Ⅰ OSA: Põletikuline protsess moduleerib WT1 ekspressiooni ja lokaliseerumist podotsüütides, mis põhjustab neerukahjustusi
Mar 23, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com
MARIELA ARELLANO-RODRÍGUEZ, PABLO ZAPATA-BENAVIDES JA ET AL.
Sissejuhatus
Wilmi kasvaja-1 geen(WTI) on üks peamisi geene, mis on seotud podotsüütide ellujäämise ja ebatõhusa neerufiltratsiooniga. Põletikulised protsessid põhjustavadneerudebaõnnestumineja see võib juhtuda WT1(Wilmi kasvaja-1 geen). WT1(Wilmi kasvaja-1 geen) kodeerib transkriptsioonifaktorit, tsingi sõrmevalku, millel on neli peamist isovormi alternatiivse splaissimise teel eksonis 5 (17AA±) ja eksonis 9 (KTS±) (1). KTS-isovormil on suurem afiinsus DNA suhtes, KTS plus lokaliseerub koos splaissosoomivalkudega tsütoplasmas (2, 3).WT1(Wilmi kasvaja-1 geen) mängib olulist rolli embrüogeneesis, eelkõige sugunäärmetes janeerudarendamine; täiskasvanutel on selle ekspressioon piiratud spetsiifiliste vistseraalsete rakkudeganeerud(podotsüüdid) ning on oluline mitme geeni, näiteks podokalüksiini, nefriini (NPHS1) ja paariskasti transkriptsioonifaktori (4-6) säilitamiseks ja moduleerimiseks. WTl ekspressiooni mutatsioonid või vähenemine võivad viia nefriini ja podokalüksiini ekspressiooni vähenemiseni ning seda seostatakse nefropaatiate, näiteks glomeruloskleroosiga (5, 7-10).
Nefrootiline sündroom on lapseeas kõige sagedasem neerusündroom, selle histoloogiline klassifikatsioon on minimaalne nefrootiline muutus, fokaalne segmentaalne glomeruloskleroos ja difuusne mesangiaalne skleroos ning steroididele reageerimise ulatuse järgi klassifitseeritakse tundlikuks ja resistentseks nefrootiliseks sündroomiks (11). .
cistanche toime: põletikuvastane
WT1(Wilmi kasvaja-1 geen) on sageli teatatud lastel, kellel on steroidresistentne nefrootiline sündroom – haruldane haigus, mis mõjutab 10-15 protsenti nefrootilise sündroomiga patsientidest (12,13). Umbes 80 protsenti kõigist sporaadilise nefrootilise sündroomiga lastest reageerivad steroidravile, kuid WT1-s ei leitud mutatsioone.Wilmi kasvaja-1 geen) suures kohortuuringus (14). Steroidiresistentse nefrootilise sündroomi ekspressiooni vähenemine ja vähemal määral steroiditundliku nefrootilise sündroomiga patsientidel (15). Lipopolüsahhariidist (LPS) põhjustatud süsteemse põletiku hiiremudelis 24 tundi pärast LPS-i manustamist, WT1(Wilmi kasvaja-1 geen) viidi üle tsütoplasmasse ja seda seostati nefriini ekspressiooni vähenemisega, mis on võtmekomponent podotsüütide pilu diafragma säilitamisel ja oluline õigeks glomerulaarfiltratsiooniks, näidates seeläbi WT1(Wilmi kasvaja-1 geen) toimib transkriptsioonifaktorina nefriini geeni ülesreguleerimiseks (16).
Tuumori nekroosifaktor-alfa (TNFa) töödeldud kopsuvähirakkudes A459 toimus WT1 (TNFa) translokatsioon.Wilmi kasvaja-1 geen) valgu tsütoplasmasse on täheldatud, mis viitab sellele, et põletikuline stiimul võib muuta selle rakusisest lokaliseerimist ja transkriptsioonifunktsiooni (17). Fosforüülimine võib mängida rolli WT1 transkriptsiooni reguleeriva aktiivsuse moduleerimisel (Wilmi kasvaja-1 geen) tuuma translokatsiooni häirimise, samuti WT1(Wilmi kasvaja-1 geen) DNA-ga seondumine(18) cAMP-sõltuva proteiinkinaasi poolt vahendatud Ser-365 ja Ser-393 fosforüülimisega tsink-sõrme domeenis (19).
Sepsis on süsteemse põletikulise vastuse tulemus ja seda iseloomustab infektsioonist põhjustatud põletikueelsete ja põletikuvastaste tsütokiinide vabanemine. Äge neerukahjustus on tavaline kriitilises seisundis patsientidel ägeda põletiku korral ja sellel on tugev seos kroonilise neerukahjustuse progresseerumisega (20, 21). On tõendeid selle kohta, et põletik mängib olulist rolli erinevate organite, sealhulgasneerud(22). Selles töös hindasime põletikueelsete tsütokiinide mõju WT1 modulatsioonile.Wilmi kasvaja-1 geen) ekspressiooni ja selle translokatsiooni tsütoplasmasse.
cistanche tubulosa eelis: vähivastane ja anti-kasvaja
Materjalid ja meetodid
Loomade mudel. Emased BALB/c hiired (8-10 nädala vanused) saadi ettevõttest Harland Mexico (Mexico City, Mexico). Hiired hoiti puuri kontrollitud toatemperatuuri, niiskuse ja valguse all (12/12 h valguse-pimeduse tsükkel) koos vee ja toiduga ad libitum. Escherichia coli O111:B4 (Sigma Aldrich, Toluca, Mexico City, Mehhiko) LPS ja üks LPS-i süstimine manustati intraperitoneaalselt annuses 8 mg/kg (16); soolalahust kasutati kontroll-ravimata hiirte jaoks. Hiired surmati 200 mg/kg naatriumpentobarbitaali lahuse intraperitoneaalse süstiga 12, 24, 36, 48 ja 72 tunni jooksul, kusjuures igal ajahetkel oli n=5 ja seejärelneerudkoguti kude ja veri. Uriin koguti enne loomade ohverdamist.
Kaks hiirtneerudeksplantaatidele süstiti kroonilise haiguse esilekutsumiseks 1 mg/kg LPS-i iga 2 päeva järelneerud vigastuspositiivse kontrollina (21). Kõik katsed viidi läbi vastavalt bioloogiateaduste teaduskonna institutsionaalse loomade hooldamise ja kasutamise komitee (CEIBA-2016-034) eelnevale heakskiidule.
Neereksplantaadid. AlatesneerudBALB/c hiirte puhul valmistati 250-300 um paksused koeviilud Krumdiecki koelõikuriga (Alabama Research and Development, Munford, AL, USA) 4 kraadi juures Krebs Henseleiti vesinikkarbonaadi (KB) puhvri pideva vooluga. mida õhutati 5% CO2-ga. Viilud koguti KB puhvris temperatuuril 4 kraadi.Neereksplantaadid kanti 12-süvendiga plaatidele Dulbecco modifitseeritud Eagle'i söötmega/F12 söötmega, millele oli lisatud 10 protsenti veise loote seerumit ja 5 protsenti antibiootikumi-seenevastast ainet, ning inkubeeriti temperatuuril 37 °C, 5 protsenti CO-ga ja segades 25 °C juures. p/min. Eksplantaate töödeldi 10 ng/ml TNFa-ga (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), 20 ng/ml interleukiin 1-ga (IL1; R&D Systems) ja 100 ng/ml LPS-ga ning analüüsiti temperatuuril 6, 12 ja 24 h hiljem.
Uriini valk. Uriiniproovid koguti igal ülaltoodud ajahetkel. Valgu kontsentratsiooni mõõdeti DC Protein Assay komplekti (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) abil ja albuminuuriat hinnati naatriumdodetsüülsulfaat-polüakrüülamiidi geelelektroforeesi ja veise seerumi albumiini riba suuruse alusel (16).
Põletikueelsed tsütokiinid. IL6, IL1 ja TNFa tasemeid mõõdeti sandwich-ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi komplektide abil (PeproTech, Mexico City, Mexico).
Kvantitatiivne polümeraasi ahelreaktsioon (qPCR). Kogu RNA eraldati neerukudedest, kasutades Trizolw reagenti (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) vastavalt tootja juhistele. Üheahelaline cDNA sünteesiti pöördtranskriptsiooniga, kasutades suure võimsusega cDNA pöördtranskriptsioonikomplekti (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) vastavalt tootja juhistele. Reaalajas PCR viidi läbi, kasutades 7500 Real-Time PCR süsteemi (Applied Biosystems) koos TaqMani geeniekspressiooni testidega. Võrdlevad reaalajas PCR-analüüsid viidi läbi iga proovi jaoks kolmes eksemplaris. Praimerid WT1 (Wilmi kasvaja-1 geen) edastasid:5-TCTGCGG AGCCCAATACAG-3'; vastupidine:5-CACATCCTGAATGCCTCT GAAGA-3';ja sond FAM:5-CACCGTGCGTGTGTATT-3'NFQ;protokoll viidi läbi 95 kraadi juures 10 minutit ja 40 tsüklit 94 kraadi juures 30 s ja 64 kraadi C 30ndatel. WT1(Wilmi kasvaja-1 geen) geen arvutati võrrandi 2-AACT(23) abil, kusjuures normaliseerimiseks kasutati glütseraldehüüd-3-fosfaatdehüdrogenaasi (GAPDH) geeni (Applied Biosystems).
ravida neeruhaigusi cistanche ekstrakti
Nefriini mRNA ekspressioon määrati 3 ug cDNA ja järgmiste praimeritega: edasi: 5'-CCCCAACATCG ACTTCACTT-3' ja vastupidine: 5'-GGCAGGACATCCATGTAGAG-3' 94 kraadi juures 30 s, 60 kraadi kraadi 30 sekundit ja 72 kraadi kraadi 30 sekundit 30 tsüklit (372 bp) (16). GAPDH ekspressiooniks kasutati praimereid: Edasi: 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3', tagurpidi: 5'- TCCACCACCC TGTTGCTGTA-3', järgmiste reaktsioonitingimustega: 94 kraadi 40 s, 60 kraadi 30 s ja 72 kraadi 40 s 35 tsükli puhul (452 bp). WT1( avaldisWilmi kasvaja-1 geen):Edasi 5'-CACATGAGAGAAACGCCCCTTCATGTG-3', tagurpidi 5'-TTTGAGCTGGTCTGAACGAGAAA-3' 94 kraadi 40 s, 64 kraadi 30 s ja 72 kraadi 30 s puhul 35 bp (1600 bp). WT1(Wilmi kasvaja-1 geen) isovormid KTS± ja 17 AA± (F2-R2 praimerid 17 AA pluss /- ja F3-R3 tuvastamiseks KTS pluss / splaissingu isovormide tuvastamiseks) viidi läbi tavapärase PCR-iga vastavalt Oji et. .al.(24). -aktiini ekspressiooni määramine viidi läbi vastavalt Lauxet al. (25). Toodete jälgimiseks kasutati 10% polüakrüülamiidgeelelektroforeesi KTS±isovormi jaoks ja 2% agaroosgeeli 17AA±isovormi jaoks.
Immunofluorestsents. TheneerudLPS-ga töödeldud hiirtelt ja kontrollid fikseeriti 10% formaliinis ja töödeldi hematoksüliini ja eosiini värvimise, immunohistokeemia ja immunofluorestsentsi jaoks.
WT1(Wilmi kasvaja-1 geen) LPS-iga ravitud hiirtel kasutati mikroskoobi objektiklaasidele kinnitatud {{0}}um paksuseid neerukoe lõike. Proovid vahastati, permeabiliseeriti Triton X-100-ga [0,1% Triton 1% naatriumtsitraadiga fosfaatpuhverdatud soolalahuses (PBS)] ja pesti kolm korda PBS-iga. Kuded blokeeriti 20-protsendilise veise loote seerumiga PBS-is 30 minutit ja inkubeeriti 4 kraadi juures öö läbi WT1 vastaste monoklonaalsete antikehadega.Wilmi kasvaja-1 geen) sc{{0}}(F-6)(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) lahjendatud 1:100 10% veise loote seerumiga PBS-is. Pärast PBS-ga pesemist tuvastati seotud antikeha olemasolu kitse hiirevastase IgG Texas Red sc-2979(Santa Cruz Biotechnology) värvimise teel. Objektiklaasid värviti 4',6-diamidino-2-fenüülindooliga. Lõpuks paigaldati slaidid ja neid uuriti kvalitatiivselt, kasutades Olympus BX61W1 konfokaalset mikroskoopi koos 40-kordse veekeelega objektiiviga ja Fluoview 4.0a tarkvara (Olympus, Tokyo, Jaapan).
Immunohistokeemia. Fosforüülitud (p)-WT1(Wilmi kasvaja-1 geen) LPS-ga töödeldud hiirte podotsüütides polüklonaalsed antikehad p-WT1 (Wilmi kasvaja-1 geen) kasutati seriini 393,sc-12933 ja 363,sc-12934-R(Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA). Slaidid, mis sisaldasid 4-μm neerukoe lõike, eemaldati vahast ja muudeti permeabiliseerituks. . Immunohistokeemia viidi läbi, kasutades universaalset kiirkomplekti (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) vastavalt tootja protokollile. Objektiklaase uuriti valgusmikroskoobiga 100× õliimmersiooniobjektiiviga (Primo Star, Carl Zeiss, GmbH, Saksamaa) .
Western blot. Kogu valk eraldati 200 ul lüüsipuhvriga (1% Triton, 150 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl, pH 7,6) ja kontsentratsiooni mõõdeti DC Protein Assay komplekti (Bio-Rad) abil. Valk (50 ug) eraldati 12% naatriumdodetsüülsulfaat-polüakrüülamiidi geelelektroforeesiga ja analüüsiti Western blot analüüsiga WT1 (Wilmi kasvaja-1 geen) [F6] antikeha sc-7585(Santa Cruzi biotehnoloogia). Proovid normaliseeriti anti-GAPDH (AB2302; Sigma, San Louis, MO, USA) abil. Valgud visualiseeriti Lumi-Light Western Blotting süsteemi sc{5}} (Santa Cruz Biotechnology) abil.
cistanche'i eelised: kaitsta neere
Tulemused
InduktsioonneerudkahjuBALB/c hiirtel LPS-iga. On hästi teada, et podotsüütide vigastus on seotud suurenenud proteinuuriaga. Albumiini ja üldvalgu sisaldus uriinis määrati naatriumdodetsüülsulfaat-polüakrüülamiidi geelelektroforeesi ja DC valguanalüüsi komplekti (Bio-Rad) abil. 12 tundi pärast LPS-ravi täheldati uriini albumiini sisalduse olulist suurenemist (p=0.001), maksimaalne tõus oli 24 tunni pärast (215,87±1,41 ug/ml) võrreldes kontrolliga (15,53). ±5,0 ug/ml) (Joonis 1A). Üldine uriinivalgu kontsentratsioon saavutas maksimumi 36 tunni pärast (26,02 ± 2,43 mg/ml) ja oli kontrolliga võrreldes oluliselt kõrgem (p=0,01). nagu on näidatud joonisel 1. LPS-i poolt indutseeritud neerukahjustust analüüsiti histoloogiliselt.24 tundi pärast ravi täheldati neerukoes fokaalset glomerulonefriiti, kusjuures suurim kahjustus leiti 36. tunni pärast, suurendades glomeruli suurust, koos mesangiaalsega. 48 tundi pärast seda täheldati glomeruli järkjärgulist taastumist kuni 72 tunnini, nagu on näidatud joonisel 1C.
Joonis 1. Süsteemse põletiku mõju neerudele.Uriini albumiini (A) ja uriinivalgu (B) kontsentratsioonid neerukahjustuse markeritena lipopolüsahhariidiga ravitud hiirtel. C: tüüpiline pilt hiire neeru histoloogiast (hematoksüliini ja eosiini värvimine) erinevatel aegadel (12, 24, 36, 48 ja 72 tundi) pärast lipopolüsahhariidi süstimist kroonilise põletiku mudeli võrdlusega, suurendus 100 korda. Oluliselt erinev: *n<><0,0]><0.00>
Põletikueelsete tsütokiinide TNFa ja IL1 tootmine LPS-ga töödeldud hiirte seerumis. LPS-i poolt põhjustatud neerukahjustuse kinnitamiseks mõõdeti põletikueelsete tsütokiinide taset ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsiga. TNFa ja I1 suurenemist täheldati 12 tunni pärast (3,6±0,9 ng/ml, 11,9±5 ng/ml) ja kuni 36 tunni pärast (4,44±0,1 ng/ml,18). ±0.9 ng/ml) LPS-ravist, mis hakkab pärast seda vähenema (joonis 2A ja B). IL6 ekspressioon suurenes 12 tundi (49,5 ng/ml) ja 36 tundi (23,5 ng/ml) pärast töötlemist, olles oluliselt kõrgem kui kontrollrühmal (joonis 2C).
Joonis 2. Põletikueelsete tsütokiinide kasvaja nekroosifaktor-alfa (TNFa) tasemete ajaline kulg.(A), interleukiin 1 (LL1)(B) ja IL6(C) hiirte seerumis pärast lipopolüsahhariidi intraperitoneaalset manustamist. Oluliselt erinev: *p Väiksem või võrdne 0.05,**p Väiksem või võrdne 0,01 ja ***p Väiksem või võrdne 0,001 .
WTI geeni ekspressioon LPS-ga töödeldud hiirte neerukoes. Et vastata meie kesksele küsimusele, kas WT1(Wilmi kasvaja-1 geen) moduleeris põletikuline protsess ja see avaldas mõju neerudele, WT1(Wilmi kasvaja-1 geen) geen määrati süsteemse põletikuga hiirte neeruproovides põletiku erinevatel aegadel. WT1(Wilmi kasvaja-1 geen) mRNA oli kontrolliga võrreldes kogu analüüsimisel madalam, madalaim suhteline ekspressioon 36 tundi ja kõrgeim 12 tundi pärast süsteemse põletiku esilekutsumist, nagu on näidatud joonisel 3A. Lisaks määrati kindlaks, kas ravi LP-dega indutseeritud WTI isovormi eksoni 5 (17 AA±) ja KTS± ekspressiooni muutmine PCR abil. Andmed näitasid, et nende isovormide ekspressiooni ei dereguleeritud, kuna kogu LPS-i poolt indutseeritud süsteemse põletikulise protsessi vältel täheldati sama käitumist kui kontrollrühmal ilma ravita (joonis 3B). Western blotting näitas, et WT1 valk vähenes kogu põletikulise protsessi vältel, veidi taastudes 36 tundi pärast ravi, kuid WT1 kogus oli väiksem kui töötlemata kontrollil (joonis 3C ja D).
Joonis 3. Lipopolüsahhariidi (LPS) mõju Wilms'i kasvaja I (WT1) geeni ekspressioonile süsteemse põletikuga hiirte neerukoes.A: WTI mRNA suhteline ekspressioon.B: WT1 isovormide KTS± ja 17IAA± suhteline ekspressioon.C: WTI valgu tasemed immunoblotanalüüsiga pärast LPS-ravi ja D: WT1 immunoblotimise tihedus. Oluliselt erinev:**p Vähem kui või võrdne 0.01 ja ***p Väiksem või võrdne 0,001,
WTI fosforüülimine ja lokaliseerimine LPS-ga töödeldud hiirte neerubiopsiates. Oluline sündmus WTI valgu translatsioonijärgses modulatsioonis on aminohappe 393 fosforüülimine, mis kutsub esile valgu nihkumise tsütoplasmasse. Määrati WT1 fosforüülimine ja lokaliseerimine LPS-iga ravitud hiirte neeruproovides. WT1 fosforüülimist analüüsiti histokeemia abil, mis näitas fosforüülitud WT1 esinemist rakkude tsütoplasmas neerukoe lõikudes alates 12 tundi pärast süsteemse põletiku esilekutsumist ja püsides kuni 72 tunnini. WT1 fosforüüliti aminohapetel 3633 ja 3633 nagu on näidatud joonisel 4A. WT1 valgu asukohta analüüsiti immunofluorestsentsi abil. WT1 asukoht LPS-ga töödeldud hiirte neeruproovides podotsüütides oli peamiselt tsütoplasmaatiline, samas kui kontrollproovide podotsüütides oli asukoht ebaselge (joonis 4B).
Joonis 4. Wilms'i kasvaja I (WTI) fosforüülimine ja lokaliseerimine lipopolüsahhariidiga töödeldud hiirte neeruproovides.A: Fosforüülitud (p)-WTI immunohistokeemiline värvimine, mis näitab seriinide 393 ja 363 fosforüülimise suurenemist alates 12 tundi pärast LPS-i manustamist (valgusmikroskoobis 100-kordne suurendus). B: WTI lokaliseerimine immunofluorestsentsi abil neerus; näited, mis näitavad WT1(ruudud) väiksemat tuuma lokaliseerumist 36 tundi pärast lipopolüsahhariidi manustamist (suurendus 40× konfokaalsel mikroskoobil).DAP1:4,6-diamidino-2-fenüülindool.
WTI ja nefriini ekspressiooni moduleerimine LPS-ga töödeldud hiirte neerudes. WT1 asukoht rakus mõjutab selle bioloogilist aktiivsust. On teatatud, et tsütoplasmaatiline WT1 ei avalda transkriptsioonilist aktiivsust; sel põhjusel analüüsiti WT1 ja nefriini mRNA ekspressiooni PCR abil LPS-iga ravitud hiirte neeruproovides (joonis 5A). PCR näitas nefriini mRNA vähenemist 24 tunnilt 48 tunnile, suurenemist 72 tunni pärast (joonis 5B). ), samal ajal kui WTI mRNA ekspressioon suurenes 12 tunni pärast ja langes seejärel põletiku ja neerukahjustuse kriitilistel tundidel (24 ja 36 tundi) ning (joonis 5B).
Joonis 5. Nefriini (NPHS1) ja Wilmsi kasvaja 1 (WT1) mRNA ekspressiooni analüüs.V: mRNA ekspressiooni analüüsis vähenesid NPHSI ja WTI 24, 36 ja 48 tundi pärast süsteemse põletiku esilekutsumist lipopolüsahhariidi abil. B: punktis A näidatud ribade kvantifitseerimine densitomeetria abil ja normaliseeritud glütseraldehüüdi 3-fosfaatdehüdrogenaasi ekspressiooniga.
TNFa ja IL1-ga töödeldud neerueksplantaadid moduleerivad WTI ja nefriini ekspressiooni. Et teha kindlaks, kas tsütokiinid moduleerivad WT1 ekspressiooni, kultiveeriti neerueksplantaate ja töödeldi neid tsütokiinidega TNFa ja IL1 6, 12 ja 24 tundi, et analüüsida WT1 ja nefriini ekspressiooni PCR abil. Nefriini mRNA ekspressioon vähenes ja WTI mRNA ekspressioon suurenes 24 tunni pärast TNFa ja ILlb-ga töödeldud neerueksplantaatides (joonis 6).
Joonis 6. Nefriini (NPHS1) ja Wilms'i kasvaja 1 (WT1) mRNA ekspressiooni analüüs neerueksplantaatides.A: NPHSi ja WTI mRNA ekspressioonitasemed erinevatel aegadel neerueksplantaatides, mis on eksponeeritud 10 ng/ml kasvaja nekroosifaktor-alfa (TNF ) ja 20 nglml interleukiin 16 (IL16) toimele. signaaltoode. Ribad kvantifitseeriti normaliseerimise teel glütseraldehüüd-3-fosfaatdehüdrogenaasiks.
WTI lokaliseerimine neerueksplantaatides immunofluorestsentsi abil. Et teha kindlaks, kas TNFa ja IL vastutasid WT1 valgu lokaliseerimise muutuse eest, töödeldi hiire neerueksplantaate 24 tundi TNFa ja L1 ja LPS-ga. ILlb ja LPS-ga töödeldud eksplantaatides ilmnes WTl valgu paiknemine tuumas/tsütoplasmas ning TNFa-ga töödeldud eksplantaatides täheldati WT1 valgu lokaliseerumist tsütoplasmas; samal ajal täheldati töötlemata kontrollides peamiselt WT1 tuuma lokaliseerumist (joonis 7).
Joonis 7. Wilmsi kasvaja 1 (WTI) valgu lokaliseerimine immunofluorestsentsi abil, kasutades punast TX (WT1) ja 4',{4}}diamidino-2-fenüülindooli (DAPI) (tuum) töödeldud neerueksplantaatide podotsüütides l0 ng/ml kasvajanekroosifaktor-alfa (TNFa), 20 ng/ml interleukiin 16(L1B) ja lipopolüsahhariidiga (LPS).WT-de vähenenud tuuma lokaliseerimine, mis on näidatud TNFa-ga töödeldud eksplantaatides, võrreldes WTI tuuma/tsütoplasmaatilise lokaliseerimisega IL1- ja LPS-ravi ajal. Suurendus, 40×.
