimisüksus, Deutsches Rheuma-Forschungszentrum Berlin) abi eest voolutsütomeetria ja rakkude sorteerimisel. Neid uuringuid toetasid DeutscheForschungsgemeinschaft Sonderforschungsbereich 650 toGR raames ning Deutsche Gesellschaft für Nephrologie ja Charité – Universitätsmedizin Berlin kliiniliste teadlaste programm ja Berliini Terviseinstituut PE-le.